Xây dựng quy trình thực nghiệm phân tích độc tố ciguatoxins trong chình biển bằng phương pháp sắc ký lỏng đầu dò khối phổ kép (LC MS MS)

Lời cam đoan
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số
liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai công bố
trong bất kỳ công trình nào khác.

Nha Trang, ngày 04 tháng 10 năm
2019
Tác giả luận văn

Nguyễn Phương Nga


LỜI CẢM ƠN

Để luận văn này đạt kết quả tốt đẹp, tôi đã nhận được rất nhiều sự giúp
đỡ quý báu của các thầy cô giáo, các nhà khoa học thuộc nhiều lĩnh vực cùng
đồng nghiệp và bạn bè.
Đầu tiên tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS. Đào Việt Hà và TS.
Phạm Đức Thịnh đã tận tình hướng dẫn, quan tâm và tạo điều kiện cho tôi
hoàn thành bản luận văn này.
Tôi chân thành cảm ơn đề tài Nghiên cứu độc tố của một số loài cá rạn
và thân mềm có nguy cơ gây ngộ độc thực phẩm tại Việt Nam (mã số:
KHCBBI.02/18-20) của Viện Hải dương học đã hỗ trợ kinh phí cho việc thực
hiện Luận văn.
Tôi xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo Viện Hóa Học, Học viện
Khoa học và Công nghệ, Phòng Quản lý Tổng hợp đã tạo mọi điều kiện thuận
lợi giúp tôi thực hiện luận văn và hoàn thành mọi thủ tục cần thiết.
Tôi chân thành cảm ơn sự giúp đỡ và tạo điều kiện về mọi mặt của
Lãnh đạo Viện Hải dương học cũng như các anh chị em trong phòng Hóa
sinh trong quá trình thực hiện luận văn.
Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến gia đình, người thân

và bạn bè đã luôn quan tâm, động viên và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình
học tập và hoàn thành luận văn.

Nha Trang, ngày 04 tháng 10 năm 2019
Tác giả luận văn

Nguyễn Phương Nga


Danh mục các ký hiệu và chữ viết tắt

AcOH

: Acetone

ACN

: Acetonitril

ATTP

: An toàn thực phẩm

APCI

: Atmospheric pressure chemical ionization

CFP

: Ciguatera Fish Poisoning

CTX

: Ciguatoxin

CTXs

: Ciguatoxins

DW

: Distilled water

đvdt

: Đơn vị diện tích

ESI

: Electrospray ionization

EI

: Electron ionization

FAB

: Fast-atom bombardment

HR-FABMS

: High-resolution fast atom bombardment mass

spectrometry
H-NMR

: Proton NMR spectroscopy

COSY

: Correlated Spectroscopy

GC

: Gas chromatography

HPLC

: High-performance liquid chromatography

HRMS

: High Resolution Mass Spectrometry

IP

: Identification point

IS

: Ion spray

LC

: Liquid Chromatography

LOD

: Limit of Detection


LOQ

: Limit of Quantitation

MeOH

: Metanol

MeCN

: Acetonitrile

MRM

: Multi Reaction Monitoring

MS

: Mass spectrometry

NĐTPB

: Ngộ độc thực phẩm biển

PTN

: Phòng thí nghiệm

RF

: Radio frequency

SIM

: Selected Ion Monitoring

SPE

: solid phase extraction

SRM

: Selected Reaction Monitoring

TFA

: Trifluoroacetic acid

TEM

: Temperature


Danh mục các bảng

Bảng 1.1. Các độc tố ciguatoxins và ion phân tử tương ứng phân tích bằng
sắc ký khối phổ………………………………………………...……………17
Bảng 2.1. Định danh và ký hiệu mẫu................................................................................... 25
Bảng 3.1. Ảnh hưởng của các điều kiện chiết rút đối với dịch chiết........…..36
Bảng 3.2. Thời gian lưu của mẫu trong phép phân tích với pha tĩnh là
Agillent……………..………………………………………………….……41
Bảng 3.3. Thời gian lưu của mẫu trong phép phân tích với pha tĩnh là
Wakosil………………………………………………………………………43
Bảng 3.4. Đánh giá độ thích hợp hệ thống trên cột Agilent Poroshell 120 ECC18 (100 × 2,1 mm; 1,9 mm kích cỡ hạt nhồi)……………………………....45
Bảng 3.5. Hàm lượng CTXs trong các mẫu Chình biển ở Việt Nam và Nhật
Bản………………………………………………………………………...…48
Bảng 3.6. Kết quả so sánh phương sai các mẫu cơ tại Việt Nam và Nhật
Bản…………………………………………………………………………...50
Bảng 3.7. Kết quả so sánh phương sai các mẫu gan tại Việt Nam và Nhật
Bản…………………………………………………………………………...50
Bảng 3.8. Kết quả kiểm định sự khác biệt ở các mẫu cơ tại Việt Nam và Nhật
Bản………………………………………………………………………….. 51
Bảng 3.9. Kết quả kiểm định sự khác biệt ở các mẫu gan tại Việt Nam và
Nhật Bản……………………………...………………………………. …….52


