Nghiên cứu xây dựng mô hình bệnh nấm hệ thống do candida để đánh giá hiệu quả thuốc chống nấm in vivo

TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 9-2015

NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG MÔ HÌNH BỆNH NẤM HỆ THỐNG DO
CANDIDA ĐỂ ĐÁNH GIÁ HIỆU QUẢ THUỐC CHỐNG NẤM IN VIVO
Lê Trần Anh*; Nguyễn Tuấn Quang*
TÓM TẮT
Mục tiêu: nhu cầu nghiên cứu và đánh giá hiệu quả thuốc chống nấm là rất cấp thiết, cả in vitro
và in vivo. Chúng tôi tiến hành nghiên cứu này nhằm xây dựng mô hình bệnh nấm hệ thống do
Candida albicans để áp dụng trong thực tiễn. Phương pháp: gây nhiễm chuột nhắt trắng không
4
suy giảm miễn dịch qua đường tĩnh mạch. Kết quả: liều chết tối thiểu của C. albicans là 4 x 10
4
5
tế bào (TB)/chuột. Liều LD10 là 4 x 10 ; liều LD90 là 7,5 x 10 TB/chuột. Tại ngày thứ 3 (D3) và
D8 sau gây nhiễm, mật độ nấm tại thận là 4,52 và 4,06 log10 CFU (đơn vị hình thành khuẩn
lạc)/gam, cao hơn so với mật độ nấm tại gan (3,77 và 2,74 log10 CFU/gam) và lách (2,93 và
2,58 log10 CFU/gam). Kết luận: áp dụng mô hình trong đánh giá thấy amphotericin B có tác dụng
kéo dài thời gian sống của chuột nhiễm liều LD90 và giảm mật độ nấm ở thận nhiễm liều LD10.
* Từ khóa: Candida albicans; Chuột; Amphotericin B; In vivo.

Develop a Murine Model of Disseminated Candidiasis to Evaluate
the Efficacy of Antifungals in Vivo
Summary
Objectives: To evaluate the efficacy of anti-fungal drugs are urgently needed, both in vitro
and in vivo. We conducted this study to develop a model of systemic mycosis caused by
Candida albicans to apply in practice. Methods: Immunocompetent mice were intravenously
4
infected. Results: The minimal lethal dose of C. albicans was 10 cells/mouse. LD10 dose was
4
5
4 x 10 ; LD90 dose was 7.5 x 10 cells/mouse. At day 3 (D3) and D8 after infection, the fungal

burden in kidney were 4.52 and 4.06 log10 CFU (colony forming units)/g respectively, higher
than that in the liver (3.77 and 2.74 log10 CFU/g) and spleen (2.93 and 2.58 log10 CFU/g).
Conclusion: Applying the model to evaluate the efficacy of amphotericin B showed that
amphotericin B reduced mortality rate and the fungal burden in kidneys of mice receiving LD 90
and LD10, respectively.
* Key words: Candida albicans; Mouse; Amphotericin B; In vivo.

ĐẶT VẤN ĐỀ
Các bệnh do nấm đang có xu hướng
ngày càng gia tăng, do đó đòi hỏi phải có
thuốc điều trị bệnh an toàn, hiệu quả.

Thuốc sản xuất ra trước khi đưa vào áp
dụng điều trị cần được đánh giá hiệu quả
một cách khách quan, khoa học. Trong
đánh giá hiệu quả thuốc có kỹ thuật đánh
giá in vitro và in vivo. Đánh giá in vitro có thể

* Học viện Quân y
Người phản hồi (Corresponding): Lê Trần Anh (anh )
Ngày nhận bài: 27/08/2015; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 25/11/2015
Ngày bài báo được đăng: 30/11/2015

