Nghiên cứu chiết xuất Methoxyflavon của thân rễ địa liền đen ( Kaenmpferia Wall.ex Baker), họ Gừng (Zingiberaceae)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

HÀ VĂN HUÂN

NGHIÊN CỨU CHIẾT XUẤT METHOXYFLAVON
CỦA THÂN RỄ ĐỊA LIỀN ĐEN
(Kaempferia parviflora Wall. ex Baker),
họ Gừng (Zingiberaceae)

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

HÀ NỘI 2019


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

HÀ VĂN HUÂN

NGHIÊN CỨU CHIẾT XUẤT METHOXYFLAVON
CỦA THÂN RỄ ĐỊA LIỀN ĐEN
(Kaempferia parviflora Wall. ex Baker),
họ Gừng (Zingiberaceae)

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

CHUYÊN NGÀNH DƯƠC LIỆU – DƯỢC HỌC CỔ TRUYỀN
MÃ SỐ: 8720206

Người hướng dẫn khoa học: PGS. TS. Đỗ Quyên

HÀ NỘI 2019


LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành được luận văn này, tôi xin tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến
PGS.TS. Đỗ Quyên là người đã hướng dẫn và tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá
trình thực hiện luận văn này.
Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô trong bộ môn Dược Liệu – Trường
Đại học Dược Hà Nội đã tận tình giảng dạy, truyền đạt tri thức giúp tôi có thể áp
dụng vào thực nghiệm để hoàn thiện luận văn này.
Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn đến ThS. Phạm Tuấn Anh và các anh chị kỹ
thuật viên - bộ môn Dược Liệu – Trường Đại học Dược Hà Nội, cùng các em sinh
viên K69 đang nghiên cứu khoa học tại bộ môn Dược Liệu - Trường Đại Học Dược
Hà Nội đã hỗ trợ và phối hợp với tôi trong quá trình thực hiện.

Hà Nội, ngày 1 tháng 4 năm 2019

Ds. Hà Văn Huân


MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN................................................................................................ .....
DANH MỤC CÁC BẢNG..................................................................................

DANH MỤC CÁC HÌNH...................................................................................
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT……………………………...
ĐẶT VẤN ĐỀ ................................................................................................. 1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN ........................................................................... 2
1.1. Vị trí, đặc điểm thực vật và phân bố loài Kaempferia parviflora
Wall.ex Baker .............................................................................................. 2
1.2. Thành phần hóa học .............................................................................. 3
1.3. Tác dụng sinh học ................................................................................. 7
1.4. phương pháp chiết xuất methoxyflavon trong thân rễ Địa liền đen
(Kaempferia parviflora Wall.ex Baker)..................................................... 10
1.5. Phương pháp định lượng methoxyflavon trong thân rễ Địa liền đen
(Kaempferia parviflora Wall.ex Baker)..................................................... 10
CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..............14
2.1. Nguyên liệu và phương tiện nghiên cứu ............................................. 14
2.2. Phương pháp nghiên cứu .................................................................... 15
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU .......................................................23
3.1. Chiết xuất, phân lập và xác định cấu trúc của 2-3 hợp chất
methoxyflavon từ thân rễ Địa liền đen (Kaempferia parviflora Wall. ex
Baker). ....................................................................................................... 23
3.2. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến chiết xuất methoxyflavon ........... 30


CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN .............................................................................45
4.1. Về chiết xuất, phân lập 2-3 hợp chất methoxyflavon trong thân rễ Địa
liền đen ...................................................................................................... 45
4.2. Xây dựng quy trình định lượng methoxyflavon trong thân rễ Địa liền
đen bằng phương pháp HPLC ................................................................... 46
4.3. Về xác định một số yếu tố ảnh hưởng chiết xuất methoxyflavon trong
thân rễ Địa liền đen.................................................................................... 48
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT ...........................................................................50

TÀI LIỆU THAM KHẢO……………………………………………………...
PHỤ LỤC………………………………………………………………………


DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1. Các methoxyflavon được phân lập từ thân rễ Địa liền đen.............. 5
Bảng 1.3. Các điều kiện định lượng methoxyflavon trong thân rễ Địa liền đen
bằng HPLC .....................................................................................................12
Bảng 2.1. Các thí nghiệm chiết xuất methoxyflavon trong thân rễ Địa liền đen21
Bảng 3.1. Bảng số liệu phổ NMR của KP1, KP2 và KP5 ..............................29
Bảng 3.2. Chương trình gradient pha động theo chương trình sắc ký 1..........30
Bảng 3.3. Chương trình gradient pha động theo chương trình sắc ký 3..........31
Bảng 3.4. Chương trình gradient pha động theo chương trình sắc ký 3..........32
Bảng 3.5. Chương trình gradient pha động của chương trình sắc ký sử dụng
phân tích .........................................................................................................35
Bảng 3.6. Thời gian lưu các mẫu thẩm định độ đặc hiệu ................................35
Bảng 3.7. Thời gian lưu và diện tích pic của chất chuẩn (1); (2) trong thẩm
định chỉ tiêu độ phù hợp hệ thống ..................................................................36
Bảng 3.8. Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp định lượng.................39
Bảng 3.9. kết quả hàm lượng methoxyflavon trong thân rễ Địa liền đen theo 2
chất chuẩn (1); (2) ..........................................................................................41


DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1. Công thức hóa học chung của các flavon trong Địa liền đen ........... 4
Hình 1.2. Cấu trúc chung của một số flavonoid khác ...................................... 6
Bảng 1.2. Cấu trúc của một số flavonoid của thân rễ địa liền đen ................... 6
Hình 2.1. Mẫu nghiên cứu Địa liền đen ..........................................................14
Hình 3.1. Sắc ký lớp mỏng Địa liền đen và 2 chất chuẩn ...............................23
Hình 3.2. Cấu trúc của hợp chất 5-hydroxy-7-methoxyflavon .......................26

Hình 3.3. phổ 'H-NMR của hợp chất KP2 .....................................................27
Hình 3.4. Cấu trúc của hợp chất 3,5,7-trimethoxyflavon ................................27
Hình 3.5. phổ 'H-NMR của hợp chất KP5 .....................................................28
Hình 3.6. Cấu trúc của hợp chất 3,5,7,4’-tetramethoxyflavon ........................29
Hình 3.7. Sắc ký đồ mẫu chứa 2 chất chuẩn theo chương trình sắc ký 2 ........30
Hình 3.8. Sắc ký đồ 2 chất chuẩn theo chương trình sắc ký 2 ........................31
Hình 3.9. Sắc ký đồ 2 chất chuẩn (1), (2) theo chương trình sắc ký 3 ............32
Hình 3.10. Sắc ký đồ của chất chuẩn 3,5,7-trimethoxyflavon (1) theo chương
trình sắc ký 4 ..................................................................................................33
Hình 3.11. Sắc ký đồ của chất chuẩn 3,5,7,4’-tetramethoxyflavon (2) theo
chương trình sắc ký 4 .....................................................................................33
Hình 3.12. Sắc ký đồ dịch chiết thân rễ Địa liền đen theo chương trình sắc ký
4......................................................................................................................34
Hình 3.13. sắc ký đồ độ đặc hiệu ....................................................................36


Hình 3.14. đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa diện tích pic và nồng độ của
chất chuẩn 3,5,7-trimethoxyflavon (1) ...........................................................38
Hình 3.15. đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa diện tích pic và nồng độ của
chất chuẩn 3,5,7,4’-tetramethoxyflavon (2)....................................................38
Hình 3.16. kết quả phân tích điều kiện tối ưu bằng phần mềm modde 5 ........42
Hình 3.17. Đồ thị biểu diễn các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết xuất
methoxyflavon trong thân rễ Địa liền đen ......................................................43


DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
1

H-NMR: Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton
C-NMR: Phổ cộng hưởng từ hạt nhân carbon

I3

ACN: Acetonitril
d: Tín hiệu duplet
DMF: 5,7- dimethoxyflavon
EtOH: Ethanol
EOAC: Ethyl acetat
TMF: 5,7,4'-trimethoxyflavon
PMF: 3,5,7,3’,4’- pentamethoxyflavon
HPLC: sắc ký lỏng hiệu năng cao
J: Đại lượng tương tác spin spin
RSM: Phương pháp bề mặt đáp ứng
s: Tín hiệu singlet
δ: Độ dịch chuyển hóa học


ĐẶT VẤN ĐỀ
Chi Địa liền (Kaempferia L.) là một chi thuộc họ Gừng
(Zingiberaceae), có khoảng 100 loài, được phân bố chủ yếu ở Trung Quốc,
Ấn độ và các nước Đông Nam Á. Ở Việt Nam, có 9-10 loài thuộc chi
Kaempferia L. [4]. Trước khi phát hiện cây Địa liền đen (Kaempferia
parviflora Wall. ex Baker) có mặt ở Việt Nam, nguồn dược liệu này chủ yếu
được nhập về từ Thái Lan và Lào vì Địa liền đen là một vị thuốc quý trong y
học cổ truyền của Thái Lan với nhiều công dụng như: tăng cường sinh dục
nam, rối loạn tiêu hóa, thuốc bổ [35], [37], [38] ...
Cho đến nay cây Địa liền đen (Kaempferia parviflora Wall. ex Baker)
chưa được ghi nhận trong danh lục Thực vật Việt Nam. Trong giai đoạn 2014
– 2016, một nghiên cứu về phân loại thực vật các cây thuộc họ Gừng ở miền
Trung Việt Nam đã phát hiện được loài Địa liền đen (Kaempferia parvifolia

