Xác định 4 tổ hợp gen AML1/ETO, PML/RARA, CBFB/MYH11, MLL/AF9 trong bạch cầu cấp dòng tủy tại Bệnh viện Truyền máu Huyết học Thành phố Hồ Chí Minh

Nghiên cứu Y học

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 4 * 2011

XÁC ĐỊNH 4 TỔ HỢP GEN AML1/ETO, PML/RARA, CBFB/MYH11, MLL/AF9
TRONG BẠCH CẦU CẤP DÒNG TỦY TẠI BỆNH VIỆN TRUYỀN MÁU
HUYẾT HỌC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
Phan Nguyễn Thanh Vân*, Nguyễn Tấn Bỉnh*, Nguyễn Thị Kim Định*, Phan Thị Xinh**

TÓM TẮT
Mục tiêu nghiên cứu: Xác định 4 tổ hợp gen AML1/ETO, PML/RARA, CBFB/MYH11, MLL/AF9 trong
bạch cầu cấp dòng tủy (BCCDT).
Phương pháp nghiên cứu: Mô tả cắt ngang. Sử dụng phản ứng khuếch đại gen phiên mã ngược với mồi
thiết kế có thể phát hiện được tất cả các kiểu bản sao của mỗi tổ hợp gen. Nghiên cứu được tiến hành trên bệnh
nhân BCCDT tại Bệnh viện Truyền máu Huyết học TP.HCM từ ngày 01 tháng 03 năm 2010 đến 31 tháng 7
năm 2011.
Kết quả: 19 bệnh nhân (BN) biểu hiện AML1/ETO (11,7%), 11 BN biểu hiện PML/RARA (6,8%), 7 BN
biểu hiện CBFB/MYH11 (4,3%), và 4 BN biểu hiện MLL/AF9 (2,5%), trong số 162 BN BCCDT.
Kết luận: Kỹ thuật RT-PCR đơn giản, có độ nhạy cao nên được triển khai tại các cơ sở chuyên khoa Huyết
học tại Việt Nam để giúp phát hiện nhanh các chuyển vị NST thường gặp không những trong BCCDT mà còn
trong các bệnh lý máu ác tính khác.
Từ khóa: Bạch cầu cấp dòng tủy (BCCDT), Phản ứng khuếch đại gen phiên mã ngược (RT-PCR: Reverse
Transcriptase Polymerase Chain Reaction).

ABSTRACT
DETECTION OF 4 FUSION GENES: AML1/ETO, PML/RARA, CBFB/MYH11, MLL/AF9 IN ACUTE
MYELOID LEUKEMIA PATIENTS AT BLOOD TRANSFUSION HEMATOLOGY HOSPITAL HO CHI
MINH CITY
Phan Nguyen Thanh Van, Nguyen Tan Binh, Nguyen Thi Kim Dinh, Phan Thi Xinh
* Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 15 - Supplement of No 4 - 2011: 498 - 502
Objective: To detect 4 fusion genes AML1/ETO, PML/RARA, CBFB/MYH11, MLL/AF9 in Acute

Myeloid Leukemia (AML) patients.
Method: Case series - descriptive research. Using RT-PCR (reverse transcriptase-polymerase chain reaction)
with primer sets that can amplify all possible transcripts of each fusion gene. From March 01, 2010 to July 31,
2011, we analysed Acute Myeloid Leukemia patients at Blood Transfusion Hematology Hospital.
Results: 19 patients expressing AML1/ETO (11.7%), 11 patients expressing PML/RARA (6.8%), 7
patients expressing CBFB/MYH11 4.3%), and 8 patients expressing MLL/AF9 (2.5%), among 162 newly
diagnosed patients with AML.
Conclusion: RT-PCR is simple and highly sensitive technique that should apply to detect the frequent
chromosome translocations not only in AML but also in other hematologic malignancies in hematology centers in
Vietnam.
* Bệnh Viện Truyền Máu Huyết Học Thành Phố Hồ Chí Minh
** Đại Học Y Dược Thành Phố Hồ Chí Minh
Tác giả liên lạc: ThS. BS. Phan Nguyễn Thanh Vân

ĐT: 0919.691.770

Email:



498

Chuyên Đề Truyền Máu Huyết Học


Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 4 * 2011

Nghiên cứu Y học

Keywords: Acute Myeloid Leukemia (AML), Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction (RT-PCR).

ĐẶT VẤN ĐỀ

Phương pháp

Cho đến nay, các bất thường về nhiễm sắc
thể (NST) liên quan chặt chẽ với bệnh lý ác tính
hệ tạo máu và là chỉ điểm quan trọng trong việc
chẩn đoán và tiên lượng bệnh(11). Khảo sát
những bất thường về NST và đột biến gen lúc
chẩn đoán là yếu tố tiên lượng độc lập đối với
đáp ứng điều trị và thời gian sống còn của bệnh
nhân (BN). Việc phân nhóm nguy cơ theo di
truyền tế bào khác nhau giữa nhóm BN trẻ tuổi
và nhóm ≥ 60 tuổi và những bất thường NST
mắc phải hiện diện trong tế bào ung thư máu
của hầu hết bệnh nhân BCCDT.