58


TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 9-2015

cung cấp thông tin ban đầu về hiệu quả
thuốc, tuy nhiên thuốc có tác dụng tốt

in vitro không đảm bảo có hiệu lực cao
in vivo. Nghiên cứu thực nghiệm động vật
càng đặc biệt quan trọng trong giai đoạn
tiền lâm sàng nghiên cứu hiệu quả phối
hợp thuốc, các thuốc mới, đánh giá hiệu
quả in vivo cũng như độc tính cấp, mạn
của chúng [4, 6]. Candida sp. là một trong
những tác nhân gây bệnh nấm hệ thống
hay gặp nhất, trong đó C. albicans là căn
nguyên phổ biến, do đó được nhiều tác
giả quan tâm nghiên cứu. Việt Nam là
nước có khí hậu nhiệt đới nóng ẩm, thuận
lợi cho nấm và các bệnh nấm phát triển.
Hiện nay ở Việt Nam chưa có cơ sở nào
thực hiện gây bệnh nấm hệ thống trên
động vật thực nghiệm để đánh giá hiệu
quả thuốc điều trị. Chúng tôi tiến hành đề
tài này với mục tiêu: Xây dựng quy trình
gây bệnh nấm hệ thống do Candida
albicans trên động vật thực nghiệm và áp
dụng đánh giá hiệu quả điều trị bệnh nấm
hệ thống in vivo của amphotericin B để
thử nghiệm mô hình.
ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU
1. Đối tƣợng nghiên cứu.
- Động vật: chuột nhắt trắng, không phân
biệt đực cái, trọng lượng 20 ± 2 gam.
- Nấm: C. albicans, chủng ATCC- 90028.
2. Vật liệu nghiên cứu.

* Dụng cụ:
- Dụng cụ nuôi chuột, giữ chuột để tiêm
tĩnh mạch, bơm tiêm 1 ml, kim 27G.

- Dụng cụ nuôi cấy, định lượng nấm:
buồng cấy vô trùng, hộp lồng petri,
ống nghiệm, que cấy nấm, đèn cồn, kính
hiển vi, buồng đếm tế bào Neubauer, máy
ly tâm.
- Dụng cụ xác định lượng nấm trong
tạng: cân điện tử Mettler Toledo (Thụy Sĩ),
chày, cối thủy tinh.
* Hóa chất:
- Dung dịch NaCl 0,9%; glucose 5%;
gentamicin, formol.
- Môi trường Sabouraud (Bio Rad, Pháp).
- Thuốc amphotericin B (amphotret,
Bharat Serums and Vaccines Ltd, Ấn Độ).
3. Các kỹ thuật sử dụng trong nghiên
cứu.
- Nấm C. albicans nuôi cấy trong môi
trường Sabouraud, ở nhiệt độ phòng theo
kỹ thuật thường quy. Vào ngày gây nhiễm,
thu hồi nấm bằng nước muối sinh lý, ly
tâm hút bỏ dịch 3 lần để rửa. Đếm trong
buồng đếm tế bào tính toán mật độ nấm.
- Tiêm tĩnh mạch đuôi chuột: chuột được
giữ trong dụng cụ, bộc lộ đuôi chuột, mỗi
lần tiêm 0,2 ml dung dịch nấm/thuốc vào
tĩnh mạch đuôi chuột.

- Kỹ thuật xác định mật độ nấm trong
tạng: lấy tạng bằng phương pháp vô trùng,
nghiền trong 2 ml dung dịch NaCl 0,9%
có kháng sinh (gentamycin 160 mg/l)
bằng chày/cối vô trùng; hòa loãng 1/10;
1/100 và 1/1.000 lần; cấy trải 0,2 ml trên
hộp lồng petri có môi trường Sabouraud,
nuôi cấy ở nhiệt độ phòng, đếm khuẩn lạc
sau 48 giờ.
59


TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 9-2015

- Kỹ thuật làm tiêu bản mô bệnh học:
lấy ra tạng cố định ngay vào dung dịch
formol, gửi Bộ môn Giải phẫu Bệnh, Học
viện Quân y làm và đọc tiêu bản.
4. Chỉ tiêu nghiên cứu và cách theo
dõi.
- Liều chết 10% (LD10), LD90 (tế bào/chuột):
sau khi gây nhiễm chuột được theo dõi
sau 14 ngày để đánh giá, tính toán liều
dựa trên phần mềm.
- Mật độ nấm ở các tạng: log10 CFU/
gam tạng.
- Hiệu quả điều trị: tỷ lệ sống của chuột
nhiễm liều LD90, mật độ nấm ở thận nhiễm
liều LD10. Chuột được gây nhiễm (ngày D0),
tiêm tĩnh mạch amphotericin B liều 1 mg/kg

thể trọng từ D1 đến D7, theo dõi chuột
đến D14.
* Xử lý số liệu: số liệu được xử lý bằng
phần mềm SPSS 16.0.
* Thời gian, địa điểm nghiên cứu:
- Thời gian nghiên cứu: 10 - 2014 đến
7 - 2015.
- Địa điểm nghiên cứu: Labo Nấm, Bộ
môn Ký sinh trùng, Học viện Quân y.
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ
BÀN LUẬN
1. Xây dựng quy trình bệnh nấm hệ
thống do C. albicans.
Bảng 1: Xác định liều nấm C. albicans
thấp nhất gây chết chuột.

