Giáo trình Sản xuất protein trong Y học: Phần 2

Sản xuất protein trong y học

CHƯƠNG 3
VECTORS
 Vectơ là những phân tử DNA tái tổ hợp mà có thể được sử dụng để mang những
đoạn DNA ngoại lai.
 Các đoạn DNA được tạo dòng trong vectơ có thể đạt được với số lượng đủ lớn
cho các thao tác trong phòng thí nghiệm.
 Các vecto dựa vào trình tự DNA đã được sửa đổi và kết hợp để thực hiện những
chức năng khác nhau.
 Việc lựa chọn các vecto dựa vào kích thước phân tử DNA được chèn vào nó.
 Các Vecto đã được khai thác cho nhiều mục đích khác nhau: sản xuất sợi đơn
DNA, sự biểu hiện cấp độ cao của các gen mã hóa protein, và việc sản xuất RNA.
Phần lớn các thí nghiệm nhân dòng vô tính phân tử sử dụng vi khuẩn E coli cho
nhân dòng DNA vô tính. Thậm chí nơi được đưa các đoạn DNA vô tính vào là tế bào
eukaryote. Các cấu trúc DNA hầu như luôn luôn được sản xuất trong E.coli trước rồi
sau đó mới đưa vào vật chủ cuối cùng. Việc nhân dòng vô tính có thể khả thi với
những ưu điểm của E.coli nên nó được sử dụng rộng rãi trong kĩ thuật di truyền.
E.coli, được đặt tên từ nhà vật lý học người Đức Theodor Escherich (1857–1911) là vi
khuẩn gram âm, hình que di chuyển bằng cách quay nhanh lông roi. Có nhiều trong
miệng và ruột người giúp bảo vệ vùng ruột khỏi các vi khuẩn truyền bệnh, giúp tiêu
hóa và sản xuất một lượng nhỏ vitamin B12 và K. Như là một sinh vật sử dụng trong
phòng thí nghiệm, E.coli có những ưu điểm sau:

Dễ dàng tăng trưởng trong môi trường đơn giản, ít tốn kém.
Là sinh vật có khả năng nhân đôi nhanh chóng khoảng 20-30 phút trong phase log.
Bộ máy di truyền học của nó đã được hiểu rõ.
Sử dụng E.coli trong phòng thí nghiệm thường an toàn và ngăn chặn đột biến là
cho chúng không thoát ra được môi trường phòng thí nghiệm.
Có một bộ gen đã được xắp sếp và lập chuỗi.
83

Sản xuất protein trong y học

Các bản sao nhiễm sắc thể phụ của DNA (các Plasmid và thể thực khuẩn DNA) có
thể được lợi dụng để mang các DNA ngoại lai.
Các tế bào E.coli hầu hết là sinh sản vô tính nhưng để tăng tính đa dạng và tăng
tính truyền đạt thông tin gen, chúng có các cơ cấu để chuyển các vật chất di truyền từ
một vi khuẩn đến loài khác. Trở lại giữa thập niên 1940 các tế bào vi khuẩn được cho
là có khả năng trao đổi vật chất di truyền với loài bán giới tính. Thí nghiệm của
Lederberg and Tatum đã mô tả rõ ràng sự vận chuyển thông tin di truyền thông qua sự
tiếp hợp vi khuẩn. Khả năng để thực hiện được sự vận chuyển này là từ một bộ gen
được gọi là F. Những gen này tồn tại trong mảnh vòng của DNA mà được sao chép lại
một cách độc lập từ nhiễm sắc thể vi khuẩn, hoặc chúng có thể được hợp nhất vào
trong nhiễm sắc thể. Vi khuẩn mang những gen này ( thường là những vi khuẩn đực)
dùng tua để bám vào một vi khuẩn gần nó, 2 tế bào được kéo lại gần nhau, và DNA
được chuyển từ vi khuẩn này đến vi khuẩn kia. Có 3 biểu hiển của nhân tố di truyền:
.F hay Fepisome là phân tử sợi đôi DNA tròn, lớn mà chỉ mang những gen di
truyền, được giữ trong vi khuẩn như là một sợi nhiễm sắc thể phụ plasmid.
.Hfr: thành tố F đã được hợp nhất vào trong bộ gen E.coli. Khi sự tiếp hợp xảy ra,
các gen F di chuyển qua tua kéo theo phần còn lại của gen sau chúng. Cuối cùng tua bị
đứt, vì thế bộ gen không được chuyển hoàn toàn. Bộ gen vi khuẩn có thể được đo
trong nhiều phút từ khi bắt đầu chuyển với một lược thời gian cần cho từng gen riêng
biệt để được chuyển từ vi khuẩn này đến vi khuẩn kia cho biết được bao lâu kể từ khi
bắt đầu sao chép.
.F’ : đây là phân tử sợi đôi DNA mang các gen di truyền và một số loại gen khác.
Những gen này được vận chuyển với hiệu suất rất cao bởi vì độ dài của sợi DNA được
chuyển khá ngắn đủ để nó có thể di chuyển dọc theo khúc nối giữa 2 tế bào vi khuẩn
trước khi tua bị đứt.
Khả năng của F’ episome để tái tổ hợp và được giữ như là một thực thể tách biệt với

các nhiễm sắc thể vi khuẩn làm nó lý tưởng để mang các trình tự DNA ngoại lai. Tuy
nhiên kích thước của F’ episome là ngăn cản sự phân tích và thao tác trên nó và thuộc
tính gen chuyển của nó có thể làm cho không ổn định.
Về tổng quan các DNA ngoại lai cần được mang trong vecto để bảo đảm sự truyền
và tái tổ hợp trong tế bào vật chủ. Vecto được mô tả tốt nhất như là các trình tự DNA
tự tái tổ hợp mà có thể được dùng để mang các DNA ngoại lai. Các vecto có nền tảng
dựa trên các chuỗi DNA được tìm thấy có thể được tái tổ hợp dưới những hình thức
khác nhau. Hầu hết các vecto được sử dụng dựa vào cả plasmid và thực khuẩn λ. Tổng
quan, các vecto được xem như các môdun riêng biệt mà cung cấp các điều kiện cơ bản
thiết yếu cho việc nhân dòng vô tính phân tử hiệu suất cao. Các vecto được sử dụng
trong tái tổ hợp DNA thường được quy cho là các vecto dòng vô tính, trong khi nếu nó
được sử dụng cho biểu hiện gen được mang trong DNA dòng vô tính, nó được gọi là
vecto biểu hiện.
Các vecto phải mang một trong các đặc điểm sau đây để làm cho nó trở nên hữu
dụng trong nhân dòng vô tính phân tử:
84


Sản xuất protein trong y học

 Có khả năng tự sao chép
 Có tính chọn lọc để nhận diện những tế bào đã biến đổi với những tế bào chưa
biến đổi.
Thêm vào đó hầu hết các vecto đều chứa những vùng enzyme nhận diện giới hạn để
cho các đoạn DNA có thể được nhân dòng vô tính vào trong vecto một cách dễ dàng.
Một mạng lưới lớn những loại vecto được sử dụng ngày nay, với các tính chất chuyên
biệt cao và được thiết kế ra để thực hiện một chức năng đặc trưng. Trong chương này
chúng ta sẽ bàn về một vài điểm tổng quan của việc thiết kế một vecto, nhưng sẽ tập
trung vào các vecto dùng trong các thí nghiệm dòng vô tính.
3.1 PLASMID

Plasmid thường được tìm thấy trong các đoạn DNA thuộc nhiễm sắc thể phụ mà thế
hệ fromone được thừa hưởng ổn định từ một vùng nhiễm sắc thể phụ khác. Plasmid
được phân tán rộng rãi trong prokaryote khoảng 1500bp đến hơn 300kbp. Hầu hết
plasmid hiện diện như là các phân tử sợi đôi DNA vòng kín và thường có một kiểu
hình riêng biệt trên tế bào vi khuẩn, nơi mà chúng được sao chép lại. Đó là vì plasmid
thường mang gen mã hóa để chống lại các tác nhân kháng sinh và kim loại nặng, hoặc
để sản xuất nguồn DNA hạn chế và các enzyme sửa chữa, những thứ mà vi khuẩn khi
bình thường thì không có được. Sự sao chép plasmid thường được ghép đôi với tế bào
chủ nơi mà chúng được giữ lại, cùng với sự sao chép plasmid là sự sao chép lại bộ gen
của tế bào vật chủ. Plasmid thường được mô tả như dư dả (relaxed) hoặc khan hiếm
(stringent) là dựa vào lượng bản sao của plasmid được giữ trong tế bào, plasmid dư tức
nhiều bản sao được giữ lại trong một tế bào(10-200), trong khi plasmid khan hiếm khi
chỉ hiện diện 1 hoặc 2 bản sao trong một tế bào.Nền tảng của sự khác nhau này là do
cơ cấu khác nhau được thực hiện bởi plasmid để tự nhân đôi. Nói chung,plasmid dư
thừa sử dụng vật chủ có nguồn gốc từ protein, trong khi plasmid khan hiếm mã hóa các
nhân tố protein cần thiết cho sự nhân đôi của chúng.
Hầu hết các plasmid được sử dụng ngày nay dựa trên nguồn gốc sự tự nhân đôi
được tìm thấy trong plasmid E.coli ColE1 hoặc họ hàng gần của nó là pMB1. ColE1
là phân tử DNA vòng đóng dài 6646bp mã hóa cho tác nhân kháng sinh của vi khuẩn,
85


