Xây dựng quy trình PCR điện di phát hiện virut gây hội chứng viêm đường hô hấp cấp trung đông

TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 8-2014

XÂY DỰNG QUY TRÌNH PCR ĐIỆN DI PHÁT HIỆN VIRUT
GÂY HỘI CHỨNG VIÊM ĐƢỜNG HÔ HẤP CẤP TRUNG ĐÔNG
Ngô Tất Trung*; Trần Thị Thu Hiền*; Phan Quốc Hoàn*; Lê Hữu Song*
TÓM TẮT
Đặc điểm lâm sàng của chứng viêm đường hô hấp cấp Trung Đông (Middle East respiratory
syndrome gây ra bởi Middle East respiratory syndrome coronavirus MERS-CoV) dễ nhầm với
hội chứng viêm đường hô hấp cấp (Severe acute respiratory syndrome - SARS). Tại thời điểm
hiện tại, chúng ta chưa có công cụ chẩn đoán phát hiện tác nhân gây bệnh nguy hiểm này.
Thiết lập quy trình PCR điện di phát hiện virut gây hội chứng MERS-CoV. Phần mềm Invitrogene
vector NTI-11.2 và các bệnh phẩm chuẩn âm được thu thập tại Bệnh viện TWQĐ 108. Tổng hợp
cADN phiên mã ngược và PCR điện di một vòng. Kết quả cho thấy bộ mồi SHPT108@MERSCoV-L, SHPT108@MERS-CoV-S hoàn toàn có khả năng phát hiện sự có mặt các đoạn ARN
coronavirus ở mật độ 1 copy ARN virut/1.000 copy ARN đối chứng, đồng thời không tạo ra
băng PCR phụ và không bắt cặp chéo vào các khu vực có tính tương đồng thấp của hệ gen
người. Kết luận: kỹ thuật PCR điện di phát hiện ARN coronavirus đã được thiết kế thành công.
* Từ khóa: Hội chứng viêm đường hô hấp cấp Trung Đông; Betacoronarivus.

ESTABLISH A PCR ASSAY FOR DIAGNOSING MIDDLE EAST
RESPIRATORY SYNDROME BETA-CORONAVIRUS
SUMMARY
Middle East respiratory syndrome is clinically similiar to severe acute respiratory syndrome
(SARS) hence, but the tool to differentiate the two diseases is unavailable at the moment. The
aim of this study is to build up a simple screening procedure for beta-coronavirus (MERS-CoV).
The reverse transcriptase followed by polymerase chain reaction (PCR): Results shown that the
two primer set SHPT108@MERS-CoV-L, SHPT108@MERS-CoV-S were optimized that allow
to detect presence of one betacoronavirus RNA copy out of 1,000 ABL RNA copies without any
mis-amplification from MERS-CoV free samples.
* Key words: Middle East respiratory syndrome; Betacoronavirus.

ĐẶT VẤN ĐỀ

Hội chứng viêm đường hô hấp cấp Trung
Đông (gây ra bởi Middle East respiratory
syndrome coronavirus [MERS-CoV]). Đây
là một ARN betaconarvirus có đặc điểm di
truyền học rất gần với virut gây hội chứng

viêm đường hô hấp cấp (SARS). Virut này
được bác sĩ Ali Moh Zaki - một nhà virut
học người Ai Cập phân lập lần đầu tiên từ
1 bệnh nhân (BN) 60 tuổi suy thận kèm
viêm phổi cấp, BN này sau đó tử vong [1].

* Bệnh viện TWQĐ 108
Người phản hồi (Corresponding): Ngô Tất Trung ()
Ngày nhận bài: 23/05/2014; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 03/07/2014
Ngày bài báo được đăng: 23/09/2014

50


TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 8-2014

Cho đến nay, bộ gen của MERS-CoV
(còn được gọi với tên khác là HCoVEMC/2012) đã được giải trình tự hoàn
toàn, nó bao gồm 30.119 nucleotide và chứa
khoảng 10 khung đọc mở (open reading
frames). Phân tích phả hệ dựa trên gen
coronaviruses replicase cho thấy MERSCoV có đặc điểm di truyền học rất gần với
Tylonycteris bat coronavirus HKU4 (BtCoVHKU4) và Pipistrellus bat coronavirus HKU5
(BtCoV-HKU5) khu trú trên dơi.

