Ứng dụng kỹ thuật Realtime PCR để phát hiện đột biến 455G/A trên gen Fibrinogen Beta ở bệnh nhân nhồi máu cơ tim trẻ tuổi

TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC

ỨNG DỤNG KỸ THUẬT REALTIME PCR ĐỂ PHÁT HIỆN
ĐỘT BIẾN - 455G/A TRÊN GEN FIBRINOGEN BETA
Ở BỆNH NHÂN NHỒI MÁU CƠ TIM TRẺ TUỔI
Lương Thị Lan Anh, Trương Thị Thanh Hương
Trường Đại học Y Hà Nội
Ngày nay, các trường hợp nhồi máu cơ tim trẻ tuổi có tính gia đình, không rõ các nguy cơ môi trường gây
bệnh, có thể liên quan đến đột biến gen, trong đó hay gặp đột biến -455G/A của gen Fibrinogen Beta (FGB)
quy định tổng hợp chuỗi fibrinogen. Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật Realtime PCR, có so sánh với giải trình
tự gen để phát hiện đột biến -455G/A ở 20 bệnh nhân nhồi máu cơ tim cấp < 60 tuổi được chẩn đoán xác
định nhồi máu cơ tim cấp tại Viện Tim mạch Việt Nam. Tỷ lệ phát hiện đột biến -455G/A trên gen Fibrinogen
Beta là 25%. Tỷ lệ phát hiện đột biến ở nam và nữ có sự khác nhau: 28,57% và 16,67%, các kết quả phù
hợp với giải trình tự gen. Nghiên cứu đã ứng dụng thành công kỹ thuật Realtime PCR để phát hiện đột biến 455G/A trên gen Fibrinogen Beta ở bệnh nhân nhồi máu cơ tim cấp trẻ tuổi.
Từ khoá: Nhồi máu cơ tim cấp, gen FGB, đột biến - 455G/A

I. ĐẶT VẤN ĐỀ

Theo các nghiên cứu, đa phần người cao
tuổi mắc phải căn bệnh này, tuy nhiên nhiều

Nhồi máu cơ tim được xếp thứ nhất trong
số 7 nhóm bệnh gây tử vong hàng đầu trên
thế giới. Ước tính ở Hoa Kỳ có khoảng 1 triệu
bệnh nhân nhập viện mỗi năm vì nhồi máu cơ
tim cấp và khoảng 200.000 đến 300.000 bệnh
nhân tử vong hàng năm vì nhồi máu cơ tim
cấp [1]. Tại Việt Nam, nhồi máu cơ tim cấp
đang có xu hướng gia tăng trong những năm
gần đây, tỷ lệ tử vong vẫn còn cao và đang là
vấn đề thời sự rất được quan tâm. Năm 2003,

theo thống kê của Viện Tim mạch Quốc gia
Việt Nam, tỷ lệ bệnh nhân vào viện vì nhồi
máu cơ tim cấp là 4,2%, đến năm 2007 con số
này là 9,1%. Ở Bệnh viện Chợ Rẫy, năm 2010
có tới 7.421 trường hợp nhập viện vì đau thắt
ngực, 1.538 ca phải nhập viện và điều trị vì
hội chứng vành cấp, 267 trường hợp tử vong
[2; 3].

trường hợp nhồi máu cơ tim xuất hiện ở
người < 60 tuổi và thậm chí ở lứa tuổi trẻ hơn,
< 30 tuổi, một số dẫn đến tử vong. Các nghiên
cứu gần đây trên thế giới đề cập đến mối liên
quan giữa nhồi máu cơ tim với biến đổi vật
chất di truyền ở cấp phân tử. Các nghiên cứu
cho rằng các trường hợp nhồi máu cơ tim trẻ
tuổi hoặc có tính gia đình, không rõ các nguy
cơ môi trường gây bệnh, có thể liên quan đến
đột biến gen, trong đó hay gặp đột biến
- 455G/A của gen Fibrinogen Beta quy định
tổng hợp chuỗi fibrinogen β [4 - 7]. Fibrinogen
là 1 protein được cấu tạo bởi 3 chuỗi polypeptide (chuỗi α, β và γ), tham gia quá trình đông
máu và đóng một vai trò quan trọng trong quá
trình hình thành huyết khối. Đột biến -455G/A
trên gen có thể gây tác động mạnh nhất lên
tốc độ tổng hợp của toàn phân tử fibrinogen,
từ đó làm tăng nguy cơ nhồi máu cơ tim [8].

