Tiêu chuẩn ngành 10 TCN 729-2006

BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PHÁT TRIỂN NÔNG THÔN
__________________

 10TCN                        TIÊU CHUẨN NGÀNH

10 TCN 729­2006
QUY TRÌNH CHẨN ĐOÁN BỆNH PHÙ Ở LỢN
DO VI KHUẨN E. COLI


                                                                                                                   10 TCN  729 – 2006

Hà Nội ­ 2006

TIÊU CHUẨN NGÀNH                                                                             10 TCN  729 – 2006

QUY TRÌNH CHẨN ĐOÁN BỆNH PHÙ Ở LỢN
DO VI KHUẨN E. COLI
(Ban hành kèm theo Quyết định số                   QĐ/BNN­KHCN
ngày           tháng 5 năm 2006 của Bộ trưởng Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông 
thôn)
1. Pham vi ap dung: 
̣
́
̣
Áp dung cho cac can bô thu y đê chân đoan bênh phu 
̣
́ ́ ̣
́
̉
̉

́ ̣
̀ở lợn do vi khuân 
̉ E.coli gây ra
2. Khai niêm bênh
́ ̣
̣

Bênh phu 
̣
̀ở lợn do vi khuân 
̉ E. coli co yêu tô bam dinh F18 va co kha năng san sinh đôc
́ ́ ́ ́ ́
̀ ́ ̉
̉
̣  
tô verotoxin 2e gây ra.  Khi co 
́
́stress đăc biêt la khi thay đôi chê đô dinh d
̣
̣ ̀
̉
́ ̣
ưỡng, nhưng chung
̃
̉  
E.coli  chung co nhân tô bam dinh Fimbriae 18 (F18)
̉
́
́ ́
́

  nhân lên trong ruôt non va bam vao
̣
̀ ́
̀ 
thanh ruôt.
̀
̣  Cac vi khuân nay san sinh đôc tô 
́
̉
̀ ̉
̣ ́Verotoxin (VT2e), đôc tô nay đ
̣
́ ̀ ược hâp phu vao
́
̣ ̀ 
mau va đên cac tê bao biêu mô cua cac vi mach quan lam c
́ ̀ ́ ́ ́ ̀
̉
̉
́
̣
̉
̀ ương thâm thâu qua mach quan
̀
̉
́
̣
̉  
gây ra phu va cac triêu ch
̀ ̀ ́

̣
ưng thân kinh điên hinh nh
́
̀
̉
̀
ư: Đi lai loang choang, xiêu veo hay nga,
̣
̣
̣
̣
̃ 
co khi co giât.
́
̣
3. May moc ­ dung cu ­ môi tr
́
́
̣
̣
ương ­ hoa chât ­ nguyên liêu
̀
́ ́
̣
3.1 May moc va dung cu
́
́ ̀ ̣
̣
­ Tu lanh 
̉ ̣

0
­ Tu âm 37
̉ ́
C

2


                                                                                                                   10 TCN  729 – 2006
­ Tu sây
̉ ́
­ Lo vi song
̀
́
­ Nôi hâp 
̀ ́ ướt
­ Cân điêṇ
­ Kinh hiên vi phong đai 1000 lân
́
̉
́
̣
̀
­ Nôi đun cach thuy (
̀
́
̉ Water bath)
­ Bô đô mô tiêu gia suc 
̣ ̀ ̉ ̉
́

­ Dung cu thuy tinh: Binh tam giac, ông đong, côc co mo, chai thuy tinh, đia lông, ông
̣
̣
̉
̀
́ ́
́ ́ ̉
̉
̃ ̀
́  
nghiêm, pipet, lam kinh.
̣
́
­ Cac dung cu khac: Panh, keo, dao căt, que cây, đen côn, but viêt kinh, bông thâm
́
̣
̣
́
́
́
́
̀
̀
́
́ ́
́  
nươc, bông không thâm n
́
́ ước, khăn bông hoăc giây thâm mêm
̣

