XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH TÍNH VÀ ĐỊNH LƯỢNG COIXOL TRONG CAM THẢO ĐẤT (SCOPARIA DULCIS L.) BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

PHẠM THỊ MINH HẢI

XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH TÍNH
VÀ ĐỊNH LƯỢNG COIXOL TRONG CAM
THẢO ĐẤT (SCOPARIA DULCIS L.) BẰNG
PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG
CAO
LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

HÀ NỘI 2019


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

PHẠM THỊ MINH HẢI

XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH TÍNH
VÀ ĐỊNH LƯỢNG COIXOL TRONG CAM
THẢO ĐẤT (SCOPARIA DULCIS L.) BẰNG
PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG
CAO

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC
CHUYÊN NGÀNH: KIỂM NGHIỆM THUỐC VÀ ĐỘC CHẤT
MÃ SỐ: 8720210

Người hướng dẫn khoa học: 1. PGS.TS. Phương Thiện Thương
2. PGS. TS. Nguyễn Thị Kiều Anh

HÀ NỘI 2019


LỜI CẢM ƠN
Để có thể hoàn thành đề tài Luận văn thạc sĩ một cách hoàn chỉnh, sự
hướng dẫn nhiệt tình của quý Thầy Cô, sự động viên ủng hộ của gia đình, bạn
bè và đồng nghiệp trong suốt thời gian học tập nghiên cứu là nguồn động lực
lớn lao và quý giá nhất đối với tôi.
Đầu tiên, xin chân thành bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc nhất
đến PGS. TS. Phương Thiện Thương và PGS. TS. Nguyễn Thị Kiều Anh, là
người trực tiếp hướng dẫn, tận tình chỉ bảo và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho
tôi trong suốt quá trình thực hiện và hoàn thành Luận văn. Đặc biệt, cho phép
tôi gửi lời cảm ơn chân thành đến ThS. Nguyễn Thị Hà Ly đã động viên, nhiệt
tình hướng dẫn và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện.
Xin chân thành bày tỏ lòng biết ơn đến toàn thể quý Thầy Cô Trường
Đại học Dược Hà Nội và đặc biệt là quý Thầy Cô Bộ môn Hóa phân tích – Độc
chất, đã tận tình truyền đạt những kiến thức quý báu cũng như tạo mọi điều
kiện thuận lợi nhất cho tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu.
Tôi xin gửi lời cảm ơn đến Ban lãnh đạo và các anh chị cán bộ Viện
Dược liệu đã không ngừng hỗ trợ về thiết bị và tạo mọi điều kiện tốt nhất cho tôi
trong suốt thời gian nghiên cứu và thực hiện Luận văn.
Cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn gia đình, các bạn và các anh chị
em đã động viên, hỗ trợ cho tôi rất nhiều trong suốt quá trình học tập và thực

hiện đề tài.
Mặc dù đã có nhiều cố gắng trong suốt quá trình thực hiện đề tài, song
có thể còn có những mặt hạn chế, thiếu sót. Tôi rất mong nhận được ý kiến
đóng góp và sự chỉ dẫn của các thầy cô giáo và các anh chị đồng nghiệp.
Hà Nội, ngày 30 tháng 03 năm 2019

Phạm Thị Minh Hải


MỤC LỤC
ĐẶT VẤN ĐỀ ............................................................................................................1
Chương 1.

TỔNG QUAN ....................................................................................3

1.1. Tổng quan về cây cam thảo đất ............................................................................3
1.1.1. Đặc điểm thực vật ............................................................................................ 3
1.1.2. Phân bố, thu hái, chế biến ................................................................................4
1.1.3. Thành phần hóa học ......................................................................................... 4
1.1.4. Tác dụng và công dụng của cây cam thảo đất...................................................4
1.2. Tổng quan về hoạt chất Coixol ..........................................................................5
1.2.1. Tính chất............................................................................................................5
1.2.2. Tác dụng sinh học của coixol ............................................................................6
1.3. Các nghiên cứu định lượng coixol đã công bố: ...............................................7
1.4. Tổng quan về sắc kí lỏng hiệu năng cao ......................................................... 10
1.4.1. Khái niệm ........................................................................................................10
1.4.2. Nguyên tắc ......................................................................................................10
1.4.3. Cấu tạo máy HPLC ......................................................................................... 10
1.4.4. Một số đại lượng dùng trong sắc ký ................................................................ 11
1.4.5. Ứng dụng của HPLC [2] .................................................................................12

Chương 2.

ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...................17

2.1. Đối tượng và phương tiện nghiên cứu ............................................................ 17
2.1.1. Hoá chất - chất chuẩn ...................................................................................... 17
2.1.2. Máy móc - trang thiết bị .................................................................................. 17
2.1.3. Đối tượng nghiên cứu...................................................................................... 17
2.2. Phương pháp nghiên cứu................................................................................18
2.2.1. Thu thập mẫu...................................................................................................18
2.2.2. Xử lý mẫu ........................................................................................................20
2.2.3. Phương pháp định tính, định lượng coixol bằng HPLC .................................21
2.2.5. Thẩm định quy trình phân tích đã xây dựng ................................................... 21
2.3. Ứng dụng ..........................................................................................................23


2.4. Phương pháp xử lý số liệu ...............................................................................23
Chương 3.

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU .............................................................25

3.1. Xây dựng phương pháp phân tích ..................................................................25
3.1.1. Xây dựng phương pháp định tính coixol bằng HPLC ....................................25
3.1.2. Nghiên cứu phương pháp xử lý mẫu: .............................................................. 29
3.1.3. Thẩm định phương pháp phân tích .................................................................35
3.2. Ứng dụng ...........................................................................................................43
3.2.1. Định tính coixol trong một số mẫu cam thảo đất ...........................................43
3.2.2. Định lượng coixol trong một số mẫu cam thảo đất tại các vùng khác nhau ..44
Chương 4.

BÀN LUẬN ......................................................................................50

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................................................53
KẾT LUẬN ..............................................................................................................53
KIẾN NGHỊ .............................................................................................................53

TÀI LIỆU THAM KHẢO


DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
Từ viết
tắt

Tiếng anh hoặc tên khoa học

Tiếng việt

AOAC

Association of Official
Analytical Chemists

Hiệp hội các nhà hóa phân
tích chính thống

HPLC

High performance liquid
chromatography

Sắc ký lỏng hiệu năng cao

AR

Analytical reagent

Thuốc thử phân tích

LOD

Limit of Detection

Giới hạn phát hiện

LOQ

Limit of Quantitation

Giới hạn định lượng

MeOH

Methanol

ACN

Acetonitril

PA

Pure analysis

Tinh khiết phân tích

RSD

Relative standard deviation

Độ lệch chuẩn tương đối

T

Tailing Factor

Hệ số đối xứng

Rs

Resolution

Độ phân giải

N

Theoretical Plate

Số đĩa lý thuyết


DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1: Một số phương pháp định lượng Coixol đã công bố........................ 7
Bảng 2.1. Lý lịch mẫu cam thảo đất thu được tại các vùng ............................ 18
Bảng 3.1. Kết quả khảo sát nhiệt độ cột.......................................................... 27
Bảng 3.2. Kết quả khảo sát dung môi chiết (n=3) ......................................... 29
Bảng 3.3. Kết quả khảo sát thể tích dung môi chiết (n=3) ............................. 32
Bảng 3.4. Điều kiện chiết xuất theo thời gian ................................................. 33
Bảng 3.5. Kết quả đánh giá độ phù hợp của hệ thống .................................... 36
Bảng 3.6. Kết quả phân tích độ lặp lại trong ngày và độ lặp lại khác ngày ... 39
Bảng 3.7. Kết quả hàm lượng mẫu dược liệu ................................................. 40
Bảng 3.8. Kết quả đánh giá độ đúng của phương pháp .................................. 41
Bảng 3.9. Kết quả khảo sát định tính coixol ................................................... 43
Bảng 3.10. Kết quả định lượng coixol trong mẫu cam thảo đất (toàn cây) tại
các vùng .................................................................................................... 44
Bảng 3.11. Kết quả định lượng coixol trong các bộ phận dùng khác nhau của
cam thảo đất .............................................................................................. 47
Bảng 3.12. Bảng kết quả đánh giá thống kê hàm lượng coixol trong các bộ
phận khác nhau của cam thảo đất ............................................................. 48


DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1. Hình ảnh cây cam thảo đất Scoparia dulcis L. .................................. 3
Hình 1.2: Sơ đồ máy sắc ký lỏng hiệu năng cao ............................................. 10
Hình 1.3. Sơ đồ phân tích định tính ................................................................ 13
Hình 1.4. Chuẩn hoá một điểm ....................................................................... 15
Hình 1.5. Đường chuẩn nhiều điểm xác định chất phân tích .......................... 15
Hình 3.1. Phổ UV – VIS của coixol ................................................................ 25
Hình 3.2. Kết quả khảo sát dung môi pha động .............................................. 26
Hình 3.3. So sánh sắc ký đồ của coixol ở các nhiệt độ cột ............................. 27
Hình 3.4 . Biểu đồ so sánh dung môi chiết coixol trong cam thao đất ........... 29
Hình 3.5. Kết quả khảo sát thời gian chiết coixol trong cam thảo đất bằng