Danh mục các hình vẽ, đồ thị

Hình 1.1. Một số cấu trúc của Ciguatoxin từ G. toxicus…………...……….10

Hình 1.2. Cấu trúc Pacific (P-CTX-1) và Caribbean (C-CTX-1)
ciguatoxin…………………………………………………………………....11
Hình 1.3. Mô phỏng chuỗi thức ăn biển…………………………………… 12
Hình 1.4. Mô hình hệ thống LC-MS.................................................................................... 14
Hình 1.5. Khối phổ và thời gian lưu của 16 dẫn xuất CTXs ………...……..22
Hình 3.1. Sắc ký đồ CTX-1B chuẩn.................................................................................... 38
Hình 3.2. Sắc ký đồ mẫu cơ có cùng thời gian lưu so với mẫu chuẩn..............38
Hình 3.3. Sắc ký đồ mẫu gan có cùng thời gian lưu so với mẫu chuẩn............38
Hình 3.4. Sắc ký đồ một số mẫu dương tính khi phân tích CTXs bằng
LC/MS-MS trên pha tĩnh Agilen. (A: C026; B: C029; C: C034; D: G035; E:
G036)……………………………………..……………………….………...40
Hình 3.5. Sắc ký đồ một số mẫu dương tính khi phân tích CTXs bằng
LC/MS-MS trên pha tĩnh Wakosil. (A: G028; B: G027; C: C026; D: C027; E:
G030)………………………………………………………………………...42
Hình 3.6. Sắc ký đồ mẫu C034 khi phân tích CTXs trên 02 pha tĩnh (A: pha
tĩnh Agilent; B: pha tĩnh Wakosil)……………………………… ………….43
Hình 3.7. Đánh giá độ đặc hiệu trên cột Agilent (A: sắc ký đồ mẫu cá chứa
độc tố; B: sắc ký đồ Acetone; C: Sắc ký đồ chuẩn CTX-1B)………... …….44


1

MỤC LỤC
MỤC LỤC........................................................................................................ 1
MỞ ĐẦU....................................................................................................... 3
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ...................................................... 7
1.1. NGỘ ĐỘC CIGUATERA .....................................................................

7

1.1.1. Khái niệm .................................................................................... 7
1.1.2. Đối tượng gây ngộ độc ................................................................ 7
1.1.3. Triệu chứng lâm sàng ................................................................. 7
1.2. ĐỘC TỐ CİGUATOXİNS .................................................................... 9
1.2.1. Bản chất, cấu trúc hoá học ......................................................... 9
1.2.2. Cơ chế hoạt động ...................................................................... 11
1.2.3. Nguồn gốc và sự tích luỹ sinh học ............................................ 11
1.3. PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG GHÉP NỐİ ĐẦU DÒ KHỐİ PHỔ
..................................................................................................................... 12
1.3.1. Nguyên lý hoạt động ................................................................. 13
1.3.2. Sự kết hợp giữa sắc ký lỏng và khối phổ ................................. 16
1.3.3. Ứng dụng sắc ký khối phổ trong phân tích độc tố Ciguatoxins
..................................................................................................................... 16
CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU......... 25
2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU............................................................. 25
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU VÀ THỰC NGHIỆM .................. 25
2.2.1. Nguyên liệu, thiết bị .................................................................. 25
2.2.1.1. Dung môi, hóa chất........................................................... 25
2.2.1.2. Thiết bị, dụng cụ phân tích ............................................... 26


2
2.2.2. Chiết tách và tinh sạch độc tố CTX từ cơ và gan của Chình
biển .............................................................................................................. 27
2.2.3. Xác định độc tố CTXs bằng phương pháp LC/MS-MS .......... 32
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................. 36
3.1. KẾT QUẢ CHİẾT RÚT VÀ TİNH SẠCH ĐỘC TỐ CTXS TỪ MỘT
SỐ BỘ PHẬN CỦA CHÌNH BİỂN (CƠ, GAN) ....................................... 36
3.2. THÀNH PHẦN VÀ HÀM LƯỢNG ĐỘC TỐ CTXS TRONG CƠ,
GAN, CHÌNH BİỂN................................................................................... 37

3.3. QUY TRÌNH THỰC NGHİỆM PHÂN TÍCH ĐỘC TỐ CTXS BẰNG
PHƯƠNG PHÁP LC/MS-MS.................................................................... 46
3.4. ĐÁNH GIÁ HIỆU QUẢ CỦA QUY TRÌNH THỰC NGHIỆM (ĐỐI
CHIẾU VỚI KẾT QUẢ KIỂM CHỨNG CỦA NHẬT BẢN).................. 48
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .................................................................... 54
TÀI LIỆU THAM KHẢO.......................................................................... 56


3
MỞ ĐẦU

1. Lý do chọn đề tài
Ciguatera (CFP) là dạng ngộ độc thực phẩm biển (NĐTPB) do ăn phải
các loài cá rạn san hô vùng biển nhiệt đới và cận nhiệt chứa độc tố ciguatoxin
(CTX) và các dẫn xuất độc tố này.
Độc tố CTXs được sản sinh ra do một loài vi tảo sống đáy là
Gambierdiscus toxicus và được tích lũy qua chuỗi thức ăn biển. Đến nay đã
phát hiện hơn 400 loài cá rạn có nguy cơ ngộ độc CFP.
Mặc dù tỉ lệ tử vong thấp (0,1%), nhưng CFP hiện nay là một trong
những mối lo ngại lớn của thế giới về mặt an toàn thực phẩm (ATTP), do độc
tố có hiệu ứng dài hạn (vài tháng cho đến cả năm), là gánh nặng đối với dịch
vụ y tế, chăm sóc sức khoẻ cộng đồng. CFP cũng gây nên tâm lý hoang mang,
bất ổn cho người tiêu dùng, dẫn đến thiệt hại về kinh tế đối với ngành công
nghiệp thuỷ hải sản nội địa và xuất khẩu của nhiều quốc gia.
Trước đây, tình trạng ngộ độc CFP chỉ xảy ra ở Nam Thái bình dương,
Caribbe và Ấn Độ, nhưng đến nay đã lan khắp châu Á, châu Âu và Bắc Mỹ.
Ở Mỹ, từ thập niên 1970 đến nay, các vụ ngộ độc CFP đã tăng gấp 5 lần lên
hơn 250 vụ mỗi năm. Trong khi đó, do nhập khẩu phần lớn hải sản, Hồng
Kông mỗi năm xảy ra hàng trăm vụ ngộ độc CFP so với mức chưa đến 10 vụ
vào những năm 1980. Tỷ lệ mắc và phân bố CFP trên thế giới ngày càng gia

tăng, theo thống kê của FAO, hàng năm có khoảng 20,000 - 30,000 vụ ngộ
độc CFP được ghi nhận, phần lớn tập trung tại các vùng biển nhiệt đới và cận
nhiệt đới.
Ở Việt Nam, theo thông tin từ y tế địa phương, từ 2007 đến nay, hàng
năm đều ghi nhận được rải rác các vụ ngộ độc nghi ngờ CFP, xảy ra chủ yếu ở
các vùng ven biển Quảng Ngãi, Ninh Thuận, Bình Thuận,…
Năm 2012, hội thảo ATTP của EU đã báo cáo ghi nhận độc tố nghi ngờ
CTXs trong cá Hồng nguồn gốc Việt Nam. Đến tháng 5/2017, EU chính thức
cảnh báo về ATTP đối với mặt hàng cá Hồng xuất khẩu của Việt Nam.


