luận văn thạc sĩ tuyển chọn và nghiên cứu các đặc tính sinh học của một số vi sinh vật nhằm sản xuất phân vi sinh

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ
CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
-----------------------------

Mai Thị Vân Khánh

Tên đề tài:

TUYỂN CHỌN VÀ NGHIÊN CỨU CÁC ĐẶC TÍNH SINH HỌC CỦA
MỘT SỐ VI SINH VẬT NHẰM SẢN XUẤT PHÂN VI SINH

LUẬN VĂN THẠC SĨ: SINH HỌC THỰC NGHIỆM

Hà Nội – 2019


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ
CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
-----------------------------

Mai Thị Vân Khánh
Tên đề tài:

TUYỂN CHỌN VÀ NGHIÊN CỨU CÁC ĐẶC TÍNH SINH HỌC CỦA
MỘT SỐ VI SINH VẬT NHẰM SẢN XUẤT PHÂN VI SINH

Chuyên ngành: Sinh học Thực nghiệm
Lớp: BIO17-1 Khóa: K2017B
Khoa: Công nghệ Sinh học

LUẬN VĂN THẠC SĨ: SINH HỌC THỰC NGHIỆM

HƯỚNG DẪN KHOA HỌC
Hướng dẫn 1: TS. Nguyễn Thành Đức
Hướng dẫn 2: TS. Lê Thị Nhi Công

Hà Nội - 2019


i

LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan bản luận văn này là kết quả nghiên cứu của cá
nhân tôi dưới sự hướng dẫn của TS. Nguyễn Thành Đức và TS. Lê Thị
Nhi Công. Các số liệu và tài liệu được trích dẫn trong luận văn là trung
thực. Kết quả nghiên cứu này không trùng với bất cứ công trình nào đã
được công bố trước đó.
Tôi xin chịu trách nhiệm với lời cam đoan của mình./.
Hà Nội,

tháng

năm 2019

Tác giả

Mai Thị Vân Khánh


ii

LỜI CẢM ƠN
Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Học viện Khoa học và Công
nghệ, Viện Di truyền Nông nghiệp, các thầy giáo, cô giáo đã tạo điều kiện
thuận lợi cho tôi được học tập và hoàn thành khóa học này.
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS. Nguyễn Thành Đức Viện Di truyền Nông nghiệp và TS. Lê Thị Nhi Công - Viện Công nghệ
sinh học, đã tận tình giúp đỡ, hướng dẫn tôi hoàn thành luận văn này.
Tôi xin được cảm ơn GS. TS Đỗ Năng Vịnh và tập thể cán bộ
Phòng Thí nghiệm trọng điểm công nghệ tế bào - Viện Di truyền Nông
nghiệp luôn động viên, giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi về cơ sở vật chất
- trang thiết bị để tôi có thể hoàn thành luận văn này.
Luận văn được sử dụng một phần số liệu và kết quả thuộc chương
trình Nghị định thư với Cộng hòa Liên bang Đức: “Nghiên cứu sản xuất và
ứng dụng một số vật liệu mới (Chất hấp thụ, hạt cải tạo và vải địa kỹ thuật)
từ phế phụ phẩm mía đường và lúa để nâng cao giá trị gia tăng và phục vị
nông nghiệp bền vững”, mã số: NĐT.22.GER/16 do GS.TS. Đỗ Năng Vịnh
làm chủ nhiệm. Tôi xin chân thành cám ơn.
Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn vô cùng sâu sắc tới gia đình,
bạn bè, đồng nghiệp những người đã luôn bên cạnh, động viên, góp ý cho
tôi trong suốt quá trình học tập.
Hà Nội,

tháng

năm 2019

Tác giả

Mai Thị Vân Khánh


iii

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

STT

Ký hiệu

Giải thích ký hiệu

1

VSV

Vi sinh vật

2

PL

Phân lập

3

(N)

Phân đạm

4

(P)

Phân lân

5

VSVPGL

Vi sinh vật phân giải lân

6

XK

Xạ khuẩn

7

KHC

Ký hiệu chủng

8

KL

Khuẩn lạc

9

TCVN

Tiêu chuẩn Việt Nam

10

NCBI

Ngân hàng dữ liệu trình tự gen

11

DNA

Phân tử mang thông tin di truyền

12

PCR

Phản ứng chuỗi polymerase

13

Gauze I

Môi trường Gauze bổ sung thêm bột CMC

14

AT

Môi trường nuôi cấy thích hợp cho các chủng vi
khuẩn chi Azotobacter


iv

DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 3.1. Đặc điểm hình thái khuẩn lạc của các chủng vi sinh vật phân giải
xenlulo phân lập từ các mẫu đất thu thập ............................................................. 24
Bảng 3.2. Đặc điểm hình thái khuẩn lạc của các chủng VSV có khả năng cố định
nitơ........................................................................................................................ 26
Bảng 3.3. Đặc điểm hình thái khuẩn lạc của các chủng vi sinh vật có khả năng
phân giải lân từ các mẫu đất thu thập ................................................................... 27
Bảng 3.4. Đặc điểm hình thái khuẩn lạc của các chủng VSV ( phân lập trên môi
trường King B) ..................................................................................................... 28
Bảng 3.5. Đánh giá hoạt tính phân giải xenlulo của các chủng vi sinh vật .............. 30
Bảng 3.6. Khả năng cố định nitơ của các chủng vi khuẩn phân lập .......................... 32
Bảng 3.7. Đánh giá hoạt tính phân giải lân của các chủng VSV phân lập ....................... 33
Bảng 3.8. Đánh giá hoạt tính sinh IAA sau 48 h của các chủng vi khuẩn phân lập ... 35
Bảng 3.9. Đặc điểm sinh lý, sinh hóa của chủng vi sinh vật phân giải xenlulo tuyển chọn 37

Bảng 3.10. Ảnh hưởng của nguồn cacbon khác nhau (glucose, sacharose, tinh
bột, CMC) đến sinh trưởng, phát triển của chủng VSV....................................... 37
Bảng 3.11. Đặc điểm hình thái khuẩn lạc và hoạt tính sinh học của chủng X-VDT3 38
Bảng 3.12. Đặc điểm sinh học của chủng N-VDT10........................................... 38
Bảng 3.13. Đặc điểm hình thái khuẩn lạc và hoạt tính sinh học của chủng N-VDT10
.............................................................................................................................. 39
Bảng 3.14. Điểm sinh học của các chủng vi sinh vật tuyển chọn ........................ 40


v

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ
Hình 3.1. Đánh giá hoạt tính phân giải xenlulo của các vsv phân lập (vòng tròn
trong suốt bao quanh lỗ thạch) ............................................................................. 31
Hình 3.2. Phản ứng màu của các chủng cố định N2 với thuốc thử Nessler ................. 32
Hình 3.3. Vòng tròn trong suốt bao quanh khuẩn lạc của các vsv phân lập (trên
môi trường chứa Ca3(PO4)2)................................................................................. 34
Hình 3.4. Khả năng sinh tổng hợp IAA thô của các chủng vi sinh vật ...................... 36
Hình 3.5. Cây phát sinh chủng loại của hai chủng X-VDT3 và X-VDT6 ........... 44