phương pháp chiết siêu âm ....................................................................... 30
Hình 3.6. Kết quả khảo sát thời gian chiết coixol trong cam thảo đất bằng
phương pháp chiết hồi lưu ........................................................................ 31
Hình 3.7. Kết quả khảo sát số lần chiết........................................................... 33
Hình 3.8. Quy trình xử lý mẫu coixol trong cam thao đất cho phân tích ....... 34
Hình 3.9. SKĐ đánh giá độ đặc hiệu của phương pháp. ................................. 35
Hình 3.10. Đồ thi biểu hiện mối quan hệ C và A coixol ................................ 37
Hình 3.11. Sắc ký đồ xác định LOD ............................................................... 38
Hình 3.12. So sánh SKĐ của mẫu thực với SKĐ của chất chuẩn .................. 43
Hình 3.13. So sánh hàm lượng coixol trong cam thảo đất theo các thời gian 46
Hình 3.14. Biểu đồ so sánh hàm lượng coixol trong các bộ phận khác nhau
của cam thảo đất........................................................................................ 48
Hình 3.15. Sắc ký đồ định lượng coixol trong các bộ phận dùng khác nhau
của mẫu CTD - 13 ..................................................................................... 49
Hình 4.1. Hàm lượng coixol giữa các khu vực ở Hà Nội theo thời gian ........ 52


ĐẶT VẤN ĐỀ
Việt Nam là một quốc gia nằm trong khu vực khí hậu nhiệt đới nóng
ẩm mưa nhiều, có nhiều điều kiện thuận lợi cho sự phát triển đa dạng và
phong phú các dược liệu có nguồn gốc từ thực vật. Tuy nhiên, nhiều cây
thuốc mới chỉ được sử dụng chủ yếu theo kinh nghiệm dân gian mà chưa
được nghiên cứu một cách đầy đủ. Vì vậy việc nghiên cứu các cây thuốc có
vai trò quan trọng trong việc phòng và điều trị bệnh hiện nay.
Cam thảo đất (Scoparia dulcis L) là một cây thông dụng ở các nước
nhiệt đới. Ở nước ta cây mọc khắp nơi từ Bắc vào Nam, cây thường gặp ở
những vùng đất hoang, ven đường, bờ sông…
Cam thảo đất có tác dụng giải độc do say sắn [7], rong kinh, ban chẩn,
phế nhiệt gây ho, viêm họng, tiêu chảy, thấp cước khí, rôm sởi trẻ em, chàm
(thấp chẩn) [5], làm thuốc giảm đau và chống viêm [16].

Trong cam thảo đất chứa nhiều hoạt chất amellin, coixol, mannitol,
glucose…Một trong những hoạt chất quan trọng là coixol, nó có tác dụng
như một thuốc giãn cơ và chống co giật [17], ức chế cơ vân, ức chế tim ếch
cô lập, làm biên độ co bóp giảm, nhịp đập chậm lại, thí nghiệm trên thỏ bằng
đường tiêm tĩnh mạch huyết áp hạ trong một thời gian ngắn, mặt khác coixol
còn có tác dụng làm hạ đường huyết nhẹ [3, 4, 6, 21, 22]. Ngoài ra coixol
còn ảnh hưởng đến việc sản xuất và bài tiết chất nhầy, bằng cách tác động
trực tiếp lên các tế bào biểu mô đường dẫn khí [18] .
Cam thảo đất đã được xây dựng thành một chuyên luận trong DĐVN
V, tuy nhiên mới chỉ đề cập đến chỉ tiêu định tính mà chưa có đề cập đến
phương pháp định lượng các hoạt trong chất trong cây.
Để góp phần nâng cao tiêu chuẩn chất lượng dược liệu cam thảo đất,
chúng tôi đã tiến hành đề tài: “Xây dựng phương pháp định tính và định
lượng coixol trong cây cam thảo đất bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu
năng cao”.
1


Với mục tiêu:
1. Xây dựng phương pháp định tính và định lượng coixol trong cây
cam thảo đất bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao
2. Ứng dụng phương pháp đã xây dựng để định lượng coixol trong các
mẫu cam thảo đất thu thập được ở các địa phương khác nhau để bước đầu
đưa ra giới hạn và hàm lượng coixol trong dược liệu này.

2


Chương 1. TỔNG QUAN
1.1.