Wall. ex Baker) ở xã Yang Mao, huyện Krông Bông, tỉnh Đắk Lắk [3]. Nhận
thấy đây là một cây thuốc quý, một số tỉnh phía Bắc Việt Nam giáp biên giới
với Lào đã trồng Địa liền đen như Thanh Hóa, Lai Châu, Sơn La.
Mặt khác, nhiều nhà khoa học Thái Lan và Nhật Bản đã nghiên cứu cây
Địa liền đen theo hướng tăng lực, tăng cường chức năng sinh dục nam, hạ
lipid máu [10], [30] ... cho thấy các tác dụng này có liên quan đến thành phần
methoxyflavon của cây Địa liền đen. Chính vì vậy, chúng tôi tiến hành đề tài
“Nghiên cứu chiết xuất methoxyflavon của thân rễ Địa liền đen (Kaempferia
parviflora Wall.ex Baker)” ở Việt Nam với 2 mục tiêu chính như sau:
 Chiết xuất, phân lập và xác định được cấu trúc của một số hợp chất
methoxyflavon từ thân rễ Địa liền đen.
 Xác định được một số yếu tố ảnh hưởng đến chiết xuất methoxyflavon
từ thân rễ Địa liền đen.

1


CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1. Vị trí, đặc điểm thực vật và phân bố loài Kaempferia parviflora
Wall.ex Baker
1.1.1. Vị trí, đặc điểm thực vật
Theo hệ thống phân loại thực vật Takhtajan công bố năm 2009 [29], Địa liền
đen thuộc chi Kaempferia có vị trí:
Ngành Ngọc lan (Magnoliophyta)
Lớp Hành (Liliopsida)
Phân lớp Loa kèn (Liliidae)
Bộ Gừng (Zingiberales)
Họ Gừng (Zingiberaceae)
Chi Kaempferia L.
Địa liền đen có tên khoa học là Kaempferia parviflora Wall.ex Baker, họ

Gừng (Zingiberaceae) sống lâu năm. Thân thảo, cây cao đến 90 cm. thân rễ
màu tím sậm, với một số rễ mọng nước phân nhiều nhánh. Lá mỏng hình
trứng hoặc hình thuôn dài, rộng khoảng 7 - 11 cm, bề mặt trên nhẵn, bề mặt
dưới có lông; cuống lá dài, có lông; mép lá có màng, màu đỏ tía. Cụm hoa
được bao bọc bởi nhiều lá xung quanh. Hoa nhỏ có màu trắng. Lá bắc chính
hình thuôn, nhẵn, đỉnh tròn; có lá bắc con bề mặt nhẵn, đỉnh tròn. Đài hoa có
lông mịn, đỉnh xẻ đôi. Tràng hoa hình ống dài, có phân thùy, thùy lưng có
đỉnh trùm lại; thùy bên hơi nhỏ hơn, đỉnh tròn. Nhị lép màu trắng. Phía trong
môi dưới màu tím, đậm hơn ở giữa, hình trứng ngược, đỉnh có khía. Nhị với
chỉ nhị rất ngắn, bao phấn dài khoảng 2 mm. Nhụy có lông, vòi nhụy dài 8 - 9
mm.

2


1.1.2. Phân bố
Theo các công bố cây Địa liền đen (Kaempferia parviflora Wall.ex
Baker) phân bố tại các nước Trung Quốc, Ấn Độ và một số nước thuộc Đông
Nam Á như Thái Lan, Lào, Malaysia, ... Trong giai đoạn 2014 – 2016, một
nghiên cứu về phân loại thực vật các cây thuộc họ Gừng ở miền Trung Việt
Nam đã phát hiện được loài Địa liền đen (Kaempferia parvifolia Wall. ex
Baker) ở xã Yang Mao, huyện Krông Bông, tỉnh Đắk Lắk. Hiện nay, đã có
một số tỉnh trồng cây Địa lền đen này như Thanh Hóa, Sơn La, Lai Châu [3].
1.2. Thành phần hóa học
Thân rễ Địa liền đen (Kaempferia parviflora Wall. ex Baker) đã có nhiều
nghiên cứu về thành phần hóa học bởi các nhóm nghiên cứu của Nhật Bản,
Thái Lan với mẫu từ Thái Lan, các hợp chất chính của thân rễ Địa liền đen là
flavonoid, glycosid, tinh dầu ... Trong đó chủ yếu là các methoxyflavon [19],
[21].
Flavonoid

Các nghiên cứu đã chỉ ra nhóm hợp chất methoxyflavon được phân lập
trong thân rễ Địa liền đen (Kaempferia parviflora Wall. ex Baker) là thành
phần chính và quan trọng nhất đối với các tác dụng sinh học của cây ... [9],
[17], [25], [39]. Nhóm hợp chất này chủ yếu là các polymethoxyflavon,
không có phần đường nên có tính chất kém phân cực. Theo các tài liệu tham
khảo, nhóm hợp chất này chiết bằng một dung môi đa năng như ethanol, sau
đó chiết phân bố với các dung môi có độ phân cực tăng dần. Các
polymethoxyflavon xuất hiện nhiều trong các phân đoạn dicholoromethan,
ethyl acetat. Các hợp chất polymethoxyflavon được trình bày ở bảng 1.1.
Saowanee Chaipech và cộng sự đã phân lập được các methoxyflavon từ
dịch chiết methanol của thân rễ Địa liền đen. Các methoxyflavon thu được
3


methoxyflavon là 5-hydroxy-7-methoxyflavon; 5,7-dimethoxyflavon; 5,4′dihydroxy-7-methoxyflavon;
trimethoxyflavon;