Trước kia, người ta cho rằng coronavirus
có khả năng xâm nhiễm vào cả người và
động vật, gây ra các biến chứng không
quá trầm trọng. Tuy nhiên, sự bùng phát
của virut gây hội chứng viêm đường hô
hấp cấp SARS-CoV vào năm 2002 - 2003
và HCoV-EMC/2012 vào năm 2012 cho
thấy coronavirus thật sự có khả năng gây
bệnh nặng, thậm chí gây tử vong cho người
[2]. Theo Cơ quan Kiểm soát bệnh Hoa Kỳ
(Center For Disease Control - CDC), tính
đến tháng 4 năm 2014) đã có 618 BN
dương tính và 192 BN tử vong do MERSCoV, đa số được phát hiện tại các nước
châu Âu và Ả Rập [3]. Đặc biệt, một số
nước châu Á nằm gần Việt Nam như
Malaysia hay Philippines đã ghi nhận
những trường hợp dương tính và tử vong
đầu tiên [7].
Việt Nam chưa ghi nhận trường hợp
nào nhiễm MERS-CoV, tuy nhiên, đây là
chủng virut có độc lực mạnh, có khả năng
lây nhiễm từ người sang người, vì thế,
việc chẩn đoán sớm và chính xác tác nhân
này là điều cần làm. Hơn nữa, chưa có
cơ sở y tế nào công bố thiết lập phương
pháp chẩn đoán chủng virut này.

51

Mục tiêu của nghiên cứu nhằm: Thiết lập

phương pháp PCR phiên mã ngược phát
hiện virut gây hội chứng viêm đường hô
hấp cấp Trung Đông (MERS-CoV).
VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU
1. Vật liệu nghiên cứu.
- Các đoạn ARN mã hóa cho một phần
bộ gen (MERS-CoV), phân lập từ dịch phế
quản BN và được lưu trữ tại Trung tâm Lưu
trữ virut châu Âu (European Virus Archive EVA), do Tiến sỹ Tobias Bleicker tặng Khoa
Sinh học phân tử, Bệnh viện TWQĐ 108.
- Máy Thermocycler Eppendorff (Hamburg,
CHLB Đức).
- Máy chụp hình gel (EC3 imaging
system Mỹ).
- Phần mềm Invitrogene vector NTI-11.2.
- Hóa chất: Tris-base, taq-polymerase,
Trizol (Sigma, Mỹ).
- Các bệnh phẩm huyết thanh dương
tính với HBV, HCV, mẫu cADN bạch cầu
tủy mạn được thu thập tại Bệnh viện TWQĐ
108 và các sinh phẩm chuẩn cho thí nghiệm
sinh học phân tử.
2. Phƣơng pháp nghiên cứu.
Mẫu ARN chuẩn dương và ARN bệnh
phẩm được dùng làm khuôn cho phản
ứng phiên mã ngược tổng hợp cADN bổ
sung. cADN này lại được dùng cho phản
ứng PCR điện di, với 2 cặp mồi đặc hiệu
cho khu vực mã hóa đầu nguồn (upstream

coding region) của HCoV-EMC/2012. Để
tiện cho thảo luận sau này, chúng tôi gọi
đó là bộ mồi SHPT108@MERS-CoV-L và
SHPT108@MERS-CoV-S) với trình tự sau:


TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 8-2014

SHPT108@MERS-CoV-L
UpE-Fwd2

GTGCCTGCAACGCGCGATTCAGTT

UpE-Rev2

GATTAGCCTCTACACGGGACCCATAG
SHPT108@MERS-CoV-S

ORF1b-Fwd

TTCGATGTTGAGGGTGCTCAT

ORF1b-Rev

TCACACCAGTTGAAAATCCTAATTG
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

1. Khả năng phát hiện của bộ mồi SHPT108@MERS-CoV-L và SHPT108@MERSCoV-S.
Theo hướng dẫn chẩn đoán cúm mới nhất do Tổ chức Y tế Thế giới ban hành, để khẳng
định sự tồn tại của một chủng virut cúm trong mẫu bệnh phẩm, cần thực hiện 2 phản

ứng PCR với 2 mồi khác biệt. Vì thế, chúng tôi thiết kế và thử nghiệm hai cặp mồi khác
nhau SHPT108@MERS-CoV-L, SHPT108@MERS-CoV-S bắt vào 2 khu vực của HCoVEMC/2012. Kết quả điện di cADN không xuất hiện các băng phụ (sản phẩm cADN)
không đặc hiệu. Điều này khẳng định tính đặc hiệu của bộ mồi do chúng tôi sử dụng.