4
Dù được rất nhiều sự quan tâm, hướng nghiên cứu về độc tố CTXs của
thế giới vấp phải trở ngại lớn về phương pháp cũng như nguồn chất chuẩn rất
quý hiếm. CTXs là những hợp chất polyete tan trong các dung môi hữu cơ,
bền nhiệt (nhiệt độ cao và đóng băng) và bền pH (axit hay kiềm), không nhạy
với ánh sáng tia cực tím, nên không thể phân biệt bằng trực quan. Gần đây,
nhóm nhà khoa học Nhật Bản đã công bố về kết quả phát triển phương pháp
mới phân tích độc tố CTXs trong mẫu thịt cá sử dụng hệ thống sắc ký lỏng
khối phổ kép (LC/MS-MS).
Tuy nhiên đến nay vẫn chưa có công bố về công trình nghiên cứu độc
tố này tại Đông Nam Á, gây khó khăn trong việc giám sát và cảnh báo vấn đề
ATTP. Hơn nữa, quá trình nghiên cứu CFP tại Việt Nam gặp nhiều khó khăn
như về đặc tính sinh học loài, nguồn gốc, cơ chế tích lũy và lan truyền độc tố
trong chuỗi thức ăn biển rất phức tạp, đặc biệt là chưa có phương pháp phân
tích phù hợp do thiếu trang thiết bị phân tích hiện đại chuyên sâu và chưa tiếp
cận, cập nhật phương pháp phân tích của thế giới.
Hiện nay, Viện Hải dương học đã xây dựng được quy trình phân tích
độc tố trong cá Hồng nhưng chưa có quy trình phân tích đối với loài Chình
biển, vì vậy, học viên chọn đề tài luận văn “Xây dựng quy trình thực nghiệm

phân tích độc tố Ciguatoxins trong Chình biển bằng phương pháp sắc ký lỏng
đầu dò khối phổ kép (LC/MS-MS)”. Nội dung phân tích độc tố CTXs trong đề
tài này sẽ sử dụng quy trình phân tích độc tố CTXs cập nhật mới nhất của
Nhật Bản. Tuy nhiên, quy trình thực nghiệm trên cần được hiệu chỉnh phù hợp
với điều kiện hệ thiết bị hiện có của Việt Nam cũng như thành phần hoá sinh
của Chình biển để đảm bảo độ tin cậy và tính chính xác của kết quả phân tích.
2. Mục tiêu nghiên cứu
- Dựa trên quy trình phân tích Ciguatoxins của Nhật Bản, tiến hành hiệu chỉnh
để xây dựng được một quy trình thực nghiệm vừa phù hợp với điều kiện trang
thiết bị tại Việt Nam vừa phù hợp với thành phần hóa sinh của Chình biển để
đảm bảo độ tin cậy và tính chính xác của kết quả phân tích.


5
3. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu
3.1. Đối tượng nghiên cứu
- 14 cá thể cá Chình, thuộc 4 loài Chình biển (cá Lịch vân vòng, cá Lịch vân
sóng, cá Lịch chấm tia, cá Lịch mõm trắng) được thu mua tại đảo Lý Sơn
(Quảng Ngãi), mỗi cá thể tách lấy 2 phần cơ và gan.
3.2. Phương pháp nghiên cứu
- Phương pháp chiết rút: dung môi Acetone được lựa chọn để hòa tan chất
phân tích, tách chiết chất phân tích ra khỏi nền mẫu.
- Phương pháp tinh sạch: thử nghiệm các điều kiện tinh sạch theo phương
pháp chiết lỏng – lỏng và phương pháp chiết ly pha rắn SPE.
- Xác định độc tố CTX: phương pháp sắc ký lỏng khối phổ kép (LC/MS-MS).
- Xử lý số liệu thực nghiệm, đánh giá hiệu quả của quy trình thực nghiệm
bằng phương pháp thống kê F-test, T-test trong phần mềm Excel.
4. Nội dung nghiên cứu
- Chiết tách và tinh sạch độc tố CTX từ một số bộ phận của Chình biển (cơ,
gan).

- Lựa chọn pha tĩnh tối ưu để xác định độc tố CTX trong mẫu đã chiết bằng
phương pháp sắc ký lỏng khối phổ kép (LC/MS-MS).
- Xây dựng quy trình thực nghiệm phân tích độc tố CTX bằng phương pháp
LC/MS-MS.
- Đánh giá kết quả của quy trình thực nghiệm trên cơ sở so sánh, đối chiếu với
kết quả kiểm chứng tại PTN của Nhật Bản.
5. Ý nghĩa khoa học của đề tài nghiên cứu
Trên cơ sở vận dụng những tiến bộ khoa học - kỹ thuật và công nghệ
mới của thế giới, đây là hướng nghiên cứu mới, tiên phong tại Việt Nam. Mặt
khác, kết quả của đề tài là dẫn liệu khoa học tin cậy phục vụ an toàn thực
phẩm biển, và là tiền đề cần thiết để có những công trình công bố quốc tế về
độc tố CTX trong sinh vật biển tại Việt Nam.