5-hydroxy7,4′-dimethoxyflavon;

5,7,4′5,7,3′,4′-

5-hydroxy-7,3′,4′-trimethoxyflavon;

tetramethoxyflavon; 5-hydroxy-3,7-dimethoxyflavon; 3,5,7-trimethoxyflavon;
3,5,7,4′-tetramethoxyflavon;

5-hydroxy-3,7,4′-trimethoxyflavon;
dihydroxy-3,7,4′-trimethoxyflavon;

5,3′-

5-hydroxy-3,7,3′,4′-tetramethoxyflavon;

3,5,7,3′,4′- pentamethoxyflavon [9].
Một nghiên cứu khác của Supinya Tewtrakul và cộng sự đã xác định
được 7 methoxyflavon gồm: 5-hydroxy-3,7-dimethoxyflavon; 5-hydroxy-7methoxyflavon;
dimethoxyflavon;

5-hydroxy-3,7,4-trimethoxyflavon;

5-hydroxy-7,4-

5-hydroxy-3,7,3,4-tetramethoxyflavon;

3,5,7-

trimethoxyflavon và 3,5,7,4-tetramethoxyflavon [33].
Ở Việt Nam, nhóm nghiên cứu của Bùi Kim Anh và cộng sự xác định
được 2 hợp chất methoxyflavon là 5,7-dimethoxyflavon; 5-hydroxy-3,7dimethoxyflavon [3].

Hình 1.1. Công thức hóa học chung của các flavon trong Địa liền đen

4


Bảng 1.1. Các methoxyflavon được phân lập từ thân rễ Địa liền đen
STT Tên chất

R1

R2

R3

R4

R5

1

5- hydroxy- 7- methoxyflavon

H

H

H

H

H

2

5,7- dimethoxyflavon

H

CH3 H

H

H

3

5,4’- dihydroxy- 7- methoxyflavon

H

H

H

OH

H

4

5- hydroxy- 7,4’- dimethoxyflavon

H

H

H

OCH3 H

5

5,7,4’- trimethoxyflavon

H

CH3 H

OCH3 H

6

5-

hydroxy-

7,3’,4’- H

H

OCH3 OCH3 H

trimethoxyflavon
7

5,7,3’,4’- teramethoxyflavon

H

8

5- hydroxy- 3,7- dimethoxyflavon

CH3 H

H

H

H

9

3,5,7- trimethoxyflavon

CH3 CH3 H

H

H

10

5- hydroxy- 3,7,4’- trimethoxyflavon CH3 H

11
12

CH3 OCH3 OCH3 H

H

OCH3 H

3,5,7,4’- tetramethoxyflavon

CH3 CH3 H

OCH3 H

5,3’-dihydroxy-3,7,4’-

CH3 H

OH

OCH3 H

CH3 H

OCH3 OCH3 H

trimethoxyflavon
13

5-hydroxy-3,7,3’,4’tetramethoxyflavon

14

3,5,7,3’,4’- pentamethoxyflavon

CH3 CH3 OCH3 OCH3 H

Bên cạnh nhóm hợp chất methoxyflavon chính, thân rễ Địa liền đen còn
có các hợp chất thuộc nhóm glycosid: Tilianin, tamarixetin 3-O-rutinoside,
syringetin 3-O- rutinoside [9].

5


Hình 1.2. Cấu trúc chung của một số flavonoid khác
Bảng 1.2. Cấu trúc của một số flavonoid của thân rễ địa liền đen
Tên chất

R1

R2

R3

R4

R5

Tilianin

H

Glc

H

OCH3 H

Tamarixetin 3-O- rutinoside

Rha1-6Glc

CH3 OH

Syringetin 3-O- rutinoside

Rha1-6Glc

CH3 OCH3 OH

OCH3 H
OCH3

Glc: β- D- Glucopyranosyl, Rha: α- L- Rhamnopyranosyl
Ngoài các hợp chất nhóm flavonoid, thân rễ Địa liền đen đã được xác
định có một số hợp chất khác như: Tinh dầu, Kaempferiaoside A,
Kaempferiaoside

B,

Glucopyranoside

[7],

2,4,6[9],

trihydroxyacetophenone

β-sitosteroid,

daucosterol

2,4-di-O-β-D[2],

(2R,

3R)-

aromadendrin trimethyl ether [6].
Tinh dầu
Nghiên cứu của nhóm Nuntaree Chaichanawongsaroj và cộng sự về thân
rễ Địa liền đen, kết quả về hàm lượng tinh dầu trong dược liệu chiếm khoảng
0,129 % [8]. Trong nghiên cứu của Supinya Tewtrakul và cộng sự, hàm lượng
tinh dầu trong thân rễ Địa liền đen khoảng 0,2 % [32].