Hình 1: Khả năng phát hiện của bộ mồi dùng trong chẩn đoán HCoV-EMC/2012.
2. Tính chất đặc hiệu của trình tự gen do bộ mồi chẩn đoán khuếch đại.

Hình 2: Tính chất đặc hiệu của trình tự gen do bộ mồi chẩn đoán khuếch đại.

52


TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 8-2014

Để khẳng định bộ mồi do chúng tôi sử

Phản ứng PCR điện di sử dụng bộ mồi

dụng (SHPT108@MERS-CoV-L) không

SHPT108@MERS-CoV-L hoàn toàn có khả

những cho kích thước đúng với thiết kế

năng phát hiện vật liệu di truyền ARN

mà trình tự cũng tương đồng với thông tin

coronavirus ở mức 1 copy ARN virut/1.000

về coronavirus được lưu trữ trên Ngân hàng

ARN người khỏe mạnh.

Gen, chúng tôi tiến hành giải trình tự đoạn
amplicon do bộ mồi SHPT108@MERS-CoV-L

BÀN LUẬN

khuếch đại. Kết quả cho thấy, phổ sắc ký

Việc chẩn đoán các virut cúm như H5N1,

giải trình tự rõ ràng (hình 2, panel trên) và

H7N9, H8N10 đòi hỏi xét nghiệm định danh ở

trình tự thu được có tính tương đồng gần

mức độ phân tử. Riêng betacoronavirus là

như tuyệt đối so với trình tự gen coronavirus

một chủng virut đặc biệt nguy hiểm lây từ

lưu trữ trên Ngân hàng NCBI (hình 2, panel

lạc đà hoặc dơi sang người [4], chủng virut

giữa và panel dưới).

này gây các triệu chứng lâm sàng rất giống

3. Ngƣỡng phát hiện của PCR.
Để xác định mật độ tối thiểu số bản copy
ARN coronavirus mà tại đó xét nghiệm của
chúng tôi có khả năng phát hiện được, tiến
hành pha loãng đoạn ARN mã hóa cho gen
Upstream coding region vào ARN tổng số tách
được từ người khỏe mạnh ở những nồng độ
khác nhau, sau đó tiến hành tách ARN tổng
số dùng làm khuôn cho phản ứng phát hiện
coronavirus. Kỹ thuật này nhằm tạo sản
phẩm chứa ARN virut có nồng độ gần
tương đồng khi BN nhiễm virut trên thực tế
lâm sàng.

hội chứng SARS. Tuy nhiên, ở nước ta chưa
có cơ sở y tế nào công bố các công cụ chẩn
đoán chủng virut nguy hiểm này [5].
Thông thường, để phát hiện khẳng định
một tác nhân gây bệnh mới, người ta phải
khuếch đại đoạn gen đặc hiệu, sau đó tiến
hành giải trình tự và so sánh với trình tự đã
biết trên ngân hàng gen. Cách làm này chỉ
phù hợp với những nghiên cứu khám phá
chứ không phù hợp với quy trình chẩn đoán
bệnh thường quy, do hội chứng viêm đường
hô hấp do virut cúm bao gồm cả virut SARS
và betacoronavirus thường có diễn biến cấp,

BN được can thiệp và cách ly sớm, hạn chế
nguy cơ lan rộng dịch ra cộng đồng. Vì vậy,
để đạt được mục tiêu đó, việc chẩn đoán
nhanh và chính xác betacoronavirus rất
cần thiết. Cho đến nay, các quy trình
chẩn đoán virut cúm nói chung như
H1N1, H5N1, H7N9 đều hướng đến việc
khuếch đại và phát hiện ít nhất 2 gen đích,
việc chẩn đoán betacoronavirus cũng không
nằm ngoại lệ. Trung tâm Lưu trữ virut châu

Hình 3: Khả năng phát hiện ARN virut hòa
loãng trong ARN người.