Sản xuất protein trong y học

colicin E1 và các gen đề kháng mà giúp vi khuẩn vật chủ thoát khỏi ảnh hưởng của tác
nhân kháng sinh. Colicin E1 là protein vận chuyển trên màng gây nên sự khử cực gây
chết màng của vi khuẩn (Konisky và Tokuda, 1979). Gen kháng thuốc mã hóa cho
protein ngăn cản hoạt động của Colicin bằng cách kiềm chế khả năng hình thành kênh
xuyên màng vi khuẩn (Zhang và Cramer, 1993). Vi khuẩn có chứa pladmid ColE1 có
thể khác biệt so với những vi khuẩn không chứa plasmid này bởi chúng có khả năng

phát triển trong một dĩa có chứa colicin E1. Tuy nhiên việc bảo vệ cho quá trình phát
triển này là khá khó khăn và đã lâu kể từ khi các kĩ thuật bảo vệ thuốc kháng sinh
không còn được sử dụng nữa.
Plasmid ColE1 được sao chép theo kiểu độc lập sử dụng DNA polymerase được
cung cấp từ tế bào vật chủ. Không giống như nguồn gốc sao chép thuộc vi khuẩn, sự
sao sao chép của ColE1 chỉ diễn ra theo một chiều. Plasmid không mã hóa cho protein
khởi sướng quá trình sao chép nhưng lại mã hóa cho các phân tử RNA không dịch mã,
các RNA này có liên quan đến sự khởi sướng quá trình sao chép cũng như một protein
đóng vai trò điều hòa các phân tử RNA. Nguồn nhân đôi DNA của ColE1 là một vùng
của DNA mà 2 phân tử RNA (RNAI và RNA II) được phiên mã từ nguồn khởi xướng
của chúng (hình 3.2). RNA II được bổ sung vào gốc sao chép ColE1 và gắn vào nó
hình thành nên dạng lai DNA-RNA (Cesarenivà cộng sự, 1991). Phân tử gắn RNA II
được tách ra từ gốc, bởi enzyme mã hóa vật chủ RNase H và đáp ứng như một đoạn
mồi nơi mà sự sao chép DNA xảy ra. Trong quá trình bắt cặp base, RNAII chỉ có thể
gắn lên 1 sợi DNA, và kể từ đây sự sao chép DNA là đơn hướng.

Hình 3.2: Plasmid ColE1 và gốc sao chép. Plasmid ColE1 là một sợi đôi DNA vòng
kín, dài 6646bp. Nó mã hóa cho tác nhân kháng sinh trong vi khuẩn colicin E1 và
protein miễn dịch giúp ngăn các ảnh hưởng từ chất độc trong các tác nhân kháng
khuẩn có trong plasmid. Sự sao chép DNA chỉ xảy ra theo 1 hướng như được chỉ ra từ
mũi tên ori. Hai phân tử RNA chưa phiên mã, gọi là RNAI và RNAII, và sản phẩm
protein của gen rop điều khiển quá trình sao chép. Mũi tên trên các gen cho thấy chiều
hướng phiên mã.
86


Sản xuất protein trong y học

Điều khiển quá trình sao chép được thực hiện bởi một phân tử RNA chưa phiên
mã khác. RNAI được bổ xung vào gốc 5’ của RNAII và dạng RNA kép giữa RNAI và

RNAII không thể thực hiện như là một đoạn mồi cho sao chép. RNAI có tồn tại tương
đối ngắn, do đó plasmid ColE1 được giữ ở mức 15-20 bản sao trong một tế bào. Sự
tương tác giữa RNAI và RNAII được giữ ổn định bởi protein ROP(Helmer-Citterichvà
cộng sự, 1988).
Cơ cấu sao chép DNA thực hiện bởi ColE1 có một số vai trò quan trọng, 2
plasmid với cùng một gốc sao chép không thể cùng tồn tại trong một tế bào. RNAI của
gốc plasmid ngăn cản RNAII của plasmid đi vào để khỏi hình thành đoạn mồi, đây
không gọi là sao chép. Điều này quan trọng trong các thí nghiệm nhân dòng vô tính
khi mà một tập hợp các plasmid được hòa trộn, điều mà tạo ra các phản ứng thắt nút,
được chuyển vào trong vi khuẩn. Các cá thể chuyển theo phương pháp chỉ mang một
plasmid đơn mà không phải là một tập hợp. Các Plasmid với các gốc sao chép khác
nhau không thể cùng tồn tại trong một tế bào. MỘt hệ quả của cơ cấu sao chép ColE1
là sự tổng hợp DNA mới không cần khởi sướng sự sao chép DNA. Sự hiện diện các
yếu tố kháng sinh mà ngăn cản sự tổng hợp protein, sự sao chép DNA nhiễm sắc thể bị
ngừng lại nhưng với plasmid nền tảng ColE1 vẫn tiếp tục được sao chép và tích lũy
với nồng độ cao (1000–2000 bản sao một tế bào) (Clewell, 1972).
3.1.1. pBR322
ColE1 và tương ứng với nó là pMB1, hữu dụng trong nhân dòng vô tính vecto
nhưng chúng lại có một số bất lợi. Đầu tiên, khó khăn trong việc nhận diện plasmid tái
tổ hợp làm chúng không được sử rộng rãi. Cần một plasmid có thể được sao chép
giống với cách của ColE1, nhưng phải trong plasmid nào dễ nhận diện.
Plasmid pBR322 lần đầu tiên được sử dụng như là một vecto plasmid, là một
plasmid nhỏ (4363bp) được cấu thành từ các plasmid trong tự nhiên và các đoạn DNA
khác (Bolivar và cộng sự, 1977). pBR322 mang những thành phần sau đây.
 Gốc sao chép : pBR322 mang gốc sao chép ColE1 và gen rop để bảo đảm một
lượng bản sao plasmid hợp lý ( 15-20 một tế bào) có thể tăng lên 200 vòng nhờ sự
khuyếch đại chloramphenicol.

Gen kháng kháng sinh: pBR322 mang 2 gen mà có thể được sử dụng như là các tín
hiệu chọn lọc. Gen kháng ampicilin được nhân dòng vô tính vào trong plasmid nhờ

87


Sản xuất protein trong y học

gen nhảy Tn3. Gen kháng tetracyline được nhân dòng vô tính từ plasmid pSC101
(Bernardi và Bernardi, 1984).
Vùng nhân dòng vô tính: plasmid mang các vùng nhận diện enzyme giới hạn.một
vài trong số này có trong cac gen kháng kháng sinh. Ví dụ như vùng cho PstI, PvuI và
SacI được tìm thấy trong gen kháng ampicilin hoặc vùng cho amHI và HindIII trong
gen kháng tetracylin.
Các gen kháng kháng sinh trong pBR322 cho phép chọn lọc trực tiếp các chất tái tổ
hợp trong một chu trình được gọi là bất hoạt vùng gắn (insertional inactivation). Ví dụ,
nếu chúng ta muốn nhân dòng vô tính một đoạn DNA vào trong vùng BamHI của
pBR322, sau đó DNA gắn sẽ làm ngắt quãng vai trò của gen KHÁNG chống tetracilin,
nhưng vai trò của gen chống ampicilin vẫn không bị thay đổi. Các tế bào đã biến đổi
được nuôi trên một đĩa thí nghiệm mang ampicilin để diệt hết tất cả các tế không mang
plasmid. Sau đó được cho phát triển tiếp trên mội trường có cả ampicilin và tetracilin.
Những tế bào có thể phát triển khi có ampicilin nhưng lại chết dưới sự chọn lọc của
tetracilin sẽ mang plasmid có DNA gắn vào. Nói cách khác, sự thêm vào các đoạn
DNA ngoại lai vào các gen kháng kháng sinh làm bất hoạt gen và dẫn tới tính nhạy
cảm với yếu tố kháng sinh.