Mẫu máu hoặc mẫu tủy được ly trích RNA
sử dụng Sepazol-I (Nacalai Tesque Inc., Nhật
Bản) theo qui trình kỹ thuật do công ty cung
cấp. Sau khi ly trích RNA, cDNA được tổng hợp
bằng cách sử dụng kít iScript cDNA synthesis
(Công ty Biorad, Mỹ), tuân thủ qui trình kỹ
thuật của công ty.

Một số chuyển vị NST tạo ra những tổ hợp
gen đặc trưng trong bệnh BCCDT như
AML1/ETO,
PML/RARA,

CBFB/MYH11,
MLL/AF9 của 4 chuyển vị nhiễm sắc thể
t(8;21)(q22;q22)(1,15,16,17),
t(15;17)(q22;q11)(2,5,6,8),
(4,7,13)
inv(16)(p13;q22)
, và t(9;11)(p21-22;q23)(3,10,14),
tương ứng.
Từ đầu năm 2010 đến nay, Bệnh viện Truyền
máu Huyết học TP. HCM đã sử dụng phương
pháp RT-PCR để khảo sát bộ 4 tổ hợp gen
thường gặp là AML1/ETO, PML/RARA,
CBFB/MYH11, MLL/AF9 trong BCCDT ngay lúc
chẩn đoán. Với phương pháp này, kết quả sẽ
được xác định trong vòng 1 tuần góp phần phân
nhóm tiên lượng vào ngày thứ 8 của phác đồ
điều trị, giúp lựa chọn hướng điều trị phù hợp
cho từng bệnh nhân.

ĐỐI TƯỢNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Thiết kế nghiên cứu

Thành phần phản ứng PCR gồm có 1 μL
cDNA được trộn với 0,1 μL (0,5 U) iTaq
Polymerase (Biorad), 1 μL (10 pmol) cặp mồi
xuôi và ngược trong 20 μL hỗn hợp. Để khuếch
đại bộ 4 tổ hợp gen AML1/ETO, PML/RARA,
CBFB/MYH11, MLL/AF9, 4 mồi cho mỗi tổ hợp
gen được sử dụng. Riêng đối với những tổ hợp
gen cần được khảo sát qua hai giai đoạn thì

phản ứng PCR lần thứ hai sử dụng 1 μL sản
phẩm của phản ứng PCR lần thứ nhất làm mạch
khuôn. Nhiệt độ bắt cặp và thời gian phản ứng
có thể thay đổi tùy theo từng loại tổ hợp gen,
cặp mồi, tùy theo từng trường hợp cụ thể. Phản
ứng PCR được thực hiện bằng cách sử dụng
máy luân nhiệt iCycler (Công ty Biorad).
Sản phẩm của phản ứng PCR được điện di
trên thạch 2% chứa 0,5 μg/mL ethidium bromide
trong 0,5 x TBE, quan sát bằng hệ thống Gel Doc
EQ (Công ty Biorad). Kết quả dương tính nếu
như biểu hiện kích thước băng tương ứng các
cặp mồi được mô tả trong bảng 1(18). Kết quả
được xử lý bằng phần mềm Excell và Medicalc.
Bảng 1: Danh sách các đoạn mồi khảo sát 4 tổ hợp
gen trong BCCDT
STT Tên mồi Trình tự nucleotide

Mô tả loạt ca.

Đối tượng
Nghiên cứu được tiến hành trên 162 bệnh
nhân BCCDT tại Bệnh viện Truyền máu Huyết
học TP.HCM từ ngày 01 tháng 03 năm 2010 đến
31 tháng 7 năm 2011. Bệnh nhân mới được chẩn
đoán xác định bệnh bạch cầu cấp dòng tủy, dựa
vào huyết đồ, tủy đồ và dấu ấn miễn dịch tế bào.

Chuyên Đề Truyền Máu Huyết Học

1

2
3
4

Tên gen và kích
thước sản phẩm

5' CTA CCG CAG
AML1-A CCA TGA AGA ACC
AML1/ETO
3'
AML1 exon 5/ ETO
5' AGA GGA AGG
exon 2: 395 bp
ETO-B CCC ATT GCT GAA
3'
5' AGC GCG ACT
PML/RARA
PML-C2
ACG AGG AGA T 3' Type bcr1: 688 bp
5' CTG CTG CTC
Type bcr2: 652 bp
RARA-D
TGG GTC TCA AT 3' Type bcr3: 289 bp

499

Nghiên cứu Y học

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 4 * 2011

STT Tên mồi Trình tự nucleotide
5

CBFB-C

6

MYH11D2

7

MLL-F1

8

AF9-R1

9

MLL-F2

10

AF9-R2

Tên gen và kích

thước sản phẩm

5' GGG CTG TCT
GGA GTT TGA TG 3' CBFB/MYH11
Type A: 271 bp
5' CTT GAG CGC
CTG CAT GTT 3'
5' CCA GAG CAG
AGC AAA CAG AAA
A 3'
MLL/AF9
5' CGA TCT GCT
GCA GAA TGT GTC MLL exon 9/ AF9
3'
exon 5: 468bp
5' CCG CCC AAG MLL exon 10/ AF9
TAT CCC TGT A 3'
exon 4: 645 bp
5' GTA TGC CTT
GTC ACA TTC ACC
A 3'