́
́
̀
­ Dung cu đo pH 
̣
̣
3.2. Hoa chât
́ ́
­ Côn 
̀ Ethylic 
­ Côn 
̀ Methylic – côn 
̀ isomylic
­ Xylen
­ Natri hydroxyt
­ Natri bicarbonat
­ Nươc cât 
́ ́
­ Dâu soi kinh 
̀
́
­ Bô thuôc nhuôm Gram (xem phu luc 1)
̣
́
̣
̣ ̣
­ Thuôc th
́ ử Kovacs (xem phu luc 1)
̣ ̣
­ Thuôc th

́ ử Voges­Prskauer (xem phu luc 1)
̣ ̣
­ Methyl red 
3.3. Môi trương va nguyên liêu
̀
̀
̣
­ Thach mau c
̣
́ ơ ban (
̉ Blood agar base)
­ Thach MacConkey (hoăc thach 
̣
̣
̣ Brilliant green) 
­ Môi trương VP­MR
̀
­ Nươc 
́ peptone 
­ Môi trương 
̀ Cimon Citrate
­ Mau bo, bê hoăc c
́ ̀
̣ ưu 
̀
­ Bô khang huyêt thanh 
̣
́
́
E.coli chuân cua l

̉
̉ ợn 
­ Khang nguyên F18
́
­ Căp môi (
̣
̀ primer) phat hiên yêu tô bam dinh F18
́ ̣
́ ́ ́ ́
­ Căp môi (
̣
̀ primer) phat hiên gene vt2e (yêu tô đôc l
́ ̣
́ ́ ̣ ực VT2e)
­ Cac nguyên liêu cân thiêt cho PCR
́
̣
̀
́
4. Phương phap chân đoan
́
̉
́
Sơ đô chân đoan bênh phu do vi khuân 
̀ ̉
́ ̣
̀
̉ E. coli 
Sơ đô chân đoan bênh phu do vi khuân 
̀ ̉

́ ̣
̀
̉ E. coli
§Æc ®iÓm
dÞch tÔ

KiÓm tra l©m
sµng

3


                                                                                                                   10 TCN  729 – 2006

Mæ kh¸m
KiÓm tra bÖnh tÝch

BÖnh phÈm

Ph©n lËp, gi¸m ®Þnh
sinh ho¸, KHV

X¸c ®Þnh yÕu tè ®éc
lùc F18 vµ VT2

§Þnh týp huyÕt
thanh
KÕt luËn
4.1.Đăc điêm dich tẽ
̣

̉
̣
­ Bênh th
̣
ương xuât hiên tr
̀
́ ̣ ước va sau khi cai s
̀
ưa. 
̃
­ Bênh xuât hiên le te, it lây lan t
̣
́
̣
̉ ̉ ́
ừ đan nay sang đan khac va th
̀ ̀
̀
́ ̀ ương trong điêu kiên
̀
̀
̣  
nuôi dương tôt.
̃
́
­ Lợn bi bênh th
̣ ̣
ương la nh
̀
̀ ưng con phat triên nhanh nhât trong đan.

̃
́
̉
́
̀
­ Ti lê chêt khoang 65%.
̉ ̣
́
̉
4.2. Triêu ch
̣
ưng lâm sang
́
̀
­ Môt hoăc nhiêu l
̣
̣
̀ ợn bi chêt đôt ngôt ma không biêu hiên triêu ch
̣
́ ̣
̣
̀
̉
̣
̣
ưng lâm sang. 
́
̀
­ Thân kinh rôi loan bao gôm: đi lai loang choang, xiêu veo hay nga, co khi co giât.
̀

́ ̣
̀
̣
̣
̣
̣
̃ ́
̣
­ Phu ̀ở mi măt, 
́ ́ ở măt, phân bung phu va s
̣
̀ ̣
̀ ̀ ưng to.
­ Thở kho, kêu khan khan do thanh quan bi phu.
́
̀
̀
̉
̣
̀
­ Lợn co biêu hiên bo ăn, bo bu. Hiên t
́ ̉
̣
̉
̉ ́
̣ ượng nay co the keo dai trong nhiêu ngay. 
̀ ́ ̉ ́ ̀
̀
̀
­ ia chay, phân long co khi toan n