Địa chỉ liên hệ: Lương Thị Lan Anh, Bộ môn Y sinh học Di
truyền, Trường Đại học Y Hà Nội

Email:
Ngày nhận: 16/12/2016
Ngày được chấp thuận: 26/2/2017

TCNCYH 106 (1) - 2017

Để phát hiện đột biến điểm -455G/A trên
gen Fibrinogen Beta, phương pháp sinh học
phân tử thường được nghĩ tới đầu tiên là giải
trình tự gen, nhưng không phải cơ sở nghiên

17


TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC
cứu và ứng dụng nào cũng có thể làm được

được chẩn đoán xác định nhồi máu cơ tim cấp

bởi yêu cầu phải có hệ thống giải trình tự gen

tại Viện Tim mạch, Bệnh viện Bạch Mai.

và chi phí tiêu hao cho giải trình tự gen khá
tốn kém. Realtime PCR là kỹ thuật khuếch đại
gen, có nhiều ưu điểm so với PCR truyền
thống, được ứng dụng ngày càng rộng rãi

- Thời gian: từ tháng 1/2013 đến tháng
1/2016.

- Địa điểm: Bộ môn Y sinh học - Di truyền,
Đại học Y Hà Nội.

trong di truyền học, công nghệ sinh học cũng
như nhiều lĩnh vực khác. Tuy nhiên, ở Việt
Nam hiện nay, chúng tôi chưa thấy tác giả nào
nghiên cứu và ứng dụng kĩ thuật này trong
việc phát hiện đột biến -455G/A nhằm góp
phần tầm soát sớm bệnh nhồi máu cơ tim.
Nghiên cứu được thực hiện nhằm: xác định

2. Phương pháp: nghiên cứu mô tả.
Quy trình nghiên cứu
- Lấy 2ml máu tĩnh mạch ngoại vi và chiết
tách DNA tổng số. DNA được kiểm tra độ tinh
sạch và hàm lượng bằng máy đo quang phổ
Nano - Drop 2000.

đột biến -455G/A của gen Fibrinogen Beta
- Thực hiện kỹ thuật Realtime PCR phát

bằng kỹ thuật Realtime PCR.

hiện đột biến -455G/A. Gen Fibrinogen Beta

II. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP

được thiết kế nhân lên bằng kỹ thuật PCR trên
vùng promoter tại vị trí nucleotide xác định

1. Đối tượng

theo ngân hàng trình tự gen Quốc tế

- 20 bệnh nhân nhồi máu cơ tim cấp < 60 tuổi

(GenBank, M 64983.1).

Bảng 1. Primer - Probe phát hiện gen FGB
Mồi – Đoạn dò

Trình tự 5’ - 3’

Sản phẩm (bp)

F -AATAACTTCCCATCATTTTGTCCAATTC
Mồi (FGBf3m- FGBr4m)

730
R -AGTCGTTGACACCTTGGGACTTAACTTG
FGB1m (phát hiện gen không đột biến)

Đoạn dò
FGB2m (phát hiện gen đột biến)
* FGBr4m: Mồi ngược (Fibrinogen Beta reverse); FGBf3m: mồi xuôi (Fibrinogen Beta forward).
- Phản ứng Realtime PCR được tiến hành
6 phản ứng:
+ Mẫu nghiên cứu với phản ứng có probe
không đột biến.
+ Mẫu nghiên cứu với phản ứng có probe

đột biến.
+ Chứng đột biến.
+ Chứng không đột biến.
+ Chứng âm (nước cất) với phản ứng có
probe không đột biến.
18

+ Chứng âm (nước cất) với phản ứng có
probe đột biến.
- Thể tích PCR: 50µl.
- Khuếch đại đoạn gen Fibrinogen Beta
(PCR) bằng hệ thống luân nhiệt của máy
Realtime PCR (Bio-Rad CFX96).
- Chu trình luân nhiệt:
+ Làm nóng hỗn hợp ở 40°C trong 10 phút,
95°C trong 5 phút.
TCNCYH 106 (1) - 2017


TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC
+ 39 chu kỳ nhiệt: 95°C trong 15 giây/60°C
trong 1 phút/72°C trong 30 giây.

chất lượng đỉnh được thu thập, kiểm định

So sánh kết quả Real time PCR với giải

bằng các phần mềm ABI Data Collection v2.0
và Sequencing Analysis Sotwave v5.3.

trình tự gen FGB
Gen Fibrinogen Beta được nhân lên bằng
kỹ thuật PCR (sử dụng cặp mồi FGBf3m FGBr4m) với 40 chu kì luân nhiệt (95oC - 5
phút/ 60oC - 30 giây/72oC - 30 giây). Thể tích
phản ứng 50 µl, bao gồm các thành phần:
DNA mẫu, mồi, và các thành phần cho phản
ứng PCR (Taq DNA polymerase, dNTP,
MgCl2, dH2O). Sản phẩm PCR được tinh sạch
bằng kit PureLink

Kết quả giải trình tự gen: các thông số và

TM

(Invitrogen). Giải trình tự

gen Fibrinogen Beta bằng hệ thống ABI sequencer được thực hiện trên máy Applied Biosystems 3.100.