Hình 3.4 Sự lồng vào yếu tố gây bất hoạt của gen kháng kháng sinh trong pBR322.
Nếu đoạn DNA được lồng vào vùng nhận diện enzyme giới hạn BamHI bên trong gen
tetracyline, gây ra bởi plasmid tái tổ hợp khi được chuyển vào trong vi khuẩn sẽ vẫn
88


Sản xuất protein trong y học

đem lại sự sống trên môi trường chứa ampiciline nhưng sẽ không thể xúc tiến được sự
phát triển trong môi trường chứa tetracilin. Gen kháng Tetracilin sẽ bất hoạt về mặt
chức năng khi có mặt DNA gắn.
3.1.2 pUC plasmid
PBR322 là một đột phá trong lĩnh vực sinh học phân tử như là một plasmid lần đầu
tiên được sử dụng trong nhân dòng vô tính phân tử nhưng tiêu tốn thời gian và dể gặp
lỗi. Vào 1982 một chuỗi plasmid được phát triển cho phép nhận diện tế bào mang
DNA ngoại lai trong bước sàng lọc đơn là plasmid pUC (Vieira và Messing, 1982). Nó
có 3 đặc tính quan trong khi so với pBR322
 Lượng bản sao lớn – đột biến trong gốc sao chép sản xuất ra 500-600 bản sao của
plasmid trong một tế bào mà không cần dùng tác nhân khuyếch đại chloroamphenicol.
 Sàng lọc xanh- trắng – Sàng lọc theo kiểu này là một dạng đặc biệt của hoạt hóa
vùng gắn.
 Nhiều vùng nhân dòng vô tính. Đây là một loại DNA nhân tạo mà chứa trình tự
của nhiều vùng nhận diện enzyme giới hạn. Nó được gắn vào một phần của vecto mã
hóa β-galactosidase α-peptide theo chiều hướng để không ảnh hưởng đến chức năng và
biểu hiện của nó. Tuy nhiên việc gắn DNA ngoại lai vào hầu như luôn luôn làm phá vỡ
hoạt động của α-peptide. Do đó các cụm tái tổ hợp vẫn còn màu trắng trong khi cụm
không tái tổ hợp lại chuyển xanh.

Hình 3.5- pUC plasmid
Ưu điểm của pUC plasmid so với pBR322 là đoạn DNA ngoại lai có thể được nhân
dòng vào nhiều vùng nhận diện enzyme giới hạn khác nhau và các chất tái tổ hợp
nhanh chóng được sàng lọc. Thêm vào đó gốc α-bổ trợ chỉ cần một gen nhỏ để mang
trên plasmid. DNA mã hóa α-peptide trong chuỗi pUC trong các vecto thì nhỏ hơn
400bp. Nếu như toàn bộ khung đọc mở LacZ được cần đến, trên 3500bp sẽ được giữ
lại trong những vecto này. Nói chung, sự ổn định của nhiều vecto plasmid giảm trong
89

Sản xuất protein trong y học

khi chiều dài của chúng tăng. Kết quả trong giới hạn chiều dài DNA là có thể được
nhân dòng vô tính vào trong một plasmid riêng biệt. Ví dụ, khả năng tế bào vi khuẩn
vẫn còn plasmid pUC tái tổ hợp giảm mạnh khi kích thước của chúng đạt đến 15kbp.
3.2 Lựa chọn chỉ thị (Dấu chuẩn chọn lọc)
Một đặc điểm cơ bản của các plasmid là chúng tạo điều kiện cho vector được
dễ dàng phát hiện. Các plasmid như vậy được sử dụng thường xuyên như các vector
trong thí nghiệm tạo dòng. Nhiều loại plasmid được tìm thấy trong tự nhiên trong các
vi khuẩn và trong một số nấm men. Việc lựa chọn đánh dấu thường phụ thuộc vào các
tế bào vật chủ được chuyển. Một số dấu hiệu chỉ có chức năng với các sinh vật nhân
sơ, trong khi những một số khác có một tác động rộng hơn. Một số dấu hiệu thường
được sử dụng lựa chọn được liệt kê dưới đây, cùng với cơ chế hoạt động của chúng.
 Ampicillin – gắn vào và ức chế một số enzym trong màng tế bào vi khuẩn có
liên quan đến sự tổng hợp của các thành tế bào Gram âm. Do đó, tế bào không nhân
bản trong trường hợp có sự hiện diện của ampicillin. Các gene kháng ampicillin
(AMPR hoặc bla) mã hóa cho các enzyme β-lactamase được tổng vào khe quanh tế
bào chất của vi khuẩn, nơi mà nó xúc tác thủy phân của vòng β-lactam của
ampicillin. Do đó, các sản phẩm của gen AMPR làm mất hiệu lực chất kháng sinh.
Theo thời gian ampicillin trong môi trường nuôi cấy trên đĩa petri có thể bị mất hiệu
lực khá rõ bởi β-lactamase. Khi điều này xảy ra, sức ép chọn lọc để duy trì các
plasmid sẽ không còn nữa và quần thể tế bào có thể phát sinh mà không có plasmid.
 Tetracycline – kết hợp với một protein tiểu đơn vị 30S của ribosom để ức chế
sự di chuyển ribosome dọc theo mRNA và do đó cản trở quá trình dịch mã tổng hợp
protein. Các gen kháng tetracycline (TETR) được mã hóa bởi 399 amino acid ở bên
ngoài màng liên quan đến protein của tế bào Gram âm và ngăn chặn các kháng sinh
xâm nhập vào tế bào. Như vậy, gene kháng thuốc không làm mất hiệu lực của kháng
sinh. Sức ép chọn lọc sẽ được duy trì trong suốt quá trình nuôi cấy tế bào để giữ cho
các plasmid có chứa gene kháng thuốc.

 Chloramphenicol – kết hợp với các tiểu đơn vị 50S ribosome để ức chế sự tổng
hợp protein. Các chloroamphenicol acetyltransferase (CAT) được mã hóa bởi gen
kháng chloramphenicol (CMR). Các protein CAT là bốn (tetrameric) bào thể protein,
trong sự hiện diện của acetyl coenzyme A, xúc tác hình thành các chất dẫn xuất
hydroxyl acetoxy của chloramphenicol nó không thể liên kết với các ribosome. Như
với ampicillin, các sản phẩm gen CMR làm mất hiệu lực của chất kháng sinh.
 Kanamycin và neomycin – kết hợp với các thành phần ribosome và hạn chế tổng
hợp protein. Các protein được tổng hợp bởi mã hóa gene KANR được tổng hợp ở khe
quanh tế bào chất và cản trở việc vận chuyển các chất kháng sinh vào trong tế bào.
Giống như các gene kháng tetracycline, gene KANR không làm mất hiệu lực các chất
kháng sinh.
 Bleomycin và zeocin – các kháng sinh glycopeptide liên kết với DNA và ức chế
DNA và sự tổng hợp RNA. Chúng tác động chống lại hầu hết các vi khuẩn (bao gồm
cả E. Coli), vi sinh vật có nhân điển hình (ví dụ như nấm men), các tế bào thực vật và
90


Sản xuất protein trong y học

tế bào động vật. Các gene Sh ble từ vi khuẩn Streptoalloteichus hindustanus mã hóa
một protein nhỏ có đề kháng đối với zeocin bằng cách gắn vào các chất kháng sinh
(Gatignol, Durand và Tiraby, 1988).
 Hygromycin B - ức chế bằng cách can thiệp dịch chuyển vị ribosome. Kháng
sinh tác động chống lại cả hai sinh vật nhân sơ và sinh vật nhân chuẩn. Các gen
kháng (HYGR, mã hóa hygromycin-B-phosphotransferase) bất hoạt các kháng sinh
bởi sự phosphoryl hóa.
Mặc dù vectơ plasmid được sử dụng cực kỳ rộng rãi sử dụng trong nhiều ứng dụng
của việc tạo dòng và đã được thiết kế với mục đích tạo ra nhiều chức năng hơn.
Những chức năng trong số này sẽ được thảo luận trong chương sau của cuốn sách
này, nhưng ở đây tôi sẽ liệt kê một số ví dụ để cung cấp cho người đọc một chức