6
7. Ý nghĩa thực tiễn của đề tài nghiên cứu
Trước những năm 2010, kỹ thuật sắc ký lỏng đầu dò khối phổ đơn
(single LC/MS) sử dụng chế độ quét ion chọn lọc (SIM) được áp dụng để phát
hiện độc tố này. Sau đó, cùng với sự tiến bộ của khoa học kỹ thuật, sắc ký
lỏng khối phổ sử dụng nguồn ion hóa phun mù điện tử (Electrospray
ionization – ESI) được ứng dụng để định lượng độc tố CTXs với nguyên lý
chọn lọc phân tử được proton hóa [M+NH 4]+ hoặc [M+H]+ để cắt các phân tử
nước trong bộ lọc khối tứ cực thứ 2 (Q2) của chế độ ghi phổ nhiều ion chọn
lọc (Multi Reaction Monitoring, MRM). Tuy nhiên, các ion sau khi mất đi
phân tử nước lại không đủ độ nhạy để phát hiện được ở nồng độ tương đương
0,01 ppb CTX-1B (giới hạn ATTP của US FDA). Khắc phục nhược điểm này,
nhóm nghiên cứu của Yogi đã phát triển thành công phương pháp sử dụng
LC/MS-MS với chế độ SIM và MRM có độ nhạy cao hơn, sử dụng cách bắt
cặp phân tử CTX với một số ion dương hoặc âm (H+, Na+, K+, NH4-, SO42-,
OH-…). Phương pháp này được đánh giá có ưu thế về độ nhạy và tính ứng

dụng trong phân tích định lượng độc tố CTXs, mặc dù đầu dò khối phổ độ
phân giải cao (HRMS) ghép nối với hệ sắc ký đã được chứng minh được khả
năng phát hiện các đồng phân của độc tố CTXs trong điều kiện thiếu vắng
chất chuẩn.
Tuy nhiên, tuỳ thuộc vào thông số kỹ thuật của từng hệ thống thiết bị
LC/MS-MS, đòi hỏi quá trình thăm dò, thử nghiệm nhằm tối ưu hoá quy trình
phân tích bao gồm công đoạn tách chiết, loại tạp chất trong mẫu, điều kiện
phản ứng (nhiệt độ, áp suất…) và hệ dung môi pha động (đẳng dòng hay đổi
dòng), cột sắc ký… phù hợp để có được LOD và LOQ tốt nhất đối với phân
tích độc tố CTXs. Báo cáo này trình bày quy trình thực nghiệm tối ưu hoá
phương pháp phân tích độc tố CTXs trong mẫu Chình biển sử dụng hệ thống
sắc ký lỏng ghép nối đầu dò khối phổ kép Shimadzu LCMS 8040 tại phòng
thí nghiệm trọng điểm cấp Viện Hàn lâm KHCNVN về An toàn thực phẩm và
môi trường (khu vực miền Trung) tại Viện Hải dương học.


7
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. NGỘ ĐỘC CIGUATERA
1.1.1. Khái niệm
Ciguatera Fish Poisoning (CFP) là một dạng ngộ độc thực phẩm biển ở
người do tiêu thụ các loài cá rạn vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới đã tích lũy
độc tố Ciguatoxin (CTX). Độc tố CTX được biết đến có nguồn gốc từ loài vi
tảo giáp sống đáy Gambierdiscus toxicus [2].
Theo một bài báo cáo được FAO công bố năm 2004, hơn 400 loài cá
được biết đến là nơi di truyền ngộ độc CFP.
1.1.2. Đối tượng gây ngộ độc
Con người đều được cho là nhạy cảm với độc tố CTX [3]. Dân cư ở các
vùng biển nhiệt đới hoặc cận nhiệt đới có khả năng ảnh hưởng cao nhất do tần
suất cao tiêu thụ các loài cá độc. Tuy nhiên, sự gia tăng mức tiêu thụ sản

phẩm thủy sản cùng với sự gia tăng giao thông liên khu vực của các sản phẩm
thủy sản đã mở rộng phạm vi địa lý của các vụ ngộ độc CFP [3].
1.1.3. Triệu chứng lâm sàng
“Ciguatera” là một hội chứng lâm sàng với chuẩn đoán chủ yếu vẫn
dựa trên tiền sử tiêu thụ cá rạn san hô và biểu hiện lâm sàng được xác định
bởi cả triệu chứng tiêu hóa và thần kinh [2].
Sự khác biệt về địa lý cũng sẽ gây ra sự khác biệt về triệu chứng của
các bệnh nhân.
Khởi phát của triệu chứng CFP thường bắt đầu bằng các vấn đề của
đường tiêu hóa như buồn nôn, nôn, tiêu chảy và đau bụng trong vòng 12 giờ
sau khi ăn phải cá có độc tố. Các triệu chứng thường thuyên giảm trong vòng
24 giờ [2]. Các vấn đề về tim mạch cũng có thể xuất hiện trong suốt giai đoạn
cấp tính này, thường là nhịp tim chậm và hạ huyết áp.
Từ vài giờ đến hai tuần sau khi ngộ độc cá ciguatera, những vấn đề về
thần kinh như đau đầu, đau cơ, dị cảm (tê và ngứa ran ở vùng ngoại vi và tứ
chi), rối loạn cảm giác nhiệt độ (sự đảo ngược cảm giác nhiệt độ với các vật


8
thể lạnh sẽ cảm thấy nóng và ngược lại),… có thể xuất hiện [2]. Các triệu
chứng thần kinh chủ quan khác được báo cáo như vị kim loại, ngứa, đau khớp
và đau cơ (đau cơ đặc biệt là ở chân) và cảm giác răng lung lay [2]. Có thể
xuất hiện triệu chứng chấn động não đến 10 ngày sau khi bị ngộ độc. Đau đầu
nhiều vị trí, đau dữ dội và kéo dài cũng là biểu hiện khi ngộ độc ciguatera.
Những triệu chứng liên quan đến hệ thần kinh trung ương (tê liệt, mất điều
hòa, choáng váng và nhầm lẫn) thường là dấu hiệu của các trường hợp nghiêm
trọng nhất. Một loạt các triệu chứng rối loạn thần kinh đã được báo cáo sau
khi ngộ độc ciguatera bao gồm mệt mỏi, lo lắng, trầm cảm, hysteria, rối loạn
trí nhớ, thiếu hiệu quả về tinh thần.
Vấn đề tiêu hóa cấp tính thường giải quyết trong vòng 1 hoặc 2 ngày