vi

MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN ................................................................................................... i
LỜI CẢM ƠN ........................................................................................................ ii
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT ...................................................................... iii
DANH MỤC CÁC BẢNG.................................................................................... iv
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ................................................................................ v
MỞ ĐẦU ................................................................................................................ 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ................................................................ 3
1.1. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU, SẢN XUẤT PHÂN BÓN HỮU CƠ VI SINH ...... 3
1.1.1. Tình hình nghiên cứu phân bón trong sản xuất nông nghiệp .................. 3
1.1.2. Tình hình sản xuất phân bón trong sản xuất nông nghiệp ........................ 5
1.1.3. Tình hình nghiên cứu, ứng dụng phân bón hữu cơ vi sinh trên thế giới
....................................................................................................................... 7
1.2. NHÓM VI SINH VẬT CÓ ÍCH PHỤC VỤ SẢN XUẤT PHÂN BÓN VI
SINH ................................................................................................................ 10
1.2.1. Vi sinh vật cố định đạm ..................................................................... 10
1.2.2. Vi sinh vật phân giải lân .................................................................... 10
1.2.3. Vi sinh vật phân giải xenlulo ............................................................. 11
1.2.4. Vi sinh vật sinh hocmon sinh trưởng thực vật .................................. 13
1.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU, ĐỊNH DANH VI SINH VẬT ........... 14
CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU . 17
2.1. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU ...................................................................... 17
2.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU ..................................................................... 17
2.2.1. Phân lập và lưu giữ các chủng vi sinh vật từ mẫu đất ....................... 17
2.2.2. Tuyển chọn và đánh giá các hoạt tính sinh học của các chủng vi sinh vật có
ích................................................................................................................. 17
2.2.3. Định danh chủng vi sinh vật phân giải xenlulo ................................. 17
2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................................................. 17
2.3.1. Phương pháp phân lập và lưu trữ các chủng vi sinh vật ................... 17


vii

2.3.2. Phương pháp xác định định tính hoạt tính CMC- aza (Williams,
1983). ........................................................................................................... 19
2.3.3. Phương pháp đánh giá hoạt tính cố định nitơ của vi sinh vật ........... 19
2.3.4. Phương pháp tuyển chọn vi sinh vật phân giải phốt pho .................. 20

2.3.6. Phân loại vi sinh vật .......................................................................... 23
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ....................................................... 24
3.1. PHÂN LẬP VÀ LƯU GIỮ CÁC CHỦNG VI SINH VẬT TỪ MẪU ĐẤT 24
3.1.1. Vi sinh vật phân giải xenlulo ............................................................. 24
3.1.2. Vi sinh vật cố định nitơ ..................................................................... 25
3.1.3. Vi sinh vật phân giải lân .................................................................... 27
3.1.4. Vi sinh vật kích thích sinh trưởng thực vật ....................................... 28
3.2. ĐÁNH GIÁ CÁC HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA CÁC CHỦNG VI SINH
VẬT CÓ ÍCH .................................................................................................... 29
3.2.1. Đánh giá hoạt tính phân giải xenlulo .............................................. 29
3.2.2. Đánh giá hoạt tính cố định Nitơ ...................................................... 31
3.2.3. Đánh giá khả năng phân giải Phốt pho (lân) khó tiêu.................... 33
3.2.4. Đánh giá khả năng sinh IAA của các chủng vi sinh vật ................ 35
3.3. ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA CÁC CHỦNG VI SINH
VẬT CÓ ÍCH PHỤC VỤ SẢN XUẤT PHÂN BÓN VI SINH ...................... 36
3.4. ĐỊNH DANH CHỦNG VSV PHÂN GIẢI XENLULO BẰNG PHƯƠNG
PHÁP GIẢI TRÌNH TỰ GENE RNA RIBOXOM ĐẶC TRƯNG CHO LOÀI
.......................................................................................................................... 40
CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ....................................................... 45
4.1. KẾT LUẬN............................................................................................... 45
4.2. KIẾN NGHỊ .............................................................................................. 45
TÀI LIỆU THAM KHẢO .................................................................................... 46


1

MỞ ĐẦU
1. Lý do chọn đề tài
Với lợi thế là đất nước nông nghiệp, Việt Nam có tiềm năng rất lớn
về nguồn phế phụ phẩm trồng trọt từ các cây trồng chính( lúa, ngô, mía,

lạc, đậu tương...), riêng mía lượng bã bùn mía sau chế biến đường là rất
lớn, mỗi năm diện tích trồng mía khoảng 257.546 ha, sản lượng ép là 15,76
triệu tấn mía cây, trong sản xuất đường sẽ sinh ra một lượng phế thải khổng
lồ: 2,5 triệu tấn bã mía, 500.000 tấn bã bùn (sau khi đã lấy nước đường) và
250.000 tấn mật rỉ. Trước đây 80% lượng bã mía này được dùng để đốt lò
hơi trong các nhà máy sản xuất đường, sinh ra 50.000 tấn tro và 20% còn
lại (khoảng 500.000 tấn) được dùng làm ván ép, còn mật rỉ dùng sản xuất
cồn, mỳ chính hoặc các công nghệ vi sinh khác như chế biến thành thức ăn
chăn nuôi. Riêng tro, đặc biệt là bã bùn không sử dụng phải đổ bỏ gây ô
nhiễm môi trường nghiêm trọng, vì trong bã bùn mía có chứa một lượng
dinh dưỡng cao như đạm, lân, lưu huỳnh và canxi, nếu được sử dụng làm
nguồn phân hữu cơ thì rất tốt cho cây trồng, đặc biệt là cây mía. Đứng
trước tình hình đó, đã có nhiều giải pháp được đặt ra như sử dụng nguồn
chất thải này làm thức ăn chăn nuôi, nhưng chỉ sử dụng những loại bã mía
sạch, chất lượng tốt nên vẫn chưa giải quyết được bã bùn (nguyên nhân
chính gây hôi thối khi đổ ra ngoài môi trường).
Một giải pháp được coi là khả quan nhất xét cả về mặt kinh tế và môi
trường đó là sử dụng bã bùn mía làm phân hữu cơ vi sinh. Vì giải pháp này
sẽ trả lại một lượng hữu cơ quan trọng cho đất trồng mía. Theo tính toán để
trồng được 250.000 ha mía, ngoài phân bón vô cơ (đạm - lân - kali) tối
thiểu phải bón 4 - 5 tấn phân chuồng cho 1 ha, tức là phải có 1 triệu tấn
phân chuồng bón cho 250.000 ha. Tuy nhiên, để sử dụng hiệu quả bã bùn
mía thì việc xử lý nguyên liệu này bằng các chủng vi sinh vật là rất quan
trọng. Trong chất thải nhà máy mía đường thì thành phần của bã thải là bã
bùn, váng bọt (chiếm 1 - 4% so với cây mía), chất xơ, đường, protein,
lipit,… đây là thành phần rất tốt cho phân hữu cơ vi sinh, việc nghiên cứu,
tuyển chọn vi sinh vật phân giải bã bùn mía là rất cần thiết.
Do vậy, đề tài “Tuyển chọn và nghiên cứu các đặc tính sinh học của
một số vi sinh vật nhằm sản xuất phân vi sinh" được đề xuất thực hiện
nhằm giải quyết được một phần vấn đề có tính cấp thiết, mang tính khoa