năng chính trong sự đa dạng của việc sử dụng plasmid.
 Tách dòng - hầu hết các thao tác thực hiện trên DNA trong phòng thí nghiệm
đều lựa chọn có mang plasmid. Dễ dàng thao tác sử dụng và lưu trữ của plasmid nên
thường được sử dụng trong các thí nghiệm về DNA tái tổ hợp.
 Vector con thoi - những plasmid không chỉ chứa toàn bộ thông tin gốc nhân bản
và lựa chọn đánh dấu cho E. coli, những trình tự cũng có chức năng tương tự để duy
trì truyền lại ở các tế bào vật chủ khác. Ví dụ, plasmid cho nhân bản và biểu hiện của
gen ở nấm men Saccharomyces cerevisiae có chứa toàn bộ thông tin nhân bản và
đánh dấu lựa chọn cho cả E. coli và nấm men. Hầu hết các các thao tác DNA sẽ được
thực hiện bằng cách sử dụng E. coli là tế bào chủ trước khi chuyển thành DNA cuối
cùng được tạo ra vào trong nấm men.
 Tạo ra RNA - nhiều plasmid đã được thiết kế để nhân bản đoạn DNA ngoại và
nó có thể phiên mã thành RNA. Như vậy plasmid bao gồm các vùng khởi động
(promoter ) cho một RNA polymerase, ví dụ: Ở bacteriophages có T3, T7 hoặc SP6,
Giả sử RNA có thể được thực hiện trong ống nghiệm bằng cách sử dụng RNA
polymerase tinh khiết và DNA plasmid. Các RNA được thực hiện bằng phương pháp
này thường được sử dụng như thăm dò lai trong Northern blotting.
 Sản xuất Protein - nhiều plasmid chứa trình tự khởi đầu (promoter) để biểu hiện
các gen ngoại mà chúng có. Biểu hiện thường được thực hiện trong E. coli, nhưng
bằng cách sử dụng các đoạn khởi động (promoter) phù hợp, protein biểu hiện có thể
được định hướng hầu như bất kỳ trong cơ thể nào. Sản xuất protein ở mức độ cao có
thể được điều khiển từ một promoter mạnh, trong khi sản xuất ở mức thấp có thể sẽ
là từ các promoter yếu hơn. Mức độ sản xuất protein cũng có thể được điều khiển
bằng cách thay đổi số lượng bản sao của plasmid này.
Trong kỹ thuật di truyền, các plasmid gặp trong tự nhiên thường được sửa đổi
nhiều để tạo ra các vector có các đặc điểm mong muốn. Ví dụ, nếu bạn đã nhân bản
vô tính một gen, bạn có thể muốn biểu hiện các sản phẩm của gene ở mức cao trong
E. coli, trong khi cũng thể biểu hiện protein trong môi trường nuôi cấy tế bào động
vật có vú và sản xuất một protein mới dựa trên protein đã biểu hiện mà kháng thể đơn
dòng có sẵn để dùng. Các hệ thống nên được thiết kể để vận chuyển vào các đoạn

91


Sản xuất protein trong y học

ADN giữa các vector mà không cần phải sử dụng enzyme giới hạn. Một trong những
hệ thống được phác thảo (hình 3.7).

Hình 3.7. Gene xáo trộn giữa các plasmid bằng cách tái tổ hợp. Các gen được
chuyển giao từ các plasmid cho đến plasmid nhận tại địa điểm LoxP sử dụng enzyme
Cre recombinase.
Ở đây, các đoạn DNA mã hóa gene mục tiêu được chuyển từ một plasmid khác do
tác động của các enzyme Cre recombinase. Cre nặng 38 kDa protein recombinase từ
các vi khuẩn P1 (Sternberg và cộng sự, 1981). Nó làm trung gian để điều chỉnh giữa
sự tái tổ hợp và trong các trình tự DNA tại các điểm cụ thể gọi là các điểm loxP (
Abremski và Hoess, 1984 ). Các điểm này bao gồm một cặp 13 bp ngược lặp đi lặp
lại cách nhau bởi một vùng đệm 8 bp. Vùng đệm 8 bp trong điểm loxP được định
hướng rằng sự tái tổ hợp xảy ra theo một chiều hướng chính xác và định hướng
trước. Plasmid cho chứa hai điểm loxP và hai điểm đó kẹp giữa hai đầu của gene mục
tiêu. Plasmid nhận chứa một điểm loxP và các yếu tố mà các gen mục tiêu sẽ trở
thành hợp nhất. Các gen mục tiêu khi chuyển sẽ liên kết với các yếu tố biểu hiện cụ
92


Sản xuất protein trong y học

thể mà các vector nhận đã được thiết kế. Hơn nữa, nếu các trình tự mã hóa cho các
gen quan trọng nằm trong khung ngược dòng với các điểm loxP ở vector cho nó sẽ tự
động được nằm trong khung với tất cả các chuỗi axit amin đã thiết kế ở vector nhận.
Một plasmid cho được thay thế và hệ thống chấp nhận plasmid đó là dựa vào một

điểm đặc biệt các phản ứng tái tổ hợp trung gian bởi thể thực khuẩn λ (Karimi, Inze
và Depicker, 2002).
Trong trường hợp này, các đoạn DNA tái tổ hợp hai bên các điểm ( att ) có thể
được chuyển vào vector tái tổ hợp có chứa các điểm tương thích ( att × attP hoặc attL
× attr ) trong một phản ứng trung gian bởi các protein tái tổ hợp λ.
Tính linh hoạt của plasmid đã dẫn đến chúng được sử dụng rộng rãi như là các
vectơ cho các thí nghiệm về thao tác trên gene. Tuy nhiên nó cũng có một số hạn chế
đáng kể. Thứ nhất, hiệu quả mà plasmid được chuyển đến một tế bào vi khuẩn là rất
thấp. Phân tử DNA plasmid được đưa vào tế bào vi khuẩn phải được tế bào chấp
nhận ( xem Chương 2 ), nhưng điều này không phải lúc nào cũng được đáp ứng.
Plasmid được chuyển vào tế bào E. coli được cho là có mức độ thích nghi tốt nhất 1
× 109 tế bào chuyển đổi có thể được tạo ra mội microgram phân tử DNA plasmid.
Đối với một plasmid điển hình, 1 μg đại diện cho khoảng 1,5 × 1011 phân tử. Điều
này có nghĩa là các tế bào thu được ít hơn 1 % các phân tử DNA có sẵn. Thứ hai,
năng suất của các plasmid để chuyển các đoạn lớn của DNA ngoại lai là rất hạn chế
(Bảng 3.1). Hầu hết các plasmid trở nên không ổn định nếu kích thước của chúng
vượt quá khoảng 15 kbp.Trong nhiều trường hợp, điều đó không thành vấn đề, nhưng
trong một số ứng dụng, điều quan trọng là phải tăng kích thước của các đoạn lên tối
đa trước khi tác dòng. Cần có các vector có khả năng tiếp nhận các đoạn DNA lớn.
Các loại vector có như vậy được phát triển để khắc phục những khó khăn này.
3.3 λ Vectors
Vào đầu năm 1950, Andre lwoff đã miêu tả một đặc tính kì lạ của Escherichia coli.
Khi ông soi sáng một chút sự căng của những tế bào E.coli với một lượng ánh sáng cực
tím vừa phải, vi khuẩn dừng hẳn sự phát triển và, sau đó khoảng 90 phút, vi khuẩn dung
giải và phóng thích ra nhiều mẫu virut, gọi là λ , bên trong môi trường trung gian
(Figue 3.8)
Những virut, nhiều khi được gọi là thể ăn vi khuẩn hoặc đơn giản là thể thực khuẩn,
có thể gây nhiễm tới các tế bào E. coli khác mà trước đây không gây nhiễm bởi những
thể thực khuẩn λ. Không chỉ tất cả những tế bào vi khuẩn chịu sự biến đổi phân hủy này
khi bức xạ bằng con đường này. Tuy nhiên, vi khuẩn đầu tiên tiêu diệt thễ ăn khuẩn A,

nhưng không thể phân hủy, là đặc điểm khác thường.Chống lại sự lây nhiễm bởi thể
ăn khuẩn A, những tế bào E. coli sẽ chịu đưng một trong 2 cách thức sau. Hoặc tế bào
thủy phân và tổng hợp nên nhiều mảnh thể ăn khuẩn mới sẽ phóng thích vào trong xung
quanh khoảng giữa, hoặc, một sự lựa chọn nữa , thể ăn khuẩn có thể thay đổi đột ngột
vào trong Dormant lifestyle mà thể ăn khuẩn DNA trở nên hợp nhất trong nhiễm sắc
thể E coli bên trong nguyên nhân này là sự phân giải lifestyle được tiếp tục.

93


Sản xuất protein trong y học

Chu trình sống của thể ăn khuẩn λ được diễn tả trên biểu đồ hình 3.9.

Thực ra nó là vi khuẩn phân giải mà nó tỏ ra phân hủy nhanh chóng để chống lại
bức xạ cực tím. Trong phòng thí nghiệm, thể ăn khuẩn λ phát triển và tái tạo được
kiểm tra trên đĩa petri (hình 3.10).

