Tiêu chuẩn ngành 10 TCN 814-2006

BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PHÁT TRIỂN NÔNG THÔN
_______________

 10TCN                    TIÊU CHUẨN NGÀNH
10TCN 814­2006
QUY TRÌNH CHẨN ĐOÁN BỆNH CÚM GIA CẦM


                                                                                                                                                     10TCN 814­2006

Hà Nội  ­ 2006

TIÊU CHUẨN NGÀNH                                                                                                         10 TCN 814­2006

QUY TRÌNH CHẨN ĐOÁN BỆNH CÚM GIA CẦM
                                              Protocol for avian influenza diagnosis
(Ban hành kèm theo Quyết định số              QĐ/BNN­KHCN
   ngày        tháng  12  năm 2006 của Bộ trưởng Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn)
I. Pham vi ap dung
̣
́
̣
Quy trinh nay đ
̀
̀ ược ap dung đê chân đoan bênh Cum gia câm tai cac phong xet nghiêm
́ ̣
̉
̉
́ ̣
́
̀ ̣ ́

̀
́
̣  
chân đoan bênh đông vât
̉
́ ̣
̣
̣
II. Khai niêm
́ ̣
Bênh cum gia câm do virus cum type A, thuôc ho Orthomyxoviridae gây ra cho cac loai
̣
́
̀
́
̣
̣
́
̀ 
gia câm va chim hoang da. Bênh co nhiêu dang khac nhau: co dang ty lê chêt rât cao, co dang
̀
̀
̃ ̣
́
̀ ̣
́
́ ̣
̉ ̣
́ ́
́ ̣  

không co triêu ch
́ ̣
ưng. 
́
Virus Cum type A co thê gây nhiêm cho gia câm, l
́
́ ̉
̃
̀ ợn, ngựa va cac loai khac kê ca con
̀ ́
̀
́ ̉ ̉
 
ngươi. Virus cum type A co 16 subtype khang nguyên H (Haemaglutinin) va 9 subtype khang
̀
́
́
́
̀
́  
nguyên N (Neuraminidase). Sự  kêt h
́ ợp cua 2 loai khang nguyên bê măt nay tao nên nhiêu
̉
̣
́
̀ ̣
̀ ̣
̀ 
chung virus cum khac nhau.
̉

́
́
III. Lây mâu va bao quan 
́
̃ ̀ ̉
̉
Bênh phâm phat hiên virus la dich ngoay ô nh
̣
̉
́ ̣
̀ ̣
́ ̉ ớp, hong, khi quan (swab), cac phu tang
̣
́ ̉
́
̉ ̣  
(Nao, phôi, khi quan, lach,ruôt..).
̃
̉
́ ̉
́
̣
Bênh phâm phat hiên khang thê la huyêt thanh gia câm nghi nhiêm cum hoăc huyêt
̣
̉
́
̣
́
̉ ̀
́

̀
̃
́
̣
́ 
thanh gia câm sau khi tiêm văc xin.
̀
́
Chi tiêt vê cach lây mâu va bao quan bênh phâm xem phân phu luc
́ ̀ ́
́
̃ ̀ ̉
̉
̣
̉
̀
̣ ̣
IV. May moc – Dung cu – Hoa chât – Nguyên liêu
́
́
̣
̣
́ ́
̣
1. May moc
́
́
* May moc chung
́
́

o
­ Tu lanh âm ­15 đên ­20
̉ ̣
́
C
­ Tu lanh th
̉ ̣
ương +2 đên +8
̀
́ oC
o
­ Tu âm 37
̉ ́
C
­ Nôi đun cach thuy (water bath)
̀
́
̉
­ Buông cây vô trung (BSC­Bio­safety cabinet)
̀
́
̀
­ May hut chân không
́ ́
­ May ly tâm lanh (ông 15 ml)
́
̣
́
­ May trôn ông nghiêm (vortex mixer)
́

̣ ́
̣
­ May ly tâm ông nho (microcentrifuge)
́
́
̉
2


                                                                                                                                                     10TCN 814­2006

* May moc th
́
́ ực hiên phan 
̣
̉ ứng huyêt thanh hoc
́
̣
­ May lăc đia (orbital shaker)
́ ́ ̃
­ May đoc ELISA
́ ̣
* May moc th
́
́ ực hiên PCR
̣
­ May nhân gien (Thermal cycler)
́
­ May ly tâm spinner
́

­ Hê thông điên di
̣
́
̣
­ Hê thông chup anh điên di
̣
́
̣ ̉
̣
­ Buông thao tac PCR (PCR work station hoăc PCR chamber)
̀
́
̣
2. Dung cu
̣
̣:
­ Binh tam giac 
̀
́
­ Ống đong thuy tinh 
̉
­ Côc co m
́ ́ ỏ
­ Ống nghiêm
̣
­ Lo chăt huyêt thanh
̣
́
́
­ Ống eppendorf 1,5 ml (Rnase/Dnase free)

­ Mang trôn chât phan 
́
̣
́
̉ ưng (reagent trough)
́
­ Pipet thuy tinh: 1, 5 va 10 ml
̉
̀
­ Micropipet đơn: 0,5­10, 5­40, 40­200, 200­1000 ml
­ Micropipet nhiêu đâu (8­12): 5­50, 50­300 
̀ ̀
ml
­ Đâu tip cac c
̀ ́ ́ ỡ 10, 20, 100, 200 va 1000
̀
ml sử dung cho micropipet (co loc va không
̣
́ ̣
̀
 
loc)
̣
­ Côi chay s
́
̀ ứ
­ Dao, keo, panh kep
́
̣
­ Găng tay cao su không bôt hoăc găng nitrile