học và thực tiễn cao. Kết quả thu được của đề tài sẽ cung cấp một số nhóm


2

chủng vi sinh vật có ích với hoạt tính mạnh cho quá trình sản xuất phân bón
vi sinh, phân bón hữu cơ vi sinh hay chế phẩm vi sinh, các chủng lưu giữ
với danh tính rõ ràng, thuận tiện trong quá trình lưu giữ và sử dụng sau
này.
2. Mục tiêu của đề tài
Phân lập và xác định đặc điểm sinh học của 2 - 3 chủng vi sinh vật
có khả năng phân giải xenlulo, cố định đạm, phân giải lân khó tiêu, sinh
hocmon sinh trưởng thực vật.
3. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu
- Đối tượng nghiên cứu là các chủng vi sinh vật được phân lập mới
từ các mẫu đất thu thập tại các ruộng lúa, ruộng mía ở các tỉnh Hà Tĩnh,
Nghệ An, Thanh Hóa.
- Phạm vi nghiên cứu: tuyển chọn các chủng vi sinh vật có hoạt tính
mạnh trong phân hủy xenlulo, phân giải lân khó tiêu, cố định đạm và sinh
hocmon sinh trưởng thực vật nhằm ứng dụng các chủng vi sinh này trong
sản xuất phân bón hữu cơ vi sinh. Đồng thời ứng dụng sinh học phân tử
trong định danh các chủng vi sinh vật phân lập được.
4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài nghiên cứu
- Đề tài góp phần tuyển chọn, định danh một số chủng vi sinh vật có
có hoạt tính cao phục vụ sản xuất phân bón hữu cơ vi sinh.
- Đề tài góp phần định danh chính xác tên loài một số chủng vi sinh
vật phục vụ sản xuất phân bón hữu cơ vi sinh.


3

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU, SẢN XUẤT PHÂN BÓN HỮU CƠ VI
SINH
1.1.1. Tình hình nghiên cứu phân bón trong sản xuất nông nghiệp
Hiện nay, các nước đang phát triển có xu hướng sử dụng ngày càng
tăng lượng phân bón hóa học và Việt Nam cũng nằm trong xu thế này. Tuy
nhiên, việc dùng quá nhiều phân đạm (N) tới mức lạm dụng đã làm tăng
dần sự mất cân đối các dưỡng chất trong đất ảnh hưởng đến năng suất và
chất lượng nông sản. Đồng thời dùng lượng N quá cao sẽ gây khó khăn
trong việc bảo quản nông sản cũng như tích lũy NO3- trong rau và các loại
cây thực phẩm sẽ là nguy cơ đe dọa sức khỏe con người và vật nuôi. Ngoài
ra, theo các nhà khoa học thì khí N2O gây hiệu ứng nhà kính lớn hơn khí
CO2 gấp 300 lần. Trong sản xuất nông nghiệp, một lượng đáng kể N bị thất
thoát vào không khí khi bón đạm Ure hoặc Sulphate Amon (SA), gây lãng
phí và gia tăng hiệu ứng nhà kính.
Muốn khai thác có hiệu quả tiềm năng dinh dưỡng của đất trồng nông
nghiệp nhằm hạn chế dần việc bón bổ sung những loại phân hóa học hay
các loại khoáng vô cơ khác, hạn chế tối đa những ảnh hưởng không tốt đến
biến đổi khí hậu mà do chính quá trình sản xuất nông nghiệp gây ra; các
nhà khoa học trong lĩnh vực trồng trọt đã nghiên cứu và cho ra đời một số
công nghệ vi sinh và công nghệ enzyme.
Mặt khác, một số chủng vi sinh còn có vai trò đối kháng với các loài
vi sinh có hại (gây bệnh cho cây), ức chế hoặc tiêu diệt những loại vi sinh
vật này giúp cây phát triển tốt hơn. Có thể ví dụ một số loại vi sinh có lợi
đã được đưa vào công nghệ sản xuất phân bón như: Vi sinh vật cố định
đạm (Rhizobium, Bradyrhizobium), vi sinh vật cố định nitơ tự do (A.
chroococcum, P. tinctorius), vi sinh vật phân giải lân (Pseudomonas sp,
Achromobacter sp, A. polymixa), vi sinh vật kích thích sinh trưởng (E.

cloaceae, A. radiobacter, A. bejerinckii, E. Aerogenes), vi sinh vật đối
kháng vi khuẩn, nấm bệnh (B. subtilis, Pseudomonas sp, Bacillus sp).
Ngoài ra còn có một số chủng vi sinh vật có lợi khác như: Bacillus


4

licheniformis, Bacillus subtilis, Lactobacillus acidophilus, Pseudomonas
putida, Saccharomyces cerevisiace.
Các vi sinh vật trong đất, đặc biệt là vi sinh vật vùng rễ có vai trò đặc
biệt quan trọng với cây trồng, chúng tạo thành mối quan hệ hữu cơ, gắn bó
trong một thể thống nhất. Quá trình mặn hóa, phèn hóa hiện đang làm giảm
rõ rệt số lượng vi sinh vật trong đất, đặc biệt là các nhóm vi sinh vật có ích
như cố định nitơ, phân giải hữu cơ, phân giải lân, sinh các chất kích thích
sinh trưởng thực vật,…và gián tiếp gây giảm năng suất cây trồng, nhất là
cây lúa. Như vậy cần phải bổ sung lại những nhóm vi sinh vật có ích này
thông qua các loại phân bón vi sinh vật chức năng.
Trong những năm vừa qua, mặc dù đã có một số nghiên cứu liên quan
đến phân bón hữu cơ đựơc thực hiện bởi các đơn vị nghiên cứu trong và
ngoài nước nhưng vẫn cón rất ít về số lượng. Ngoài các nghiên cứu về hiệu
lực, hiệu quả của phân bón hữu cơ, các đề tài, dự án nghiên cứu còn tập
trung vào tìm kiếm, tuyển chọn các sản phẩm phân hữu cơ, đặc biệt là phân
hữu cơ vi sinh để phục vụ sản xuất nông nghiệp. Một số đề tài có giá trị
phải kể đến như: “Nghiên cứu, sản xuất phân hữu cơ vi sinh đa chức năng
đặc chủng cho cây cao su vùng Tây Bắc từ than bùn và phế phụ phẩm nông
nghiệp” của Viện Thổ nhưỡng Nông hóa; “Đánh giá ảnh hưởng của một số
loại phân hữu cơ đến năng suất và hàm lượng nitrat trong rau trên đất xám”
của Viện Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp miền Nam; “ Nghiên cứu phân
vùng địa lý sinh thái hiệu lực phân bón Việt Nam” do Giáo sư Võ Tòng
Xuân chủ trì. Có thể thấy công tác nghiên cứu khoa học trong lĩnh vực

phân bón nói chung và phân bón hữu cơ nói riêng chưa được quan tâm đầu
tư đúng mức. Nhìn lại danh mục các nghiên cứu về phân bón thì phần lớn
là quá cũ hoặc chỉ thông qua các dự án hợp tác quốc tế. Trong mười năm
2006-2016 chỉ có 03 đề tài nghiên cứu cấp Bộ có liên quan đến phân bón,
trong đó có 2 đề tài về xử lý phế phụ phẩm và 01 đề tài vi sinh vật. Đối với
đề tài cấp nhà nước, trong thời gian 10 năm kể trên chỉ có 02 đề tài nghiên
cứu cấp nhà nước về lĩnh vực này.
Bên cạnh đó, việc nghiên cứu chưa đi liền với thực tế phát triển ngành
phân bón, chưa phục vụ hiệu quả cho công tác quản lý nhà nước. Hiện tại
vẫn còn thiếu rất nhiều nghiên cứu mang tính bài bản, hệ thống về mối liên
hệ giữa tính chất đất và nhu cầu phân bón đặc thù cho từng loại đất, vùng
đất; về nhu cầu phân bón phù hợp, đặc thù với các loại đất khác nhau, trên