̉
̉
̉
́
̀ ươc hoăc lân cuc mau t
́
̣ ̃ ̣
́ ươi.
­ Lợn thường chêt trong vong t
́
̀ ừ 4 giờ đên 48 gi
́
ờ sau khi co triêu ch
́ ̣
ứng lâm sang. 
̀
4.3. Bênh tich
̣
́
­ Phu d
̀ ươi da toan thân.
́
̀
­ Phu ̀ở mi măt, kêt mac,  đ
́ ́ ́ ̣
ường cong lớn da day.
̣ ̀
­ Co dich nhây 
́ ̣
̀ ở dươi niêm mac da day.

́
̣
̣ ̀

4


                                                                                                                   10 TCN  729 – 2006
­ Tran dich mang tim, mang phôi, xoang bung tich n
̀ ̣
̀
̀
̉
̣
́ ươc.
́
­ Mau đăc sâm, phôi viêm, gan s
́ ̣
̃
̉
ưng , tim nhao, hach ruôt viêm toan bô.
̃
̣
̣
̀ ̣
4.4.Phương phap chân đoan trong phong thi nghiêm
́
̉
́
̀

́
̣
   4.4.1. Lây mâu
́
̃
­ Dung cu lây mâu: lo thuy tinh, binh tam giac hoăc tui nilông vô trung
̣
̣ ́
̃ ̣
̉
̀
́
̣ ́
̀
­ Bênh phâm: Lây vô trung phu tang, hach mang treo ruôt, ruôt non môi  loai cho vao
̣
̉
́
̀
̉ ̣
̣
̀
̣
̣
̃
̣
̀ 
tưng lo riêng biêt đây kin va đ
̀
̣

̣ ̣
́ ̀ ưa ngay vao phong xet nghiêm cang nhanh cang tôt. Nêu phong
̀
̀
́
̣
̀
̀
́
́
̀  
0
0
thi nghiêm 
́
̣ ở  xa, bênh phâm phai đ
̣
̉
̉ ược bao quan trong đIêu kiên lanh t
̉
̉
̀
̣
̣
ừ 2 C đên 8
́ C va g
̀ ửi 
vê phong xet nghiêm châm nhât 48h sau khi lây mâu.
̀ ̀
́

̣
̣
́
́
̃
  4.4.2. Nuôi cây, phân lâp giam đinh vi khuân
́
̣
́ ̣
̉
  4.4.2.1. Nuôi cây, phân lâp 
́
̣
Bênh phâm đ
̣
̉
ược nuôi cây trên môi tr
́
ương: Thach mau, thach
̀
̣
́
̣   MacConkey  (nêú  
không co thach
́ ̣  MacConkey  thi co thê thay băng thach
̀ ́ ̉
̀
̣  Brilliant green). Nuôi  ở  370C trong 
điêu kiên hiêu khi  24 gi
̀

̣
́
́
ờ. 
   4.4.2.2. Giam đinh đăc tinh sinh hoa
́ ̣
̣ ́
́
           Môt sô đăc tinh sinh hoa đăc tr
̣ ́ ̣ ́
́ ̣ ưng cua vi khuân 
̉
̉ E.coli
Vi khuân̉

Indol

MR

VP

Citrate

Lactose

E.coli

+

+

­

­

+

Dung 
huyêt́
±

­ Trên môi trương thach 
̀
̣ MacConkey khuân lac 
̉
̣ E.coli co mau hông đâm, nham, đ
́ ̀ ̀
̣
́
ường 
kinh 2­4 mm. 
́
­ Trên môi trương thach 
̀
̣ Brilliant green khuân lac 
̉
̣ E.coli mau vang va môi tr
̀ ̀
̀
ường trở 