và các rối loạn tim mạch đảo ngược trong vòng 48 – 72 giờ. Sự phục hồi từ
các triệu chứng thần kinh là lâu hơn và ít dự đoán hơn, từ 1 tuần đến 6 tháng.
Ngứa, đau khớp và mệt mỏi có thể kéo dài trong nhiều tháng hoặc
nhiều năm. Sự mệt mỏi có thể dẫn đến suy nhược như một hội chứng mệt mỏi
mãn tính. Mãn tính có thể phản ánh sự tồn tại lâu dài của ciguatoxins trong cơ
thể.
Sự tồn tại của các triệu chứng ở một số bệnh nhân trong vài năm đã
được ghi nhận và không có gì bất thường. Khoảng 65% số bệnh nhân có triệu
chứng từ 6 tháng hoặc lâu hơn với báo cáo tái phát lên đến 2 năm. Ở Thái
bình dương, các báo cáo đã ghi nhận về sự tiến triển nhanh chóng của triệu
chứng thần kinh khi ngộ độc CFP, dẫn đến suy hô hấp, hôn mê và đôi khi tử
vong [2].
Trên cơ sở các quan sát cho thấy rằng việc tiếp xúc nhiều lần với độc
tố ciguatera có liên quan đến một bệnh lâm sàng nặng hơn, người ta đã đưa ra
giả thuyết rằng CTX tan trong chất béo có khả năng tích tụ trong cơ thể người
và làm giảm ngưỡng chịu đựng của cơ thể. Tuổi thọ và cân nặng càng lớn
càng làm tăng khả năng lưu giữ độc tố, cũng có liên quan đến thời gian và
mức độ nghiêm trọng của các triệu chứng nhiễm độc. Các hành vi về thể chất
hoặc chế độ ăn uống (ví dụ: tập thể dục, uống rượu hoặc uống quá nhiều


9
caffein) hoặc tiếp xúc lại với độc tố CTX có thể gây tái phát lại các triệu
chứng ngộ độc.
1.2. ĐỘC TỐ CİGUATOXİNS
1.2.1. Bản chất, cấu trúc hoá học
Ciguatoxin là các polyether gồm 13 – 14 vòng liên kết với nhau bằng
các liên kết ether tạo thành một cấu trúc bền vững. CTX tan trong lipid nên
khi vào cơ thể dễ dàng tấn công vào các màng tế bào, gây ngộ độc nhanh
chóng. Phân tử CTX tương đối bền nhiệt, không bị phá hủy hay biến tính khi

chế biến thức ăn. Độc tố này không mùi, không vị và thường không thể phát
hiện bằng các thử nghiệm đơn giản.
CTX trong cá có nhiều đồng phân liên quan chặt chẽ với nhau. CTX
phân lập từ vùng biển Pacific (P-CTX) được xác định các đặc trưng cấu trúc
trước các CTX phân lập từ Caribbean (C-CTX). 02 dạng này có sự khác biệt
tương đối cả về cấu trúc phân tử và độc tính [2]. P-CTX được Scheuer và cs.
phân lập đầu tiên từ cá Chình năm 1967. Một thập kỉ sau, Yasumoto và
cs.,1977 đã phát hiện ra nguồn gốc của CTX ở quần đảo Gambier và đặt tên
cho sinh vật sản sinh độc tố là Gambierdiscus toxicus [2].
Cấu trúc chính của P-CTX phân lập từ cá Chình được mô tả hoàn chỉnh
năm 1989 [2] và được gọi là Gambiertoxin 4B hoặc P-CTX-4B (Hình 1.1).


10
P-CTX 4B

P-CTX-3C

51-Hydroxy P-CTX-3C

Hình 1.1. Một số cấu trúc của Ciguatoxin từ G. toxicus [2]


11
P-CTX-1: R1 = CH2OHCHOH; R2 = OH

C-CTX-1

Hình 1.2. Cấu trúc Pacific (P-CTX-1)
và Caribbean (C-CTX-1) ciguatoxin [2]

1.2.2. Cơ chế hoạt động
Do có thể hòa tan trong chất béo, nên khi hấp thu vào máu đến các tế
bào, CTXs sẽ tấn công vào màng tế bào, khử cực màng tế bào, mở cực màng
tế bào thần kinh cho ion Na+ vào bên trong tế bào tạo ra sự kích động thần
kinh, làm hư hại sự tái tạo tế bào thần kinh.
1.2.3. Nguồn gốc và sự tích luỹ sinh học
Những quan sát chi tiết của Randall (1958) về hành vi kiếm ăn của các
loài cá ở Thái bình dương đã đưa ông đến giả thuyết rằng độc tố CTXs do vi


12
sinh vật sống đáy sản xuất, sau đó được tiêu thụ bởi các loài cá bé và chuyển
qua các loài cá lớn hơn theo chuỗi thức ăn. Bọn vi tảo giáp sống đáy thuộc chi
Gambierdiscus xuất hiện ở những khu vực nhiệt đới và cận nhiệt đới trên thế
giới. Loài tảo này sản sinh CTX và/hoặc tiền chất của CTX (Gambiertoxin).
G. toxicus là trọng tâm chính của các nghiên cứu độc tính của CTX trong
nhiều năm, tuy nhiên sau đó, có thêm các nghiên cứu về một số loài
Gambierdiscus mới như G. belizeanus [4], G.yasumotoi [5], G. pacificus, G.
australes, G. polynesiensis [6]. Ngoài sự khác biệt về mức độ độc tính của
loài, độc tính của từng chủng Gambierdiscus có thể rất khác nhau và phụ
thuộc vào một số yếu tố môi trường [2].
Tảo giáp dinoflagellate thuộc chi Gambierdiscus xuất hiện ở vùng biển
nhiệt đới hoặc cận nhiệt đới trên thế giới. Loài tảo này sản sinh ciguatoxin
và/hoặc tiền chất của ciguatoxin (gambiertoxin) [3]. Các gambiertoxin được
chuyển từ sinh vật đáy sang các loài ăn thực vật (cá, động vật không xương
sống…) và sau đó đến cá ăn thịt thông qua chuỗi thức ăn biển. Độc tố sẽ lớn
dần theo chuỗi thức ăn. Con người khi ăn phải cá ăn thực vật hoặc cá ăn thịt
bị ô nhiễm sẽ gây ra triệu chứng ngộ độc CFP. Các yếu tố ảnh hưởng đến
nồng độ CTX tích lũy trong cá bao gồm tốc độ ăn vào, hiệu quả của quá trình
đồng hóa, mức độ và tính chất của bất kỳ biến đổi sinh học độc tố, tốc độ suy

giảm và tốc độ tăng trưởng của cá [7].