Trình tự đoạn promoter của gen Fibrinogen
Beta của mẫu bệnh và chứng người Việt Nam
được so sánh với trình tự tham chiếu công bố
trên GenBank thông qua sử dụng phần mềm
phân tích Chromas Lite v2.1.1 và Seaview để
xác định đột biến điểm.
Các số liệu được tổng hợp và tính toán
bằng Word và Excel 2010.
3. Đạo đức nghiên cứu
Đối tượng nghiên cứu được thông báo rõ
về mục đích nghiên cứu, được cung cấp
thông tin và bệnh nhân đồng ý tự nguyện

Đối chiếu kết quả phát hiện đột biến -

tham gia nghiên cứu. Đối tượng nghiên cứu

455G/A của gen Fibrinogen Beta bằng kỹ

được giữ kín bí mật cá nhân và được phản

thuật realtime PCR với kết quả giải trình tự.

hồi kết quả nghiên cứu.

Kết quả phù hợp khi các bệnh nhân có kết
quả Realtime PCR và giải trình tự tương ứng
với nhau.

III. KẾT QUẢ
1. Thông tin mẫu nghiên cứu

Phân tích và xử lý số liệu

Có tổng số 20 bệnh nhân tham gia nghiên

Kết quả nghiên cứu gen Fibrinogen Beta

cứu, trong đó có 14 nam và 6 nữ. Độ tuổi

trên máy Realtime PCR được phân tích bằng

trung bình của các bệnh nhân là từ 18 - 56 tuổi.

phần mềm CFX Manager™Software.
Bảng 2. Tuổi trung bình của các bệnh nhân nghiên cứu

Chỉ số

Giới

Tuổi trung bình chung của các bệnh nhân ( X ± SD)

Nam

40,86 ± 12,25

Nữ

34,83 ± 9,13

Cả 2 giới

39,00 ± 11,15

Tuổi trung bình ở những bệnh nhân nghiên cứu là 39,00 ± 11,15 tuổi. Tuổi trung bình ở những
bệnh nhân nam (40,86 ± 12,25 tuổi) lớn hơn bệnh nhân nữ (34,83 ± 9,13 tuổi).

TCNCYH 106 (1) - 2017

19

TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC
2. Phát hiện đột biến -455G/A bằng kỹ thuật Realtime PCR
2.1. Tỷ lệ phát hiện đột biến -455G/A
Bảng 3. Tỷ lệ phát hiện đột biến -455G/A
Chỉ số

n

Số bệnh nhân có đột biến gen

Tỷ lệ đột biến/ giới (%)

Nam

14

4

28,6

Nữ

6

1

16,7*

Tổng

20

5

25

Giới

*: Không khác biệt so với nam (p > 0,05).
Có 5 trên tổng số 20 bệnh nhân phát hiện mang đột biến -455G/A của gen Fibrinogen Beta,
chiếm 25%, trong đó có 4 nam (80%) và 1 nữ (20%).
Tỷ lệ phát hiện đột biến gen ở nam và nữ có sự khác nhau, tuy nhiên không có ý nghĩa thống
kê (p > 0,05).
2.2. Hình ảnh Realtime PCR phát hiện đột biến -455G/A

Hình 1. Kết quả Realtime PCR và giải trình tự ở mẫu không có đột biến và mẫu đột biến
-455G (không đột biến); -455A (đột biến).
Chứng hoặc mẫu đột biến
Chứng âm
Chứng hoặc mẫu không đột biến

20

Chu kì ngưỡng (Ct)

TCNCYH 106 (1) - 2017


TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC

2.3. Kiểu gen đột biến -455G/A
Bảng 4. Kiểu gen đột biến -455G/A
Kiểu gen

n

%

Đồng hợp tử

5

100

Dị hợp tử

0

0

Tổng

5

100

Trong số 5 bệnh nhân phát hiện có đột biến -455G/A của gen Fibrinogen Beta, kiểu gen đều là
đồng hợp tử, tức cả hai alen của gen đều bị đột biến, không có trường hợp nào kiểu gen là dị
hợp tử (chỉ có 1 alen bị đột biến).
2.4. Đối chiếu kết quả Realtime PCR với giải trình tự đột biến -455G/A