5

các loại cây trồng khác nhau và ở các giai đoạn sinh trưởng phát triển phân
bón mới thì việc đánh giá tác động môi trường và tác động đến sức khỏe
của con người thông qua chất lượng nông sản còn chưa được quan tâm
đúng mức. Chưa có nghiên cứu bài bản, hệ thống nào về hiệu suất sử dụng
phân bón, thất thoát dinh dưỡng và các biện pháp khắc phục. Việc chuyển
giao các tiến bộ kỹ thuật mới thông qua hệ thống khuyến nông để khuyến
khích, hướng dẫn người dân sử dụng phân bón hữu cơ còn hạn chế. Tính
đến thời điểm hiện tại, rất ít dự án khuyến nông về phân bón hữu cơ được
triển khai.
1.1.2. Tình hình sản xuất phân bón trong sản xuất nông nghiệp
Ở Việt Nam phân bón hữu cơ hiện nay được sản xuất trong nước theo
hai phương thức là ủ truyền thống và sản xuất công nghiệp. Phương thức ủ
truyền thống được sử dụng chủ yếu ở quy mô nông hộ dựa trên nguồn
nguyên liệu là chất thải hay các phế phụ phẩm cây trồng thu gom từ chăn

nuôi và trồng trọt tại nông hộ. Các phế phụ phẩm hữu cơ được trộn đều,
đồng thời có thể bổ sung thêm các nguyên tố khoáng và chế phẩm vi sinh
vật sau đó ủ thành đống với mục đích di trì nhiệt độ hình thành trong đống
ủ để thúc đẩy quá trình phân hủy chất hữu cơ, đẩy nhanh quá trình khoáng
hóa và tiêu diệt các sinh vật gây bệnh cho người, vật nuôi, cây trồng.
Phương thức sản xuất công nghiệp áp dụng tại các cơ sở sản xuất phân bón
được đầu tư cơ sở hạ tầng, dây chuyền máy thiết bị với quy mô công suất
lớn nhỏ khác nhau (từ 20.000 đến 500.000 tấn).
Hiện nay, cả nước có 180 doanh nghiệp đã được cấp Giấy phép sản
xuất phân bón hữu cơ, chiếm 24,5% so với tổng số Giấy phép sản xuất mà
Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn và Bộ Công thương đã cấp (735
Giấy phép). Tổng công suất của các cơ sở sản xuất phân bón hữu cơ là 2,5
triệu tấn/năm, chiếm 8,5% so với tổng công suất các cơ sở sản xuất phân
bón trong nước (29,5 triệu tấn/năm) và bằng gần 1/10 so với công suất sản
xuất phân bón vô cơ (26,7 triệu tấn/năm).
Giai đoạn 2015-2017, Việt Nam xuất khẩu phân bón hữu cơ đến 34
quốc gia khác nhau với khối lượng tăng mạnh trong hai năm 2016 và 2017.
Cụ thể, khối lượng xuất khẩu năm 2017 xấp xỉ 76.000 tấn, tăng hơn 6 lần
so với năm 2015 (12.000 tấn). Về doanh nghiệp xuất khẩu: Năm 2015 mới
chỉ có 2 doanh nghiệp xuất khẩu phân bón hữu cơ, năm 2016 là 12 doanh


6

nghiệp, đến năm 2017 đã có 19 doanh nghiệp tham gia xuất khẩu phân bón
hữu cơ, chủ yếu là Công ty Cổ phần hữu hạn VEDAN Việt Nam (gần
68.000 tấn), Công ty TNHH MTV Quế Lâm Phương Bắc (xấp xỉ 3.900
tấn), Công ty cổ phần Sê Công (trên 2.000 tấn) còn lại là các doanh nghiệp
khác xuất khẩu từ 7-504 tấn. Về chủng loại: Năm 2015 có 17 sản phẩm
phân bón hữu cơ được xuất khẩu, năm 2016 tăng lên 56 sản phẩm và năm

2017 đã có tổng cộng 75 sản phẩm phân bón hữu cơ được xuất khẩu ra
nước ngoài. Trong số đó, chủ yếu là phân bón hữu cơ (42 sản phẩm với
khối lượng xấp xỉ 60.000 tấn), phân bón hữu cơ khoáng (20 sản phẩm với
khối lượng trên 9.500 tấn), phân bón hữu cơ vi sinh (11 sản phẩm với khối
lượng xấp xỉ 6.500 tấn) và một lượng ít phân bón khoáng hữu cơ.
Khối lượng phân bón hữu cơ nhập khẩu trong 3 năm gần đây đều đã
tăng đáng kể. Cụ thể, khối lượng nhập khẩu năm 2017 là khoảng 220.000
tấn, tăng gấp đôi so với năm 2016 (xấp xỉ 102.000 tấn). Trong số đó, phải
kể đến phân bón vi sinh vật, khối lượng nhập hẩu năm 2017 (617 tấn) tăng
gần 5 lần so với năm 2015 (126 tấn) và tăng gần 2 lần so với 2016 (319
tấn). Khối lượng nhập khẩu phân bón hữu cơ sinh học năm 2017 (xấp xỉ
117.000 tấn) tăng gần 8 lần so với năm 2016 (xấp xỉ 15.000 tấn). Đặc biệt,
năm 2017 Việt Nam đã bắt đầu nhập khẩu phân bón hữu cơ cải tạo đất với
khối lượng 105 tấn (Báo cáo: Thực trạng và giáp pháp phát triển phân bón
hữu cơ, 2018).
Thời gian qua, các nhà khoa học trong cả nước đã nghiên cứu và sản
xuất thành công rất nhiều loại phân hữu cơ vi sinh nhằm cải tạo đất và
chăm sóc cây trồng. Kết quả thử nghiệm tại các vùng sản xuất cho thấy, các
sản phẩm phân bón hữu cơ vi sinh này có tác dụng tích cực đến việc nâng
cao năng suất, chất lượng nông sản, đồng thời có tác dụng tăng độ phì
nhiêu đất và bảo vệ môi trường sinh thái. Một số loại phân hữu cơ vi sinh
điển hình như: HUĐAVIL; HN 2000; Omix; Vi sinh tổng hợp Biomic –C;
Phân hữu cơ vi sinh vật chức năng, VTN1; VTN2 và VTN3...v...v....
Phân bón hữu cơ vi sinh đã được nghiên cứu từ lâu, song do yếu tố chủ
quan và khách quan khác nhau nên mức độ ứng dụng cho đến nay vẫn còn
nhiều hạn chế. Đặc biệt, các loại phân chuyên dụng cho từng loại cây còn
rất ít, hơn nữa các loại phân vi sinh này mới chỉ được sản xuất từ một số
loại vi sinh vật và nguyên liệu nhất định (cố định nitơ cộng sinh- Nitragin,