6


Theo Y Pitakpawasutthi và cộng sự trong thân rễ Địa liền đen có chứa
tinh dầu, trong đó các thành phần chính là α-copaene; dauca-5,8-diene;
camphene; β-pinene; borneol; linalool [22].
Một nghiên cứu khác của P Pripdeevech và cộng sự cũng xác định được
32 hợp chất trong tinh dầu và tất cả đều thuộc 2 nhóm là monoterpen,
sesquiterpen. Một số thành phần chính là germacrene D; borneol; β-pinene;

camphene; α-copaene [24].
1.3. Tác dụng sinh học
Kaempferia parviflora Wall. ex Baker đã được chứng minh có nhiều tác
dụng dược lý qua nhiều nghiên cứu khác nhau, đó là: chống viêm [25], [26],
kháng khuẩn, kháng nấm [14], chống dị ứng [32], [34], tác dụng trên mô mỡ
[11], [13], [16], tác dụng trên hệ sinh dục [28], tác dụng trên tim mạch [15],
[31], [36], tác dụng chống ung thư [23].
1.3.1. Tác dụng chống viêm
Dịch chiết thân rễ Địa liền đen (Kaempferia parviflora Wall. ex Baker)
đã được chứng minh có tác dụng chống viêm với khả năng ức chế hoạt động
NO và PGE 2. Cụ thể hơn, quá trình ức chế sản xuất PGE 2 trong tế bào RAW
264.7 cho giá trị IC50= 9,2 µg/ml. Về quá trình ức chế giải phóng ức chế giải
phóng NO, một chất trung gian gây viêm (IC 50= 3,6 µg/ml), các nhà nghiên
cứu đã tiến hành thử nghiệm mô hình chống viêm với các phân đoạn dịch
chiết cloroform và n-hexan ở liều 150 mg/kg. Kết quả cho thấy giảm phù nề ở
3 và 5 giờ sau khi tiêm carrageenan với phần trăm ức chế lần lượt là 25,4 và
25,3%; cao hơn so với lô chứng sử dụng indomethacin ở liều 10 mg/kg là
18,3% sau 3 giờ. Trong khi đó với phân đoạn dịch chiết ethanol, ethyl acetat,
nước cho phần trăm ức chế thấp hơn lần lượt là 12,9; 5,6 và 6,2% [26].

7


1.3.2. Tác dụng kháng nấm
Hoạt tính kháng nấm của thân rễ Địa liền đen Kaempferia parviflora
Wall. ex Baker đã được thử nghiệm đối với các tác nhân gây bệnh cho con
người như vi khuẩn, nấm men, nấm ngoài da, sử dụng đĩa thạch khuếch tán.
Dịch chiết ethanol thể hiện hoạt tính kháng nấm mạnh đối với nấm da với
kích thước vòng tròn kháng nấm từ 10,7-19,8 mm ở nồng độ 2 mg dịch chiết
thân rễ Địa liền đen. Qua nghiên cứu thấy rằng dịch chiết ethanol của thân rễ

Địa liền đen thể hiện hoạt tính kháng nấm mạnh Trichophyton rubrum,
Trichophyton mentagrophytes và Microsporum gypseum với giá trị MIC là
62,5 µg/ml, 125 µg/ml và 250 µg/ml. Trong đó hợp chất 3,5,7trimethoxyflavon có hoạt tính kháng nấm đáng kể với giá trị MIC là 250
µg/ml với ba loài nấm trên [14].
1.3.3. Tác dụng chống dị ứng
Nhóm nghiên cứu của Shoko Kobayashi đã nghiên cứu tác dụng chống
dị ứng của các hợp chất methoxyflavon có trong thân rễ Địa liền đen. Những
hợp chất flavon này đã được nghiên cứu về hoạt tính ức chế giải phóng βHexosaminidase và ức chế hoạt tính β-Hexosaminidase trên tế bào RBL –
2H3. Tác dụng chống dị ứng mạnh khi chống lại sự giải phóng kháng nguyên
hexosaminidase với giá trị IC50= 10,9 µg/ml [41].
1.3.4. Tác dụng trên mô mỡ
Moeko Hidaka và cộng sự đã tiến hành nghiên cứu đánh giá trên mô
hình thí nghiệm chuột mắc bệnh tiểu đường béo phì Tsumura Suzuki (TSOD)
được cho ăn theo 3 chế độ ăn: chế độ ăn tiêu chuẩn (MF) trộn với dịch chiết
ethanol từ thân rễ Địa liền đen Kaempferia parviflora Wall. ex Baker (KPE),
dịch chiết giàu polymethoxyflavonoid từ thân rễ địa liền đen (PMF), dịch
chiết nghèo polymethoxyflavonoid từ thân rễ Địa liền đen Kaempferia
8


parviflora Wall. ex Baker (X). Sau đó đánh giá hiệu quả của ba chế độ ăn này
đối với tổn thương da lão hóa do bức xạ UVB gây ra. Kết quả cho thấy rằng
KPE và PMF làm giảm đáng kể trọng lượng cơ thể chuột và ức chế sự gia
tăng độ dày của lớp mỡ dưới da [11].
1.3.5. Tác dụng trên hệ sinh dục
Trong một nghiên cứu về khả năng ức chế Phosphodiesterase 5 (PDE5 –
một chất có vai trò điều chỉnh nồng độ cGMP) của thân rễ Địa liền đen
Kaempferia parviflora Wall. ex Baker, Prapapan Temkitthawon và cộng sự đã
chỉ ra rằng dịch chiết ethanol từ thân rễ Địa liền đen có khả năng ức chế PDE5
và PDE 6, và nhóm hợp chất có tác dụng này là các polymethoxyflavon. Trong