53

Âu là tổ chức đầu tiên chuẩn hóa phương


TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 8-2014

pháp RT-PCR sử dụng đồng thời 2 gen

thể nhiễm MERS-CoV nào, vì thế, để kiểm

đích upE và open read-ing frame (ORF) 1b

chứng phương pháp, chúng tôi cần nhiều

gen làm đích phân tử [6]. Hơn nữa, do MERS-

hơn nữa sự hợp tác với các trung tâm ngoại

CoV là một chủng virut mới bùng phát, nên

kiểm có uy tín của thế giới.

ngoài phương pháp do Trung tâm Lưu trữ
virut châu Âu đề xuất, các cơ quan kiểm
dịch quan trọng khác trên thế giới như Tổ
chức Y tế Thế giới, Cơ quan Kiểm soát
bệnh Hoa Kỳ (CDC) chưa có khuyến cáo chi
tiết về một phương pháp xét nghiệm cụ thể
ở mức độ phân tử cho chủng virut độc này.
Vì thế, Khoa Sinh học Phân tử, Bệnh viện
TWQĐ 108 đã tiến hành hợp tác với EVA.

KẾT LUẬN
Kỹ thuật RT-PCR với bộ mồi SHPT108
@MERS-CoV-L, SHPT108@MERS-CoV-S
có khả năng phát hiện được ARN coronavirrus ở
mật độ 1 copy virut/1.000 copy ARN tổng số
người khỏe mạnh. Kết quả thực nghiệm
không tạo ra sản phẩm cADN phụ và không
bắt cặp chéo vào các khu vực có tính tương
đồng thấp của hệ gen người.

Thông qua sự hợp tác này, 2 đoạn ARN mã

TÀI LIỆU THAM KHẢO

hóa 2 gen đích upE và open reading frame

1. Zaki AM et al. Isolation of a novel
coronavirus from a man with pneumonia in Saudi
Arabia. N Engl J Med. 2012, 367 (19), pp.18141820.

(ORF) 1b gen đã được chuyển về Việt Nam
an toàn, từ đây chúng tôi đã thiết lập được
quy trình chẩn đoán betacoronavirus với độ
nhạy kỹ thuật 1 copy ARN virut/1.000 copy
ARN người khỏe mạnh (chúng tôi đã lặp lại
ngưỡng này 91/95 lần thử nghiệm). Đặc
biệt, ngay cả khi mẫu bệnh phẩm có nồng
độ ARN MERS-CoV hoặc thậm chí không
có

MERS-CoV

SHPT108@MERS-CoV

ARN

bộ
cũng

mồi
không

khuyếch đại bất đặc hiệu các đoạn gen

người (từ 30 mẫu bệnh phẩm bạch cầu tủy
mạn) hoặc đoạn gen ARN virut khác như
HCV (50 mẫu), H1N1 (15 mẫu). Điều này
thể hiện tính đặc hiệu cao của bộ mồi
SHPT108@MERS-CoV. Tuy nhiên, đến
nay Việt Nam chưa gặp trường hợp BN có

54

2. Van Boheemen S et al. Genomic
characterization of a newly discovered
coronavirus associated with acute respiratory
distress syndrome in humans. MBio. 2012, 3
(6).
3. Assiri A et al. Hospital outbreak of Middle
East respiratory syndrome coronavirus. N Engl J
Med. 2013.
4. Azhar EI et al. Evidence for camel-tohuman transmission of MERS coronavirus.
N Engl J Med. 2014.
5. Hui DS, ZA Memish, A Zumla. Severe
acute respiratory syndrome vs. the Middle
East respiratory syndrome. Curr Opin Pulm
Med. 2014.
6. Palm D et al. Laboratory capability for
molecular detection and confirmation of novel
coronavirus in Europe. November 2012. Euro
Surveill. 2012, 17 (49).