KẾT QUẢ
Từ 01/03/2010 đến 31/07/2011, 162 bệnh nhân
BCCDT đã được chọn vào nhóm nghiên cứu, để
xác định 4 tổ hợp gen nêu trên. Tuổi trung vị là
35,5 tuổi, giá trị bách phân thứ 25 (25%) là 16 và
giá trị bách phân thứ 75 (75%) là 46. Trong đó,
tuổi trung vị của giới nam là 39, của giới nữ là
31,5. Sự phân bố tuổi được thể hiện ở bảng 2.

Bảng 2: Sự phân phối nhóm bệnh BCCDT theo tuổi
Nhóm tuổi
Dưới 15 tuổi
Từ 15 đến dưới 30 tuổi
Từ 30 đến dưới 45 tuổi
Từ 45 đến dưới 60 tuổi
Từ 60 tuổi trở lên
Tổng số

Số lượng
36
35
39
40
12
162

Tỉ lệ%
22,2%
21,6%
24,1%
24,7%
7,4%
100,0%

Tỉ lệ nam (51,9%) và nữ (48,1%) gần như
tương đồng nhau. Chẩn đoán tủy đồ chiếm đa
số là M2 (61,1%); kế tiếp, M3 (14,2%), M4 (12,3%)
(Bảng 3).
Bảng 3: Sự phân phối nhóm bệnh BCCDT theo chẩn

đoán tủy đồ
Chẩn đoán
M0
M1
M2
M3
M4
M5
M6
M7
Tổng số

500

Số lượng
3
5
99
23
20
3
7
2
162

Tỉ lệ%
1,9%
3,1%
61,1%
14,2%

12,3%
1,9%
4,3%
1,2%
100,0%

Kết quả xác định gen được mô tả trong bảng
4. Trong đó, nhóm tiên lượng tốt (AML1/ETO,
PML/RARA, CBFB/MYH11) chiếm tỉ lệ 22,8%,
nhóm còn lại chiếm tỉ lệ 77,2%.
Bảng 4: Kết quả 4 tổ hợp gen trong BCCDT
Loại gen
AML1/ETO
PML/RARA
CBFB/MYH11
MLL/AF9
Không biểu hiện gen
Tổng số

Số lượng
19
11
7
4
121
162

Tỉ lệ%
11,7%
6,8%

4,3%
2,5%
74,7%
100,0%

Chẩn đoán tủy đồ và dấu ấn miễn dịch tế
bào có liên quan với tổ hợp gen (Bảng 5, 6, 7
và 8).
Bảng 5: Phân phối nhóm bệnh BCCDT theo chẩn
đoán tủy đồ và tổ hợp gen (P < 0,0001)
Loại gen
Không
AML1/
CBFB/M MLL/A
PML/RARA
biểu hiện Tổng số
ETO
YH11
F9
gen
M0
0
0
0
0
3
3 (1,9%)
M1
0
0

0
0
5
5 (3,1%)
M2
17
0
4
1
77
99 (61,1%)
M3
0
11
0
1
11
23 (14,2%)
M4
2
0
3
0
15
20 (12,3%)
M5
0
0
0
2

1
3 (1,9%)
M6
0
0
0
0
7
7 (4,3%)
M7
0
0
0
0
2
2 (1,2%)
19
11
7
4
121
Tổng số (11,7%
162
(6,8%)
(4,3%) (2,5%) (74,7%)
)
Chẩn
đoán

Bảng 6: Phân phối nhóm bệnh BCCDT, thể M2 và tổ

hợp gen AML1/ETO (P = 0,0143)
Tổ hợp gen
AML1/ETO +
AML1/ETO Tổng số

Chẩn đoán
Không phải
M2
Tổng số
M2
17
2
19 (11,7%)
82
61
143 (88,3%)
99
63
162
(61,1%)
(38,9%)

Bảng 7: Phân phối nhóm bệnh BCCDT, thể M2 và tổ
hợp gen PML/RARA (P = 0,0001)
Tổ hợp gen
PML/RARA +
PML/RARA Tổng số

Chẩn đoán
M2

Không phải M2 Tổng số
0
11
11 (6,8%)
99
52
151 (93,2%
)
99 (61,1%) 63 (38,9%)
162

Chuyên Đề Truyền Máu Huyết Học


Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 4 * 2011
Bảng 8: Phân phối nhóm bệnh BCCDT, thể M3 và tổ
hợp gen PML/RARA (P < 0,0001)
Tổ hợp gen
Chẩn đoán
M3
Không phải M3
Tổng số
11
0
11 (6,8%)
PML/RARA +
12
139
151 (93,2%)
PML/RARA Tổng số