7

Rhizoda... cố định nitơ hội sinh, tự do- Azogin, Rhizolu...phân giải lân...),
hiệu quả sử dụng của các loại phân bón này ở các địa phương khác nhau là
không giống nhau. Nguyên nhân của hiện tượng này là do sự phong phú, đa
dạng của hệ vi sinh vật đất và tác động qua lại nhiều chiều của các vi sinh
vật với nhau, của vi sinh vật với cây trồng và điều kiện môi trường. Ở Việt
Nam, Viện Thổ nhưỡng Nông hóa – Viện Khoa học Nông nghiệp Việt
Nam là cơ quan đầu mối về quỹ gen vi sinh vật nông nghiệp, hiện đang lưu
giữ và bảo quản trên 600 chủng vi sinh vật các loại phục vụ cho sản xuất
phân bón vi sinh, các chế phẩm bảo vệ thực vật và xử lý môi trường.
Hiện nay, ở nước ta có nhiều cơ sở sản xuất nhiều loại phân hỗn hợp từ
than bùn. Trên thị trường có các loại phân hỗn hợp với các tên thương
phẩm sau đây: Biomix (Củ Chi), Biomix (Kiên Giang), Biomix (Plâyku),
Biofer (Bình Dương), Komix (Thiên Sinh), Komix RS (La Ngà),
Compomix (Bình Điền II), phân hữu cơ sinh học và hữu cơ vi sinh Quế
Lâm, phân lân hữu cơ sinh học sông Gianh và nhiều loại phân lân hữu cơ
sinh học ở nhiều tỉnh phía Bắc.
1.1.3. Tình hình nghiên cứu, ứng dụng phân bón hữu cơ vi sinh
trên thế giới
Tại tỉnh Quảng Đông, Trung Quốc tình hình sử dụng phế phụ phẩm
nông nghiệp ủ thành phân bón hữu cơ trong sản xuất nông nghiệp tăng dần.
Khoảng 77% nông dân sử dụng 60% sản phẩm phụ của cây trồng vụ trước
cho các cây trồng vụ sau, 18% hộ nông dân sử dụng 90% sản phẩm phụ
cho cây trồng vụ sau. Trong rơm rạ chứa khoảng 0,6% N, 0,1% P, 0,1% S,
1,5% K, 5% Si và 40% C. Rơm rạ là nguồn sẵn có với số lượng dao động
từ 2-10 tấn/ha nên đó là nguồn cung cấp dinh dưỡng cho cây. Gần như tất
cả K và 1/3 N, P, S nằm trong rơm rạ. Do vậy, rơm rạ chính là nguồn cung
cấp chất dinh dưỡng rất tốt cho cây (Bell và Edwards, 1989)[1]. Viện Lân và
Kali của Canada (1995) xác nhận 80% tổng số kali cây lấy đi nằm trong

xác, bã cây. Nếu các xác bã thực vật này được hoàn lại cho đất đã canh tác
thì chúng sẽ cung cấp một lượng kali đáng kể cho các cây trồng vụ sau. Các
vùng trồng mía lớn trên thế giới (Ấn Độ, Trung Quốc, Cuba,...) cũng có
cách thức trả lại ngọn lá mía cho đất để làm dinh dưỡng cho vụ sau thông
qua kỹ thuật ủ tạo phân hữu cơ. Van Dillewijn (1952) phân tích thấy bộ
phận ngọn và lá mía chiếm 62% N, 50% P2O5 và 55% K2O trong tổng số


8

của bộ phận thu hoạch. Như vậy có nghĩa 4 nếu trả lại ngọn lá mía bón lại
cho vụ sau thì cung cấp một lượng dinh dưỡng tương đối lớn cho cây (Van
Dillewijn, 1952)[1]. Các nghiên cứu, áp dụng công nghệ EM đạt được kết
quả một cách rộng rãi trong lĩnh vực xử lý môi trường, chế biến thức ăn
chăn nuôi, chế biến phân bón vi sinh cho cây trồng.... Qua các báo cáo
khoa học tại các Hội nghị Quốc tế về công nghệ EM cho thấy công nghệ
EM có thể gia tăng cân bằng sinh quyển, tính đa dạng của đất nông nghiệp,
tăng chất lượng đất, khả năng sinh trưởng, chất lượng sản phẩm nông
nghiệp. Vì thế, các nước trên thế giới đón nhận EM là một giải pháp để
đảm bảo cho một nền nông nghiệp phát triển bền vững và bảo vệ môi
trường. Nhiều nhà máy, xưởng sản xuất EM đã được xây dựng ở nhiều
nước trên thế giới và đã sản xuất được hàng ngàn tấn EM mỗi năm như:
Trung Quốc, Thái Lan (hơn 1000 tấn/năm), Myanmar, Nhật Bản, Brazil
(khoảng 1.200 tấn/năm), Srilanca, Nepal, Indonesia (khoảng 50 - 60
tấn/năm) (Erangelista và Urriza, 1999)[3]. Trong nền nông nghiệp cổ truyền
của các nước trên thế giới cũng như ở Việt Nam và các nước Asian, phân
hữu cơ không chỉ cung cấp dinh dưỡng cho cây trồng với hàm lượng vốn
có của nó mà còn đóng vai trò quan trọng trong việc cải thiện các đặc tính
lý hoá học của đất thông qua vai trò của vật chất hữu cơ. Do đó hiện nay
phân hoá học được coi là yếu tố quan trọng để đẩy năng suất cây trồng nên

xu hướng sử dụng phân hoá học vẫn ngày càng tăng. Nhưng phân hữu cơ
nói chung và phân hữu cơ vi sinh nói riêng vẫn đóng vai trò quan trọng
trong sản xuất nông nghiệp bền vững và bảo vệ môi trường ở các nước
nhiệt đới cũng như là ở các nước phát triển. Hiện nay do nhu cầu của thị
trường mà ngành chăn nuôi ở nước ta đã có những thay đổi, nguồn phân
hữu cơ sử dụng trong nông nghiệp đang có chiều hướng giảm dần do lượng
chất độn chuồng giảm. Trong khi đó nguồn phế phụ phẩm từ nông nghiệp
như rơm rạ, thân lá ngô, sắn, tế guột...thường bị đốt ngay tại chỗ sau khi
thu hoạch, gây ảnh hưởng tới môi trường và làm thất thoát một lượng đáng
kể các chất dinh dưỡng từ phụ phẩm nông nghiệp. Tác giả Tabagari và các
cộng tác viên (1987) dẫn theo Đinh Thị Ngọ (Đinh Thị Ngọ, 1996)[4],
nghiên cứu dùng than bùn để tủ gốc cho chè trên đất Podzolic cho thấy: cây
chè được tủ bằng than bùn có sinh khối phần trên mặt đất cao nhất, sau đó
đến tủ gốc bằng màng mỏng 5 PE màu đen, công thức đối chứng không tủ
cho sinh khối thấp nhất. Trọng lượng bộ rễ đặc biệt là rễ hút tăng 63% ở
công thức tủ bằng than bùn, tăng 27% ở công thức tủ bằng màng mỏng PE


9

màu đen (so với đối chứng), lượng rễ hút phân bố nhiều ở tầng đất 0 –
10cm (công thức tủ bằng than bùn chiếm 46%, công thức tủ bằng màng
mỏng PE màu đen chiếm tới 64%, công thức không tủ chỉ có 7%). Nghiên
cứu dài hạn về ảnh hưởng của việc sử dụng nguồn phụ phẩm nông nghiệp
(đã xử lý thành phân bón hữu cơ) trên đất phiến thạch sét tại Brazil sau 17
năm đã chỉ ra rằng, trong công thức luân canh với sử dụng tối đa nguồn
hữu cơ từ thân lá ngô và cây họ đậu đã làm tăng hàm lượng các bon trong
tầng đất mặt (0-17,5 cm) 24% và đạm tổng số tăng 15% và hàm lượng kali
dễ tiêu cũng tăng 5% so với đối chứng với công thức đối chứng độc canh
hai vụ ngô (Diekow, 2005)[5]. Ảnh hưởng của vùi phụ phẩm nông nghiệp

