Nghiên cứu vai trò của gen stua ở nấm sợi aspergillus niger sử dụng phương pháp chuyển gen nhờ vi khuẩn agrobacterium tumefaciens

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
KHOA SINH HỌC
--------------------

Đỗ Thị Bình Xuân Lộc

NGHIÊN CỨU VAI TRÒ CỦA GEN stuA Ở NẤM SỢI
Aspergillus niger SỬ DỤNG PHƢƠNG PHÁP CHUYỂN
GEN NHỜ VI KHUẨN Agrobacterium tumefaciens

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội - 2019


ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
KHOA SINH HỌC
--------------------

Đỗ Thị Bình Xuân Lộc

NGHIÊN CỨU VAI TRÒ CỦA GEN stuA Ở NẤM SỢI
Aspergillus niger SỬ DỤNG PHƢƠNG PHÁP CHUYỂN
GEN NHỜ VI KHUẨN Agrobacterium tumefaciens

Chuyên ngành: Vi sinh vật học
Mã số: 8420101.07

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: TS. Trần Văn Tuấn

Hà Nội - 2019


Luận văn tốt nghiệp

Đỗ Thị Bình Xuân Lộc

LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành luận văn thạc sĩ của mình, em xin gửi lời cảm ơn chân thành
và sâu sắc nhất tới TS. Trần Văn Tuấn - Trưởng bộ môn Vi sinh vật học, Trưởng
Phòng Genomic, Phòng thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Enzym và Protein,
Trường Đại học Khoa học Tự nhiên - Đại học Quốc gia Hà Nội, người đã dày công
hướng dẫn, chỉ dạy tận tình, luôn động viên và tạo mọi điều kiện tốt nhất cho em
trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu.
Em xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo và các thành viên Phòng thí nghiệm
Trọng điểm Công nghệ Enzym và Protein đã giúp đỡ, cung cấp cơ sở vật chất và tạo
điều thuận lợi cho em hoàn thành tốt nghiên cứu của mình. Luận văn được thực
hiện với sự hỗ trợ kinh phí từ đề tài của Quỹ NAFOSTED, mã số 106.04-2018.36.
Em cũng vô cùng biết ơn các thầy cô Bộ môn Vi sinh vật học và Khoa Sinh
học - Trường Đại học Khoa học Tự nhiên - Đại học Quốc gia Hà Nội đã nhiệt tình
chỉ bảo, truyền đạt những kiến thức quý báu và giúp đỡ em trong quá trình học tập.
Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn gia đình, bạn bè và các thành viên phòng
Genomic đã khích lệ, giúp đỡ em trong suốt quá trình thực hiện luận văn và trong
cuộc sống.
Em xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 18 tháng 06 năm 2019

Học viên

Đỗ Thị Bình Xuân Lộc


Luận văn tốt nghiệp

Đỗ Thị Bình Xuân Lộc

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
AS

Acetosyringone

ATMT

Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation

bp

Base pair

CD

Czapek-Dox

DNA

Deoxyribonucleic acid

IM

Induction medium (Môi trường cảm ứng)

kb

Kilobase

Mb

Megabase

kDa

Kilodalton

LB

Luria- Bertani/Left Border

PCR

Polymerase chain reaction

PDA

Potato dextrose agar

RB

Right Border

SDS

Sodium dodecyl sulfate


Luận văn tốt nghiệp

Đỗ Thị Bình Xuân Lộc

DANH MỤC BẢNG
Trang
Bảng 2.1. Danh sách các chủng vi sinh vật và vector dùng trong nghiên cứu

25

Bảng 2.2. Các thiết bị sử dụng trong nghiên cứu

26

Bảng 2.3. Các cặp mồi dùng trong nghiên cứu

28


Luận văn tốt nghiệp

Đỗ Thị Bình Xuân Lộc

DANH MỤC HÌNH
Trang
Hình 1.1. Hình thái nấm sợi A. niger trên đĩa và dưới kính hiển vi