̣
̣
­ Đia 96 giêng đay ch
̃
́
́ ư V
̃
­ Đen soi tr
̀
ưng
́
­ Kim 22 G, 11/2 inch
­ Syringe 1 ml
­ Dui đuc tr
̀ ̣ ưng
́
­ Keo dań
3. Hoa chât
́ ́
* Hoa chât thông th
́ ́
ường (hóa chất phân tích tinh khiết dành cho phòng thí nghiệm)
­ Nươc cât hoăc n
́ ́
̣ ươc kh
́ ử ion
­ Na2HPO4
­ NaH2PO4.H2O
­ Na Cl
­ HCl

­ NaOH
* Hoa chât cho PCR
́ ́
­ Côn Ethanol 70%, côn Ethanol tuyêt đôi
̀
̀
̣
́
­ Trizol® LS reagent hoăc Trizol® reagent
̣
­ Chloroform
­ Isopropanol
4. Nguyên liêu 
̣
3


                                                                                                                                                     10TCN 814­2006

4.1. Nguyên liêu cho phân lâp va phan 
̣
̣
̀
̉ ưng HA, HI
́
­ Trưng ga co phôi 9­ 10 ngay tuôi, khoe manh
́
̀ ́
̀
̉

̉ ̣
­   Khang
́   huyêt́   thanh   chuân̉   H1­H16   (ví   dụ   khang
́   huyêt́   thanh   H5N1  
A/Chicken/scot/59)
­ Khang nguyên chuân H1­H16 (vi du khang nguyên H5N1 Weybridge – UK)
́
̉
́ ̣
́
­ Men xử ly huyêt thanh RDE (Receptor Destroying Enzyme)
́
́
­ Hông câu ga 0,5%
̀
̀ ̀
­ Khang sinh
́
4.2. Nguyên liêu cho RT­PCR
̣
­ Kit chiêt tach RNA cua virus 
́
́ ́
̉
­ Kit RT­PCR OneStep 
́
­ Thach điên di
̣
̣
­ Marker (100 bp DNA ladder)

­ RNA đôi ch
́ ưng d
́ ương tinh
́
­ PBS 0,01M pH 7,2
­ Nươc cât đa x
́ ́ ̃ ử ly DEPC
́
Kiêm tra lâm sa
̉
̀ng

Đăc điêm dich tê
̣
̉
̣
̃ 
hoc̣

V. Cac ph
́ ương phap chân đoan
́
̉
́
SƠ ĐỒ CHẨN ĐOÁN BỆNH CÚM GIA CẦM
Lấy mẫu bênh phâm
̣
̉

(huyế t thanh, swab, phu tang..)

̉ ̣

Phát hiên kha
̣
́ng 
thê ̉ (HI)

Phát hiên virus
̣

Phân lâp virus
̣

4

RT­PCR (RRT­PCR)

(­)

(+)

(­)

Phân lâp lâ
̣ ̀n 
2

Giám đinh 
̣
(HI)

Phân lâp virus
̣

Kết luân bênh
̣
̣

(+)


                                                                                                                                                     10TCN 814­2006

1. Kiêm tra môt sô đăc điêm dich tê hoc, triêu ch
̉
̣ ́ ̣
̉
̣
̃ ̣
̣
ưng – bênh tich
́
̣
́
1.1. Môt sô đăc điêm dich tê hoc
̣ ́ ̣
̉
̣
̃
Bênh Cum gia câm co tinh lây truyên rât nhanh va manh. 

̣
́
̀
́ ́
̀ ́
̀ ̣
Chim hoang da đ
̃ ược coi la nguôn truyên lây mâm bênh. Chim măc bênh truyên virus
̀
̀
̀
̀
̣
́ ̣
̀
 
qua nươc dai, dich n
́ ̃ ̣
ươc mui va phân. 
́
̃ ̀
Chim va gia câm mân cam co thê bi nhiêm bênh khi tiêp xuc tr
̀
̀
̃ ̉
́ ̉ ̣
̃
̣
́
́ ực tiêp v

́ ới chim măć  
bênh hoăc gian tiêp qua cac bê măt nhiêm bân.
̣
̣
́ ́
́ ̀ ̣
̃
̉
Ngoai ra môt sô loai khac cung co thê bi măc bênh: ng
̀
̣ ́ ̀
́ ̃
́ ̉ ̣ ́ ̣
ười, lợn, ngựa..
1.2 Triêu ch
̣
ưng
́
­ Gia câm bi xu lông, u ru, bo ăn, giam đe.
̀ ̣ ̀
̉ ̃ ̉
̉
̉
­ Đâu, măt s
̀
̣ ưng, phu quanh măt. Mao, tich s
̀
́
̀ ́ ưng, xuât huyêt
́

́
­ Măt bi viêm kêt mac va co thê xuât huyêt
́ ̣
́ ̣
̀ ́ ̉
́
́
­ Chân giưa vung ban va khuyu bi xuât huyêt
̃ ̀
̀ ̀
̉
̣
́
́
­ Co triêu ch
́ ̣
ưng hô hâp 
́
́
­ Con vât măc bênh th
̣
́ ̣
ương chêt trong vong 24­48 gi
̀
́
̀
ờ sau khi xuât hiên cac triêu
́
̣
́

̣  
chưng đâu tiên
́
̀
1.3. Bênh tich
̣
́
­ Xuât huyêt tran lan 
́
́ ̀
ở cac c
́ ơ quan nôi tang
̣ ̣
­ Gia câm phu thung d
̀
̀ ̃ ươi da vung đâu, cô va ng
́
̀
̀
̉ ̀ ực
­ Miêng ch
̣
ưa nhiêu dich
́
̀ ̣
­ Khi quan xuât huyêt ch
́ ̉
́
́ ứa nhiêu dich nhay
̀ ̣