60

Chuột

Liều
(TB/chuột)

Tình trạng
sống/chết

Ca1

10.000

Chết

Ca2

10.000

Sống

Ca3

100.000

Chết

Ca4

100.000

Chết

Ca5

500.000

Chết

Ca6

500.000

Chết

Ca7

1.000.0000

Chết

Ca8

1.000.0000

Chết

Ca9

1.500.0000

Chết

Ca10

1.500.0000

Chết

Liều tối thiểu gây chết chuột là 104 TB
C. albicans/chuột.
Gây nhiễm bệnh nấm hệ thống trên
động vật thực nghiệm có thể có nhiều

mục đích khác nhau và có thể áp dụng
mô hình khác nhau. Chúng tôi lựa chọn
mô hình gây nhiễm C. albicans qua đường
tĩnh mạch để tạo bệnh nấm hệ thống
trên chuột không suy giảm miễn dịch,
vì C. albicans là nguyên nhân phổ biến
nhất của bệnh nấm Candida hệ thống và
được nghiên cứu nhiều nhất trên động vật;
chuột nhắt trắng có nhiều ưu điểm như
chi phí thấp, dễ nuôi, điều kiện kỹ thuật
tương đối dễ dàng, dễ mua từ các nhà
cung cấp.
Kết quả tìm được liều chết tối thiểu
của chủng C. albicans là 104 TB/chuột.
Bảng 2: Liều gây chết của C. albicans
(TB/chuột).
Liều

LD10

LD50

LD90

40.000

225.000

750.000

Liều LD10 là 4 x 104; liều LD90 là 7,5 x 105
TB/chuột.
Sau khi lựa chọn được điều kiện thí
nghiệm, cần xác định liều gây nhiễm. Kết
quả tìm LD10 và LD90 của chúng tôi phù
hợp với một số tác giả khác. C. albicans
ATCC 90028 có độc lực khá cao, khi gây


TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 9-2015

nhiễm liều 5 - 6,8 x 105 cfu/chuột trung vị,
thời gian sống của chuột 7 ngày [10].
Graybill và CS (1996) thấy liều LD10 là 2,7 x
104 CFU/chuột [5]. Liều 1 x 106 CFU/chuột
là liều chuẩn (LD90) trong các nghiên cứu
so sánh hiệu lực kéo dài thời gian sống
[4, 10].

cứu đều đánh giá hiệu quả thuốc điều trị
đến mật độ nấm ở thận.

Bảng 3: Mật độ C. albicans tại các
tạng sau gây nhiễm liều LD10 (mean ± SE,
log10 CFU/g, n = 5).
Thời
gian

Thận
(1)

Gan
(2)

Lách
(3)

p1-2;3

x 100 lần
D3

4,52 ± 0,16 3,77 ± 0,10 2,93 ± 0,25

< 0,05

D8

4,06 ± 0,26 2,74 ± 0,19 2,58 ± 0,32

< 0,05

Tại các thời điểm mật độ nấm ở thận
đều cao hơn ở gan, lách.
Kết quả nghiên cứu mật độ nấm tại
một số tạng chuột của chúng tôi phù hợp
với đa số các tác giả: thận là nơi có mật
độ nấm cao nhất. Nghiên cứu của Chin
và CS (2014) cho thấy mật độ nấm ở
phổi, gan giảm rất nhanh (2 logs và 1 log