4

Hình 1.2. Quá trình phát triển của A. niger được theo dõi dưới kính hiển vi
điện tử quét

5

Hình 1.3. So sánh các nhóm protein chức năng ở A. niger với một số loài
nấm khác

7

Hình 1.4. Vi khuẩn A. tumefaciens dưới kính hiển vi điện tử và cấu trúc
của Ti plasmid

13

Hình 1.5. Sơ đồ hệ thống vector nhị thể dùng cho ATMT

14

Hình 1.6. Sơ đồ cơ chế của phương pháp ATMT

15

Hình 1.7. Hình thái cuống sinh bào tử ở A. nidulans hoang dại (WT) và

đột biến stuA

23

Hình 3.1. Sự tương đồng của stuA giữa các loài Aspergillus khác nhau

41

Hình 3.2. Mức độ mẫn cảm kháng sinh của của A. niger N402 với kháng sinh
hygromycin và clonNAT ở các nồng độ khác nhau

42

Hình 3.3. Sơ đồ tạo cấu trúc xóa gen stuA ở A. niger sử dụng marker kháng
kháng sinh

43

Hình 3.4. PCR xác nhận 5 khuẩn lạc A. tumefaciens

45

Hình 3.5. Sơ đồ chuyển cấu trúc vector xóa gen stuA vào chủng A. niger
N402 bằng phương pháp ATMT

46

Hình 3.6. Sàng lọc và PCR xác nhận các thể chuyển cấu trúc xóa gen stuA ở
A. niger

48


Luận văn tốt nghiệp

Đỗ Thị Bình Xuân Lộc

Hình 3.7. Sơ đồ tạo cấu trúc xóa gen stuA ở A. niger sử dụng marker trợ dưỡng

50

Hình 3.8. Chuyển cấu trúc và xác nhận chủng xóa gen stuA sử dụng marker trợ
dưỡng ở A. niger

52

Hình 3.9. Tạo cấu trúc và xác nhận phục hồi stuA ở A. niger

54

Hình 3.10. Hình thái, hệ sợi và cấu trúc cuống sinh bào tử của các chủng
A. niger nghiên cứu

56

Hình 3.11. Khả năng sinh trưởng của các chủng A. niger trên các nguồn
cacbon khác nhau

58

Hình 3.12. Khả năng sinh trưởng của các chủng A. niger trên các nguồn nitơ
khác nhau

60

Hình 3.13. Khả năng đáp ứng stress của các chủng A. niger

61

Hình 3.14. Tăng nhiệt độ giúp phục hồi một phần khả năng hình thành bào tử
ở chủng xóa gen stuA

64

Hình 3.15. Khả năng sinh axit hữu cơ của các chủng A. niger

65

Hình 3.16. Khả năng sinh enzym cellulase của các chủng A. niger

66

Hình 3.17. Khả năng gây hỏng quả sau thu hoạch của các chủng A. niger

67


Luận văn tốt nghiệp

Đỗ Thị Bình Xuân Lộc

MỤC LỤC
MỞ ĐẦU ....................................................................................................................1
Chƣơng 1. TỔNG QUAN .........................................................................................3
1.1. Tổng quan về nấm sợi Aspergillus niger ..........................................................3
1.1.1. Lịch sử nghiên cứu và đặc điểm sinh học của nấm sợi A. niger ................3
1.1.2. Đặc điểm di truyền của nấm sợi A. niger ...................................................6
1.1.3. Vai trò của nấm sợi A. niger.......................................................................8
1.2. Phương pháp chuyển gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens ..11
1.2.1. Giới thiệu về vi khuẩn A. tumefaciens .....................................................12
1.2.2. Cơ chế chuyển gen vào nấm thông qua vi khuẩn A. tumefaciens ............14
1.2.3. Marker chọn lọc dùng cho chuyển gen vào nấm......................................16
1.2.4. Ưu, nhược điểm của phương pháp ...........................................................18
1.2.5. Triển vọng của phương pháp ATMT trong nghiên cứu chức năng gen...20
1.3. Tổng quan về gen stuA ...................................................................................21
1.3.1. Giới thiệu về gen stuA ..............................................................................21
1.3.2. Vai trò của gen stuA ở nấm sợi ................................................................22
Chƣơng 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP .......................................................25
2.1. Nguyên liệu .....................................................................................................25
2.1.1. Chủng vi sinh vật và vector ......................................................................25
2.1.2. Hóa chất và trang thiết bị .........................................................................25
2.1.3. Môi trường nuôi cấy .................................................................................27
2.1.4. Các cặp mồi PCR .....................................................................................28
2.2. Phương pháp nghiên cứu ................................................................................30
2.2.1. Thu nhận bào tử nấm ................................................................................30