23 (14,2%)
139 (85,8%)
162

BÀN LUẬN
Đối với BCCDT, những bất thường NST
lúc chẩn đoán có ý nghĩa tiên lượng rất rõ
ràng. Có 4 kiểu chuyển vị NST thường gặp
trong
BCCDT
là
t(8;21)(q22;q22),
t(15;17)(q22;q11),
inv(16)(p13;q22),
và
t(9;11)(p21-22;q23) tạo ra 4 kiểu tổ hợp gen là
AML1/ETO,
PML/RARA,
CBFB/MYH11,
MLL/AF9 tương ứng. Trong 4 chuyển vị NST
trên, thì t(8;21)(q22;q22), t(15;17)(q22;q11),
inv(16)(p13;q22) thuộc nhóm tiên lượng tốt,
và t(9;11)(p21-22;q23) hay không có chuyển vị
NST thuộc nhóm tiên lượng trung bình.
Từ 01/03/2010 đến 31/07/2011, khảo sát 162
bệnh nhân (BN) BCCDT mới chẩn đoán bằng
kỹ thuật RT-PCR, chúng tôi phát hiện 19 BN
biểu hiện AML1/ETO (11,7%), 11 BN biểu hiện
PML/RARA (6,8%), 7 BN biểu hiện
CBFB/MYH11 (4,3%), và 4 BN biểu hiện

MLL/AF9 (2,5%) (Bảng 4). Trong nghiên cứu
này, chỉ với kỹ thuật RT-PCR, chúng tôi đã
phát hiện được 41 bệnh nhân có mang 4 kiểu
tổ hợp gen thường gặp trên, chiếm tỷ lệ 25,3%
giúp phân nhóm tiên lượng được bệnh nhân
BCCDT. Trong đó, nhóm tiên lượng tốt
(AML1/ETO,
PML/RARA,
CBFB/MYH11)
chiếm tỉ lệ 22,8%, tỉ lệ này tương đương với
nghiên cứu của United Kingdom Medical
Research Council (MRC-10). Nhóm còn lại
chiếm tỉ lệ 77,2% có biểu hiện MLL/AF9 hay
không biểu hiện tổ hợp gen nào trong số 4 tổ
hợp gen khảo sát, tuy nhiên chúng ta chưa thể
loại trừ bất thường nhiễm sắc thể (NST) khác
nên không xếp vào nhóm tiên lượng trung
bình được.
Điều đó cho chúng ta thấy được vai trò quan
trọng của NST đồ trong phân nhóm tiên lượng

Chuyên Đề Truyền Máu Huyết Học

Nghiên cứu Y học

BCCDT, các kỹ thuật di truyền phân tử hiện đại
như FISH hoặc RT-PCR cũng chỉ hỗ trợ chứ
không thể thay thế hoàn toàn NST đồ. Tuy
nhiên, kỹ thuật RT-PCR có nhiều ưu điểm trong
việc khảo sát bộ 4 tổ hợp gen thường gặp của

BCCDT, trong thời gian ngắn nhất (trong vòng
24 giờ), có ý nghĩa tiên lượng cũng như định
hướng điều trị. Tiêu biểu như phát hiện t(15;17)
và tổ hợp gen PML/RARA đóng góp rất lớn
trong việc quyết định điều trị bằng ATRA; cũng
như là cơ sở cho chẩn đoán, theo dõi điều trị và
tiên lượng.
Trong nghiên cứu của chúng tôi, có mối liên
quan giữa chẩn đoán tủy đồ và tổ hợp gen (P <
0,0001 - Bảng 5), cụ thể liên quan có ý nghĩa
thống kê (P < 0,05) giữa chẩn đoán BCCDT thể
M2 và gen AML1/ETO (Bảng 6), thể M2 và gen
PML/RARA (Bảng 7), thể M3 và gen PML/RARA
(Bảng 8). Nói cách khác, tổ hợp gen PML/RARA
thường gặp ở BCCDT thể M3 và không gặp ở
BCCDT thể M2 cũng như các thể khác; trong khi
đó tổ hợp gen AML1/ETO thường gặp ở BCCDT
thể M2. Điều này góp phần cho hướng chẩn
đoán chính xác các thể bệnh BCCDT.
Gần đây, có nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng
do sự xuất hiện những đột biến gen hoặc những
thay đổi về biểu hiện của một gen nào đó đã ảnh
hưởng trực tiếp đến tiên lượng của bệnh nhân.
Điều này được ghi nhận trên cả bệnh nhân
BCCDT người lớn lẫn trẻ em(9,12). Có mối tương
quan giữa kiểu gen được quy định bởi các đột
biến trên với dự hậu điều trị hay nguy cơ tái
phát ở BN được chẩn đoán BCCDT có kết quả di
truyền học bình thường. Trong tương lai, ngoài
các kỹ thuật NST đồ, FISH và RT-PCR đã thiết

lập điều kiện và ứng dụng thành công vào chẩn
đoán các bất thường NST, chúng ta cần triển
khai khảo sát các đột biến gen trên để phân
nhóm tiên lượng chính xác hơn nữa cho nhóm
bệnh nhân có NST đồ bình thường hoặc những
bệnh nhân cấy NST không mọc. Đồng thời,
cũng cần triển khai RQ-PCR để định lượng số
bản sao của những tổ hợp gen để theo dõi đáp
ứng chính xác hơn trong quá trình điều trị. Đó
là một công việc lớn cần nhiều thời gian và kinh

501


Nghiên cứu Y học

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 4 * 2011

phí vì liên quan đến nhiều gen và nhiều tổ hợp
gen.