nên vang chanh. 
̀
­ Thach mau: 
̣
́ E. coli gây bênh phu th
̣
̀ ương gây dung huyêt thach mau. Khuân lac mau
̀
́
̣
́
̉
̣
̀ 
trăng xam, tron, bong. 
́
́
̀
́
­ Kiểm tra hình thái vi khuẩn trên kính hiển vi:
Lấy que cấy chấm vào khuẩn lạc nghi ngờ trên thạch máu, hòa vào gịot nước sinh lý 
trên phiến kính hoặc lấy một vòng que cấy canh trùng đã nuôi cấy vi khuẩn giàn mỏng trên  
phiến kính, để khô, rồi cố định tiêu bản trên ngọn lửa đèn cồn.
Tiêu bản sau khi đã được cố  định, nhuộm bằng phương pháp Gram (Phụ  lục 4). Xem  
tiêu bản bằng vật kính dầu 100X.
Vi khuẩn bắt mầu đỏ  (màu Gram âm), dạng trực khuẩn ngắn, cầu khuẩn hoặc hình 
bầu dục, đứng rải rác, không thành chuỗi.
­ Sau khi kiểm tra hình thái trên kính hiển vi, cấy khuẩn lạc vào môi trường thạch  
McConkey.
­ Chọn khuẩn lạc có mầu hồng đậm trên thạch McConkey cấy vào môi trường nước 

thịt hay nước peptone để tiếp tục kiểm tra các đặc tính sinh hóa.
­ Phan 
̉ ưng IMViC 
́
IMViC = sinh Indol, methyl red (MR), Voges­Proskauer (VP) va citrate)
̀

5


                                                                                                                   10 TCN  729 – 2006
Từ nhưng khuân lac co mau hông đâm trên thach
̃
̉
̣
́ ̀
̀
̣
̣   MacConkey  va gây dung huyêt trên
̀
́
 
thach mau, tiên hanh lam phan 
̣
́
́ ̀
̀
̉ ưng IMViC.
́
Vi khuân 

̉ E. coli co IMViC=  +/ + / ­/­
́
+ Sinh  Indol: cây khuân lac vao môi tr
́
̉
̣
̀
ương n
̀
ươć  peptone  hay môi trương co ch
̀
́ ưá  
0
tryptophan, nuôi ở 37 C từ 18 giờ đên 24 gi
́
ơ. Nho 0,2 ml đên 0,3 ml thuôc th
̀
̉
́
́ ử   Kovacs vaò  
môi trương đa nuôi cây vi khuân, nêu trên bê măt môi tr
̀
̃
́
̉
́
̀ ̣
ường co vong mau đo 
́ ̀
̀ ̉ ở la phan 

̀ ̉ ứng  
dương tinh.   
́
+ VP: Cây khuân lac nghi ng
́
̉ ̣
ờ vao môi tr
̀
ường nươc VP­MR, nuôi 
́
ở 37 0C sau 24 giờ nhỏ 
vao môi tr
̀
ương nuôi cây trên 5 giot thuôc th
̀
́
̣
́ ử VP (xem phân phu luc), đoc kêt qua sau 2 gi
̀
̣ ̣
̣
́
̉
ơ ̀
phut, nêu co mau đo hông la d
́ ́ ́ ̀ ̉ ̀
̀ ương tinh, không biên mau hoăc mau vang la âm tinh.
́
́
̀

̣
̀ ̀
̀
́
0
+ MR: Cây khuân lac nghi ng
́
̉
̣
ờ vao môi tr
̀
ương n
̀
ươc VP­MR, nuôi 
́
ở  37 C sau 24 giơ ̀
0
nho vao môi tr
̉ ̀
ương nuôi cây trên 5 giot dung dich đo methyl trong côn 95
̀
́
̣
̣
̉
̀
 (xem phân phu
̀
̣ 
luc), đoc kêt qua sau 5 phut, nêu co mau đo la phan 