(chưa qua xử lý cũng như đã xử lý thành phân bón hữu cơ) đến năng suất
cây trồng ở vùng bán khô hạn của Ấn Độ chỉ ra rằng sinh khối tăng 25,3 %
và năng suất hạt tăng 9,2 % so với công thức đối chứng. Ngoài ra sử dụng
phế phụ phẩm còn có thể tiết kiệm được 50% lượng phân hoá học, giảm chi
phí cho người dân trong sản suất (Heman và Singh, 1992)[6]. Nhật Bản
cũng khuyên nông dân trồng chè của mình nên tận dụng nguồn phế phụ
phẩm nông nghiệp làm phân bón hữu cơ cho cây chè để tăng hàm lượng
mùn trong đất (Taton, 2005)[7]. Nguồn Carbon hữu cơ trong đất có thể được
cải thiện trong suốt quá trình bón phân hữu cơ. Từ năm 1992 - 1997, Quỹ
Kellogg, W. K tài trợ thử nghiệm bón phân hữu cơ được bổ sung thêm một
số loài vi sinh vật có ích thuộc 2 chi: Bacillus, Pseudomonas có khả năng
phân giải lân, kali tại 2 vùng trồng chè trọng điểm của Srilanca và nhận
thấy năng suất chè tăng 9 – 14% so với đối chứng có bón phân hữu cơ và
tăng 17% so với đối chứng không sử dụng 2 loại phân bón này (Kellogg,
1997)[8]. Kết quả thí nghiệm của Christian Bruns và Christian Schüler năm
2000 cũng cho thấy nếu phân hữu cơ (làm từ phân người, gia súc và cây
xanh) có bổ sung thêm Bacillus subtilus, Lactobaccillus rhammossus,
Bacillus polymyxa bón cho chè thì chất hòa tan trong chè tăng từ 47,31%
(chỉ bón phân hữu cơ) lên 51,01% (bón phân hữu cơ vi sinh) (Christian
Bruns và Christian Schüler, 2000)[9]. Đã có nhiều biện pháp xử lý rác thải
nông nghiệp như đốt, chôn lấp, ủ phân phân hữu cơ vi sinh. Ở Australia,
Pháp, Indonesia, Malaysia, Miến Điện, Philippine, Tây Ban Nha và Thái
Lan, phụ phẩm nông nghiệp thường được đem đốt. Các nước Mỹ, Đức,
Italia... xử lý bằng cách chôn vùi chiếm 60-80%. Bên cạnh việc sử dụng
nguồn rác thải nông nghiệp để làm nhiên liệu, trong nuôi trồng thủy sản,


10

công nghiệp sản xuất đồ gốm, công nghiệp sản xuất silic...Đa số lượng rác

thải còn lại được đốt bỏ không sử dụng.
1.2. NHÓM VI SINH VẬT CÓ ÍCH PHỤC VỤ SẢN XUẤT PHÂN BÓN
VI SINH
1.2.1. Vi sinh vật cố định đạm
Cố định đạm hay cố định nitơ là một quá trình mà nitơ (N2) trong khí
quyển được chuyển đổi thành amoni (NH4+). Nitơ trong khí quyển hoặc
phân tử khí nitơ (N2) tương đối trơ, tức là nó không dễ dàng phản ứng với
các hóa chất khác để tạo ra hợp chất mới. Quá trình cố định phân giải các
phân tử nitơ dạng hai nguyên tử (N2) thành các nguyên tử.
Cố định đạm trong tự nhiên và tổng hợp, là quá trình cần thiết cho tất
cả các hình thái của sự sống bởi vì nitơ là cần thiết để sinh tổng hợp các
yếu tố cấu tạo cơ bản của thực vật, động vật và các hình thái sự sống khác;
ví dụ, nucleotide trong DNA và RNA và các axit amin trong protein. Do
đó, cố định đạm cần thiết trong nông nghiệp và sản xuất phân bón. Đây cũng
là một quá trình quan trọng trong sản xuất thuốc nổ (ví dụ như thuốc súng,
thuốc nổ TNT, v.v). Cố định đạm tự nhiên trong không khí là nhờ tia sét.
Cố định đạm cũng gồm những dạng chuyển đổi sinh học khác của nitơ,
chẳng hạn như chuyển đổi sang nitơ điôxit (NO2). Vi sinh vật có thể cố
định được nitơ là những sinh vật nhân sơ (cả vi khuẩn và vi khuẩn cổ) gọi
chung là các vi khuẩn cố định đạm (diazotroph). Một số thực vật bậc cao,
và một số động vật (mối), đã có những hình thức cộng sinh với các vi
khuẩn (diazotroph) này.
Nhiều nghiên cứu cho thấy các nhóm vi sinh vật trong đất có khả năng
hòa tan lân khó tan và phóng thích lân dễ tan cho cây trồng do chúng có
khả năng tổng hợp và phóng thích các acid hữu cơ và trực tiếp hòa tan lân
khó tan thành lân dạng dễ hấp thu. Khi sử dụng các loài vi sinh vật nầy sản
xuất phân sinh học bón cho cây trồng đã giúp tăng năng suất một cách rất
có ý nghĩa.
1.2.2. Vi sinh vật phân giải lân

11

Photpho là nguyên tố quan trọng thứ 2 trong 3 nguyên tố dinh dưỡng đa
lượng chính của cây trồng (N, P,K), là thành phần của axit nucleic, phytin,
photpholipit. Photpho có tác động trực tiếp đến quá trình tích lũy đường,
protein, lipid, vitamin… của cây trồng. Đặt biệt photpho là thành phần
không thể thiếu của ATP, ADP, AMP (phân tử trao đổi năng lượng), kiểm
soát, điều khiển quá trình trao đổi năng lượng của cây (hô hấp, quan hợp..).
Photpho có tác dụng thúc đẩy phát triển và tăng khả năng chống chịu của
cây trồng. Thiếu photpho, sự hình thành tế bào mới bị chậm lại, cây còi cọc
ít phân cành, đẻ nhánh, lá có màu xanh lục bẩn, không sáng. Thiếu
photpho, năng suất cây trồng bị giảm sut nghiêm trọng, ngay cả khi được
cung cấp đủ nitơ. Sự xuất hiện, tồn tại và chuyển hóa của photpho trong tự
nhiên diễn ra theo một quy trình khép kín gọi là vòng tuần hoàn của
photpho thông qua 4 quá trình (khoáng hóa, cố định sinh học, cố định hóa
học và phân giải). Theo như các nghiên cứu cây trồng chỉ có thể hấp thu 5 25% lượng lân được bón, số còn lại bị đất giữ lại dưới dạng hấp phụ hoặc
cố định, trong đó hấp phụ thông qua trao đổi ion sẽ trở thành dạng tan, còn
cố định thì không thể chuyển đổi thông qua ion trao đổi. VSV phân giải
lân, VSV chuyển hóa lân (Phosphate Solubilizing Microorganisms – PSM)
là các VSV có khả năng chuyển hóa hợp chất photpho khó tan thành dạng
dễ tiêu cho cây trồng sử dụng. Các VSV phân giải hợp chất photpho khó
tan được biết đến nay là các loài: Pseudomonas, Micrococus, Bacillus,
Flavobacterium, Penicillium, Sclerotium, Aspergillus. Các VSV này không
chỉ phân giải photphat canxi mà cả photphat nhôm, sắt, mangan và các
dạng khác kể cả quặng.
1.2.3. Vi sinh vật phân giải xenlulo
Thủy phân xenlulo bởi enzyme từ vi sinh vật là bước quan trọng trong
chu trình carbon. Mặc dù có một lượng rất lớn xenlulo nhưng chỉ một phần
trăm rất nhỏ vi sinh vật có khả năng phân giải vì sự cứng cáp của thành tế

bào. Có ít nhất năm cơ chế riêng biệt được sử dụng ở những loài vi sinh vật
khác nhau nhằm phân giải xenlulo với sự có mặt của enzyme cellulase.
Không chỉ đóng góp vai trò trong chu trình carbon tự nhiên, vi sinh vật
phân giải xenlulo còn có tiềm năng lớn trong việc phân hủy xenlulo trong
nước ô nhiễm (Hubbe và cs 2012; Hubbe và cs 2013)[10,11] và chuyển hóa