̀
­ Đương tiêu hoa xuât huyêt 
̀
́ ́
́
­ Ga đe buông tr
̀ ̉
̀
ứng xuât huyêt
́
́
2. Chân đoan phong thi nghiêm
̉
́
̀
́
̣
2.1. Phat hiên khang nguyên
́
̣
́
2.1.1. Phương phap phân lâp virus cum trên tr
́
̣
́
ứng ga co phôi
̀ ́
Phải thực hiện trong phòng thí nghiệm đảm bảo an toàn sinh học
a. Chuân bi bênh phâm tr
̉

̣ ̣
̉
ươc khi phân lâp:
́
̣
­ Dich ngoay ô nh
̣
́ ̉ ơp, hong, khi quan:
́
̣
́ ̉
+ Lăc manh ông ch
́
̣
́
ưa tăm bông dich ngoay băng may lăc vortex mixer
́
̣
́ ̀
́ ́
5


                                                                                                                                                     10TCN 814­2006

+ Bo tăm bông cua ông dich ngoay 
̉
̉ ́
̣
́

+ Bô sung 1/10 l
̉
ượng khang sinh đâm đăc 10X (xem phu luc), lăc đêu
́
̣
̣
̣ ̣
́ ̀
+ Đê mâu lăng căn khoang 30 phut 
̉ ̃ ́
̣
̉
́ ở nhiêt đô phong
̣
̣
̀
Mâu đa săn sang đê tiêm truyên.
̃ ̃ ̃ ̀
̉
̀
­ Tô ch
̉ ưc phu tang:
́
̉ ̣
+ Nghiên bênh phâm băng côi chay s
̀ ̣
̉
̀
́
̀ ứ vô trung thanh huyên dich 10% v

̀
̀
̃ ̣
ới dung dich
̣  
vân chuyên hoăc băng PBS 0,01M pH7,2
̣
̉
̣
̀
+ Bô sung 1/10 l
̉
ượng khang sinh đâm đăc, chuyên sang ông ly tâm. Ly tâm v
́
̣
̣
̉
́
ơi tôc đô
́ ́ ̣ 
400g (2.000 vong/phut) trong 10 phut.
̀
́
́
+ Thu dich nôi.
̣
̉
b. Tiên hanh phân lâp:
́
̀

̣
­ Chon tr
̣ ưng co phôi 9­10 ngay tuôi khoe manh, 3 tr
́
́
̀
̉
̉ ̣
ưng/bênh phâm
́
̣
̉
­ Lau trưng băng côn 70% va đuc lô nho phia trên buông h
́
̀
̀
̀ ̣ ̃ ̉
́
̀ ơi
­ Dung syringe 1 ml lăp kim va hut dich bênh phâm (đa x
̀
́
̀ ́ ̣
̣
̉
̃ ử  ly ́ở  trên) tiêm vao xoang
̀
 
niêu mô v
̣

ơi l
́ ượng 0,2 ml/trưng
́
­ Găn vêt tiêm băng keo dan
́ ́
̀
́
­ Ấp trưng tiêp 2­3 ngay 
́
́
̀ ở nhiêt đô 37
̣
̣ 0C
­ Theo doi sau khi tiêm, soi tr
̃
ưng ngay 2 lân. Nh
́
̀
̀
ững trứng chêt đ
́ ược cât vao tu lanh
́ ̀ ̉ ̣  
0
4 C đê kiêm tra.
̉ ̉
c. Thu hoach n
̣
ươc tr
́ ưng sau khi phân lâp:
́

̣
0
­ Trưng chêt hoăc sông đ
́
́
̣
́ ược cât vao tu lanh 4
́ ̀ ̉ ̣
C qua đêm hoăc it nhât 4 gi
̣ ́
́
ờ trươc khi
́
 
thu hoach.
̣
­ Lau trưng băng côn 70%
́
̀
̀
­ Dùng syringe hút trực tiếp nước trứng bằng cách đâm kim qua vỏ.
­ Thu dich niêu mô vao ông nghiêm. Thu hoach riêng tr
̣
̣
̀ ́
̣
̣
ứng sông va chêt.
́
̀ ́

2.1.2. Giam đinh virus phân lâp
́
̣
̣
a. Kiêm tra n
̉
ươc tr
́ ưng băng phan 
́
̀
̉ ứng HA
­ Nho 25 µl PBS 0,01M vao đia 96 giêng ch
̉
̀ ̃
́
ữ V từ giêng th
́
ứ 1 đên giêng 12 cua môi
́
́
̉
̃ 
hang
̀
­ Cho 25 µl dich niêu mô vao giêng th
̣
̣
̀
́
ư 1

́
­ Pha loang khang nguyên băng cach chuyên 25 µl dich niêu mô t
̃
́
̀
́
̉
̣
̣
ừ giêng th
́
ứ 1 sang  
giêng th
́
ư 2 va tuân t
́
̀ ̀ ự đên giêng 11 thi bo đi 25 µl.
́
́
̀ ̉
­ Nho thêm 25 µl PBS vao cac giêng
̉
̀ ́
́
­ Nho 25 µl hông câu ga 1% (v/v) vao tât ca cac giêng trên.
̉
̀
̀ ̀
̀ ́ ̉ ́
́

­ Lăc đia băng may hoăc băng tay
́ ̃ ̀
́
̣
̀
0
­ Ủ đia phan 
̃
̉ ưng 
́ ở nhiêt đô phong 20
̣
̣
̀
C, thơi gian khoang 40 phut hoăc 60 phut  nhiêt
̀
̉
́
̣
́
̣ 
0
đô 4
̣ C.  . 
 