94


Sản xuất protein trong y học

Thể ăn khuẩn được pha trộn với những tế bào E. coli xem là 1 dung dịch mềm dẻo
agar được gọi là top agar hỗn hợp được rót trên bề mặt dinh dương agar một lớp
mỏng và được ủ cho vi khuẩn phát triển.
λ phát triển là nguyên nhân của cái chết (sự phân giải) của những tế bào E.coli
xung quanh vị trí tiêm nhiễm lúc ban đầu. Trong những vị trí được theo dõi trên đĩa
có một chút hỗn độn những màng trong vải batit vi khuẩn. DNA λ có thể được lọc từ
những mẫu thể ăn khuẩn bao gồm có những màng này.

Di truyền học và phân tử sinh vật học ở cấp độ phân tử của thể thực khuẩn λ vừa
được nghiên cứu rộng khắp – xa hơn là cung cấp thông tin về λ , độc giả được hướng
dẫn bởi văn bản hết sức hoàn hảo bởi Mark Ptashne (Ptashne, 1992). DNA bao gồm
thể ăn khuẩn là 1 phân tử sợi đôi thẳng với kích thước 48502 bp, đầu 5- và 3- kết
thúc của λ hệ gene có 12 cặp base mà sợi đôi được gọi là cố kết hay cos kết thúc.
Những chuỗi này bổ sung và có thể được thấu với một vài thứ khác tới dạng 1 phân
tử sợi đôi mạch vòng (hình 3.11). Chức năng liên quan tới gene của λ thường được
tập hợp lại với nhau tạo nên hệ gene λ loại trừ 2 gene điều hòa dương N và Q, những
gene bên trên phía bên tay trái của bản đồ gene quy ước mã hóa cho protein đầu và
cuối của mảnh thể ăn khuẩn.

95


Sản xuất protein trong y học

Theo sau nó là những gene mà sản phẩm protein liên quan với sự tái tổ hợp và
quá trình hoạt hóa thực khuẩn của nhiễm sắc thể thể ăn khuẩn được chèn vào bên
trong nhiễm sắc thể chủ và được tái tạo ổn định như là tiền thể ăn khẩn. Phía bên tay
phải của bản đồ gene có liên quan đến sự điều chỉnh bản sao và tiền ăn khuẩn nhiễm
vào cho tới lần thứ 2 ( N, cro,cl), theo cùng là những gene cho sự tổng hợp DNA,
chức năng điều chỉnh chậm trễ (Q) và sự phân hủy của những tế bào chủ.
Sự hiểu biết khá lớn của chúng ta về thể thực khuẩn λ và những con đường mà nó
phân hủy và phân giải chu trình sống được điều khiển vừa được tạo nên λ một vector
lý tưởng để mang những mảnh DNA ngoại bào. Lợi thế chủ yếu của λ căn cứ vào
những vector ngoài bào plasmid có khả năng mà thể ăn khuẩn có thể xâm nhiễm vào
tế bào E.coli. Khi chúng ta thực sự có 1 buổi thảo luận, sự biến nạp DNA plasmid vào
trong vi khuẩn là 1 quy trình không có hiểu quả, sự xâm nhiễm λ là một con đường có
hiệu quả để đưa DNA vào trong tế bào vi khuẩn.
Để nghiên cứu làm thế nào mà λ có thể được lợi dụng như là một vector, thật là

quan trọng để có 1 hiểu biết cơ bản về chính thể ăn khuẩn. Thể ăn khuẩn λ lây nhiễm
và phân giải xảy ra được định rõ trong trong từng buớc. sự lây nhiễm xảy ra như là
kết quả của sự hút bám của mảnh thể ăn khuẩn λ tới tế bào vi khuẩn bằng việc kết
hợp với receptor maltose. Bộ gen DNA của λ được tiêm nhiễm vào trong tế bào và
hầu như gửi thông tin ngay lập tức. ngay tại điểm này nó có thể xâm nhập bằng 1
trong 2 con đường.
 Con đường Lýogenic. DNA thể ăn khuẩn trở thành hợp nhất với hệ gen vi khuẩn
tái tổ hợp via tương đồng giữa attP và khu vực hệ gene attB vi khuẩn) và tái tạo cùng
với DNA của vi khuẩn. di chứng DNA tiền thực khuẩn kết hợp cho tới khi nó gây
ra việc xâm nhập bằng con đường phân giải
96


Sản xuất protein trong y học

 Con đường phân giải. Số lượng to lớn của những mảnh thể ăn khuẩn (protein và
DNA) xảy ra mà cuối cùng dẫn đến sự phân giải tế bào.
Sự giả quyết khi sự phân giải hay phân huỷ xảy ra là kết quả của hoạt động của
protein cII, Hoạt tính của CII thì phụ thuộc vào bản sao của chất ức chế cI. Và một vài
gene phụ thuộc vào sự hoà hợp với DNA thể ăn khuẩn bên trong nhiễm sắc thể E.coli.
hoạt tính cII là kết quả sự chấp nhận con đường phân giải , trong khi cII không hoạt tính
kết quả trong con đường phân huỷ cũng được kéo theo.
Protein cII thì tương đối không bền và dễ bị ảnh huởng tới sự phân tách và phá
huỷ của protease vi khuẩn. Những điều kiện của môi truòng ảnh huởng tới hoạt tính
của những protease này. Khi phát triển ở mức trung lớn, ví dụ , proteases có hoạt
động chung , giống như cII bị suy biến và λ phân giải xảy ra.
Dưói những điều kiện của E.coli starvation , protease ít thiết thực và cho nên λ sẽ có
nhiều sự phân giản thường xuyên hơn Cách hoạt động này rất có ý nghĩa cho tế bào thiếu
đới này sẽ ít cấu thành thiệt suy yếu để tạo nên những mảnh thể ăn khuẩn mới.
Con đường phân huỷ được mô tả bởi 1 chuỗi những bản sao xảy ra mà sản xuất sự

khác biệt của nhưng protein mà phụ thuộc vào sự tái tạo ra DNA thể ăn khuẩn và sản
phẩm của những mảnh thể ăn khuẩn mới.
 Bản sao sớm bản sao của gene N và cro xuất hiện. bản sao này được đưa ra để
ngăn cản bởi sản phẩm của gene cI và trong 1 quá trình phân giải sự ngăn cản này là
cơ bản của sự miễn dịch lần hai
 Bản sao chậm trễ sớm. bản sao protein N kêt shợp với RNA polymerase vi khuẩn
và đẩy mạnh bản sao của gene thể ăn khuẩn cuộn tròn vào trong bản sao DNA
 Sự tái tạo. sự tái tạo lớn tiến đến 1 đơn khởi nguyên của khu vực tái tạo. sự tái
tạo chậm trễ dẫn đến via 1 chu trình lăn cuôn tới sản xuất long concatamer của DNA
thể ăn khuẩn mà nó kết hợp với những thể ăn khuẩn khác tại những vị trí cos
 Bản sao trễ. Sản phẩm protein của gene cro che lấp đi mức độ quan trọng và sau
đó dừng lại ở bản sao sớm. sản phẩm của gene Q hoạt hoá bản sao, đưa đến kêt quả
sản phwmr protein cần đến cho đầu và đuôi của mảnh thể ăn khẩun truởng thành, và
những thể ăn khuẩn đó phụ thựôc vào sự phân huỷ tế bào vi khuẩn
Cuối cùng, tập hợp thể ăn khuẩn mang đến khi 1 đơn vị chiều dài của DNA được
mang vào tập hợp đầu bởi sự phân tách concatameric DNA tại vị trí cos. Đuôi thì
được thêm vào và những mảnh truởng thành thể ăn khuẩn được hoàn tất. Cùng với sự
phân huỷ tế bào , khoảng 100 mảnh thể ane khuẩn tổng hợp mới được phóng thích từ
1 tế bào lây nhiễm đơn vi khuẩn..
Wild-type λ DNA bao gồm một vài vị trí nhận ra enzyme hạn chế khác thường
bên trong những mảnh DNA ngoại lai có thể được nhân vô tính, và do vậy mà nó
không hoàn toàn thích hợp như là 1 vector để mang nhiều chuỗi. thêm vào đó, sự
gắn kết của DNA vào trong λ thể ăn khuẩn có kích cỡ giới hạn..
Khả năng gắn kết sẽ chỉ mang đến với những mảnh DNA tương ứng giữa 78 và
105 % so với kích thuớc của hệ gene wild – type ( 37 – 51 kbp). Những giới hạn đạt
ra hạn chế gay gắt với số lượng DNA mà có thể n\tạo dòng trong hệ gene thể ăn
97