sau 24 - 168 giờ gây nhiễm), mật độ nấm
ở thận tăng 2 logs từ 24 - 72 giờ và giảm
nhẹ sau 168 giờ [3]. Theo Leunk và CS
(1979), sau khi gây nhiễm nấm C. albicans
vào tĩnh mạch đuôi của chuột, sau 30 phút
thấy nấm tập trung chủ yếu ở phổi (23%),
gan (7,5%), nhưng khi chuột chết, lượng
nấm phân lập được tại thận chiếm tới
98,2% [7]. Nghiên cứu của Odds và CS
(2000) thấy thận là cơ quan có mật độ
nấm C. albicans cao nhất, khoảng 105cfu/g
trong 4 ngày đầu, 106 - 107 (cfu/g) ngày 14.
Tại phổi, gan, lách: 103 ± 105cfu/g ngày 1;
giảm xuống dưới < 100 cfu/g ngày thứ 7
sau gây nhiễm; mật độ C. albicans ở não
chuột thấp [9]. Chính vì lý do mật độ nấm
ở thận cao nhất nên đa số các nghiên

x 400 lần

Hình 1: Nấm C. albicans tại thận (D5) (PAS).

Hình 2: Nấm C. albicans tại gan (D5)
(PAS, x 630 lần).
Các tế bào nấm men nảy chồi, màu
tím đỏ.
61


TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 9-2015

Làm tiêu bản mô bệnh học để đánh giá
tổn thương các tạng cho thấy tại thận,
gan xuất hiện ổ viêm với những tế bào
nấm men, chứng tỏ nấm lan tràn đến
thận, gan. Theo Ashman (1996), tại thận

thấy viêm thận cấp (acute pyelonephritis),
các tế bào nấm men, sợi nhìn rõ ở thận
chuột có biểu hiện viêm nặng, ở chuột
viêm nhẹ không thấy thâm nhiễm tế bào
bạch cầu đa nhân [2].

2. Đánh giá hiệu quả của amphotericin B trong điều trị bệnh nấm hệ thống do
C. albicans.
Bảng 4: Thời gian sống của chuột gây nhiễm Candida albicans liều LD90 và điều trị (ngày).
Trung bình

Trung vị

Thuốc
Ước đoán

Ðộ sai chuẩn (SE)

Ước đoán

Ðộ sai chuẩn (SE)

Amphotericin B

11,74

0,29

13,0

0,57

Chứng

10,31

0,29

11,0

0,45

(p < 0,001)
Biểu đồ 1: Tỷ lệ sống theo thời gian của chuột gây
nhiễm C. albicans liều LD90 và điều trị.
Kết quả nghiên cứu cho thấy amphotericin B có hiệu quả điều trị, thể hiện bằng kéo
dài thời gian sống ở chuột gây nhiễm C. albicans liều LD90 (p < 0,001).
Trong đánh giá hiệu quả của thuốc, 2 chỉ tiêu chính hay sử dụng là tác dụng kéo dài
thời gian sống của động vật khi gây nhiễm liều LD90 và giảm mật độ nấm ở tạng khi
gây nhiễm liều LD10 [4, 6]. Nghiên cứu của chúng tôi tiến hành theo khuyến cáo của một
62

TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 9-2015

số nhà nghiên cứu để đánh giá thời gian sống chuột được gây nhiễm liều LD90%, điều
trị thuốc sau 24 giờ và kéo dài 7 ngày, theo dõi chuột chết trong vòng 2 tuần [6]. Khi sử
dụng đường cong Kaplan-Meier cho thấy sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (p < 0,001).
Bảng 5: Mật độ nấm ở thận sau gây nhiễm C. albicans liều LD10 và điều trị (log10
CFU/g, n = 5).
Thời gian

Thuốc

Mean ± SE

Trung bình

Nhỏ nhất

Cao nhất

D3

Amphotericin B (1)

3,27 ± 0,21

3,30

2,70

3,85

Chứng (2)

4,52 ± 0,16

4,57

3,93

4,86

Amphotericin B (1)

1,57 ± 0,65

2,27

0

2,92

Chứng (2)