Tổng quan về cây cam thảo đất
Cây cam thảo đất hay còn gọi là cây cam thảo nam, cây dã cam thảo.
Tên khoa học: Scoparia dulcis L. Thuộc họ hoa mõm chó:

Scophulariaceae [5].
1.1.1. Đặc điểm thực vật
Cây thảo cứng, mọc thẳng, gốc hóa gỗ, phân nhánh nhiều, cao 0,3-1m.
Thân nhẵn, hình trụ, hơi có cạnh. Lá mọc vòng 3 cái một hay mọc đối, có
cuống ngắn, hình mác hay bầu dục, hẹp dần ở gốc, đầu tù hoặc hơi nhọn,
mép lá nửa phía trên khía răng tù.
Hoa trắng 3-5 cái, mọc ở kẽ lá, cuống hoa dài, mảnh như sợi tóc; lá
đài 4, hẹp ngang; tràng có ống ngắn hình bánh xe gồm 4 thùy gần bằng nhau;
nhị 4.
Quả nang nhỏ, gần hình cầu, chỉ hơi vượt quá đài tồn tại; hạt rất nhỏ,
nhăn nheo.
Mùa hoa quả: Tháng 5 - 7
Dược liệu là toàn cây. Thu hái quanh năm, rửa sạch. Dùng tươi hay
phơi sấy khô. [3, 6]

Hình 1.1. Hình ảnh cây cam thảo đất Scoparia dulcis L.
3


1.1.2. Phân bố, thu hái, chế biến
Tại Việt Nam, cây mọc khắp nơi ở đất hoang ven các đường đi, bờ
ruộng.
Trên thế giời, cam thảo đất có nhiều ở miền Nam Trung Quốc, Ấn Độ,
Thái Lan…[11]
Thu hái toàn cây, rửa sạch, thái nhỏ dùng tươi hoặc phơi khô [3, 6]

1.1.3. Thành phần hóa học
Cây có chứa một lượng alcaloid và một chất đắng; ngoài ra còn có
nhiều acid silicic và một hoạt chất là amellin. Phần của cây trên mặt đất chứa
một chất dầu sền sệt, mà trong thành phần có dulciol, scopariol, có manitol
và glucose. Rễ chứa manitol, tanin, alcaloid, một hợp chất triterpen. Vỏ rễ
có chứa hexcoxinol, b-sitosterol và manitol[3, 6].
Các hoạt chất chính bao gồm acid scopadulcic A và B, scopadiol,
scopadulciol, scopadulin, acid scoparic A - C và acid betulinic[20], [21],
[26]. Các hoạt chất khác bao gồm: acacetin, amyrin, apigenin, benzoxazin,
benzoxazolin, benzoxazolinone, cirsimarin, cirsitakaoside, coixol, acid
coumaric, cynaroside, daucosterol, dulcinol, acid dulcioic, acid gentisic,
glutinol, hymenoxin, linarin, luteolin, mannitol, scoparinol, scutellarein,
scutellarin, sitosterol, stigmasterol, taraxerol, vicenin và vitexin. [21]
1.1.4. Tác dụng và công dụng của cây cam thảo đất
-

An thần, làm giảm hoạt động tự nhiên của chuột [3].

-

Làm giãn cơ trung tâm, chống co giật [17].

-

Hạ đường huyết thông qua ức chế α-glucosidase, kiềm chế PPAR-và tăng

tiết insulin [25]. Trên chuột đái tháo đường, kết quả cho thấy nồng độ insulin
trong huyết tương tăng đáng kể sau 15 ngày điều trị bằng scoparic acid D
phân lập từ cao chiết ethanol của cam thảo đất [23].
-

Chống oxy hóa và các gốc tự do [27].

4


-

Chống độc tính trên thận, từ nghiên cứu của Jose S. và cộng sự đã cho

thấy sự bảo vệ thận đáng kể của Scoparia dulcis chống lại độc tính trên thận
do cisplatin [20].
-

Kháng khuẩn kháng nấm, gây độc với tế bào. Từ nghiên cứu của Zulfiker

và cộng sự cho thấy hoạt tính kháng khuẩn trên các chủng vi khuẩn Gram () và Gram (+), kháng nấm, gây độc tế bào từ cao chiết ethanol của cam thảo
đất [31].
-

Gây độc với tế bào ung thư, hợp chất N – methylbenzoxazolinon, một

alkaloid lần đầu được phân lập thể hiện độc tính tế bào ung thư cơ vân RD
với IC50 là 67,0 μM [9].
-

Điều hòa và kích thích sự miễn dịch đối với miễn dịch qua trung gian tế

bào và dịch thể ở chuột Wistar [30].

1.2.

Tổng quan về hoạt chất Coixol
Công thức cấu tạo:
H
N
O
O

O

C8H7NO3
Danh pháp:


Tên IUPAC: 6-methoxy3H-1,3-benzoxazol-2-one



Tên khác: 6-MBOA, 6-methoxybenzoxazolinone, coixol, ...



Trọng lượng phân tử: 165,043 [24].