* Đoc kêt qua:
̣
́
̉
Hiêu gia HA cua virus đ
̣

́
̉
ược tinh 
́ ở đô pha loang cao nhât con co hiên t
̣
̃
́ ̀ ́ ̣ ượng ngưng kêt́ 
hông câu. 
̀
̀
Vi du: Nêu 
́ ̣
́ ở đô pha loang 1/128 con co ng
̣
̃
̀ ́ ưng kêt thi hiêu gia HA la 1/128. 
́ ̀ ̣
́
̀
­ Nêu HA(+) d
́
ương tinh, ch
́
ưng to co virus. Tiêp tuc giam đinh băng phan 
́
̉ ́
́ ̣
́
̣
̀

̉ ưng HI v
́
ơí 
khang huyêt thanh chuân cua môt sô subtype H virus Cum A va khang huyêt thanh chuân
́
́
̉
̉
̣
́
́
̀
́
́
̉  
Newcastle đê xac đinh loai virus phân lâp.
̉ ́ ̣
̣
̣
­ Nêu HA(­) âm tinh, phôi chêt, co bênh tich phôi, lây n
́
́
́ ́ ̣
́
́ ước trứng tiêm truyên lân 2.
̀ ̀
6


                                                                                                                                                     10TCN 814­2006

­ Nêu HA(­) âm tinh, phôi phat triên binh th
́
́
́
̉
̀
ường, co thê tiêm lai hoăc không.
́ ̉
̣
̣
0
Bao quan virus phân lâp đ
̉
̉
̣ ược ở – 70 C.
b. Giam đinh virus phân lâp băng phan 
́
̣
̣
̀
̉ ứng ngăn trở ngưng kêt hông câu ­ HI
́ ̀
̀
 
­ Pha khang nguyên 4HA/25
́
 µl: Lây đô pha loang cuôi cung co phan 
́
̣

̃
́ ̀
́ ̉ ưng ng
́
ưng kêt́ 
hông câu chia cho 4. 
̀
̀
Vi du:  Hiêu gia HA cua dich niêu mô la 1/128
́ ̣
̣
́
̉ ̣
̣
̀
 
Đơn vi 4 HA =  128: 4 = 32. 
̣
Như  vây se trôn 1 phân dich n
̣
̃ ̣
̀ ̣
ươc tr
́ ưng v
́
ơi 31 phân PBS đê đat đ
́
̀
̉ ̣ ược dung dich
̣  

khang nguyên 4HA.
́
­ Chuân đô khang nguyên 4HA
̉
̣
́
: Sau khi pha, khang nguyên 4HA phai  đ
́
̉ ược chuân đô
̉
̣ 
lai. Tiên han nh
̣
́ ̀ ư phan 
̉ ưng HA.
́
­ Tiên hanh phan 
́
̀
̉ ưng HI
́
: Trên 1 đia co thê tiên hanh phan 
̃ ́ ̉ ́ ̀
̉ ưng HI v
́
ơi nhiêu khang
́
̀
́  
huyêt thanh cua cac subtype khac nhau

́
̉
́
́
+ Nho 25 µl PBS vao cac giêng cua đia 96 giêng 
̉
̀ ́
́
̉ ̃
́
+ Nho tiêp 25 µl khang huyêt thanh vao giêng đâu tiên
̉ ́
́
́
̀
́
̀
+ Pha loang khang huyêt thanh theo c
̃
́
́
ơ sô 2, băng cach chuyên 25 µl khang huyêt thanh
́
̀
́
̉
́
́
 
tư giêng 1 sang giêng 2 va tuân t

̀ ́
́
̀ ̀ ự đên giêng 11 va bo đi 25 µl cuôi cung.
́
́
̀ ̉
́ ̀
+ Nho 25 µl khang nguyên 4HA đa chuân bi vao cac giêng t
̉
́
̃
̉
̣ ̀ ́
́ ừ giêng 1 ­ 11. 
́
Thêm 25 µl PBS vao hang đôi ch
̀ ̀
́ ứng hông câu (giêng 12)
̀
̀
́
+ Lăc đia va u 
́ ̃ ̀ ̉ ở nhiêt đô phong 30 phut
̣
̣
̀
́
+ Nho 25 µl dung dich hông câu vao tât ca cac giêng cua đia, lăcđêu.
̉
̣

̀
̀ ̀ ́ ̉ ́
́
̉ ̃ ́ ̀
+ Đê đia 
̉ ̃ ở  nhiêt đô phong 30­40 phut. Đoc kêt qua khi h
̣
̣
̀
́
̣
́
̉
ồng cầu đối chứng lắng 
xuống đáy.
* Đoc kêt qua:
̣
́
̉
­ Phan 
̉ ưng (+) d
́
ương tinh: Hông câu lăng xuông đay. Nh
́
̀
̀ ́
́
́
ư  vây, virus phân lâp va
̣

̣
̀ 
khang huyêt thanh chuân t
́
́
̉ ương ưng v
́ ơi nhau. 
́
­ Xac đinh subtype: Môt virus phân lâp đ
́ ̣
̣
̣ ược xac đinh subtype khi no phan 
́ ̣
́ ̉ ưng v
́
ơí 
môt khang huyêt thanh chuân hiêu gia cao h
̣
́
́
̉
̣
́
ơn so vơi cac khang huyêt thanh chuân khac. Hiêu
́ ́
́
́
̉
́
̣  

gia cang cao ch
́ ̀
ưng to s
́
̉ ự tương đông cua virus phân lâp v
̀
̉
̣ ới khang huyêt thanh chuân cang
́
́
̉
̀  
lơn.
́
2.1.3. Phương phap RT­PCR
́
a. Chiêt tach ARN.
́ ́
Co thê chiêt tach RNA băng bô kit hoăc ph
́ ̉
́ ́
̀
̣ ́
̣
ương phap chiêt tach Trizol. 
́
́ ́
Cac mâu swab nên chiêt tach băng kit, khi s
́
̃

́ ́
̀
́
ử dung th
̣
ực hiện theo hương dân cua nha
́
̃ ̉
̀ 
san xuât.  
̉
́
Chiêt tach băng Trizol
́ ́
̀
:
Cho 0,75 ml Trizol® LS reagent (hoăc 1 ml  Trizol® reagent) + 0,25 ml dich bênh
̣
̣
̣  
phâm(0,1 ml dich bênh phâm nêu dung  Trizol® reagent) vao ông 1,5 ml. Lăc đêu
̉
̣
̣
̉
́ ̀
̀ ́
́ ̀ 
va đê 
̀ ̉ ở nhiêt đô phong 5 phut. 