̣
̣
́
̉
́ ́ ́ ̀ ̉ ̀ ̉ ứng dương tinh, co mau vang la âm tinh.
́
́ ̀ ̀
̀
́
+  Citrate: kiêm tra s
̉
ự  sử  dung
̣  citrate  cua vi khuân. Cây khuân lac vao thach
̉
̉
́
̉
̣
̀
̣  simon  
0
citrate  nuôi  ở  37 C từ 18 giờ đên 24 gi
́
ờ. Vi khuân s
̉ ử  dung citrate (d
̣
ương tinh) lam môi
́
̀
 

trương chuyên t
̀
̉ ừ mau xanh la cây sang mau xanh n
̀
́
̀
ươc biên. Âm tinh khi môi tr
́
̉
́
ường giư ̃
nguyên mau xanh la cây.  
̀
́
   4.4.2.3. Kiêm tra kha năng san sinh đôc tô F18 va VT2e
̉
̉
̉
̣ ́
̀
Kiêm tra yêu tô bam dinh F18 băng phan 
̉
́ ́ ́
́
̀
̉ ưng 
́ Polymerase chain reaction (PCR) hay ngưng 
kêt nhanh trên phiên kinh
́
́ ́

­ Kiêm tra băng phan 
̉
̀
̉ ưng ng
́
ưng kêt nhanh trên phiên kinh v
́
́ ́ ới khang nguyên F18
́
+  Đê tim yêu tô bam dinh F18, nuôi cây vi khuân 
̉ ̀
́ ́ ́ ́
́
̉ E. coli trên môi trương 
̀ Minca hoăc̣
+  Lây khuân lac, hoăc vi khuân trong cac canh trung nuôi cây lam phan 
́
̉
̣
̣
̉
́
̀
́ ̀
̉ ưng ng
́
ưng kêt́ 
nhanh trên phiên kinh v
́ ́ ơi khang nguyên F18 theo h
́

́
ương dân cua nha san xuât
́
̃ ̉
̀ ̉
́
­ PCR đê phat hiên gene f18 san sinh yêu tô bam dinh F18 
̉
́ ̣
̉
́ ́ ́ ́
4.4.2.4. Kiêm tra kha năng san sinh đôc tô 
̉
̉
̉
̣ ́Verotxin 
­ Kiêm tra đôc l
̉
̣ ực trên đông vât thi nghiêm la chuôt nhăt trăng 
̣
̣
́
̣
̀
̣
́ ́
+ Tiêm 2 chuôt nhăt trăng môi con 0,2 ml canh trung nuôi cây tinh (không lăc). Nêu co
̣
́ ́
̃

̀
́ ̃
́
́ ́ 
đôc l
̣ ực chuôt chêt sau 24 gi
̣
́
ơ.̀
­ Dung phan 
̀
̉ ưng PCR phat hiên gene vt2e (yêu tô đôc l
́
́ ̣
́ ́ ̣ ực VT2e ­ Nêu co điêu kiên)
́ ́ ̀
̣

5. Kêt luân
́
̣
Dựa trên đăc điêm dich tê, 
̣
̉
̣
̃  triêu ch
̣
ưng lâm sang, bênh tich 
́
̀

̣
́  va kêt qua chân đoan
̀ ́
̉
̉
́ 
trong phong thi nghiêm:
̀
́
̣
­ Phân lâp, giam đinh đăc tinh sinh hoa
̣
́ ̣
̣ ́
́
­ Kiêm tra yêu tô đôc l
̉
́ ́ ̣ ực F18 va VT2e
̀
KT. BỘ TRƯỞNG
          THỨ TRƯỞNG

6


                                                                                                                   10 TCN  729 – 2006

        Bùi Bá Bổng

Phu luc

̣ ̣
Phu luc 1: Nhuôm gram
̣ ̣
̣
1. Thuôc nhuôm
́
̣
a. Dung dich kêt tinh tim 
̣
́
́
Kêt tinh tim 
́
́
Nươc cât
́ ́
b. Dung dich 
̣ fuscin mẹ
Fucsin kiêm 
̀
0
Côn 96
̀
 C 
Axit phenic kêt tinh 
́