Hình 1.3. Mô phỏng chuỗi thức ăn biển [7]
1.3. PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG GHÉP NỐİ ĐẦU DÒ KHỐİ PHỔ
Hiện nay sắc ký lỏng ghép cặp khối phổ LC-MS được sử dụng rộng rãi
trong nhiều lĩnh vực như dược phẩm, môi trường, thực phẩm, vật liệu công
nghiệp và một số mảng khác.


13
1.3.1. Nguyên lý hoạt động
Nhìn chung, sắc ký lỏng LC cho phép tách các thành phần khác nhau
trong cùng một mẫu dựa vào sự khác biệt về tính ái lực (lực lưu giữ chất) đối
với pha tĩnh của cột và với pha động, và tùy thuộc vào tính chất của từng
thành phần mà phát hiện chúng bởi đầu dò UV, huỳnh quang, độ dẫn điện...
Bằng cách sử dụng những đầu dò này, việc tiến hành phân tích định tính các
hợp chất chủ yếu dựa trên thời gian lưu, phân tích định lượng dựa vào chiều
cao và diện tích đỉnh. Phương pháp sắc ký có thể cho phép phân tách xuất sắc
các chất; tuy nhiên, việc định danh và định lượng một cách đáng tin cậy sẽ
gặp khó khăn trong trường hợp có nhiều thành phần rửa giải cùng lúc từ cột
sắc ký cũng như khi phải tiến hành phân tích đồng thời tất cả các chất có mặt
trong mẫu.
Mặt khác, khối phổ MS là phương pháp phát hiện có độ nhạy cao; đầu
tiên các loại chất phân tích được ion hóa bằng nhiều kỹ thuật khác nhau, sau
đó trong chân không các ion phát sinh này được phân loại dựa trên cơ sở tỉ lệ
khối lượng trên điện tích của mỗi ion (tỉ lệ m/z) và sau cùng tiến hành đo
cường độ của chúng. Phổ khối lượng thu được cho thấy một mức độ xuất hiện
các ion sao cho mỗi ion đi kèm với một số khối, do đó, MS hỗ trợ rất lớn
trong việc phân tích định lượng. Số khối thu được trực tiếp từ khối phổ, là
một thông tin đặc trưng cho (từng) phân tử. Tuy nhiên, đó là khi các thành

phần trong mẫu được phân tích độc lập với nhau. Nếu nhiều chất phân tích
đồng thời được tiêm vào thì việc giải phổ trở nên cực kì khó khăn.
LC-MS là một hệ thống thiết bị tập hợp vừa khả năng phân tách chất
xuất sắc của LC và vừa khả năng định lượng xuất sắc của MS. Một phổ khối
thu được bằng cách sử dụng chế độ quét (scan analysis) sẽ cho biết khối
lượng phân tử và thông tin về cấu trúc, trong khi thời gian lưu được cung cấp
bởi các đầu dò LC nhằm thực hiện phân tích định tính. Ngoài ra, chế độ quét
ion chọn lọc SIM (Selected Ion Monitoring) sẽ căn cứ vào số khối – là một
thông số cung cấp độ chọn lọc cao. Ngay cả trong trường hợp sự phân tách
bằng sắc ký lỏng không đáp ứng đủ, có thể tiến hành phân tích định lượng
nhằm tránh ảnh hưởng của tạp chất. MS tổng hợp giữa khả năng phân tích đa


14
dạng các chất cùng với tính chọn lọc nên được đánh giá là đầu dò rất hiệu quả
trong sắc ký lỏng.
Hệ thống phân tích khối phổ kế gồm có bộ phận đưa mẫu vào (như hệ
thống HPLC, GC…), bộ phận ghép nối giữa bộ phận tiêm mẫu và những bộ
phận của hệ thống MS, nguồn ion hóa mẫu, các thấu kính tĩnh điện giúp tạo
ion một cách hiệu quả, khối phổ kế phân tách ion theo tỉ lệ m/z và các ion sau
lọc sẽ đi vào đầu dò. Căn cứ phương pháp phân tách ion, có nhiều loại khối
phổ kế khác nhau. Hệ thống khối phổ có chế độ ion hóa ở áp suất khí quyển
kèm với sử dụng bộ phân tích khối tứ cực (còn gọi là bộ lọc khối tứ cực)
thường được dùng như một đầu dò trong sắc ký lỏng ghép cặp khối phổ LCMS. Một số kỹ thuật ion hóa ở áp suất khí quyển như ion hóa đầu phun điện
tử (ESI) và ion hóa hóa học ở áp suất khí quyển (APCI),…; và chúng được
dùng vừa như bộ phận ghép nối với HPLC và vừa như nguồn cung ion. Sau
khi desolvat hóa, tại đây các ion tạo thành được điều hướng bởi bát cực để di
chuyển bộ phân tích khối tứ cực. Trong bộ phân tích khối tứ cực, điện thế một
chiều và xoay chiều RF (radio frequency - tần số vô tuyến) được xen kẽ vào
trên đường di chuyển của các ion, do đó chỉ các ion đáp ứng đúng tỉ lệ m/z lựa

chọn trước mới có thể đi qua các cặp đối diện của các thanh này. Số lượng ion
đi đến đầu dò sẽ được chuyển đổi thành tín hiệu và được ghi nhận bởi máy vi
tính.