̣
̣
̀
́
Thêm 0.2 ml chloroform vao môi ông. Lăc manh trong 15 giây va đê 
̀
̃ ́
́
̣
̀ ̉ ở  nhiêt đô
̣
̣ 
phong 5 phut. 
̀
́
Ly tâm ông 
́ ở tôc đô 12.000g trong 15 phut 
́ ̣
́ ở 4°C. 
Chuyên phân n
̉
̀ ươc (khoang 500 µl) sang ông microtube m
́
̉
́
ới. 
Thêm 0.5 ml Isopropanol va lăc đêu. Đê 5­10 phut 
̀ ́ ̀
̉
́ ở nhiêt đô phong. 

̣
̣
̀
Ly tâm ông 
́ ở tôc đô 10.000 g trong 5 phut 
́ ̣
́ ở 4°C. Bo dung dich trong ông đi.
̉
̣
́
7


                                                                                                                                                     10TCN 814­2006

Rửa RNA đong 
́ ở đay ông băng côn 80%, lăc manh va ly tâm v
́ ́
̀
̀
́
̣
̀
ới tôc đô 10.000 g
́ ̣
 
trong 5 phut 
́ ở 4°C. 
Bo dung dich trong ông va lam khô RNA 10 phut 
̉

̣
́
̀ ̀
́ ở nhiêt đô phong va hoa tan lai
̣
̣
̀
̀ ̀
̣ 
vơi 30 µl n
́
ươc cât không co Rnase hoăc n
́ ́
́
̣ ước cât đa x
́ ̃ ử ly DEPC
́
.
b. Tiên hanh phan 
́
̀
̉ ứng RT­PCR
­ Pha hỗn hợp phản ứng (Master mix): Công thưc pha co thê thay đôi cho phu h
́
́ ̉
̉
̀ ợp vơí 
tưng loai primer va t
̀
̣

̀ ưng loai kit RT­PCR khac nhau. 
̀
̣ ́
́
­ Chu trinh nhân gien: Chu trình nhân gien g
̀
ồm 2 giai đoạn: Phiên mã ngược (RT) và  
nhân gien (PCR). Quy trình cụ thể sẽ tùy thuộc vào loại kít và primer được sử dụng.
c. Chay điên di:
̣
̣
­   Chuân̉   bị   thach
̣   agarose   1,5%   pha   trong   dung   dich
̣   TAE   hoăc̣   TBE   có  Ethidium 
Bromide (10 mg/ml)
­ Đô thach vao khuôn điên di (co l
̉ ̣
̀
̣
́ ược)
­ Thach khô, rut l
̣
́ ược ra va cho mâu vao cac giêng (5 µl san phâm PCR + 2µl dung dich
̀
̃ ̀ ́
́
̉
̉
̣  
loading buffer).

­ Sử dung Marker trong l
̣
̣
ượng phân tử (thang 100 bp)
­ Chu y khi chay PCR phai co mâu đôi ch
́ ́
̣
̉ ́ ̃ ́ ứng dương va đôi ch
̀ ́ ứng âm đi kem (mâu đôi
̀
̃ ́ 
chưng âm tinh co thê la n
́
́
́ ̉ ̀ ước cât sach)
́ ̣
d. Đoc kêt qua:
̣
́
̉
­ Mâu d
̃ ương tinh: Xuât hiên vach giông v
́
́ ̣
̣
́ ới mâu đôi ch
̃ ́ ứng dương tinh.
́
­ Mâu âm tinh: Không co vach
̃

́
́ ̣
Đanh gia kêt qua:
́
́ ́
̉  Co virus Cum hoăc virus Cum thuôc subtype nao d
́
́
̣
́
̣
̀ ựa vao primer chay mâu.
̀
̣
̃
2.1.4. Phương phap Realtime RT­PCR (RRT­PCR)
́
 Phương phap nay co gia tri chân đoan nh
́ ̀ ́ ́ ̣
̉
́ ư phương phap RT­PCR. 
́
a. Chiết tách ARN: xem phần RT­PCR
b. Tiến hành phản ứng RRT­PCR:
­ Pha hỗn hợp phản ứng: Tùy thuộc loại kít được sử dụng 
­ Chu trình nhân gien: Tùy thuộc kít, primer, probe và loại máy realtime PCR được sử 
dụng.
c. Đọc kết quả:
­ Kết quả  được đánh giá dựa trên ngưỡng vòng (Ct) được phát hiện của các mẫu 
kiểm tra.

­ Phản ứng được chấp nhận khi đ/c (­) có Ct = 0 và  đ/c (+) có Ct dao động quanh 25
­ Mẫu dương tính: khi Ct ≤ 35
­ Mẫu nghi ngờ khi Ct ≥ 35
­ Mẫu âm tính khi không có Ct.
2.2. Phat hiên khang thê
́
̣
́
̉
2.2.1. Phan 
̉ ưng HI phat hiên khang thê subtype H5 (hoăc cac subtype khac )
́
́
̣
́
̉
̣
́
́
Huyêt thanh kiêm tra: Huyêt thanh ga không cân x
́
̉
́
̀
̀ ử ly băng RDE, huyêt thanh vit, ngan
́ ̀
́
̣
 
co thê x

́ ̉ ử ly băng RDE đê chông hiên t
́ ̀
̉
́
̣ ượng ưc chê ng
́
́ ưng kêt không đăc hiêu va x
́
̣
̣
̀ ử ly hông
́ ̀  
câu đê chông hiên t
̀ ̉
́
̣ ượng ngưng kêt hông câu gia. (cac ph
́ ̀
̀
̉
́ ương phap x
́ ử  ly huyêt thanh xem
́
́
 
phân phu luc)
̀
̣ ̣
a. Chuân bi khang nguyên: 
̉
̣

́
­ Chuân đô khang nguyên – Xac đinh hiêu gia HA (phan 
̉
̣
́
́ ̣
̣
́
̉ ưng ng
́
ưng kêt hông câu HA) 
́ ̀
̀
­ Pha khang nguyên chuân 4HA/25 µl
́
̉
8