nhóm hợp chất flavon này, đáng chú ý là hợp chất 5,7- dimethoxyflavon có
khả năng ức chế PDE 5 mạnh nhất (IC50= 10,64µM) và 3,5,7,3’,4’pentamethoxyflavon ức chế PDE 6 mạnh nhất (IC50= 7,83µM) [30].
1.3.6. Tác dụng trên tim mạch
Một nghiên cứu của Tep-arechan và cộng sự đã nghiên cứu ảnh hưởng
của 5,7-dimethoxyflavon (DMF) được phân lập từ thân rễ Địa liền đen
Kaempferia parviflora Wall. ex Baker. Nghiên cứu được thực hiện trên động
mạch chủ của chuột. Kết quả chó thấy sự giãn động mạch chủ của chuột với
nồng độ DMF từ 1 μM đến 100 μM. Tác dụng này giảm đáng kể khi loại bỏ
nội mạc động mạch [31].
1.3.7. Tác dụng chống ung thư
Gần đây có nhiều nghiên cứu về tác dụng chống ung thư của thân rễ Địa
liền đen Kaempferia parviflora Wall. ex Baker. Trong một nghiên cứu của
Saranyapin Potikanond và cộng sự đã chỉ ra rằng dịch chiết thân rễ Địa liền
đen bằng ethanol 95% làm giảm khả năng tồn tại của tế bào HeLa [23].

9


1.3.8. Tác dụng ức chế enzym chuyển hóa ở gan
5,7-dimethoxyflavon (5,7-DMF), một trong những thành phần chính của
thân rễ Địa liền đen Kaempferia parviflora Wall. ex Baker, có tác dụng trực
tiếp ức chế enzym chuyển hóa cytochrome P450 (CYP) 3As [21].
1.4. phương pháp chiết xuất methoxyflavon trong thân rễ Địa liền đen
(Kaempferia parviflora Wall.ex Baker)
Theo các tài liệu tham khảo, methoxyflavon trong thân rễ Địa liền đen
có cấu trúc chứa nhiều nhóm thế methoxyl, không có phần đường nên có tính
chất kém phân cực, tan tốt trong các dung môi hữu cơ kém phân cực. Hợp
chất này thường được chiết trung gian thông qua một dung môi đa năng như
ethanol, methanol bằng phương pháp chiết xuất hồi lưu. Từ dịch chiết trên,
chiết phân bố với các dung môi có độ phân cực tăng dần như n-hexan,

dichloromethan, ethyl acetat … để thu được các phân đoạn giàu
methoxyflavon. Dựa vào kết quả của các nghiên cứu, các phân đoạn giàu
methoxyflavon là dichloromethan, ethylacetat [2], [8], [17].
Ngoài ra, dựa vào tính chất kém phân cực của hợp chất methoxyflavon,
một số nghiên cứu đã chiết methoxyflavon từ thân rễ Địa liền đen bằng
phương pháp chiết xuất siêu tới hạn bằng CO2. Kết quả thu được hiệu suất
chiết thay đổi trong khoảng 1,7%- 2,8%, tỷ lệ thuận với áp suất và nhiệt độ
chiết [37], [38].
1.5. Phương pháp định lượng methoxyflavon trong thân rễ Địa liền đen
(Kaempferia parviflora Wall.ex Baker)
Theo các tài liệu công bố, các hợp chất methoxyflavon trong thân rễ Địa
liền đen được định lượng bằng phương pháp HPLC. Thân rễ Địa liền đen
thường được xác định hàm lượng methoxyflavon bằng cách định lượng đa

10


thành phần. Mẫu được chuẩn bị bằng cách chiết với các dung môi khác nhau
như ethanol, methanol, dicholoromethan.
Toshiaki Azuma và cộng sự đã định lượng methoxyflavon trong thân rễ
Địa liền đen bằng HPLC. Sử dụng cột Mightysil RP-18 GP (5 µm, 4,6 x 250
mm), pha động gồm có acid phosphoric 1% trong nước và methanol. Tốc độ
dòng là 0,8 ml/phút, phát hiện bằng detector UV với bước sóng 330 nm và
thể tích tiêm mẫu là 10 µl. Hàm lượng của các methoxyflavon trong thân rễ
Địa liền đen xác định được trong khoảng 23,9 mg/g đến 61 mg/g [6].
Nghiên cứu định lượng methoxyflavon trong thân rễ Địa liền đen của
nhóm nghiên cứu K. Ninomiya bằng phương pháp HPLC. Sử dụng cột Inertsil
ODS3 C18 (3 µm, 2,1 mm x 100 mm). Pha động gồm pha A (methanol) và
pha B (H2O chứa 0,1% acetic acid). Tốc độ dòng chảy là 0,2 ml/phút, phát
hiện bằng cách đo bước sóng λ 330 nm và thể tích tiêm mẫu là 2 µl. Hàm