Sản xuất protein trong y học

khuẩn. Hai luận điểm quan trọng, tuy nhiên, giả thiết đưa ra mà λ có thể phù hợp như
là vector tạo dòng.
Đầu tiên nó được xác định sản phẩm gene phụ thuộc vào sự tái tổ hợp có thể bị
loại bỏ bởi hệ gene λ và phân huỷ chu trình sống có thể vẫn đựoc hoàn thiện và
những mảng có hình thái, DNA còn lại, thường nhắc đến như ở bên tay trái hay tai
phải của hệ gene λ , khả năng có điều kiện tất cả chức năng tất yếu cho cong đưòng
phân huỷ mang tới. Điều thứ hai, tất nhiên mang lại những enzyme giới hạn bởi
những vị trí được nhận ra có thẻ được được loại trừ mà không có chức năng gene quá
ít, mà cho phép sự phát triển của vector với vị trí duy nhất cho sự găn vào của DNA
ngoại bào. 1 vector có thể theo cách đó được xây dựng mà nó thiếu những gene phụ
thuộc vào sự tái tổ hợp, và vì vậy mà có thể chỉ nhập vào chu trình phân giải, nhưng
có khả năng mang nhiều DNA lớn ngoại bào thêm vào. Hai buớc cơ bản của vector
vừa được phát triển:
Vector thêm vào – DNA được thêm vào trong 1 enzyme giới hạn nhận biết vị trí cắt
Vector thay thế - DNA ngoại bào thay thế cho những mảnh DNA (mảnh nhồi) của
vector

Sự thuận lợi của vector thay thế mà nó có khả năng mang nhưng đoạn DNA
lớn. ví dụ, λEMBL4 có 1 vector 42 kbp mà nó bao gồm có 14 kbp DNA đệm giữa bên
tay trái và phải của λ. Sự gắn chặt chỉ của nhửng chủng λ sẽ tạo ra 1 hệ gene λ 28kbp.
Cái đó quá nhỏ để xếp vào trong 1 mảnh λ . sự thêmvào DNA ngoại bào giữa 2 chủng
λ tuy nhiên hệ gene đạt tới kích cỡ gói gọn. Giới hạn kích thuớc gói gọn là cách thức
98


Sản xuất protein trong y học

mà λEMBL4 có khả năng lưu giữ những mảnh DNA ngoại lai khoảng chùng kích
thuớc 23kbp ( hình 3.12)

Giới hạn kích thước của gói λ như vậy cung cấp 1 bộ máy chắc chắn để DNA ngoại
bào được thêm vào giữa chủng λ tới dạng tái tổ hợp. Một vài kế hoạch cơ bản khác để
tìm ra để nhận dạng những thể ăn khuẩn λ tái tổ hợp..
Sự khử của gene cI. Một vài vector thể ăn khuẩn λ ( e.g λgt 11) có duy nhất
enzyme cắt giới hạn nhận dạng những vị trí cắt chứa đựng vị trí gene cI. Những thể ăn
khuẩn mà gene cI phá vỡ bởi sự thêm vào DNA ngoại lai có 1 thay đổi hình thái, mà
những mãng tạo ra xuất hiện “ clear” khi kháng lại sự hỗn độn. tấm chắn của loại này
là kĩ thật khó và phụ thuộc vào khả năng kết nối kỉ năng trên từng phần của nguời
quan sát.
Tấm chắn blue – white. Những vector ăn khuẩn λ ( e.g. λZAP) được xây dựng để
chứa đựng gen lacZ giống hệt nhau của the α-fragment và β -galactosidase. Tấm chắn
cho những thể ăn khuẩn tái tổ hợp có thể sau đó được hình thành trong tế bào E coli
Nhanh chóng từ the ω-fragment của β –galactosidase trong 1 con đường giống nhau tạo
nên tấm chắn tái tổ hợp trong pUC base plasmid. Một lựa chọn là hệ gene λ được tạo
ra, vấn đề là làm thế nào để đưa DNA vào trong vi khuẩn mà nó có thể tái tạo lại trong
E. coli ( hình 3.13), bình thưòng gói gọn trong vivo của λ DNA bao gồm đầu tiên làm
pre-head.

Một đơn vị chiều dài của DNA λ sau khi được thêm vào bên trong pre- head , với
đơn vị chiều dài chuẩn bị bởi sự phân chia của hệ gene λ concatamerized tại những vị
trí xung quanh. Một protein capsid thứ yếu D sau khi thêm vào trong pre – head để
hoàn thiện đầu chín, và những sản phẩm của những hệ gene khác đáp ứng như là
99


Sản xuất protein trong y học

protein chính yếu, bảo đảm sự liên kết của những đuôi đã hàn thành với dầu hoàn
thành. Gói gọn λ của hệ gene tái tổ hợp có để xảy ra trong in vitro bằng cách lợi dụng
2 đoạn E.coli mà chống lại λ phân giải kìm hãm những điểm khiếm khuyết khác nhau

gói gọn trong cô đưòng này.
Một điểm khuyết trong sản xuất protein E, kết quả từ một sự thay đổi t\bên trong
gene E, ngăn cản pre-head thành dạng thẳng BHB2688. một sự thay đổi trong gene D
cản trở sự thay đổi của pre-head, với DNA kết thúc, bên trong dầu hoàn thiện trong
strain BHB2690. thành phần của BHB2699/BHB2690 dung giải nhỏ nhất, tuy nhiên,
hoàn thành một vài thứ thiếu hụt khác nhau và cung cấp tất cả những sản phẩm gói
gọn chính xác ( hình 3.13 ). Do đó, hệ gene λ tái tổ hợp có thể đựoc tạo nên bằng in
vitro và gói gọn trong mảnh thể ăn khuẩn bình thường truớc khi tái sinh và nhân lên
trong tế bào Ecoli.
3.4. Các vector cosmid
Chỉ những đoạn DNA phù hợp cho in vitro mới được chuyển vào thể thực khuẩn λ
tại 2 điểm cos trong chuỗi trình tự ở khoảng 37 – 51 kbp. Vector cosmid đã được phát
triển nhờ quan điểm này, và nó giống plasmid ở chỗ được đưa vào trong thể thực
khuẩn λ ở điểm cos (Collins and Bruning, 1978). Hình 3.14 cho thấy toàn bộ cấu trúc
của một vector cosmid và một hệ thống tạo dòng vô tính để chuyển DNA ngoại lai.
Cũng như plasmid, cosmid gồm một bản sao và một marker lựa chọn. Cosmid cũng
chỉ có duy nhất một enzyme giới hạn để nhận biết điểm để chèn các đoạn DNA vào.
Sau khi phản ứng chuyển vừa xảy ra, thể λ mới sẽ được đưa vào tế bào E.coli. DNA
được chuyển vào cũng giống như các λ DNA bình thường và nó sẽ truyền đạt thông tin
bổ sung cho các điểm cos. Sẽ có hiện tượng thiếu hụt các chuỗi λ có nghĩa, tuy nhiên,
những đoạn λ chuyển sẽ không chuyển sang giai đoạn này. Thông tin trong DNA sẽ
được bảo vệ trong tế bào E.coli. Do vậy sự chọn lọc các thể biến dị sẽ dựa trên cơ sở
của sự kháng thuốc kháng sinh và khuẩn lạc của vi khuẩn sẽ có dạng chứa các cosmid
tái tổ hợp. Khi tiền thể thực khuẩn λ có thể chèn vào khoảng 37 – 51kbp, và hầu hết
cosmid có kích thước khoảng 5kbp thì đoạn DNA ở khoảng 37 – 41 kbp có thể được
tạo dòng thành những vector. Đây là một tính chất quan trọng so với việc tạo dòng từ
chính các vector λ
Cosmid, giống plasmid, rất bền vững, tuy nhiên phải chèn vào một đoạn DNA lớn
điều này có ý nghĩa trong việc bảo vệ vector trong tế bào vi khuẩn. Các chuỗi DNA
lặp lại thường gặp ở các DNA của sinh vật eukaryote, và sự tái cấu trúc của DNA có

thể dẫn đến sự tổ hợp lại các trình tự lặp lại của DNA chèn vào cosmid. Khó khăn
chính khi làm việc với cosmid là những sản phẩm tuyến tính, chuyển đoạn DNA vào
cosmid và chèn nhiều vị trí cùng lúc. Hai vấn đề cơ bản đặt ra:
Các phản ứng chuyển vào cosmid và chèn DNA, giống như những gì đã trình
bày trong hình 3.14, sẽ tạo ra những phân tử DNA vòng không có khả năng tham gia
vào phản ứng “bao gói” in vitro.
Có nhiều hơn một phân tử DNA được lồng vào sẽ gắn vào giữa đoạn DNA
cosmid. Điều này khiến cho cấu trúc DNA được lồng vào có vẻ sai khác.
100