                                                                                                                                                     10TCN 814­2006

Chu y
́ ́: Trươc khi pha cân tinh l
́
̀ ́ ượng khang nguyên dung cho phan 
́
̀
̉ ưng công thêm 1ml
́
̣

 
đê đam bao l
̉ ̉
̉ ượng khang nguyên cân dung.
́
̀ ̀
­ Chuân đô khang nguyên 4HA tr
̉
̣
́
ươc khi tiên hanh phan 
́
́ ̀
̉ ứng HI
b. Phan 
̉ ưng HI:
́
­ Nho 25 µl PBS vao cac giêng cua đia 96 giêng 
̉
̀ ́
́
̉ ̃
́
­ Nho tiêp 25 µl huyêt thanh vao giêng đâu tiên
̉ ́
́
̀
́
̀
­ Pha loang huyêt thanh theo c

̃
́
ơ  sô 2, băng cach chuyên 25 µl khang huyêt thanh t
́
̀
́
̉
́
́
ư ̀
giêng 1 sang giêng 2 va tuân t
́
́
̀ ̀ ự đên giêng 11 va bo đi 25 µl cuôi cung.
́
́
̀ ̉
́ ̀
­ Nho 25 µl khang nguyên 4HA đa chuân bi vao cac giêng t
̉
́
̃
̉
̣ ̀ ́
́ ừ giêng 1 ­ 11. Thêm 25 µl
́
 
PBS vao hang đôi ch
̀ ̀
́ ứng hông câu (giêng 12)

̀
̀
́
­ Lăc đia va u 
́ ̃ ̀ ̉ ở nhiêt đô phong 30 phut
̣
̣
̀
́
­ Nho 25 µl dung dich hông câu vao tât ca cac giêng cua đia, lăcđêu.
̉
̣
̀
̀ ̀ ́ ̉ ́
́
̉ ̃ ́ ̀
­ Đê đia 
̉ ̃ ở nhiêt đô phong 30­ 40 phut. Đoc kêt qua
̣
̣
̀
́
̣
́
̉
Đoc kêt qua:
̣
́
̉
Phan 

̉ ưng (+) d
́
ương tinh:
́  Hông câu lăng xuông đay.
̀
̀ ́
́
́
Hiêu gia HI cua mâu đ
̣
́
̉
̃ ược tinh 
́ ở đô pha loang huyêt thanh cao nhât con co hiên t
̣
̃
́
́ ̀ ́ ̣ ượng  
ưc chê ng
́
́ ưng kêt hông câu. Huyêt thanh đ
́ ̀
̀
́
ược coi la d
̀ ương tinh khi co hiêu gia huyêt thanh ≥
́
́ ̣
́
́

 
1/16. Huyêt thanh đôi ch
́
́ ưng âm tinh phai co hiêu gia ≤ 1/4
́
́
̉ ́ ̣
́
Chu y
́ ́:  Khi kiêm tra huyêt thanh cac loai khac không phai la ga nên co 1 giêng chi co
̉
́
́
̀
́
̉ ̀ ̀
́
́
̉ ́ 
huyêt thanh va hông câu đê kiêm tra hiên t
́
̀ ̀
̀ ̉ ̉
̣ ượng ngưng kêt hông câu không đăc hiêu. Nêu phat
́ ̀
̀
̣
̣
́
́ 

hiên thây co ng
̣
́ ́ ưng kêt hông câu không đăc hiêu xay ra v
́ ̀
̀
̣
̣
̉
ơi mâu huyêt thanh nao cân x
́ ̃
́
̀ ̀ ử ly lai
́ ̣ 
mâu huyêt thanh đo va kiêm tra lai băng phan 
̃
́
́ ̀ ̉
̣ ̀
̉ ứng HI.
2.2.2. Phan 
̉ ưng ELISA 
́
Cac bô kit ELISA th
́ ̣
ương mại chi phat hiên đ
̉
́ ̣ ược khang thê gia câm v
́
̉
̀ ới khang nguyên

́
 
Nucleocapsid, tưc la phat hiên đ
́ ̀ ́ ̣ ược khang thê cum A ma không phân biêt đ
́
̉ ́
̀
̣ ược subtype cuả  
khang thê co trong huyêt thanh. Khi s
́
̉ ́
́
ử dung kit ELISA nên ap dung theo quy trinh kem theo. 
̣
́
́ ̣
̀
̀
2.3. Chân đoan phân biêt
̉
́
̣
Chân đoan phân biêt v
̉
́
̣ ới cac bênh sau đây:
́ ̣
­ Bênh Niu cat x
̣
́ ơn

­ Bênh Gumboro
̣
­ Bênh Dich ta vit 
̣
̣
̉ ̣
­ Bênh Tu huyêt trung
̣
̣
́ ̀
VI. Kêt luân
́
̣
­ Nêu kêt qua phân lâp HA d
́
́
̉
̣
ương tinh, giam đinh HI d
́
́
̣
ương tinh v
́
ơi khang huyêt
́
́
́ 
thanh chuân, kêt luân co virus cum.
̉