7.

Đây là nghiên cứu đầu tiên khảo sát bộ 4 tổ
hợp gen AML1/ETO, PML/RARA, CBFB/MYH11,
MLL/AF9 trên người Việt Nam. Chúng tôi đã
chuẩn hóa thành công và đang sử dụng các kỹ
thuật trên một cách thường quy trong khảo sát
những bất thường NST và gen cho những bệnh
nhân BCCDT tại Bệnh viện Truyền máu Huyết

học TP. Hồ Chí Minh.

8.

KẾT LUẬN
Kỹ thuật RT-PCR phát hiện 4 tổ hợp gen
thường gặp trong BCCDT một cách nhanh
chóng, có độ nhạy và độ đặc hiệu cao, góp phần
cho hướng chẩn đoán chính xác các thể bệnh
BCCDT, giúp phân nhóm tiên lượng chính xác
góp phần nâng cao chất lượng và hiệu quả điều
trị. Kỹ thuật đơn giản nên có thể dễ dàng triển
khai trong những phòng xét nghiệm sinh học
phân tử của chuyên ngành Huyết học.

9.

10.

11.

12.

13.

14.

TÀI LIỆU THAM KHẢO
1.

2.

3.

4.

5.

6.

502

Asou H, Tashiro S, Hamamoto K, et al. (1991). Establishment of
a human acute myeloid leukemia cell line (Kasumi-1) with 8;21
chromosome translocation. Blood, 77 (9): 2031-2036.
Borrow J, Goddard AD, Sheer D, et al. (1990). Molecular analysis
of acute promyelocytic leukemia breakpoint cluster region on
chromosome 17. Science, 249 (4976): 1577-1656.
Cavazzini F, Bardi A, Tammiso E, et al. (2006). Validation of an
interphase fluorescence in situ hybridization approach for the
detection of MLL gene rearrangements and of the MLL/AF9
fusion in acute myeloid leukemia. Haematologica, 91 (3): 381385.
Claxton DF, Liu P, Hsu HB, et al. (1994). Detection of fusion
transcripts generated by the inversion 16 chromosome in acute
myelogenous leukemia. Blood, 83 (7): 1750-1755.
de Thé H, Chomienne C (1990). The t(15;17) translocation of
acute promyelocytic leukemia fuses the retinoic acid receptor α
gene to a novel transcribed locus. Nature, 347: 558-561.
Lemons RS, Eilander D (1990). Cloning and characterization of
the t(15;17) translocation breakpoint region in acute

promyelocytic leukemia. Genes Chromosome Cancer, 2: 79-87.

15.

16.

17.

18.

Liu PP, Tarle SA, Hajra A (1993). Fusion between transcription
factor CBFβ/PEBP2β and a myosin heavy chain in acute myeloid
leukemia. Science, 261: 1041-1044.
Longo L, Pandolfi PP (1990). Rearrangements and aberrant
expression of the RARa gene in acute promyelocytic leukemias. J
Exp Med, 172: 1571-1575.
Mrozek K, Marcucci G, Paschka P, et al. (2007). Clinical relevance
of mutations and gene-expression changes in adult acute
myeloid leukemia with normal cytogenetics: are we ready for a
prognostically prioritized molecular classification? Blood, 109 (2):
431-478.
Muller CI, Trepel M, Kunzmann R, et al. (2004). Hematologic
and molecular spontaneous remission following sepsis in acute
monoblastic leukemia with translocation (9;11): a case report and
review of the literature. Eur J Haematol, 73 (1): 62-67.
Raimondi CS (2006). Cytogenetics of acute leukemias. In: PUI
(Eds.). Childhood Leukemias, 2nd edition: 235-237. Cambrigde
University Press, UK.
Shimada A, Taki T, Tabuchi K, et al. (2008). Tandem
duplications of MLL and FLT3 are correlated with poor

prognoses in pediatric acute myeloid leukemia: a study of the
Japanese childhood AML Cooperative Study Group. Pediatr
Blood Cancer, 50 (2): 264-272.
Shurtleff SA, Meyers S, Hiebert SW, et al. (1995). Heterogeneity
in CBF beta/MYH11 fusion messages encoded by the
inv(16)(p13q22) and the t(16;16)(p13;q22) in acute myelogenous
leukemia. Blood, 85 (12): 3695-4397.
Strissel PL, Strick R, Tomek RJ, et al. (2000). DNA structural
properties of AF9 are similar to MLL and could act as
recombination hot spots resulting in MLL/AF9 translocations
and leukemogenesis. Hum Mol Genet, 9 (11): 1671-1679.
Tighe JE, Calabi F (1994). Alternative, out-of-frame runt/MTG8
transcripts are encoded by the derivative (8) chromosome in the
t(8;21) of acute myeloid leukemia M2. Blood, 84 (7): 2115-2135.
Tighe JE, Daga A, Calabi F (1993). Translocation breakpoints are
clustered on both chromosome 8 and chromosome 21 in the
t(8;21) of acute myeloid leukemia. Blood, 81 (3): 592-597.
van de Locht L. T., Smetsers T. F., Wittebol S., et al. (1994).
Molecular diversity in AML1/ETO fusion transcripts in patients
with t(8;21) positive acute myeloid leukaemia. Leukemia, 8 (10):
1780-1783.
van Dongen JJ, Macintyre EA, Gabert JA, et al. (1999).
Standardized RT-PCR analysis of fusion gene transcripts from
chromosome aberrations in acute leukemia for detection of
minimal residual disease. Report of the BIOMED-1 Concerted
Action: investigation of minimal residual disease in acute
leukemia. Leukemia, 13 (12): 1901-1928.