Sản xuất protein trong y học

Những khó khăn này có thể được khắc phục với việc cắt cosmid với 2 enzyme giới
hạn khác nhau bằng việc tạo ra các điểm giới hạn trái và giới hạn phải để không kết hợp
với vị trí nào khác (Ish-Horowicz and Burke, 1981). Enzyme phosphastase sẽ tác động
lên DNA chèn để đảm bảo những đoạn lồng vào sẽ không chèn vào DNA của cosmid.
3.5 M13 vectors

M13 và các họ hàng của chúng là f1 và fd là thực khuẩn E.coli, dạng sợi. M13 là
một lysogenic phage giống đực đặc trưng (male – specific) – thực khuẩn thể sinh ra
virus phân hủy vi khuẩn khi bị kích thích. Hệ gene của chúng là một DNA chuỗi đơn
dạng vòng dài 6407 bp (hình 3.15). Thực khuẩn thể M13 (M13 phage) có kích thước
900 * 9 nm, chứa một vòng đơn phân tử DNA (goi là chuỗi +). M13 xâm nhập vào vi
khuẩn qua “cảng” là tiêm mao. Phage gắn một đầu vào tiêm mao rồi chuỗi đơn DNA
của chúng xâm nhập vào vi khuẩn ( hình 3.16). Chuỗi đơn nhân đôi một cách nhanh
chóng tạo chuỗi kép ( relicative form, RF) bằng cách tổng hợp mạch DNA bổ sung
(mạch -) sử dụng DNA polymerase của vi khuẩn. Dạng RF của phage tăng lên theo
cấp số nhân, khoảng 100 phân tử RF xuất hiện trong vi khuẩn. Quá trình phiên mã của
hệ gene virus sản xuất những protein cần thiết cho sự lắp ráp một virus mới. Chuỗi

đơn mã hóa protein (protein mã hóa bởi gene 2 ) thúc đẩy sự sao chép RF DNA chỉ có
101


Sản xuất protein trong y học

trên một mạch đơn của DNA virus( mạch +). Các chuỗi phân tử DNA mạch đơn được
lắp ráp trong các cơ thể virus mới rồi được giải phóng khỏi tế bào mà không phá hủy
tế bào đó. Một tế bào vi khuẩn giải phóng khoảng 1000 phage trong một vòng đời của
nó. Sự xâm nhiễm của thực khuẩn thể M13 không gây chết tế bào. Tế bào E.coli
không bị phá hủy nhưng chúng phát triển chậm lại do phải gánh vác việc tổng hợp các
bộ phận của phage. M13 nguyên thủy của quá trình sao chép (gọi là f1 ori) chứa 2
chuỗi DNA riêng biệt xếp chồng lên nhau có nhiệm vụ kiểm sóat quá trình sinh tổng
hợp DNA. Hai vị trí – f1 initiator (khởi đầu) và f1- terminator (kết thúc) là dấu hiệu
nhận biết sự bắt đầu và kết thúc sinh tổng hợp DNA. Vị trí khởi đầu được nhận biết
bởi protein tổng hợp từ gene 2 – nằm trên mạch + trong RF DNA. Ở vị trí này, vòng
DNA bắt đầu sao chép theo một chiều nhất định và kết thúc ở vị trí f1 terminator cũng
được nhận biết bởi protein mã hóa bởi gene 2.

Sự chuyển đổi giữa dạng mạch đôi RP và mạch đơn (+) của hệ gene của M13 làm
nảy ra ý tưởng ứng dụng chúng làm vector. Chúng ta sẽ theo dõi ở chương sau, DNA
mạch đơn tổng hợp từ phage rất thuận tiện trong kĩ thuật chuyển gene đột biến invitro
(chương 7) và DNA sequencing (chương 8). Khác với λ, M13 không có “ vùng không
cần thiết” có thể bị hủy trước khi gắn DNA ngoại lai. Nhưng lại có vùng intergenic
(vùng hoạt động) giữa vùng khởi đầu của quá trình lặp và gene 2( hình 3.15) trong đó
đoạn DNA ngoại lai được chèn vào. Vector M13 được phát triển cuối thập niên 70 khi
gene lacZ (mã hóa α- peptide của β-galacttosidase ) được chèn vào hệ gene M13
102

Sản xuất protein trong y học

(Messing và cộng sự, 1977). Sau đó, polylinker tương tự và những đoạn α–peptide như
dòng pUC plasmid được chuyển gene vào hệ gene M13, vùng nhận biết của enzyme cắt
giới hạn bị loại bỏ (Yanisch-Perron, Vieira and Messing, 1985; Norrander, Kempe and
Messing, 1983). Dạng RF của vector M13 có thể được xử lí qua các bước chuẩn bị như
DNA plasmid và DNA ngoại lai được chèn vào như plasmid thông thường.
Những ứng dụng đặc trưng của vector M13 giúp chúng được sử dụng như những
phương tiện hình thành chuỗi đơn DNA. Một đoạn DNA ngoại lai được tạo dòng vô
tính trong M13, một lượng lớn chuỗi đơn sau đó được cô lập dễ dàng từ các phage
trưởng thành xuất ra từ tế bào vi khuẩn E.coli. Khó khăn chính ở dạng vector này là
chúng sẽ không ổn định khi đoạn DNA ngoại lai gắn vào lớn hơn vài kilobases.
(Zinder and Boeke, 1982).

103


Sản xuất protein trong y học

3.6 Phagemids
Phagemids là những plasmid chứa đọan phage f1 gốc của sự sao chép để sinh
mạch đơn DNA. Phagemids thường là những đoạn plasmid nhỏ vì vậy chúng có khả
năng tiếp nhận những đoạn DNA lớn hơn chèn vào đó hơn vector M13-based.
Phagemids lần đầu tiên được phát triển vào đầu những năm 1980, khi người ta khám
phá ra rằng sự thêm vào của bản gốc f1 khi tái sinh có thể sao chép thành pBR322 để
sinh mạch đơn DNA (Dotto và Horuichi, 1981; Dotto, Enea và Zinder, 1981). Sự sao
chép bản gốc f1 không đủ để điều khiển sự sản sinh mạch đơn DNA, nhưng nếu một
giống vi khuẩn mang phagemid trong cơ thể bị nhiễm độc bởi cấu trúc wild-type M13
hoặc f1 helper phage, thì sự sản sinh mạch đơn phagemid DNA sẽ xảy ra. Các
phagemid mạch đơn DNA sẽ được đóng thành các hạt virus và tiết vào môi trường

xung quanh theo cùng một cách mà các hạt thực khuẩn M13 được sản sinh. Ngoài ra,
người ta khám phá rằng việc nhân bản bản gốc f1 trong việc định hướng đảo ngược sẽ
dẫn đến việc sản sinh các mạch đối diện của DNA (Dente, Cesavent and Cortese,
1983). Vì vậy, mạch đơn DNA đại diện hoặc mạch của sợi nhân bản có thể sản sinh
sau khi nhân bản vô tính thành một vector phagemid phù hợp. Những phagemids có
một điểm là, khi phage hỗ trợ vắng mặt, sợi đôi DNA được tách ra như một plasmid
bình thường. Hơn nữa, sự thiếu các gene bổ sung của thể thực khuẩn mà các vector
cần mang nghĩa là kích thước nhỏ của chúng có sự gia tăng về công suất để mang
những đoạn DNA bên ngoài.
Những phagemids khác đã được phát triển để tận dụng lợi thế từ những khía cạnh
khác nhau của plasmids, λ phage và M13 phage. Chúng ta thấy rằng sự sao chép bản
gốc f1 đều có cùng khởi đầu và kết thúc. Trong bộ máy di truyền của thể thực khuẩn
M13, những giải trình tự này trùng lập với nhau, như vậy việc sao chép lại sẽ bắt đầu
và kết thúc sau khi đã hình thành bộ máy di truyền hình vòng. Những phần tử khởi đầu
và kết thúc sẽ được phân cắt riêng biệt để xác định những điểm khởi đầu và kết thúc
cho việc sao mã DNA. Một loại vector λ bổ sung, λZAP, được xây dựng như vậy phía
bên trái và phải của cánh tay λ sẽ được kết nối thông qua giải trình tự DNA của một
phagemid bắt đầu với f1 khởi đâu và kết thúc với f1 kết thúc (Short và cộng sự, 1988).
Loại Vector này (hình 3.17) có khả năng thực hiện chức năng của một thể thực khuẩn
λ, ví dụ, xây dựng cấu trúc thư viện cDNA. Tuy nhiên, DNA ngoại bào có thể được cắt
từ λ phage dưới dạng một plasmid sau khi dã gây nhiễm lần 2 bằng thể thực khuẩn
M13. λZAP chứa đựng tất cả những giải trình tự λ DNA cần thiết cho sự tăng trưởng
của các yếu tố gây phân hủy (lytic), và giữa các sợi DNA này là một giải trình DNA
cần thiết cho sự sao mã plasmid và chọn lọn (ColE1 ori và AMPR). Thêm vào dó,
λZAP chứa gene lacZ và nhiều mạng lưới tự nhân bản với cùng một hình dáng tương
tự với pUC plasmids. Giải trình tự plasmid trong vector bắt đầu với f1 khởi đầu và kết
thúc với f1 kết thúc. Vector mang DNA ngọai bào có thể được chọn lọc bởi bộ lọc
xanh-trắng của màng λ và DNA bổ sung có thể bị cô lập dưới dạng của một plasmid
khi vi khuẩn chứa các thể thực khuẩn λ bị nhiễm bởi phage f1 hỗ trợ. Mạch đơn DNA
sẽ phát “thông tư” và sẽ được đóng gói như một M13 – như một thể thực khuẩn và tiết

ra từ tế bào. Sự ra đời của thể thực khuẩn M13 sẽ hợp thành chủng F_E.coli và việc
104


Sản xuất protein trong y học

chọn lọc trên các ampicillin sẽ dẫn đến việc hình thành một cụm chứa những plasmid
tái tổ hợp, để rồi sau đó có thể bị cô lập như những plasmid mạch đôi.