lượng các methoxyflavon trong thân rễ Địa liền đen được chiết bằng methanol
xác định được là 61,08 mg/g [20].
Trong một nghiên cứu của Khaetthareeya Sutthanut và cộng sự định
lượng các methoxyflavon trong thân rễ Địa liền đen bằng HPLC với cột C8 (5
µm, 250 mm × 4,6 mm). Thể tích tiêm mẫu là 10 µl. Methoxyflavon được
phát hiện bằng cách đo ở bước sóng λ 254 nm. Pha động gồm pha A là
acetonitril, pha B là Nước. Tốc độ tiêm mẫu thay đổi từ 1,0 ml/phút xuống 0,5
ml/phút trong vòng 60 phút ở nhiệt độ 25°C. Hàm lượng các methoxyflavon
xác định được trong khoảng 40,54 mg/g đến 363,73 mg/g [42].
Nhóm nghiên cứu TsutomuShimada đã định lượng methoxyflavon trong
thân rễ Địa liền đen bằng HPLC với điều kiện sắc ký như sau: cột CD – C18
(4,6 x 250 mm), ổn định ở 500C; pha động có pha A là acid trifluoroacetic 0,5
% trong nước, pha B là acid acetic 0,5 % trong acetonitril chạy theo chương

11


trình gradient dung môi; tốc độ dòng 1 ml/phút; phát hiện bằng cách đo ở
bước sóng λ được dò trong khoảng 250 nm đến 500 nm. Hàm lượng các
methoxyflavon xác định được trong khoảng 0,6 mg/g đến 8,8 mg/g [27].
Bảng 1.3. Các điều kiện định lượng methoxyflavon trong thân rễ Địa
liền đen bằng HPLC
STT

Pha tĩnh

Pha động

Tốc độ Bước sóng TLTK
dòng

phát hiện

1

Mightysil RP-18 GP
(5 µm, 4,6 x 250
mm)
C18 (5 µm, 2 mm ×
50 mm)
C8 (5 µm, 250 mm ×
4,6 mm)

Pha A: acid photphoric 1%
Pha B: MeOH

0,8
330 nm
ml/phút

2
3

4

5

6

Pha A: ACN
Pha B: Acid formic 0,5%

Pha A: ACN
Pha B: Nước cất
A/B: 48/52

0,2
335 nm
ml/phút
1
254 nm
ml/phút
đến 0,5
ml/phút
trong
60 phút
Cột C18 (3 µm, 210 Pha A: methanol,
0,8
330 nm
mm × 100 mm)
Pha B: nước chứa 0,1% acid ml/phút
acetic,
Chương trình gradient: 0 phút
(A/ B = 25:75, v/v), 5–45 phút
(63:37, v/v) , 45–60 phút
(25:75, v/v)
Imtakt Unison UK- Pha A: MeOH/nước cất (1:9) 0,2
260 nm
C18 (3µm 150x 4.6 Pha B: MeOH
ml/phút
mm)
Chương trình gradient: 0–0,01

phút: A/B= 60:40; 0,01–30
phút: A/B= 60:40 – 0:100; 3035 phút: A/B= 0:100; 35-35,01
phút: A/B= 0:100-60:40; 35,0140 phút: A/B= 60:40.

[6]

[18]
[42]

[20]

[12]

Cadenza
CD-C18 Pha A: acid trifluoroacetic 0,5% 1
250 nm – [27]
(4,6 x 250 mm)
trong nước,
ml/phút 500 nm
pha B: acid acetic 0,5% trong
acetonitril,
Chương trình gradient: 0-5 phút
50% B, 5-30 phút 50%-95% B,
30-33 phút 95% B, 33-38 phút
95%-50% B

12


Nhận xét: Từ bảng 2.1 và các tài liệu tham khảo về định lượng

methoxyflavon trong thân rễ Địa liền đen bằng HPLC, chúng tôi nhận thấy
điều kiện sắc ký được dùng để định lượng methoxyflavon trong thân rễ Địa
liền đen như sau:
-

Pha tĩnh: cột sắc ký được dùng là C18 hoặc C8, với kích thước hạt nhồi
thường là 5 µm.

-

Pha động: được sử dụng là MeOH –H3PO4 1%, MeOH - CH3COOH 0,1%
hoặc ACN – H2O, ACN – HCOOH 0,5%, gradient nồng độ.

-

Tốc độ dòng: 0,2 ml/phút, 0,8 ml/phút, 1 ml/phút.

-

Detector: Thường dùng là DAD ở bước sóng λ 254 nm, 260nm, 330 nm,
335 nm.
Do vậy, chúng tôi tiến hành khảo sát các điều kiện sắc ký tương tự như

trên để định lượng methoxyflavon trong thân rễ Địa liền đen bằng phương
pháp HPLC.