1.2.1. Tính chất
Coixol là bột kết tinh hình kim, không màu, là hợp chất có hàm lượng
cao trong cây Cam thảo đất [10], nhiệt độ nóng chảy 151 – 152oC, hòa tan
trong hydroxyd kiềm. Coixol bị phân hủy bởi acid hydrocloric đặc. [32]
5

1.2.2. Tác dụng sinh học của coixol
-

Tác dụng giãn cơ, chống co giật [17].

-

Tác dụng hạ đường huyết nhẹ [21].

-

Ngăn chặn sự biểu hiện của gen mucin MUC5AC và sản xuất protein

mucin MUC5AC gây ra bởi EGF hoặc TNF-a. Coixol làm giảm bài tiết
MUC5AC mucin được kích thích bởi PMA [18].
-

Có thể điều chỉnh sự biểu hiện gen, sản xuất và bài tiết chất nhầy của

đường thở, bằng cách tác động trực tiếp lên các tế bào biểu mô đường dẫn
khí. [18]
-

Tác dụng kích thích adenylate cyclase ở một số mô, các đặc tính

adrenergic của coixol cho thấy nó có thể tạo ra các hiệu ứng đa dạng bao
gồm các hoạt động trực tiếp lên quá trình tổng hợp và giải phóng
gonadotropin (GnRH). Coixol có cấu trúc tương tự melatonin (5-methoxyN-acetyltryptamine), melatonin liên kết với màng tử cung và niêm mạc có

thể bị thay thế bởi coixol và bởi các tác nhân adrenergic khác. Nên coixol
được coi như một chất chủ vận-adrenergic và một chất tương tự melatonin
có thể giải thích cho tác dụng kích thích và ức chế của hợp chất này đối với
sự phát triển sinh dục [28].
-

Các hoạt tính kháng nấm và kháng enzym phiên mã ngược HIV-1 có

thể có giá trị trong điều trị bệnh nấm và nhiễm HIV ở bệnh nhân AIDS [29].

6


1.3. Các nghiên cứu định lượng coixol đã công bố:
Bảng 1.1: Một số phương pháp định lượng coixol đã công bố
T
TT

Phương pháp phân tích

Xử lý mẫu

L

Kết quả

T
K

I

1

Các nghiên cứu trên thế giới
HPLC-MS/MS:
+ Cột: MS Agilent Poroshell
120 EC.
C18 (3,0 x 50 mm, 2,7 µm) +
+ Nhiệt độ cột: 45°C
+ Pha động:
Kênh A: Methanol – acid
formic (100 : 0,1; tt/tt);
Kênh B: methanol – acid
formic (100 : 0,1; tt/tt).
Chế độ gradient.
+ Tốc độ dòng: 1,0 ml/phút.
+ Detector MS: ESI (+) – SIM

Chiết trực
tiếp
Dung môi
MeOH :
H2O (85:15)
Tác động:
Siêu âm

(LOD: 0,26
pg/µl. LOQ:
0,78 pg/µl.
Lượng coixol

trong mẫu: 255,5
[13]

± 2,1 mg / kg
trong Scoparia
dulcis có nguồn
gốc từ Nepalese

7


2

3

4

HPLC – UV:
+ Cột: ProntoSIL C18 UHC520 (50x2 mm, 3 µm)
+ Nhiệt độ cột: 30°C
+ Pha động:
Kênh A: water – TFA
(100:0,1; tt/tt); Kênh B:
Methanol.
Chế độ gradient (15% B từ 01 phút, 15-50% B từ 1-2 phút,
50-95% B từ 2-6 phút, duy trì
ở 95% từ 6-7 phút, 95-15% B
từ 7-8 phút).
+ Tốc độ dòng: 1,0 ml/phút.
+ Bước sóng phát hiện: 280

nm.
HPLC - UV:
+ Pha tĩnh: cột C18 Unison
US (4.6 × 250 mm , 5 µm)
+ Nhiệt độ cột: 30°C
+ Pha động: acid
trifluoroacetic trong
acetonitril 0.1% (tt/tt). Chế
độ gradient.
+ Tốc độ dòng: 1,0 ml/phút.
+ Bước sóng phát hiện: 290
nm.
HPLC – UV:
+ Pha tĩnh: Cột HC-C18
Agilent (4.6 mm × 250 mm,
5 µm).
+ Nhiệt độ cột: 30°C
+ Pha động: acetonitril 0,1% acid phosphoric (tt/tt :
25/75),
+ Tốc độ dòng: 1,0 ml/ phút,

Chiết trực
tiếp
Dung môi
MeOH :
H2O (85:15)
Tác động:
Siêu âm

Chiết trực

tiếp
Dung môi
Ethanol
Phương
pháp chiết:
chiết áp suất
giảm

Chiết trực
tiếp
Dung môi
acetone
Phương
pháp chiết:
Soxhlet

LOD: 11,64
pg/µl.
LOQ: 35,28
pg/µl.
Lượng coixol
trong mẫu: 220,2
± 2,1 mg / kg
trong Scoparia
dulcis có nguồn
gốc từ Nepalese

[13]

LOD: 0,07 mg/

ml và LOQ: 0,25
mg / ml. Độ thu

[19]

hồi từ 98,36 đến
100,30%

Phương pháp có
độ tuyến tính tốt
(r2 = 0.9999), độ
chính xác cao
(RSD 0,96%), độ
lăp lại tốt (RSD
0,33%). Tỷ lệ thu
hồi cao 97.48%

[15]

8


+ Bước sóng phát hiện: 232
nm.