Hình 1.4. Mô hình hệ thống LC-MS


15
- Chế độ quét (SCAN)
Khi thao tác với chế độ scan (quét), đầu dò sẽ nhận được tất cả các
mảnh ion để cho khối phổ toàn ion đối với tất cả các chất trong suốt quá trình
phân tích. Chế độ này thường dùng để định danh hay phân tích khi chất phân
tích có nồng độ đủ lớn. Đối với đầu dò khối phổ ba tứ cực, chế độ SCAN
thường được lựa chọn để khảo sát ion mẹ.
- Chế độ khảo sát ion chọn lọc (Selected Ion Monitoring – SIM)
Trong chế độ SIM, đầu dò MS chỉ ghi nhận tín hiệu một số mảnh ion
đặc trưng cho chất cần xác định. SIM chỉ cho tín hiệu của các ion đã được lựa
chọn trước đó, do vậy không thể dùng để nhận danh hay so sánh với các thư
viện có sẵn. Chế độ SIM có thể được dùng để định lượng; ví dụ, trong khoảng
khối từ 50 - 300 như trên, mảnh ion 150 là đặc trưng và cao nhất thì có thể chỉ
chọn riêng m/z 150 ra để định lượng. Có thể chọn được nhiều ion một lần, và
càng nhiều ion thì càng tốt về độ nhạy và độ chính xác. Đối với đầu dò khối
phổ ba tứ cực, chế độ SIM thường được lựa chọn để khảo sát năng lượng phân
mảnh khi đã biết ion mẹ.
- Chế độ khảo sát ion cô lập (Selected Reaction Monitoring – SRM) và
khảo sát đa ion cô lập (Multiple Reaction Monitoring – MRM)
Đối với khối phổ ba tứ cực – máy đo khối phổ hai lần liên tiếp (MSMS); 2 kỹ thuật ghi phổ có độ nhạy cao thường được sử dụng là SRM và
MRM.
SRM là cô lập ion cần chọn để phân mảnh và cô lập 01 mảnh ion con
cần quan tâm trong các mảnh ion sinh ra, đưa vào đầu dò để phát hiện. Thực

tế, do yêu cầu kỹ thuật đối với phân tích vi lượng nên các ion con cần quan
tâm thường từ 2 trở lên, do vậy kỹ thuật ghi phổ MRM thông dụng hơn SRM.
Đầu tiên, cô lập ion cần chọn (ion mẹ) ở tứ cực thứ nhất, phân mảnh ion cô
lập đó tại tứ cực thứ 2 (thực chất là buồng va chạm) thu được các ion con, cô
lập 2 (hoặc nhiều) ion con cần quan tâm ở tứ cực thứ 3 và đưa vào đầu dò để
phát hiện.


16
1.3.2. Sự kết hợp giữa sắc ký lỏng và khối phổ
Hệ thống GC-MS là một thành công trong kết hợp các thiết bị phân tích
với nhau, mặc dù kỹ thuật LC và MS trực tuyến đã được đặt nhiều kì vọng
cao, nhưng công dụng của LC-MS chỉ mới được đưa vào thực hiện gần đây.
Khối phổ kế là thiết bị trong đó chất cần phân tích được hóa hơi thành
ion sau đó được phát hiện ở chân không cao (0,1 Pa > p > 10 - 5 Pa). Trong
LC-MS, việc kết nối đơn thuần phần LC với MS sẽ làm cho pha lỏng hóa hơi
và lượng lớn khí được bơm vào hệ thống MS sẽ giảm độ chân không đến
điểm mà tại đó những ion cần phân tích không thể đến được đầu dò. Đối với
sắc ký lỏng, ngay cả với tốc độ dòng 1 mL/phút và phụ thuộc vào loại dung
môi thì việc hóa hơi có thể làm tăng thể tích của dung môi lên 1000 lần, do đó
sản sinh ra một lượng khí cực lớn. Tuy nhiên, lượng pha động có thể bay hơi
phải được giới hạn trong LC-MS, nên nhiều loại giao diện ghép nối được
nghiên cứu và phát triển để xử lý vấn đề này nhưng hiện nay giải pháp này
vẫn bị hạn chế về độ nhạy, độ bền và sự tiện lợi.
1.3.3. Ứng dụng sắc ký khối phổ trong phân tích độc tố Ciguatoxins
Khối lượng phân tử của CTX được xác định bởi phương pháp khối phổ
độ phân giải cao (HR-FABMS) với giá trị của ion [M+H] + là 1061,6 [8]. Vài
thập kỷ gần đây, kỹ thuật phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) phát triển với
ưu điểm vượt trội về lượng rất nhỏ mẫu cần phân tích cấu trúc. Kết quả
nghiên cứu cho thấy, cấu trúc phân tử của CTX bao gồm nguyên tử carbon,

protons (hydrogen) và oxy với đặc trưng của gốc Me (methonin); và hoàn
toàn không có mặt proton nitrogen [8]. Kỹ thuật ion hóa điện tử (electron
ionization - EI) và bắn phá nhanh nguyên tử (fast-atom bombardment - FAB)
cùng bộ phân tích khối hỗn hợp tứ cực đã được sử dụng để ghi phổ khối của
16 độc tố CTXs ở chế độ ion dương [M+Na] + và đã xác định cấu trúc hoá học
của chúng (Bảng 1.1). Kết quả phân tích phổ khối lượng bắn phá nguyên tử
nhanh có độ phân giải cao (HR-FABMS), độc tố CTX-4A và -4B có khối
lượng phân tử là 1061,6 đ.v.c., cường độ hấp phụ cao nhất ở bước sóng 226
nm (trong dung môi MeOH) [8]. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (HNMR) COSY (đo phổ giữa proton của các nguyên tử C kế cận nhau) có thể


17
phân biệt giữa CTX-4A và -4B bằng sự khác biệt của độ dời hoá học
(chemical shift, δ) của proton H-48 [9], [10], [11].
Bảng 1.1. Các độc tố ciguatoxins và ion phân tử tương ứng
phân tích bằng sắc ký khối phổ
Tên quy