13


CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Nguyên liệu và phương tiện nghiên cứu
2.1.1. Nguyên liệu
Mẫu nghiên cứu là thân rễ Địa liền đen, được thu tại tỉnh Thanh Hóa vào
tháng 7 năm 2018. Mẫu được TS. Nguyễn Thế Cường, Phòng Thực vật, Viện
Sinh thái và Tài nguyên Sinh vật giám định tên khoa học là Kaempferia
parviflora Wall. ex Baker, thuộc họ Gừng (Zingiberaceae). Mẫu tiêu bản số
hiệu ND 01 được lưu tại Khoa Hóa Thực vật, Viện Dược liệu. Thân rễ Địa
liền đen được làm nhỏ, sấy khô ở 50 oC, bảo quản trong túi nilon kín để nghiên
cứu thành phần hóa học.
1

2

Hình 2.1. Mẫu nghiên cứu Địa liền đen
Ghi chú: 1: Phần trên mặt đất cây Địa liền đen, 2: Thân rễ Địa liền đen
2.1.2. Phương tiện nghiên cứu
Hóa chất và dung môi:
- Các dung môi dùng để chiết xuất và phân lập: EtOH 96%, nước cất hai lần,
ethyl acetat, n-hexan.

14


- Các dung môi hữu cơ dùng để định lượng bằng phương pháp HPLC.
-

Chất chuẩn: 3,5,7-trimethoxyflavon (1); 3,5,7,4’-tetramethoxyflavon (2)

được phân lập từ mục tiêu 1.
Thiết bị, máy móc, dụng cụ:

- Hệ thống chiết hồi lưu dung tích bình cầu 500 ml.
- Tủ sấy Shellab, tủ sấy chân không Binder.
- Bếp cách thủy Memmert.
- Cồn kế, nhiệt kế.
- Cân phân tích Precisa XT 220A, độ chính xác 0,0001 g.
- Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC (Shimadzu, Nhật Bản): Gồm 2
hệ thống bơm LC–30AD, detector DAD, phần mềm Labsolution để truy xuất
hình ảnh và số liệu trên máy HPLC.
- Dụng cụ thủy tinh: Bình cầu các loại dung tích 50 - 2000ml, ống nghiệm,
cốc có mỏ, bình định mức, ống nghiệm, pipet chính xác.
- Các dụng cụ thí nghiệm khác thuộc Bộ môn Dược liệu - Trường Đại học
Dược Hà Nội.
2.2. Phương pháp nghiên cứu
Đề tài được thực hiện với 2 mục tiêu là: Chiết xuất, phân lập và xác định
được cấu trúc của một số dẫn chất methoxyflavon từ thân rễ Địa liền đen; xác
định được các yếu tố ảnh hưởng đến chiết xuất methoxyflavon từ thân rễ Địa
liền đen. Chúng tôi sử dụng các phương pháp nghiên cứu như sau để thực
hiện các nội dung nghiên cứu.
2.2.1. Phương pháp định tính methoxyflavon bằng sắc ký lớp mỏng

15


+ Mẫu thử: Thân rễ Địa liền đen được chiết hồi lưu bằng dung môi
ethanol ở nhiệt độ 700C trong 60 phút. Cất thu hồi dung môi bằng cô quay áp
suất giảm thu được cắn. Lấy khoảng 1 mg cắn thu được pha với 1 ml
methanol để chấm sắc ký lớp mỏng.
+ Mẫu chuẩn: 3,5,7-trimethoxyflavon (1) và 3,5,7,4’-tetramethoxyflavon
(2).
+ Bản mỏng tráng sẵn DC-Alufolien 60 F254 (Merck, silica gel, 0,25

mm).
+ Hệ dung môi khai triển: n-hexan – ethyl acetat, [6 : 4] .
+ Phát hiện chất bằng đèn tử ngoại ở hai bước sóng 254 nm và 366 nm
hoặc dùng thuốc thử là dung dịch H2SO4 10% trong ethanol 96% hơ nóng để
phát hiện vết chất.
2.2.2. Phương pháp chiết xuất
Dược liệu được chiết với dung môi ethanol 75 % bằng phương pháp
chiết hồi lưu. Phân đoạn dịch chiết bằng các dung môi có độ phân cực tăng
dần như n-hexan, dichloromethan và ethyl acetat.
2.2.3. Phương pháp phân lập
Phân lập các hợp chất trong thân rễ Địa liền đen bằng sắc ký cột mở
(CC) và kết tinh trong hệ dung môi thích hợp; theo dõi các phân đoạn bằng
sắc ký lớp mỏng. Sắc ký cột được tiến hành với chất hấp phụ là silica gel
(0,040-0,063mm, Merck) và C-18. Sắc ký lớp mỏng được thực hiện trên bản
mỏng tráng sẵn DC-Alufolien 60 F254 (Merck, silica gel, 0,25 mm) và bản
mỏng pha đảo RP-18 F254 (Merck, 0,25 mm). Độ tinh khiết của các chất phân
lập được kiểm tra sơ bộ bằng sắc ký lớp mỏng.

16