5

II

6

Hàm
lượng
coixol trong mẫu
ở rễ > thân > vỏ
hạt

Tại Tỉnh Sơn
Tây: Hàm lượng
coixol trong rễ
và thân cây là
cao nhất với
16,1155 mg/g và
5,6659
mg/g.
Hàm
lượng
coixol trong lá là
cao nhất với
10,6258 mg/g.
Hàm
lượng
coixol trong rễ
giảm từ tháng 6
đến tháng 11

HPLC – UV:
+ Pha tĩnh: Cột C18
+ Nhiệt độ cột: 25°C
+ Pha động: axetonitril 0,1% acid phosphoric (tt:tt =

50: 50),
+ Tốc độ dòng: 1,0 ml / phút,
+ Bước sóng phát hiện: 232
nm.

[33]

Nghiên cứu trong nước
HPLC – UV:
+ Pha tĩnh: Cột nhồi C18
(4.6 mm × 250 mm, 5 µm),
+ Nhiệt độ cột: 30°C
+ Pha động: acetonitril 0,1% acid phosphoric. Chế
độ gradient.
+ Tốc độ dòng: 0,8 ml / phút,
+ Bước sóng phát hiện: 232
nm.

Chiết trực
tiếp
Dung môi
Methanol
Phương
pháp chiết:
chiết
Soxhlet kết
hợp cô quay
dưới áp suất
thấp

Phương
pháp
cho độ lặp lại tốt,
đường chuẩn có
độ tuyến tính cao
(R²=
0,9999),
Hàm
lượng
coixol thấp nhất
là 1,86µg/1g hạt,
Hàm lượng cao
nhất trong mẫu là
23,64µg/1g hạt.

[8]

9


1.4. Tổng quan về sắc kí lỏng hiệu năng cao
1.4.1. Khái niệm
Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) là kĩ thuật phân tích dựa trên cơ sở
của sự phân tách các chất trên một pha tĩnh chứa trong cột, nhờ dòng di
chuyển của pha động lỏng dưới áp suất cao. Sắc ký lỏng dựa trên cơ chế hấp
phụ, phân bố, trao đổi ion, loại cỡ, ái lực… tùy thuộc vào loại pha tĩnh sử
dụng [1].
1.4.2. Nguyên tắc
Mẫu phân tích được hòa tan trong dung môi và được cho qua cột bằng
một dòng chất lỏng liên tục (pha động). Các chất tan là thành phần của mẫu

sẽ di chuyển qua cột theo pha động với tốc độ khác nhau tùy thuộc vào hệ số
phân bố giữa chất tan với pha tĩnh và pha động. Nhờ tốc độ di chuyển qua
cột khác nhau, các thành phần của mẫu sẽ tách riêng biệt thành dải, làm cơ
sở cho phân tích định tính và định lượng. [2]
1.4.3. Cấu tạo máy HPLC
Do bản chất hóa học của các chất phân tích rất khác nhau nên có nhiều
kỹ thuật để tách định lượng bằng HPLC. Tuy vậy nguyên tắc cấu tạo của một
máy sắc ký lỏng đều giống nhau, gồm các bộ phận như sau (hình 1.1) [12]:

Hình 1.2: Sơ đồ máy sắc ký lỏng hiệu năng cao

Trong đó:
1. Hệ thống cấp pha động
10


2. Bơm cao áp
3. Bộ phận tiêm mẫu
4. Cột sắc kí
5. Detector
6. Hệ thống máy tính có phần mềm ghi nhận tín hiệu, xử lí dữ liệu và
điều khiển hệ thống.
1.4.4. Một số đại lượng dùng trong sắc ký
1.4.4.1. Thời gian lưu và thể tích lưu
Trong sắc ký rửa giải, sự lưu giữ của một chất có thể được biết dưới
dạng thời gian lưu tR. Thời gian lưu được xác định trực tiếp trên sắc đồ bởi
vị trí của đỉnh pic. Từ thời gian lưu có thể tính được thể tích lưu VR dựa trên
công thức:

VR  υ  t R

Trong đó:
tR (thời gian lưu) là khoảng cách trên đường nền từ điểm tiêm mẫu đến
đường thẳng đứng kẻ từ đỉnh pic của chất;
 (tốc độ dòng) là lưu lượng của dòng pha động.
1.4.4.2. Hệ số đối xứng
Hệ số đối xứng (As) (hay hệ số kéo đuôi) của một pic Hình 5.b được
tính theo công thức:
AS 

w 0,05
2d

Trong đó:
w 0,05 là chiều rộng của pic ở 1/20 chiều cao của pic;
d là khoảng cách từ đường thẳng đứng đi qua đỉnh pic đến cạnh phía
trước của pic ở 1/20 chiều cao của pic.
Khi As = 1,0 thì pic hoàn toàn đối xứng (lý tưởng).
11


1.4.4.3. Hiệu năng của cột và số đĩa lý thuyết biểu kiến
Tùy theo kỹ thuật được sử dụng, dựa trên các dữ liệu thu được trong
điều kiện đẳng nhiệt, đẳng dòng hay đẳng mật độ, hiệu năng của cột (hay
hiệu lực biểu kiến của cột), biểu thị dưới dạng số đĩa lý thuyết biểu kiến (N),
có thể tính được theo công thức dưới đây:
t
N  5,54 R
 wh






2

Trong đó:
tR là thời gian lưu của chất phân tích (phút/ giây);
Wh là chiều rộng của pic ở nửa chiều cao pic tính theo cùng đơn vị đo tR
N là số đĩa lý thuyết biểu kiến thay đổi theo chất, theo cột cũng như
theo thời gian lưu.
1.4.4.4. Độ phân giải
Độ phân giải (RS) giữa hai pic của hai chất được tính theo công thức:
RS 

1,18t R2  t R1 
w h1  w h2

Trong đó:
tR1 là thời gian lưu, hay khoảng cách trên đường nền từ điểm tiêm mẫu
đến đường thẳng góc kẻ qua hai đỉnh pic tương ứng với hai chất cạnh
nhau;
wh1 và wh2 là chiều rộng của hai pic ở nửa chiều cao của pic tương ứng.
Độ phân giải lớn hơn 1,5 thì hai pic được tách đến đường nền. Công
thức cho ở trên có thể không đúng khi các pic không được tách trên đường
nền.[5]

1.4.5. Ứng dụng của HPLC [2]
1.4.5.1 Định tính
12

Mỗi chất phân tích trong những điều kiện tương ứng đã được lựa chọn
có một thời gian lưu xác định. Vì vậy tR là thông số định tính chất phân tích.
Nguyên tắc:
Chạy sắc kí mẫu chuẩn theo những điều kiện tối ưu đã lựa chọn để xác
định thời gian lưu của từng chất trong mẫu đó. Sau đó chạy mẫu phân tích
cũng trong những điều kiện như chạy mẫu chuẩn và so sánh thời gian lưu để
kết luận sự có mặt của từng chất.

Hình 1.3. Sơ đồ phân tích định tính

Qua sơ đồ trên ta thấy mẫu phân tích có B và C.
1.4.5.2. Định lượng
Tín hiệu đo là diện tích của pic hay chiều cao của pic. Để tiến hành
định lượng chất phân tích, người ta sử dụng các chất chuẩn là chất phân tích
có độ tinh khiết cao. Tiến hành khảo sát chất chuẩn để tìm điều kiện đo của
chất chuẩn, mẫu giả và cuối cùng mới đo trên mẫu thực tế.
Mỗi chất phân tích trong những điều kiện tối ưu đã lựa chọn thì diện
tích (chiều cao) của pic tỉ lệ với nồng độ của chất phân tích:
S = K.C (S: diện tích của pic)
h = K.C (h: chiều cao của pic)
13


Các phương trình này dùng để định lượng chất phân tích bằng HPLC,
thường người ta dùng diện tích của pic để độ chính xác cao hơn.
Có nhiều phương pháp để định lượng chất phân tích:
 Phương pháp chuẩn ngoại
 Phương pháp chuẩn nội
 Phương pháp chuẩn hóa diện tích pic