Chuyên Đề Truyền Máu Huyết Học

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 4 * 2011

Nghiên cứu Y học

KHẢO SÁT SỰ MẤT ĐOẠN 13q14 VÀ 17p13
TRÊN BỆNH NHÂN BẠCH CẦU MẠN DÒNG LYMPHÔ
Trần Thị Trúc Thanh*, Lê Nguyễn Kim Dung*, Phan Thị Xinh**

TÓM TẮT
Mục tiêu: Khảo sát sự mất đoạn nhiễm sắc thể (NST) 13q14 và 17p13 trên bệnh nhân bệnh bạch cầu mạn
dòng lymphô (BCMDL).
Phương pháp: Kỹ thuật lai tại chỗ phát huỳnh quang (FISH) được sử dụng để phát hiện những bất thường
NST này.
Kết quả: Trong 5 ca được khảo sát, chúng tôi phát hiện 3 ca có sự mất đoạn 13q14 và 1 ca có sự mất đoạn
17p13. Trong đó 1 ca vừa có mất đoạn 13q14, vừa có mất đoạn 17p13.
Kết luận: Kỹ thuật FISH thực hiện trên những tế bào bạch cầu ở kỳ trung gian có khả năng phát hiện sự
mất đoạn NST 13q14 và 17p13 một cách chính xác và nhanh chóng so với kỹ thuật phân tích NST đồ. Đây là
một trong những yếu tố tiên lượng quan trọng giúp dự đoán thời gian diễn tiến bệnh và thời gian sống toàn bộ ở
bệnh BCMDL.
Từ khóa: Bạch cầu mạn dòng lymphô, mất đoạn 13q14, mất đoạn 17p13.

ABSTRACT
DETERMINING THE DELETION OF 13q14 AND 17p13 IN PATIENTS WITH CHRONIC
LYMPHOCYTIC LEUKEMIA
Tran Thi Truc Thanh, Le Nguyen Kim Dung, Phan Thi Xinh
* Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 15 - Supplement of No 4 - 2011: 503 - 506
Objective: To detect the deletion of 13q14 and 17p13 in patients with chronic lymphocytic leukemia (CLL).
Methods: Florescence in situ hybridiztion (FISH) technique was used to identify these chromosomal
abnormalities.

Results: There are 5 cases which were examined. The deletion in chromosome band 13q14 was detected in 3
of 5 cases. There is 1 case which has the deletion of both 13q14 and 17p13.
Conclusion: In comparision with metaphase karyotyping, the interphase FISH can detect the deletion in
chromosome band 13q14 and 17p13 more accurately and quickly. These chromosomal abnormalities are
significant prognostic factors which are useful for predicting time to progression and overall survival in CLL.
Keywords: chronic lymphocytic leukemia (CLL), deletion of 13q14, deletion of 17p13.
Diễn biến lâm sàng của bệnh BCMDL rất đa
ĐẶT VẤN ĐỀ
dạng. Có những BN tử vong chỉ vài tháng sau
BCMDL đặc trưng bởi sự tăng sinh và tích
chẩn đoán, trái lại có bệnh nhân sống đến 20
tụ những tế bào lymphô trong máu, tủy
năm hoặc hơn(2,7).
xương, hạch bạch huyết, và lách. Bệnh thường
Cho đến nay, hệ thống của Rai và Binet
gặp ở những bệnh nhân (BN) có độ tuổi trung
vẫn được sử dụng như những phương pháp
bình là 65, chỉ có 10 - 15% BN dưới 50 tuổi(7).
* Bệnh viện truyền máu huyết học Thành phố Hồ Chí Minh
** Đại học Y dược Thành phố Hồ Chí Minh
Tác giả liên lạc: TS. BS. Phan Thị Xinh

ĐT: 0932728115

Chuyên Đề Truyền Máu Huyết Học

Email:

503

Nghiên cứu Y học

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 4 * 2011

hữu dụng cho việc phân chia giai đoạn lâm
sàng để tiên đoán thời gian sống của những
BN BCMDL(1,6). Tuy nhiên, đối với hầu hết BN
lần đầu được chẩn đoán bệnh, những hệ
thống này không thể tiên đoán được nguy cơ
tiến triển bệnh cũng như thời gian sống trên
từng cá nhân ở giai đoạn sớm của bệnh (giai
đoạn A của hệ thống Binet hoặc giai đoạn 0
đến 2 của hệ thống Rai)(2). Và việc xác định
những bất thường về NST đã giúp khắc phục
hạn chế của hai hệ thống trên. Những bất
thường NST được xem là những yếu tố tiên
lượng độc lập quan trọng và là chỉ điểm cho
việc lựa chọn các chiến lược điều trị(4).
Sự mất đoạn NST 6q21, 11q22-23, 13q14,
17p13; 3 NST số 3, 8, 12; và những chuyển đoạn
liên quan đến NST 14q32 là những bất thường
thường gặp và có ý nghĩa tiên lượng trong bệnh
BCMDL(2,3,5,8). Những bất thường di truyền tế
bào này có thể được phát hiện bằng kỹ thuật
phân tích NST đồ hoặc bằng kỹ thuật FISH. Tuy
nhiên, do khả năng phân bào của những tế bào
BCMDL rất kém nên dòng tế bào bất thường chỉ
được phát hiện trên 40% đến 50% tổng số ca
BCMDL khi sử dụng kỹ thuật phân tích NST

đồ(5). Vì vậy, kỹ thuật FISH với những đoạn dò
được thiết kế đặc hiệu, và không đòi hỏi phải
thu nhận được tế bào phân chia có khả năng
phát hiện những bất thường NST đến 80% tổng

A

số ca BCMDL(5) một cách nhanh chóng, chính
xác đang ngày càng được sử dụng rộng rãi.
Trong số những bất thường NST thường gặp
trên thì mất đoạn NST 13q và 17p có ý nghĩa tiên
lượng đặc biệt nhất. Theo nghiên cứu của
Döhner Hartmut và cộng sự (2000) trên 325 BN
BCMDT, mất đoạn NST 13q chiếm tỉ lệ cao nhất
đến 55%, còn mất đoạn 17p chiếm 7%(2). Những
BN có bất thường 13q được xếp vào nhóm có
tiên lượng tốt với thời gian sống trung bình, và
thời gian sống trung bình không điều trị dài
nhất tương ứng là 133 tháng và 92 tháng. Trái
lại, những BN có mất đoạn 17p lại có tiên lượng
kém nhất so với những BN có mang bất thường
NST khác với thời gian sống trung bình và thời
gian sống trung bình không điều trị tương ứng
là 32 tháng và 9 tháng(2). Vì vậy, trong nghiên
cứu này, chúng tôi ứng dụng kỹ thuật FISH tập
trung khảo sát hai bất thường này nhằm hỗ trợ
việc phân nhóm tiên lượng sớm và chính xác ở
giai đoạn chẩn đoán qua đó giúp lựa chọn phát
đồ điều trị phù hợp.

NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU
Nguyên vật liệu

B

13q14

control

C

13qter

13qter

Hình 1: Cấu trúc các đoạn dò và kết quả FISH khảo sát trên tế bào không phân chia. Đoạn dò tại vùng 13q14 trải
dài 220kb gắn chất phát huỳnh quang màu đỏ, trong khi đó đoạn dò gắn chất phát huỳnh quang màu xanh nằm ở
vùng đầu tận (13qter) dùng để kiểm tra sự hiện diện NST 13 (A). Để phát hiện mất đoạn 17p13, đoạn dò phát
huỳnh quang màu đỏ dài 330 kb phủ toàn bộ gen p53 được thiết kế, còn đoạn dò để kiểm tra sự hiện diện NST 17
gắn chất phát huỳnh quang màu xanh nằm ở vùng tâm động NST 17 (B). Bình thường sẽ quan sát được 2 tín
hiệu màu xanh và 2 tín hiệu màu đỏ trên 1 tế bào. Trong trường hợp mất đoạn 13q14 xảy ra, chúng ta chỉ quan
sát được 1 tín hiệu màu đỏ và 2 tín hiệu màu xanh trên 1 tế bào (C).

504

Chuyên Đề Truyền Máu Huyết Học


Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 4 * 2011

- 2 mL tủy xương được thu nhận từ 5 BN
BCMDL tại Bệnh viện Truyền Máu Huyết Học
(BVTMHH) Thành phố Hồ Chí Minh.
- Đoạn dò Poseidon™ DLEU (13q14) &
13qter Control probe – KBI-10102 (hãng
Kreatech) dùng để khảo sát sự mất đoạn 13q14
(hình 1A).
- Đoạn dò Poseidon™ p53 (17p13) & SE17
Control probe – KBI-10112 (hãng Kreatech) dùng
để khảo sát sự mất đoạn 17p13 (hình 1B).

Phương pháp nghiên cứu
- Tiến hành thu nhận tế bào bạch cầu từ mẫu
tủy xương bằng phương pháp thu hoạch trực
tiếp, cố định tế bào trên lam.
- Biến tính và lai hóa với đoạn dò đặc hiệu.
Bước này được thực hiện trên máy ThermoBrite
của hãng Abbott. Ủ ở 37oC trong 16 đến 18 giờ.
- Rửa để loại bỏ những mẫu dò không bắt
cặp đặc hiệu bằng dung dịch 4 x SSC / 0,3% NP40, và dung dịch 4 x SSC / 0,1% NP-40.
- Đọc kết quả trên 200 tế bào để tìm bất
thường dưới kính hiển vi huỳnh quang.