Luận văn tốt nghiệp

Đỗ Thị Bình Xuân Lộc

2.2.2. Tách chiết DNA hệ gen ............................................................................30
2.2.3. Thành phần của phản ứng PCR ................................................................31
2.2.4. Đánh giá mức độ mẫn cảm kháng sinh của A. niger ................................32
2.2.5. Tạo các vector nhị thể dùng cho chuyển gen ...........................................32
2.2.6. Chuyển gen vào nấm sợi A. niger thông qua vi khuẩn A. tumefaciens ....35
2.2.7. Điều tra vai trò của gen stuA ở nấm sợi A. niger .....................................37
Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................................40
3.1. Protein mã hóa bởi gen stuA có mức độ tương đồng cao trong chi Aspergillus
và Penicillium ........................................................................................................40
3.2. Xóa thành công gen stuA ở nấm sợi Aspergillus niger sử dụng marker kháng
kháng sinh ..............................................................................................................42
3.2.1. Đánh giá mức độ mẫn cảm kháng sinh của A. niger N402 ......................42
3.2.2. Tạo thành công cấu trúc xóa gen stuA......................................................43
3.2.3. Xóa gen stuA ở A. niger sử dụng marker kháng kháng sinh ....................44
3.3. Xóa thành công gen stuA ở A. niger sử dụng marker trợ dưỡng pyrG ...........49
3.3.1. Tạo cấu trúc xóa gen stuA sử dụng marker trợ dưỡng pyrG ....................49
3.3.2. Xóa gen stuA ở A. niger sử dụng marker trợ dưỡng pyrG từ A. oryzae ...51
3.4. Phục hồi thành công gen stuA ở chủng xóa gen .............................................53
3.5. Điều tra vai trò của gen stuA ở nấm sợi A. niger ............................................55
3.5.1. Gen stuA ảnh hưởng đến hình thái, cấu trúc cuống sinh bào tử của A.
niger ....................................................................................................................55
3.5.2. Gen stuA ảnh hưởng đến khả năng sinh trưởng của A. niger trên các
nguồn cacbon khác nhau ....................................................................................57
3.5.3. Gen stuA ảnh hưởng đến khả năng sinh trưởng của A. niger trên các
nguồn nitơ khác nhau .........................................................................................59


Luận văn tốt nghiệp

Đỗ Thị Bình Xuân Lộc

3.5.4. Gen stuA ảnh hưởng đến khả năng đáp ứng stress của A. niger ..............61
3.5.5. Nhiệt độ giúp phục hồi một phần khả năng hình thành bào tử ở chủng A.
niger xóa gen stuA ..............................................................................................63
3.5.6. Gen stuA ảnh hưởng đến khả năng sinh axit hữu cơ của A. niger ...........66
3.5.7. Gen stuA ảnh hưởng đến khả năng sinh enzym cellulase của A. niger ....67
3.5.8. Gen stuA ảnh hưởng đến khả năng gây hỏng quả sau thu hoạch của A.
niger ....................................................................................................................67
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................................................70
TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................71
PHỤ LỤC .................................................................................................................... i