4,06 ± 0,26

4,28

3,08

4,49

p1-2

< 0,01

D8

< 0,01

(Non parametric test, Mann-Whitney U test)
Mật độ nấm ở thận chuột sau gây nhiễm C. albicans liều LD10 ở D3 và D8 tiêm
amphotericin B giảm rõ ràng so với nhóm chứng.
Trong nghiên cứu này chúng tôi đánh
giá mật độ nấm ở hai thời điểm giữa đợt
điều trị (D3) và sau khi kết thúc điều trị 24
giờ theo hướng dẫn của Viện Nghiên cứu
Bệnh Dị ứng và Truyền nhiễm Quốc gia
Mỹ (NIAID) [8] và được áp dụng trong
một số nghiên cứu [4, 6].
Kết quả nghiên cứu cho thấy ở cả hai
thời điểm, amphotericin B đều làm giảm
rõ rệt mật độ nấm tại thận, ở D8 một số
chuột không thấy nấm. Nghiên cứu cũng
cho thấy mật độ nấm giảm rõ ràng, có
những chuột không thấy nấm mọc nữa,
nhưng không phải tất cả chuột đều sạch
nấm. Theo một số tác giả, mặc dù thuốc
chống nấm có tác dụng rất nhanh trên in
vitro nhưng không một loại thuốc nào (kể
cả polyene như amphotericin B) làm sạch

nấm hoàn toàn in vivo; có thể do môi
trường in vivo có tác dụng bảo vệ nấm

khỏi thuốc hay thuốc khó tiếp cận nấm gây
bệnh [1].
KẾT LUẬN
- Chúng tôi đã xây dựng được mô hình
chuột thực nghiệm mắc bệnh hệ thống
do C. albicans qua gây nhiễm tĩnh mạch
đuôi chuột không suy giảm miễn dịch.
- Liều tối thiểu C. albicans gây chết là
10 TB/chuột. Liều LD10 là 4 x 104; LD90 là
7,5 x 105 TB/chuột. Tại ngày thứ 3 (D3)
và D8 sau gây nhiễm, mật độ nấm tại
thận là 4,52 và 4,06 log10 CFU/gam, cao
hơn so với mật độ nấm tại gan (3,77 và
2,74 log10 CFU/gam) và lách (2,93 và
2,58 log10 CFU/gam).
4

- Áp dụng mô hình trong đánh giá thấy
amphotericin B có tác dụng kéo dài thời
gian sống của chuột nhiễm liều LD90 và
giảm mật độ nấm ở thận nhiễm liều LD10.
63


TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 9-2015

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Agents and Chemotherapy. 1996, 40 (3),
pp.816-818.

1. Anaissie EJ, McGinnis MR, Pfaller MA,
Anstead GM, Arora A. Clinical Mycology
(second edi.). Elsevier Inc. 2009.

6. Kavanagh K. Medical Mycology: Cellular
and Molecular Techniques. West Sussex, England:
John Wiley & Sons. 2007.

2. Ashman RB, Fulurija A, Papadimitriou JM.
Strain-dependent differences in host response
to Candida albicans infection in mice are related
to organ susceptibility infectious load. Infection
and Immunity. 1996, 64 (5), pp.1866-1869.

7. Leunk RD, Moon RJ. Physiological and
metabolic alterations accompanying systemic
candidiasis in mice. Infect Immun. 1979, 26 (3),
pp.1035-1041.

3. Chin VK, Foong KJ, Maha A, Rusliza B,
Norhafizah M, Chong PP. Multi-step pathogenesis
and induction of local immune response by
systemic Candida albicans infection in an
intravenous challenge mouse model. International
Journal of Molecular Sciences. 2014, 15 (8),
pp.14848-14867. doi:10.3390/ijms150814848.

4. Graybill J. The role of murine models in
the development of antifungal therapy for systemic
mycoses. Drug Resistance Updates. 2000, 3,
pp.364-383. doi:10.1054/drup.2000.0171.
5. Graybill JR, Bocanegra R, Fothergill A,
Rinaldi MG. Bleomycin therapy of experimental
disseminated candidiasis in mice. Antimicrobial

64

8. NIH/NIAID. (n.d.). Standard Operating
Procedure (SOP) Candida albicans Murine
Invasive Candidiasis Model NIH/NIAID Task
Order A13.
9. Odds FC, Nuffel L Van, Gow NA. R.
Survival in experimental Candida albicans
infections depends on inoculum growth conditions
as well as animal host. Microbiology. 2000,
146 (8), pp.1881-1889.
10. Wiederhold NP, Najvar LK, Bocanegra Ra,
Kirkpatrick WR, Patterson TF. Caspofungin
dose escalation for invasive candidiasis due
to resistant Candida albicans. Antimicrobial
Agents and Chemotherapy. 2011, 55 (7),
pp.3254-3260. doi:10.1128/AAC.01750-10.