Trong khuôn khổ đề tài xin phép được trình bày phương pháp chuẩn
ngoại:
Tuỳ thuộc vào tính chất của mẫu: hàm lượng, yếu tố cản trở, tính chất
phức tạp của nền cũng như độ chính xác yêu cầu mà người phân tích có thể
áp dụng các cách định lượng khác nhau: Chuẩn hoá một điểm và chuẩn hoá
nhiều điểm.
a) Chuẩn hoá một điểm
- Nguyên tắc:
Chuẩn hoá một điểm là sử dụng một phép đo của chất chuẩn đã biết
trước nồng độ, đo độc lập và song song với phép đo chất cần phân tích.
- Phương pháp này thường áp dụng:
+ Đối với chất phân tích có hàm lượng lớn hoặc đã làm giàu đến
mức độ cần thiết.
+ Để đánh giá khi không yêu cầu độ chính xác cao vì ở đây đã bỏ qua các
yếu tố cản, các sai số ngẫu nhiên có thể làm giảm tính chính xác của phép
đo.
+ Nồng độ của chất phân tích Cx phải nằm trong khoảng tuyến
tính.
- Phương pháp:
Sử dụng hai phép đo độc lập:
+ Phép thứ nhất: Chạy sắc kí chất chuẩn trong điều kiện tương tự chất phân
tích (nền và các thông số khác giống nhau).
14


+ Phép thứ hai: Chạy sắc kí chất phân tích.
- Kết quả tính như sau:

Hình 1.4. Chuẩn hoá một điểm

Ta có:
C
C
C x Cc

 Cx  c h x hay: Cx  c Sx
h x hc
hc
Sc

b) Chuẩn hoá nhiều điểm (phương pháp đường chuẩn)
- Chuẩn bị một dãy dung dịch chuẩn có nồng độ khác nhau trong điều
kiện tương tự mẫu phân tích. Tiến hành sắc ký, dựng đường chuẩn hay đường
hồi quy tuyến tính biễu diễn sự phụ thuộc chiều cao (diện tích) của pic vào
nồng độ chất phân tích. Để xác định nồng độ chất phân tích Cx ta cũng thực
hiện phép đo đối với chất phân tích, được Sx (hx) nhất định, đối chiếu với
đường chuẩn ta có nồng độ chất phân tích trong mẫu.

Hình 1.5. Đường chuẩn nhiều điểm xác định chất phân tích

Phương pháp này có ưu điểm là sau khi đã dụng đường chuẩn rồi thì
có thể sử dụng để phân tích hàng loạt mẫu trong cùng điều kiện được khảo
sát. Nếu hàm lượng chất phân tích quá bé nằm dưới giới hạn của đường chuẩn
thì phải sử dụng phương pháp làm giàu để tăng nồng độ của chất phân tích
15


để nó nằm trong vùng tuyến tính. Trong nhiều trường hợp mẫu phân tích có
thành phần phức tạp, chúng ta chưa biết chính xác nên không thể chuẩn bị
dãy mẫu đầu thoả mãn những quy định cho phương pháp này do đó không

xác định chính xác vị trí của đường chuẩn, vì vậy kết quả phân tích mắc sai
số lớn. Trường hợp này không nên sử dụng phương pháp đường chuẩn mà
tốt nhất là sử dụng phương pháp thêm chuẩn để xác định nồng độ của chất
phân tích trong mẫu.

16


Chương 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tượng và phương tiện nghiên cứu
2.1.1. Hoá chất - chất chuẩn
a, Chất chuẩn:
Chất chuẩn Coixol (hàm lượng 98%, hãng Shanghai Yuanye BioTechnology Co., Ltd. Trung Quốc. Lot: A22A8L34526)
b, Hóa chất:
- Các dung môi dùng cho sắc ký lỏng hiệu năng cao (MeOH, ACN) của hãng
Merck., Đức
- Các dung môi, hoá chất dùng để xử lý mẫu methanol, ethanol của Trung
Quốc và đạt tiêu chuẩn tinh khiết phân tích (P.A.)
- Nước cất sử dụng là nước cất hai lần đã được deion hoá.
2.1.2. Máy móc - trang thiết bị
- Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) Shimadzu bao gồm: Bơm LC20AD, detector UV - VIS, hệ thống tiêm mẫu tự động SIL-20A HT, bộ phận
ổn nhiệt CTO-10AS của Shimadzu-Nhật Bản.
- Cột pha đảo Agilent - C18 (250 x 4,6mm, 5µm).
- Bể siêu âm Power Sonic450 ( Hwashin – Hàn Quốc)
- Bếp cách thủy (Memmert - Đức, WB - 14 LO).
- Cân phân tích (Precisa - Thụy sỹ, XT 220A), độ chính xác 0,00001 g.
- Cân kỹ thuật điện tử (Ohaus - Mỹ) độ chính xác 0,01 g
- Tủ sấy (Memmert - Đức, ULM 500).
- Cân xác định độ ẩm (Sartorius - Đức, MA - 45).
- Các dụng cụ thông thường ở phòng thí nghiệm: Pipet, bình định mức, sinh

hàn hồi lưu…
2.1.3. Đối tượng nghiên cứu
Dược liệu cam thảo đất dùng làm mẫu nghiên cứu cho các thí nghiệm
khảo sát là mẫu dược liệu đã được các chuyên gia Bộ môn Thực vật trường
17