2,5g
1000 ml
1g

10 ml
5g

7


                                                                                                                   10 TCN  729 – 2006
Nươc cât
́ ́
100ml
          Pha loang dung dich me theo ti lê 1/10 v
̃
̣
̣
̉ ̣
ơi n
́ ươc cât khi nhuôm
́ ́
̣
c. Dung dich 
̣ lugol 
Iodua kali 
1g
Iodua tinh thê ̉
0,5g
Nươc cât
́ ́
150 ml
d. Côn axeton 
̀

Côn nguyên chât 
̀
́
3 phân 
̀
Axeton 
1 phâǹ
2. Cach nhuôm 
́
̣
- Nho dung dich tim  lên tiêu ban: 1 phut đên  2 phut 
̉
̣
́
̉
́ ́
́
- Rửa nươc nhanh, vây khô n
́
̉
ươć
- Nho dung dich 
̉
̣ lugol: đê 1 phut 
̉
́
- Rửa nươc nhanh, vây khô 
́
̉
- Nho côn 

̉ ̀ Axeton 
- Rửa nươc thât nhanh
́
̣
- Nho dung dich 
̉
̣ fucsin loang: Đê 1 phut 
̃
̉
́
- Rửa nươc 
́
- Thâm khô. Sây khô 
́
́
3. Xem kinh băng vât kinh dâu
́
̀
̣ ́
̀
- Vi khuân gram d
̉
ương băt mau tim 
́ ̀ ́
- Vi khuân gram âm băt mau đo 
̉
́ ̀ ̉

Phu luc 2: Thuôc th
̣ ̣

́ ử Kovacs
a­ Paradimetylaminobenzaldehyte   2,5 g
b­ Amyl alcohol (côn amyl)
̀
 37,5 ml
c­ HCL đăc̣
12,5 ml
0
Cach pha: Hoa dung dich a vao b cho tan hêt va đê trong t
́
̀
̣
̀
́ ̀ ̉
ử lanh âm 4
̣
C. Thêm 5ml đêń  
10 ml HCL tư t
̀ ư hoa đêu rôi đê tu lanh cho lanh lai tiêp tuc đô HCL cho đu l
̀ ̀ ̀ ̀ ̉ ̉ ̣
̣
̣
́ ̣
̉
̉ ượng.
* Thuôc th
́ ử không được đê qua nong trong luc pha chê. Bao quan trong lo mau, lanh.
̉
́ ́
́

́ ̉
̉
̣ ̀ ̣
Dương tinh: Vong thuôc th
́
̀
́ ử co mau đo
́ ̀ ̉
Âm tinh: Vong thuôc th
́
̀
́ ử co mau vang
́ ̀ ̀
                                        

8


                                                                                                                   10 TCN  729 – 2006
Phu luc 3: Thuôc th
̣ ̣
́ ử phan 
̉ ưng VP
́
Chê thuôc th
́
́ ử
­ Dung dich 1:     Alpha­naphthol            5g
̣
                            Côn 96                          100 ml

̀
­ Dung dich 1:     NaOH                            40g
̣
                            Nươc cât                        100 ml 
́ ́
Tiên hanh phan 
́ ̀
̉ ưng: cây vi khuân cân kiêm tra vao  môi tr
́
́
̉
̀
̉
̀
ường VP – MR, nuôi cây 
́ ở 
370C  từ 24 giờ đên 48 gi
́
ờ, sau đo nho vao môi tr
́ ̉ ̀
ường nuôi cây trên 5 giot dung dich 1 va 2.
́
̣
̣
̀  
Sau 5 phut co mau đo hông la 
́ ́ ̀ ̉ ̀
̀phan 
̉ ưng d
́ ương tinh. Không biên mau hoăc mau vang la phan

́
́
̀
̣
̀ ̀
̀ ̉  
ưng âm tinh. 
́
́

Phu luc 3: Thuôc th
̣ ̣
́ ử phan 
̉ ưng MR
́
Đo methyl            0,04g
̉
Côn 95                 60 ml
̀
Nươc cât              40 ml
́ ́

9