So sánh kết quả phân tích đột biến -455G/A của gen FGB ở 20 bệnh nhân bằng kỹ thuật Realtime PCR và kỹ thuật giải trình tự gen, kết quả như sau:
Bảng 5. Sự phù hợp giữa kết quả Realtime PCR
và giải trình tự gen Fibrinogen Beta với đột biến -455G/A
Bệnh nhân
nhồi máu cơ tim

Phân tích bằng kỹ thuật
Realtime PCR (1)

Phân tích bằng kỹ
thuật giải trình tự (2)

Tỷ lệ phù hợp
(1)/(2)

Đột biến -455G/A

5

5

100%

Không đột biến

15

15

100%

Tổng số

20

20

100%

Kết quả tìm đột biến của 2 phương pháp Realtime PCR và giải trình tự ở các bệnh nhân là
như nhau, tỷ lệ phù hợp là 100%.

IV. BÀN LUẬN
tim trẻ tuổi trong nghiên cứu này là 25%. Theo
Sau khi hoàn chỉnh thành công kỹ thuật

một nghiên cứu năm 2004, tỉ lệ người mang

Realtime PCR để phát hiện đột biến -455G/A

đột biến -455G/A trong nhóm bệnh nhân xơ

của gen Fibrinogen Beta, nghiên cứu này

vữa động mạch là 25,8%, cao hơn so với tỉ lệ

bước đầu ghi nhận và xử lý các số liệu về đột

15,2% ở nhóm chứng không mắc bệnh [9].

biến -455G/A ở bệnh nhân nhồi máu cơ tim

Nghiên cứu khác cho thấy, tỉ lệ đột biến -

trẻ tuổi. Mặc dù còn hạn chế về cỡ mẫu, tuy

455G/A ở 885 nam giới tuổi dưới 70, có tiền

nhiên đây cũng là mở đầu cho các nghiên cứu

sử cơn đau thắt ngực là 21%, còn một nghiên

tiếp theo chi tiết hơn về đột biến này.

cứu năm 2014, tỉ lệ đột biến này là 35,3% tính

Tỷ lệ phát hiện đột biến -455G/A trên gen

trên 486 bệnh nhân có tiền sử đột quỵ [10;

Fibrinogen Beta ở các bệnh nhân nhồi máu cơ

11]. Như vậy có thể thấy, tỉ lệ phát hiện đột

TCNCYH 106 (1) - 2017

21


TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC

biến trong nghiên cứu của chúng tôi khá

Tỷ lệ phát hiện đột biến -455G/A trên gen

tương đồng so với các tác giả khác trên thế

Fibrinogen Beta là 25%. Tỷ lệ phát hiện đột

giới. Ngoài ra, một nghiên cứu năm 1999 cho

biến ở nam và nữ có sự khác nhau: 28,57%

thấy đột biến -455G/A làm tăng 5,4% lượng

và 16,67%, tuy nhiên không có ý nghĩa thống

fibrinogen, kết hợp với 1 đột biến khác cũng

kê, (p > 0,05).

trên gen Fibrinogen Beta là -854G/A thì tỉ lệ
này tăng lên xấp xỉ 11%, hay nghiên cứu năm

Lời cảm ơn

1998 cũng kết luận kiểu gen -455AA có nồng

Nghiên cứu thực hiện thành công nhờ sự

độ fibrinogen trung bình là 3,9 g/L so với trung

hỗ trợ của Bộ môn Y sinh học - Di truyền,

bình 3,1 g/L của kiểu gen -455GG [10; 12].

Trường Đại học Y Hà Nội, Viện Tim mạch Việt

Điều này cho thấy đột biến -455G/A đóng vai

Nam và Công ty Cổ phần Công nghệ Việt Á.

trò quan trong trong sự gia tăng nồng độ fibrinogen, chứng tỏ tầm quan trọng của nghiên

TÀI LIỆU THAM KHẢO

cứu hoàn chỉnh kỹ thuật Realtime PCR để

1. Longo D (2012). Epidemiology of Cardiovascular Disease, Harrisons Principles of
internal Medicine, McGraw-Hill United States.