12

xenlulo thành nhiên liệu sinh học thay thế nhiên liệu hóa thạch (Falter và cs
2015; Wang và cs 2011)[12,13].
Đã có nhiều nghiên cứu được tiến hành để phân lập dòng vi sinh vật
sản sinh enzyme phân giải xenlulo và khả năng phân giải xenlulo của
chúng. Các vi sinh vật phân giải xenlulo chủ yếu được phân lập từ hệ tiêu
hóa động vật ăn cỏ như bò, cừu, dê (Oyeleke và Okusanmi, 2008)[14], và
côn trùng như bọ cánh cứng, mối (Huang và cs 2012; Hu và cs 2014)[15,16].
Ngoài ra chúng còn được tìm ra trong phân ủ, phân hữu cơ, bùn từ nước
thải (Bayer và cs 2004)[17]. Nhóm vi khuẩn phân giải xenlulo bao gồm
Clostridium, Bacteroides sucinogenes, Butyrivibrio fibrisolvens,
Ruminococcus albus, Methanobrevibacter ruminatium, Siphonobacter
aquaeclarae, Cellulosimicrobium funkei, Paracoccus sulfuroxidans,
Ochrobactrum cytisi, Ochorobactrum haematophilum, Kaistia adipata,
Desvosia riboflavia, Labrys neptuniae, Ensifer adhaerens, Shinella
zoogloeoides, Citrobacter freundii, và Pseudomonas nitroreducens. Các
loài này phần lớn thuộc nhóm vi sinh vật kị khí, chúng được phân lập chủ yếu
từ ruột của những loài động vật sử dụng gỗ làm nguồn thức ăn (Huang và cs
2012; Milala và cs 2005; Schwarz 2001)[18,19]. Trong đất người ta cũng phân
lập được các dòng vi khuẩn Gram (+) hiếu khí như Brevibacllus,
Paenibacillus, Bacillus, và Geobacillus. Đối với các dòng ưa ấm, pH và nhiệt
độ tối thích cho enzyme carbonmethyl cellulase của chúng hoạt động là 5,5 và

55 oC, còn đối với các dòng ưa nhiệt là pH 5,0 và nhiệt độ 75oC (Rastogi và
cs, 2009)[20].
Xạ khuẩn (Actinomycetes) là vi khuẩn Gram (+) có dạng sợi như nấm.
Chúng là vi sinh vật hiếu khí có mặt khắp nơi trong tự nhiên. Xạ khuẩn rất
giàu G+C chiếm 57-75 % (Lo và cs, 2002)[21] chúng chiếm ưu thế trong đất
phèn khô (Jeffrey, 2008)[22]. Xạ khuẩn còn được biết đến nhiều bởi các sản
phẩm chuyển hóa bậc hai, nổi bật là các loại kháng sinh như streptomycin,
gentamicin, rifamycin và erythomycin. Ngoài ra, xạ khuẩn còn có vai trò
quan trọng trong công nghiệp dược phẩm cũng như trong nông nghiệp.
Streptomyces là giống chủ đạo trong xạ khuẩn, đây cũng là vi sinh vật sản
sinh cellulase được quan tâm nghiên cứu. Một số loài đáng chú ý thuộc
giống này như Streptomyces reticuli, Streptomyces drozdowiczii,


13

Streptomyces lividans (Kluepfel và cs, 1986; Schrempf và Walter, 1995)[.
Thermoactimnomyces được tìm thấy trong trầm tích đại dương,
Streptosporangium trong quặng apatit cũng là những loài có khà năng phân
hủy xenlulo (Chang và cs, 2009; Veiga và cs,1983)[23,24].
Nấm là sinh vật có cơ chế sinh hóa độc đáo trong phân giải cơ chất tạo
những sản phẩm bậc hai đặc biệt, đây là nhóm được nghiên cứu nhiều nhất
trong lĩnh vực phân hủy xenlulo. Các cellulase từ nấm thường có hoạt lực
cao và dường như không có các dạng vật lý phức tạp như enzyme này từ vi
khuẩn. Acremonium spp., Chaetomium spp., Trichoderma reesei,
Trichoderma
viride,
penicillium
pinophilum,
Phanerochaete

chrysosporium, Fusarium solani, Talaromyces emersonii, Trichoderma
koningii, Fusarium oxysporium, Aspergillus niger, Aspergillus terreus and
Rhizopus oryzae có vai trò quan trọng trong quy trình phân hủy xenlulo ở
nhiều môi trường khác nhau (Yang và cs, 2011; Shahriarinour và cs,
(2011)[25,26].
1.2.4. Vi sinh vật sinh hocmon sinh trưởng thực vật
Một số nghiên cứu cho thấy có sự tổng hợp ACC deaminase (1aminocyclopropane-l-carboxylate deaminase) từ các vi khuẩn kích thích
sinh truởng thực vật ở vùng rễ như: Methylobacterium sp., Alcaligenes spp.
Bacillus pumilus, Enterbacer cloacae, burkholderia cepacia, Pseudomonas
putida, Pseudomonas spp.và Variovoraxparadoxus . Cơ chế này đuợc lý
giải là do ACC có khả năng làm giảm ethylen trong rễ mà ethelen này ức
chế sự sinh trưởng của rễ) do đó kích thích rễ phát triển. Phytohormone tác
động kích thích lên sinh trưởng thực vật. Phytohormone phổ biến nhất là
auxin indole-3-acetic acid (IAA), đã có nhiều nghiên cứu về sự sản xuất
auxin này ở các loài vi khuẩn như: Azospirillum brasilense, Aeromonas
veronii, Agrobacterium sp., Alcaligenes piechaudii, Bradyrhizobium spp.,
Comamonas acidovorans, Enterobacter sp., và Rhizobium leguminosarưm.
Một số quan sát cho thấy rằng vi khuẩn Methylobacterium sống cộng sinh
trên thực vật mà không gây bệnh cho cây chủ, nguợc lại chúng còn có khả
năng hỗ trợ cây chủ phát triển rất tốt. Năm 2004, Omer và cộng sụ đã khảo
sát sự hiện diện của IAA trong môi truờng chứa dịch nuôi cấy vi khuẩn