Luận văn tốt nghiệp

Đỗ Thị Bình Xuân Lộc

MỞ ĐẦU
Aspergillus niger là một trong những loài phổ biến và quan trọng nhất thuộc
chi Aspergillus. Loài nấm này có thể được tìm thấy khắp nơi trên Trái Đất, từ đất,
thức ăn, các sản phẩm thực vật và ngay cả trong không khí. A. niger đã được Cục
quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Hoa Kỳ (FDA) công nhận là an toàn và sản
phẩm do nó sinh ra được sử dụng phổ biến trong công nghệp thực phẩm và đồ uống.
A. niger có khả năng tiết nhiều loại enzym vào môi trường nuôi cấy, do đó loài nấm
này được ứng dụng rộng rãi trong sản xuất các axit hữu cơ và các enzym ngoại bào,
điển hình là axit citric, axit gluconic, các enzym quan trọng như phytase, amylase,
protease, α-galactosidae và hàng loạt các enzym khác.
Nghiên cứu chức năng gen ở nấm sợi đã có những bước tiến lớn trong những
năm gần đây. Năm 1998, phương pháp chuyển gen thông qua vi khuẩn

Agrobacterium tumefaciens được áp dụng thành công lần đầu tiên ở nấm sợi.
Phương pháp này với ưu điểm là đơn giản, dễ thực hiện, chi phí thấp, áp dụng được
trên nhiều loại nấm khác nhau làm cho phương pháp này trở thành một công cụ hữu
hiệu trong các thí nghiệm nghiên cứu tạo đột biến gen đích và điều tra chức năng
gen ở nấm sợi. Xóa gen theo cơ chế tái tổ hợp tương đồng là giải pháp toàn diện để
điều tra và đánh giá một cách cụ thể chức năng của gen, đồng thời cho phép quan
sát kiểu hình liên quan đến gen đã bị xóa một cách chính xác.
Gần đây, hệ gen của A. niger đã được giải trình tự hoàn toàn, những dữ liệu
thu được đã hỗ trợ tích cực cho các nghiên cứu về cải biến di truyền để điều tra vai
trò của các gen mong muốn. Gen stuA là gen chủ chốt của quá trình phát triển và
biệt hóa tế bào, hình thành bào tử, hình thành sợi, trao đổi chất bậc một và trao đổi
chất bậc hai. Vai trò của gen stuA đã được nghiên cứu ở nhiều nấm sợi khác như
Aspergillus fumigatus, Aspergillus nidulans, Acremonium chrysogenum… Tuy
nhiên, vai trò của gen này ở A. niger vẫn chưa được điều tra. Do đó, đề tài luận văn
với tiêu đề: ―Nghiên cứu vai trò của gen stuA ở nấm sợi Aspergillus niger sử

1


Luận văn tốt nghiệp

Đỗ Thị Bình Xuân Lộc

dụng phƣơng pháp chuyển gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens‖ được
xây dựng và thực hiện với những nội dung chính như sau:
-

Xóa gen stuA ở A. niger sử dụng phương pháp chuyển gen nhờ vi khuẩn A.
tumefaciens và marker chọn lọc là gen kháng kháng sinh hoặc gen trợ
dưỡng uridine/uracil.

-

Phục hồi sự biểu hiện của gen stuA ở chủng A. niger đột biến đã xóa gen
stuA.

-

Điều tra, so sánh đặc điểm sinh lý, sinh hóa của chủng A. niger xóa gen
stuA so với chủng nấm gốc và chủng phục hồi.