3.7 Nhiễm sắc thể nhân tạo.
Hạn chế chủ yếu của hầu hết các vector mà chúng ta đã nghiên cứu cho đến nay là
giới hạn về kích thước của DNA cần tạo dòng. NST của sinh vật nhân chuẩn chứa
hàng trăm hoặc hàng ngàn gene, cùng với DNA những yếu tố cần thiết cho sự ổn định
về chức năng của NST như telomeres và centromeres. Telomeres, trong đó bao gồm
DNA và protein, được đặt ở cuối NST và bảo vệ chúng khỏi bị hư hỏng. Centromeres
(tâm động) là những phân đoạn DNA lặp lại rất cần thiết cho sự sắp xếp của NST
trong suốt quá trình phân bào.
Các vector phải được thiết kế hợp lý sao cho nhân bản được nhiều đoạn DNA, do
đó, để khôi phục sự sao chép NST một cách chủ động trong các phân đoạn DNA có
thể dung kĩ thuật nhân bản vô tính. Nhân bản vô tính theo cách này cũng tương tự như
nhân bản vô tính trong phage λ – với sự tái tạo lại của các phân tử DNA – ngoại trừ
các DNA ngoại lai có thể được nhân bản vô tính với tỉ lệ cao hơn.
3.7.1 YACs
Các NST nhân tạo của nấm men (YAC). Vector YAC cho phép tạo dòng, trong các
tế bào nấm men, các đoạn DNA ngoại lai có thể có kích thước tới 500 kbp. Trong
những vector chứa các thành phần quan trọng của NST, bao gồm cả các thành phần
sau đây.
105

Sản xuất protein trong y học

A yeast centromere (CEN4). Trình tự của tâm động, đảm bảo sự chia đôi và đi về 2
cực của tế bào như tâm động, được quy định bởi một đoạn DNA với kích thước 125
bp. Chuỗi hoàn chinh bao gồm 3 yếu tố: một phân đoạn dài 78-86 bp với hơn 90%
lượng AT, một đoạn bảo tồn ở một bên và một đoạn bảo toàn ngắn ở bên khác (ghi
nhận của Clarke – 1990).
Yeast autonomously replicating sequence (ARS1). Trình tự sao chép tự chủ của
nấm men, là yếu tố cần thiết của quá trình nhân bản trong tế bào nấm men từ sự tự sao
chép của NST ở nấm men.
Yeast telomeres (TEL). Trình tự đầu cuối của NST, Telomeres là trình tự đặt biệt
(5_-TGTGGGTGTGGTG-3_) có mặt ở các đầu của NST trong nhiều bản sao và là cần
thiết cho sự tái tạo và duy trì NST.
Genes for YAC selection in yeast. Các gen phù hợp với sự lựa chọn của YAC.
Vector có một bản sao chức năng của URA3, một gen liên quan đến sự sinh tổng hợp
uracil, và TRP1, một gen liên quan đến sự sinh tổng hợp tryptophan, đó là sự lựa chọn
của các tế bào nấm men có mang vector.
Bacterial replication origin and a bacterial selectable marker. Vi khuẩn tái tổ hợp
và vi khuẩn chuẩn di truyền. Để truyền các vector YAC vào trong các tế bào vi khuẩn,
trước khi chèn vào hệ gen, các vector YAC thường chứa các ori ColE1 và các gen
kháng ampicillin giúp cho sự tăng trưởng và phân tích trong E.coli.

Hình 3.18. Cloning of very large DNA fragments into a YAC vector.
106


Sản xuất protein trong y học

Quá trình tạo dòng các đoạn DNA trong 1 YAC được thể hiện sơ lược trong hình
3.18. Các YAC được cắt ở một vị trí xác định bằng một enzyme cắt giới hạn tạo thành

hai nhánh mà mỗi nhánh đều có 1 chuỗi telomere ở cuối. Một trong hai nhánh chứa 1
trình tự sao chép tự chủ (ARS1), 1 trình tự trung tâm (CEN4) và có dấu chuẩn di
truyền (TRP1).
Nhánh khác chứa dấu chuẩn di truyền (URA3). Những đoạn DNA lớn (>100kbp)
được nối giữa 2 nhánh (Anand, Villasante and Tyler-Smitu, 1989). Việc chèn các
DNA ngoại lai vào đã bất hoạt tRNA của gen SUP4, thể hiện chức năng tRNATyr trong
DNA vector. Trong một ade2–ochre của tế bào nấm men, sự biểu hiện của SUP4 là sự
hình thành các khuẩn lạc màu trắng, trong khi đó việc chèn các DNA ngoại lai sẽ thể
hiện các khuẩn lạc màu đỏ (Burke, Carle and Olson, 1987). Tế bào nấm men được đột
biến ở gen sản phẩm ADE2 (mã hóa cho các enzyme phosphoribosylaminocacboxylaza-imidazol) tạo ra nhiều con đường sinh tổng hợp adenine, làm chúng tích
tụ trong không bào. Sự tích tụ này đã tạo cho tế bào có màu đỏ. Các YACs tái tổ hợp
đã biến đổi một loại nấm men mà trong đó có sự sai sót ở các bản sao NST của các gen
ura3, trp1 và ade2. Quá trình biến nạp này đã được xác định bằng các khuẩn lạc phát
triển bất định trên những vùng thiếu uracil và tryptophan. Điều này đảm bảo rằng các
tế bào đã nhận được một nhiễm sắc thể nhân tạo có cả hai telomere (vì sự bổ sung của
2 yếu tố dinh dưỡng) và nhiễm sắc thể nhân tạo có chứa DNA chèn (vì tế bào có màu
đỏ). Có những khó khăn liên khi làm việc với YACs. Một số trong số này là được liệt
kê dưới đây.
 Rất nhiều phân tử DNA lớn rất yếu và dễ gãy, vấn đề đầu tiên là sắp xếp lại.
 Theo ước tính có khoảng 10-60% bản sao được lưu trong thư viện bộ gen là thể
khảm, tức là từ các vùng khác nhau của bộ gen trở thành một bản sao YAC đơn
(Green và cộng sự, 1991.).
 Dòng vô tính có xu hướng không ổn định, với các DNA ngoại lai thường bị biến
mất. Trình tự DNA vốn có lặp lại rất hiếm trong hệ gen của nấm men, và với việc chèn
các trình tự DNA của người sẽ làm tăng tầng số tái tổ hợp trong YAC. Điều này có thể
làm cho YAC không ổn định. Thật thú vị, tuy nhiên, các vector YAC lớn hơn ổn định
hơn so với các vector ngắn, do đó nó được chọn để tạo các DNA lớn (Smith, Smyth
and Moir, 1990).
 Có một tỷ lệ lớn các YAC nguyên chất mất trong suốt quá trình tăng trưởng
 Thật khó khăn để tách các YAC từ các NST vật chủ khác vì kích thước của

chúng quá giống nhau. Việc tách chúng đòi hỏi kĩ thuật phức tạp pulsed-field gel
electrophoresis (PFGE) (điện di trên gel với trường dao động).
 Sản lượng của ADN là không cao khi YAC được phân lập từ tế bào nấm men.
3.7.2 PACs
Để khắc phục một số vấn đề liên quan đến sử dụng cosmid hoặc hệ thống YAC,
một phương pháp để nhân bản và đóng gói các đoạn DNA bằng cách sử dụng thể thực
khuẩn P1đã được phát triển để cung cấp khả năng sao chép các đoạn DNA với kích
thước lớn từ 70-95 kbp. Thể thực khuẩn P1 có một bộ gen lớn hơn nhiều so với phage
107