KẾT QUẢ
Về mặt kỹ thuật, chúng tôi đã chuẩn hóa
được kỹ thuật FISH với nhiệt độ và thời gian
biến tính tối ưu là 77oC trong 6 phút. Kết quả
của 5 BN được trình bày ở bảng 1.
Bảng 1: Kết quả FISH của 5 BN BCMDL
STT

1
2
3
4
5

Năm
sinh
1940
1926
1939
1960
1953

Giới tính
Nam

Nữ

X
X
X
X
X

Tỉ lệ% tế bào dương tính
(%)
Mất đoạn
Mất đoạn
13q14

17p13
18
0
51,5
0
0
0
0
7
9,5

Trong 5 BN BCMDL được phân tích, chúng
tôi nhận thấy đa số là nam. Trong đó BN có độ
tuổi cao nhất là 85 tuổi, và thấp nhất là 51 tuổi.
Kết quả khảo sát cho thấy trong 4 BN được
khảo sát sự mất đoạn 13q14 thì có đến 3 BN cho
kết quả dương tính (hình 1C); và chỉ có 1 BN có

Chuyên Đề Truyền Máu Huyết Học

Nghiên cứu Y học

mất đoạn 17p13 trong 5 BN được khảo sát.
Trong đó, 1 BN có mất đoạn NST 17p13 đồng
thời có mất đoạn NST 13q14. Chỉ có 1 BN không
tìm thấy mất đoạn NST 13q14 và 17p13.

BÀN LUẬN
Từ năm 2006 kỹ thuật FISH đã trở thành xét
nghiệm thường quy tại BVTMHH Thành phố

Hồ Chí Minh. Cho đến nay, chúng tôi đã sử
dụng kỹ thuật FISH để khảo sát trên 20 bất
thường NST thường gặp trong các thể bệnh ung
thư máu, trong đó có những đoạn dò có khả
năng phát hiện những bất thường NST thường
gặp trên bệnh BCMDL như 13q14, 17p13, 11q23,
3q26, 8q24, và t(14;18).
Trong thời gian gần đây, chúng tôi bắt đầu
triển khai khảo sát mất đoạn 13q và 17p thường
quy trên BN BCMDL tại BVTMHH. Tuy chỉ có 5
BN được khảo sát, nhưng kết quả cho thấy sự
mất đoạn 13q rất thường gặp (3 trong 4 BN), kết
quả này cũng phù hợp với nghiên cứu trên thế
giới là mất đoạn 13q chiếm tỉ lệ cao nhất trong
số những bất thường NST thường gặp ở bệnh
BCMDL(2). Với kỹ thuật FISH, chúng tôi có thể
phát hiện được 14 tế bào bất thường trong 200 tế
bào (7%) giúp hạn chế bỏ sót những dòng tế bào
bất thường so với kỹ thuật NST đồ kinh điển
(chỉ phân tích 20-30 tế bào phân chia). Đây là kỹ
thuật đơn giản, dễ thực hiện, và với trang thiết
bị sẵn có chúng tôi có thể khảo sát tất cả những
bất thường di truyền trên bệnh BCMDL, giúp
phân nhóm tiên lượng và lựa chọn phương
pháp điều trị thích hợp cho BN BCMDL.

TÀI LIỆU THAM KHẢO
1.

2.

3.

4.

Binet JL, Auquier A, Dighiero G, et al. (1981). A new prognostic
classification of chronic lymphocytic leukemia derived from a
multivariate survival analysis. Cancer, 48: 198-206.
Döhner H, Stilgenbauer S, Benner A, et al. (2000). Genomic
aberrations and survival in chronic lymphocytic leukemia. N
Engl J Med, 343: 1910-1915.
Döhner H, Stilgenbauer S, Döhner K, Bentz M, Lichter P. (1999).
Chromosome aberrations in B-cell chronic lymphocytic
leukemia: reassessment based on molecular cytogenetic analysis.
J Mol Med, 77: 266-346.
Juliusson G, Merup M. (1998). Cytogenetics in chronic
lymphocytic leukemia. Semin Oncol, 25: 19-26.

505


Nghiên cứu Y học
5.

6.

506

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 4 * 2011

Juliusson G, Oscier DG, Fitchett M, et al. (1990). Prognostic
subgroups in B-cell chronic lymphocytic leukemia defined by
specific chromosomal abnormalities. N Engl J Med, 323: 720-723.
Rai KR, Sawitsky A, Cronkite EP, et al. (1975). Clinical staging of
chronic lymphocytic leukemia. Blood, 46: 219-252.

7.
8.

Rozman C, Montserrat E. (1995). Chronic lymphocytic leukemia.
N Engl J Med, 333: 1052-1058.
Zenz T, Dohner H, Stilgenbauer S (2007). Genetics and riskstratified approach to therapy in chronic lymphocytic leukemia.
Best Pract Res Clin Haematol, 20: 439-491.

Chuyên Đề Truyền Máu Huyết Học