Tên khác

ước

Ion phân tử

Nguồn tự

Nguồn tài

[M+H]+

nhiên

liệu

Pacific ciguatoxins
P-CTX-1

CTX-1B

1111,6

Cá ăn thịt

[12], [13]

P-CTX-2

CTX-2A2;52-

1095,5

Cá ăn thịt

[12],

epi-54-deoxyCTX
P-CTX-3

CTX-2B2;54-

[13],

[14]
1095,5

Cá ăn thịt

[12], [13]

1023,6

Gambierdicus [15]
toxicus

M-secoCTX-3C

1041,6

G. toxicus

[15]

CTX-3C

1023,6

G. toxicus

[15], [16]

deoxyCTX
49-epiCTX-3C

CTX-3B

2,3dihydroxy CTX-2A1
CTX-3C

Cá ăn thịt/G.
1057,6

51hydroxyC
TX-3C

CTX-2C1

1039.5

Cá ăn thịt

[17]

CTX-4B

GT-4B

1061.6

G. toxicus /cá
ăn thực vật

[8],
[18]

toxicus

[17], [16]

[16],


18
52-epiciguatoxin CTX-4A; GT-4A
-4B

1061.6

G. toxicus

[16], [18]

1141,6

Cá ăn thịt

[19],
[21]

[20],

1141,6

Cá ăn thịt

[19],
[21]

[20],

C-CTX1127

1127,6

Cá ăn thịt

[20], [21]

C-CTX1143

1143,6

Cá ăn thịt

[20], [21]

C-CTX1157

1157,6

Cá ăn thịt

[20], [21]

C-CTX1159

1159,6

Cá ăn thịt

[20], [21]

I-CTX-1

1141,6

Cá ăn thịt

[22], [23]

I-CTX-2

1141,6

Cá ăn thịt

[22], [23]

I-CTX-3

1157,6

Cá ăn thịt

[22], [23]

I-CTX-4

1157,6

Cá ăn thịt

[22], [23]

Caribbean ciguatoxins
C-CTX-1
C-CTX-2

56-epi-C-CTX-1

Indian ciguatoxins

Khối phổ được sử dụng để phân tích CTXs cả khi cần xác định đặc tính
và cấu trúc của các đồng phân khác nhau, chủ yếu sử dụng kỹ thuật FAB và
ion hoá. Lewis và cs.,1994 [24] đã đề cập đến kỹ thuật dùng nguồn sương ion
(IS) cho điều tra phổ của độc tố này. Rất nhiều nguồn ion được ứng dụng, chủ
yếu mục đích để xác định khối lượng phân tử và giả phân tử của các ion độc
tố P-CTX-1 với các m/z khác nhau như 1111,8 đối với [M + H]+; 1133,8 đối


19

với [M + Na]+; 1129,8 đối với [M+H+ H2O]+ và khi đã bị cắt đi lần lượt 05
phân tử nước (m/z 1094; 1076, 1058; 1040 và 1022).
Phân tích khối phổ thu nhận được bằng kỹ thuật IS cung cấp thông tin
phổ và các mảnh phổ tương tự như trong kỹ thuật FAB, và có thể phát hiện
được CTX-1 tinh sạch (tương đương với độ nhạy của HPLC-FLD). Tuy
nhiên, rất nhiều yếu tố ảnh hưởng đến các ion này khi thử nghiệm phân tích
các dịch chiết thô từ cá được thêm P-CTX-1 ở nồng độ 1,5 ng/g mẫu ban đầu.
Tuy nhiên, đây vẫn được coi là một cách đơn giản, nhạy để kiểm chứng kỹ
thuật sắc ký lỏng ghép nối khối phổ. Khi sử dụng phương pháp này để phân
tích dịch chiết độc tố có độ tinh sạch cao từ ruột Chình biển Lycodontis
javanicus gây ngộ độc CFP đã cho phép xác định 14 đồng phân gồm 02 ở m/z
1095,7; 06 ở 1111,6 hoặc 06 ở 1127,7 với ưu thế của P-CTX-1, -2 và -3.
Ngoài các ion chính, mỗi đồng phân này lại cho các mảnh ion [M+NH 4]+ và
[M+Na]+. Ở đây, cũng ghi nhận là hệ dung môi MeCN:H 2O bổ sung 1 nM
ammonium acetate cho kết quả tốt hơn so với bổ sung 0,1% TFA, và sử dụng
bơm hỗ trợ hệ HPLC-MS sẽ giúp tín hiệu ghi nhận tăng gấp 20 lần so với
HPLC-MS truyền thống [13]. Thành công chứng minh được đặc tính phân
mảnh này vô cùng hữu hiệu để xác định các đồng phân mới của độc tố CTXs.
Trong một công bố khác, HPLC-MS được ứng dụng để xác định đặc
tính của 12 đồng phân C-CTXs trong dịch chiết tinh sạch của loài cá Vẩu
Caranx latus [25]. Trong trường hợp này, bơm cao áp HP 3300 được kết nối
với đầu dò tứ cực API Qstar Pulsar (PE-Sciex). Ion tương ứng với [M+NH 4]+,
[M+H]+ và [M+H-H2O]+ và [M+H-2H2O]+ được ghi nhận với cường độ nhất
khi formic acid được bổ sung vào dung dịch đệm. Ngược lại, khi dùng TFA,
hầu như thiếu vắng có mặt của phân tử ion [M+NH 4]+. Ngoài ra, formic acid
luôn cải thiện đường nền và khối phổ thu nhận được cao gấp 5 lần so với
TFA. Kỹ thuật phân tách pha đảo trở nên hiệu quả hơn trên cột sắc ký Zorbax
C3 (2,1 × 150 mm, Agilent) so với cột Aquapore C18 RP 300 (1 × 50 mm),
đặc biệt là có thể phân tách được các đồng phân gần nhau. Với chế độ sắc ký
thay đổi nồng độ pha động (gradient) là hệ dung môi MeCN:H 2O khi có và

không có mặt formic acid 0,1%; đã xác định được 05 đồng phân CTXs mới ở