́ ̣
́
́
­ Nêu kêt qua RT­PCR (RRT­PCR) d
́ ́
̉
ương tinh, kêt luân d
́
́ ̣ ương tinh virus cum.
́
́
­ Nêu gia câm ch
́
̀
ưa tiêm phong, phat hiên co khang thê cum, kêt luân gia câm đa nhiêm
̀
́ ̣
́ ́
̉ ́
́ ̣
̀
̃
̃  
virus cum.
́
­ Nêu kêt qua phân lâp âm tinh, RT­PCR (RRT­PCR) âm tinh, kêt luân âm tinh virus 
́ ́
̉
̣
́

́
́ ̣
́
cum
́
VII. Tài liệu tham khảo
1. Manual of standards for diagnosis tests and vaccines (OIE).
2. WHO manual on Animal Influenza Diagnosis and Surveillance

9


                                                                                                                                                     10TCN 814­2006

       KT. BỘ TRƯỞNG
          THỨ TRƯỞNG

                                                                                                          
 
                                                                Bùi Bá Bổng

           

PHỤ LỤC
I. Lây va Bao quan bênh phâm 
́ ̀ ̉
̉
̣
̉
1. Lây mâu:

́
̃
­ Dich ngoay hong, khi quan: Đ
̣
́
̣
́ ̉
ưa tăm bông vao sâu trong hong ho
̀
̣
ặc khí quản rôì 
ngoay thu lây dich nhay, sau đo t
́
́ ̣
̀
́ ừ từ rut ra rôi đ
́
̀ ưa vao ông ch
̀ ́
ứa dung dich bao quan, be que
̣
̉
̉
̉
 
vưa v
̀ ơi chiêu dai cua ông, đong kin năp.
́
̀ ̀ ̉ ́
́

́ ́
­ Dich ngoay ô nh
̣
́ ̉ ơp: Cho que ngoay sâu vao hâu môn gia câm, ngoay quanh thanh hâu
́
́
̀ ̣
̀
́
̀
̣  
môn, đưa vao ông ch
̀ ́
ưa dung dich bao quan nh
́
̣
̉
̉
ư trên.
­ Mâu phân: Dung tăm bông ngoay tr
̃
̀
́ ực tiêp vao phân t
́ ̀
ươi  ở  chuông ga, rôi cho vao
̀
̀ ̀
̀ 
ông ch
́

ưa dich bao quan.
́ ̣
̉
̉
­ Mâu tô ch
̃ ̉ ưc: Lây keo căt phân tô ch
́
́ ́ ́
̀ ̉ ức cân lây cho vao tui nilon hay hôp nh
̀ ́
̀ ́
̣
ựa sach,
̣  
bao quan lanh. Mâu tô ch
̉
̉ ̣
̃ ̉ ưc nho co thê cho vao dung dich bao quan.
́
̉ ́ ̉
̀
̣
̉
̉
­ Mâu huyêt thanh: Lây 3­5 ml mau gia câm vao ông nghiêm, đê nghiêng, ch
̃
́
́
́
̀

̀ ́
̣
̉
ờ maú  
đông chăt lây huyêt thanh.
́ ́
́

10


                                                                                                                                                     10TCN 814­2006

Bênh phâm sau khi cho vao dung dich vân chuyên co thê bao quan 
̣
̉
̀
̣
̣
̉
́ ̉ ̉
̉ ở  40C từ 1­2 ngay,
̀  
0
nêu bao quan lâu h
́ ̉
̉
ơn nên giư ̃ở nhiêt đô ­20
̣
̣

C. 
Mâu huyêt thanh co thê đê 
̃
́
́ ̉ ̉ ở nhiêt đô 4
̣
̣ 0C trong vong 1 tuân, nêu bao quan lâu h
̀
̀
́ ̉
̉
ơn nên 
0
giư ̃ở nhiêt đô ­20
̣
̣
C. 
Mâu đ
̃ ược chuyên t
̉ ơi phong xet nghiêm trong điêu kiên lanh (phich đa), cang s
́
̀
́
̣
̀
̣
̣
́
́
̀ ơm

́  
cang tôt, co phiêu g
̀
́ ́
́ ửi bênh phâm kem theo.
̣
̉
̀
2. Môi trương bao quan bênh phâm
̀
̉
̉
̣
̉
Bênh phâm la dich ngoay ô nh
̣
̉
̀ ̣
́ ̉ ớp, hong, khi quan đ
̣
́ ̉ ược bao quan trong dung dich vân
̉
̉
̣
̣  
chuyên. Co thê s
̉
́ ̉ ử dung môi tr
̣
ương 199 hoăc môi tr

̀
̣
ương glycerol co bô sung khang sinh, bao
̀
́ ̉
́
̉  
0
0
quan 
̉ ở 4 C tư 1­2 ngay, nêu lâu nên gi
̀
̀
́
ữ ở nhiêt đô ­20
̣
̣
C.
­ Môi trương 199 ch
̀
ưa 0,5% BSA (Albumin huyêt thanh bo)
́
́
̀
Bô sung khang sinh 
̉
́
Penicillin G
2.000.000U/lit́
Streptomycin

200 mg/lit́
Polymyxin B
2.000.000 U/lit́
Gentamicin
250 mg/lit́
Nystatin
500.000 U/lit́
Ofloxacin HCl
60 mg/lit́
Sulfmethoxasole
200 mg/lit́
­ Môi trương Glycerol
̀
+ Pha chê PBS
́
NaCl
8 g
KCl
0,2 g
Na2HPO4
1,15 g
KH2PO4
0,2 g
Nươc cât vđ
́ ́
1000 ml
0
+ Hâp vô trung (121
́
̀

C/15) phut, bô sung khang sinh (nh
́ ̉
́
ư trên) va trôn v
̀ ̣ ới 
glycerol theo ty lê 1:1
̉ ̣
Ngoai ra co thê s
̀
́ ̉ ử  dung cac môi tr
̣
́
ương bao quan khac nh
̀
̉
̉
́ ư: Muôi đêm Hank, môi tr
́ ̣
ường  
M.E.M, PBS, Tryptose Phosphate broth, Veal Infusion Broth, Sucrose­phosphate buffer. Cać  
dung dich nay co thê đ
̣
̀ ́ ̉ ược bô sung bovine serum albumin (BSA), gelatin 0,5­1%, cac chât
̉
́
́ 
khang sinh, khang nâm.
́
́
́