phát hiện đột biến này.
75% các trường hợp còn lại không phát
hiện có đột biến -455G/A có thể bệnh nhân
mắc các đột biến khác ngoài đột biến trên.
Theo một thống kê, các bệnh nhân nhồi máu
cơ tim do đột biến gen Fibrinogen Beta, ngoài
đột biến -455G/A hay gặp còn có thể xuất hiện
các đột biến -148C/T, -249C/T, -854G/A, 993C/T [12]. Điều này sẽ giúp mở ra những
hướng mới cho các nghiên cứu sau này.
Tỷ lệ phát hiện đột biến ở nam và nữ có

sự khác nhau: 28,57% ở nam và 16,67% ở

2. Ngô Quý Châu (2012). Bệnh học Nội
khoa 1. Nhà xuất bản Y học, Hà Nội, 185.
3. Nguyễn Thị Hồng Huệ (2013). Nghiên
cứu giá trị NT-PRO-BNP trong nhồi máu cơ
tim cấp không ST chênh lên. Tạp chí Y dược
lâm sàng, 108, 21.
4. Brown E. T., Fuller G. M (1998). Detection of a complex that associates with the Bβ
fibrinogen G− 455-A polymorphism. Blood, 92
(9), 3286 - 3293.

nữ, tuy nhiên không có ý nghĩa thống kê,

5. Mika M (2003). Fibrinogen gene promoter− 455 A allele as a risk factor for lacunar

(p > 0,05). 100% các trường hợp đột biến đều

stroke. Stroke, 34(4), 886 - 891.

có kiểu gen đồng hợp tử, điều này cũng phù

6. Sevimli S (2014). Impact of-455G/A

hợp với đặc điểm di truyền lặn trên nhiễm sắc

Polymorphism of the β-Fibrinogen Gene on

thể thường của gen, khi ở trạng thái đồng hợp

Platelet Aggregation in Patients With Acute

tử mới biểu hiện bệnh.

Coronary Syndrome. Clinical and Applied

V. KẾT LUẬN

Thrombosis/Hemostasis, 20(3), 238 - 243.

Đã ứng dụng thành công kỹ thuật Realtime

7. Gu L (2014). Influence of the βfibrinogen-455G/A polymorphism on develop-

PCR để phát hiện đột biến -455G/A trên gen

ment of ischemic stroke and coronary heart

Fibrinogen Beta ở bệnh nhân nhồi máu cơ tim

disease. Thromb Res, 133(6), 993 - 1005.

cấp trẻ tuổi, các kết quả phân tích phù hợp với

8. Wilhelmsen L (1984). Fibrinogen as a
risk factor for stroke and myocardial infarction.

kết quả giải trình tự gen.
22

TCNCYH 106 (1) - 2017


TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC
New England journal of medicine, 311(8), 501
- 505.

vascular biology, 18(2), 265 - 271.

9. Sun H (2004). [Relationship between
fibrinogen B beta gene FGB-455G/A polymorphism and atherosclerotic cerebral infarction].

promoter A− 455 allele associated with poor

Chinese journal of medical genetics, 21(4),
382 - 385.

BMC neurology, 14(1), 1.

10. de Maat M. P (1998). -455G/A Polymorphism of the β-Fibrinogen Gene is Associated With the Progression of Coronary Athero-

11. Mika M (2014). Βeta-fibrinogen gene
longterm survival among 55 - 71 years old
Caucasian women in Finnish stroke cohort.

12. Van’t Hooft F. M (1999). Two common, functional polymorphisms in the promoter region of the β-fibrinogen gene contrib-

sclerosis in Symptomatic Men Proposed Role
for an Acute-Phase Reaction Pattern of

ute to regulation of plasma fibrinogen concen-

Fibrinogen. Arteriosclerosis, thrombosis and

cular biology, 19(12), 3063 - 3070.

tration. Arteriosclerosis, thrombosis and vas-

Summary
APPLICATIONS OF REALTIME PCR TO DETECT -455G/A IN
FIBRINOGEN BETA (FGB) GENE IN YOUNG PATIENTS
WITH MYOCARDIAL INFARCTION
Myocardial infarction in younger individuals or familial myocardial infarction of unknown etiology may be related to genetic mutations, including mutations common -455G/A Fibrinogen Beta
gene regulations fibrinogen chain synthesis. Mutations -455G/A of Fibrinogen Beta gene identified
by using Real - time PCR is compared with sequencing results. Our study was conducted on 20
patients under 60 years old with acute myocardial infarction admitted in the Vietnam National
Heart Institute. The mutation detection rates of -455G/A in the Fibrinogen Beta gene was 25%.
Mutation detection rate in male and female were 28.57% and 16.67% respectively. These results
fit with the sequencing results. Researchers have successfully applied Real-time PCR techniques
to detect mutations 455G/A in the Fibrinogen Beta gene in younger patients with acute myocardial
infarction.
Keywords: Acute myocardial infarction, FGB, -455G/A

TCNCYH 106 (1) - 2017

23