14

biến dưỡng methyl. Qua đó, phát hiện thấy có 3 trong 16 chủng phân lập có
phản ứng duơng tính với với thuốc thử Salkowski. Điều này đuợc chứng
minh rõ hơn bằng phương pháp sắc lý lỏng cao áp (HPLC) kết hợp với
phân tích phổ NMR (nuclear Mangnetic Radiation: cộng hưởng từ hạt
nhân). Ba chủng tạo ra IAA có hàm luợng phytohormone từ 6 - 13,3 mg/1

nếu bổ sung L-tryptophan (L-TRP). Khi không bổ sung L-TRP thì nồng độ
IAA tạo ra chỉ từ 1.1-2,4 mg/1. Các kết quả này đã gây đuợc sụ chú ý lớn.
1.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU, ĐỊNH DANH VI SINH VẬT
Định danh vi sinh vật cần phải khảo sát các đặc điểm hình thái và các
đặc điểm sinh lí, sinh hóa của vi sinh vật. Đồng thời, phương pháp sinh học
phân tử giải trình tự đoạn gen đặc trưng của vi sinh vật cũng được tiến hành
để cho kết quả nhanh chóng và chính xác.
Phương pháp truyền thống: Việc phân loại vi khuẩn được thực hiện đầu
tiên vào năm 1987, khi Ferdinad Cohn phân nhóm vi khuẩn dựa vào hình
dạng tế bào. Mặc dù phưomg pháp phân loại dựa vào hình thái sớm cho
thấy không có hiệu quả trong phân loại, nhưng hình thái và đặc điểm cấu
trúc hiển vi vẫn có vai trò quan trọng trong định danh vi sinh vật, đặc biệt
là trong việc định danh các chủng mới. Phương pháp truyền thống để định
danh vi sinh vật thường dựa vào các chỉ tiêu phân loại như: đặc điểm hình
thái, sinh lý, đặc điểm biến dưỡng năng lượng. Trong đó các thử nghiệm để
xác định các đặc điểm sinh lý, sinh hóa là các chỉ tiêu quan trọng nhất.
Thông thường để định danh các loài vi khuẩn mục tiêu theo phương thức
truyền thống, người ta thường dựa vào các khóa phân loại, trong đó khóa
phân loại Prokaryote đầy đủ nhất, được sử dụng rộng rãi là khóa phân loại
Bergey (Bergey ’s Manual of Systematic Bacteriology)[27]. Riêng đối với
nấm men việc định danh theo phương thức truyền thống rất phức tạp. Từ
trước đến nay có rất nhiều khóa phân loại nấm men của nhiều tác giả khác
nhau. Hansen là người đưa ra khóa phân loại nấm men đầu tiên. Trong
khóa phân loại này, Hansen chia nấm men thành 8 giống. Sau Hansen,
Klocker (1907), Guilliermond (1920) cũng đã tiến hành chỉnh sữa khóa
phân loại của Hansen, nhưng chưa được hoàn thiện. Đến năm 1952, J.
Lodder và Kreger-van rij đã tổng kết lại một cách khá hoàn thiện vấn đề


15

phân loại nấm men và xuất bản một tài liệu rất có giá trị (J. Lodder and
N.J.W.Kreger-Van Rij, 1952), được xuất bản lần thứ hai năm 1957. Năm
1970, J. Lodder bổ sung sửa chữa lại và in tái bản lần thứ nhất năm 1970,
lần thứ hai 1971. Đây là tài liệu phân loại nấm men rất có giá trị và và là
khóa phân loại thông dụng nhất hiện nay trên thế giới. Hệ thống phân loại
này dựa trên kiểu phân chia tế bào, hình thái bào tử nang và đã xác định
349 loài nấm men thuộc 39 chi khác nhau.
Phương pháp hiện đại: Ngày nay, sự phát triển của các kỹ thuật sinh
học hiện đại đã đưa việc phân loại, định danh vi sinh vật lên một bước phát
triển mới. Phương pháp hiện đại trong định danh vi sinh vật dựa trên vật
liệu di truyền có thể cho kết quả chính xác trong một thời gian ngắn. Tuy
nhiên, phương pháp phân loại hiện đại này đòi hỏi phải có trang thiết bị
hiện đại và hóa chất đắt tiền. Năm 1967, Zucker Kank và Pauling đã cho
rằng các phân tử sinh học có thể là “tài liệu của lịch sử tiến hóa”, là “thước
đo tiến hóa”. Phân tử rRNA 16S ở prokaryote và 18S ở eukaryote (riêng
nấm men thì trình tự đoạn D1/D2 26s rRNA và vùng ITS 5.8S rRNA được
sử dụng phổ biến để xây dựng cây phát sinh chủng loài) là một công cụ hữu
ích trong phân loại và định danh vi sinh vật. Ngoài đặc điểm là hiện diện
trong tất cả các sinh vật, có chức năng không đổi, phân tử rRNA 16S còn
có ưu điểm là có nhiều bản sao trong tế bào, có tính bảo tồn cao nhưng vẫn
có những vùng trình tự khác biệt giữa các loài và trình tự đặc trưng từng
nhóm vi sinh vật; đặc biệt là thích hợp với mục tiêu phân loại nhờ có kích
thước vừa phải (khoảng 1500 ribonucleotide), thuận tiện cho việc giải trình
tự. Phương pháp hiện đại dùng đế định danh vi sinh vật bên cạnh việc dựa
vào trình tự rRNA, các trình tự rDNA (trình tự mã hóa cho rRNA) cũng
thường được sử dụng, vì DNA là vật liệu dễ thu nhận và có tính bền cao
hơn RNA. Một số phương pháp phân loại dựa vào vật liệu di truyền đang
được sử dụng hiện nay: dùng mẫu dò kết hợp vói phương pháp lai in-situ
phát huỳnh quang (Fluorescence ỉn-sừu Hybridazation - FISH). Mẫu dò là

một trình tự acid nucleic, thường là một đoạn mạch đơn của acid nucleic
(DNA) được gắn với một nhân tố nhận biết là phóng xạ hay chất phát
huỳnh quang, dùng đế nhận biết trình tự nucleotide đặc trưng (trình tự nhận
diện) của một chủng vi sinh vật đã biết trước. Phân tích dữ liệu các trình tự


16

ssu rRNA (Small Subunit rRNA) đã biết sẽ cho phép xác định các trình tự
nhận diện chuyên biệt cho từng giới. Một số trình tự nhận diện cho một
nhóm chuyên biệt chuyên biệt trong giới, thậm chí một giống, một loài
cũng đã được xác định. Trong tương lai, nhiều trình tự tương tự được xác
định và sẽ rất hữu dụng trong việc nhận diện, định danh một vi sinh vật
mới. Các trình tự nhận diện chuyên biệt cho vi khuẩn có thể được tổng hợp,
đánh dấu bằng chất phát huỳnh quang và dùng để phát hiện chuyên biệt các
giới này. Các mẫu dò này được gọi là “mẫu dò phát sinh chủng loại”
(phylogenic prode). Bằng việc xử lý mẫu chứa vi sinh vật bằng một tác
nhân thích hợp làm tăng tính thấm của màng, cho phép mẫu dò vào bên
trong tế bào, thực hiện phương pháp lai phân tử (lai in-situ, tức là lai trực
tiếp trên tế bào mẫu), và quan sát dưới kính hiển vi huỳnh quang, người ta
có thể xác định trực tiếp chủng thuần thuộc giới nào hay quần xã vi sinh vật
hiện diện trong một mẫu tự nhiên gồm những giới nào. Kỹ thuật lai và phát
hiện này được gọi là phương pháp lai in-situ huỳnh quang (FISH).