II. Chuân bi cac dung dich va x
̉
̣ ́
̣
̀ ử ly huyêt thanh
́
́
1. Dung dich PBS 0,01M pH7.2
̣
Na2HPO4
1,096 g
NaH2PO4.H2O
0,316 g
Na Cl
8,5 g
Nươc c
́ ất
1 lit́
Chinh pH = 7.2 băng NaOH 1N hoăc HCl 1N, hâp vô trung, bao quan 4
̉
̀
̣
́
̀
̉
̉ 0C không qua 3
́  
tuân.
̀
2. Dung dich n

̣
ươc muôi sinh ly 0,85%: 
́
́
́
8,5 g NaCl trong 1 lit n
́ ươc cât.
́ ́
0
Hâp vô trung, bao quan 4
́
̀
̉
̉
C không qua 3 tuân.
́
̀
11


                                                                                                                                                     10TCN 814­2006

3. Dung dich hông câu ga 1%:
̣
̀
̀ ̀
­ Mau ga trông khoe manh đa tr
́ ̀ ́
̉ ̣
̃ ưởng thanh, không co khang thê cum va newcastle.

̀
́ ́
̉ ́
̀
­ Dung b
̀ ơm tiêm 5 – 10 ml hut săn 1ml (10 % thê tich) dung dich chông đông (Natri
́ ̃
̉ ́
̣
́
 
Citrat 4%, Alserver) rôi lây mau ga cho mau vao ông nghiêm.
̀ ́
́ ̀
́ ̀ ́
̣
­ Ly tâm 1000 – 1500 vong/phut, trong 15 phut, đô bo huyêt t
̀
́
́
̉ ̉
́ ương, cho thêm nước 
sinh ly (NaCl 0,85%) vao hông câu, lăc đêu. Ly tâm nh
́
̀ ̀
̀ ́ ̀
ư trên 3 – 4 lân đê r
̀ ̉ ửa hông câu. Sau
̀
̀

 
lân ly tâm cuôi hut bo n
̀
́ ́ ̉ ước ở trên.
­ Pha hông câu thanh huyên dich 1% băng cach pha 1 ml hông câu v
̀
̀
̀
̃ ̣
̀
́
̀
̀ ới 99 ml nươć  
muôi sinh ly.
́
́
0
­ Bao quan huyên dich hông câu 
̉
̉
̃ ̣
̀
̀ ở nhiêt đô 4 – 8
̣
̣
C. Hông câu sau khi pha co thê dung
̀
̀
́ ̉ ̀  
trong 4­5 ngay (nêu dung dich hông câu bi dung huyêt loai bo không dung).

̀
́
̣
̀
̀ ̣
́ ̣
̉
̀
4. Xử lý huyết thanh: 
a. Xử lý huyết thanh chống hiện tượng ức chế không đặc hiệu
Khang huyêt thanh chuân chê trên cac loai khác gà nh
́
́
̉
́
́
̀
ư tho, dê, c
̉
ừu... cân đ
̀ ược xử lý 
băng RDE (Receptor Destroying Enzyme) tr
̀
ươc khi xet nghiêm. 
́
́
̣
Các mẫu huyết thanh có phan 
̉ ưng cho kêt qua không ro rang co thê x
́

́
̉
̃ ̀
́ ̉ ử  ly RDE đê
́
̉ 
khăng đinh kêt qua d
̉
̣
́
̉ ương tinh.
́
Các bước tiến hành:
­ Trôn 3 phân RDE v
̣
̀
ơi 1 phân khang huyêt thanh (vd: 0,9 ml RDE+0,3 ml huyêt thanh)
́
̀
́
́
́
­ Ủ ở nhiêt đô 37
̣
̣ 0C trong nôi đun cach thuy (water bath) qua đêm.
̀
́
̉
­ Sau u tiêp 
̉ ́ ở nôi đun cach thuy nhiêt đô 56

̀
́
̉
̣
̣ 0C/30 phut đê vô hoat RDE con d
́ ̉
̣
̀ ư. 
­ Khang huyêt thanh đa x
́
́
̃ ử ly đê nguôi  cho thêm 6 phân n
́ ̉
̣
̀ ước muôi sinh ly (0,3 ml HT
́
́
 
+ 1,8ml SL), đô pha loang cuôi cung cua khang huyêt thanh se la 1/10.
̣
̃
́ ̀
̉
́
́
̃ ̀
b. Xử ly huyêt thanh chông hiên t
́
́
́

̣ ượng gây ngưng kêt hông câu không đ
́ ̀
̀
ặc hiệu.
Hiên t
̣ ượng gây ngưng kêt hông câu gia co thê x
́ ̀
̀
̉ ́ ̉ ử  ly băng cach hâp phu huyêt thanh
́ ̀
́
́
̣
́
 
kiêm tra v
̉
ơi hông câu ga. Thêm 25 µl hông câu đăc vao 500 µl huyêt thanh, lăc nhe va đê 
́ ̀
̀ ̀
̀
̀ ̣
̀
́
́
̣ ̀ ̉ ở  
nhiêt đô phong trong 30 phut, sau đo ly tâm 
̣
̣
̀

́
́
ở tôc đô 800 g trong vong 2­5 phut. Thu l
́ ̣
̀
́
ấy huyêt́ 
thanh đa hâp phu.
̃ ́
̣

       KT. BỘ TRƯỞNG
           THỨ TRƯỞNG

                                                                                                          
 

                                                  Bùi Bá Bổng

12


                                                                                                                                                     10TCN 814­2006

13