2


Luận văn tốt nghiệp

Đỗ Thị Bình Xuân Lộc

Chƣơng 1. TỔNG QUAN
1.1. Tổng quan về nấm sợi Aspergillus niger
1.1.1. Lịch sử nghiên cứu và đặc điểm sinh học của nấm sợi A. niger
Chi Aspergillus là một chi nấm sợi gồm hàng trăm loài phân bố ở các điều
kiện khí hậu khác nhau trên toàn thế giới, bao gồm một số tác nhân gây bệnh cơ hội
(A. fumigatus, A. terreus), sản xuất độc tố (A. flavus, A. parasiticus) và các loài
được ứng dụng rộng rãi trong sản xuất công nghiệp như A. aculeatus, A. oryzae,
trong đó nổi bật hơn cả là A. niger [58, 87]. Năm 1867, lần đầu tiên A. niger được
mô tả bởi nhà thực vật học người Pháp Philippe Edouard Léon van Tieghem trong
bản thảo ―Physiologie des mucédinées”. Khi đó, ông phân lập được Aspergillus sp.
có bào tử tương tự như Aspergillus glaucus nhưng có màu đen trên các môi trường
khác nhau, tạo ra mùi mốc và một số đặc điểm khác. Ông đã đặt tên cho loài nấm

này là A. niger [30]. A. niger thuộc giới nấm, ngành Ascomycota, lớp
Euascomycetes, bộ Eurotiales, họ Trichocomaceae, chi Aspergillus, nhóm
Aspergillus phân nhóm Nigri hay tên gọi khác là phân nhóm Aspergillus đen [45].
A. niger phân bố rộng rãi trên toàn thế giới, nó có thể được phân lập trên tất
cả các châu lục và không có sự chọn lọc nào với điều kiện môi trường, chúng sinh
trưởng một cách tự nhiên trên vật chất hữu cơ [92]. Loài nấm này phát triển mạnh
trong đất và rác, phân compost và nguyên liệu thực vật đang phân rã, thậm chí có
thể được tìm thấy trong môi trường băng giá và môi trường biển. A. niger là vi sinh
vật hiếu khí, sinh trưởng và phát triển khi có mặt oxy. Chúng có thể sinh trưởng ở
các điều kiện môi trường đa dạng từ nhiệt độ đến pH. A. niger phát triển ở nhiệt độ
từ 6 - 47°C, tối ưu ở khoảng 35 - 37°C. Nó có thể sống sót ở 60°C nhưng sẽ bị loại
bỏ ở 63°C trong vòng 25’. Khoảng pH cho phép A. niger sinh trưởng rất rộng, từ
1,5 - 9,8 và tối ưu nhất là ở pH = 6 [7, 41, 57].

3


Luận văn tốt nghiệp

Đỗ Thị Bình Xuân Lộc

Hình 1.1. Hình thái nấm sợi A. niger trên đĩa và dưới kính hiển vi [43, 120]
(A) Hình thái khuẩn lạc trên đĩa thạch, (B) Mép ngoài khuẩn lạc, (C) Trung
tâm khuẩn lạc, (D) Hình thái hiển vi của cuống sinh bào tử. (E) Bào tử của nấm sợi
A. niger dưới kính hiển vi. Thanh tỉ lệ = 10 µm
Ở 30°C, đường kính khuẩn lạc của A. niger tăng khoảng 0,25 mm trong vòng
1 giờ với điều kiện dư thừa chất dinh dưỡng. Hình ảnh dưới kính hiển vi điện tử
quét cho thấy rằng vùng mép ngoài của khuẩn lạc A. niger 7 ngày tuổi chỉ gồm một
lớp sợi nấm duy nhất. Một vài milimet phía trong vùng ngoại vi thì hệ sợi dày hơn
và có thể lên đến sáu lớp sợi nấm chồng lên nhau. Sáu lớp sợi nấm này chia thành 3

lớp riêng biệt: lớp trên cùng, lớp dưới cùng và các lớp ở giữa gồm mạng lưới hệ sợi
mỏng và dày. Cấu trúc hệ sợi với ba lớp riêng biệt cũng được quan sát thấy ở trung
tâm của khuẩn lạc [47].

4


Luận văn tốt nghiệp

Đỗ Thị Bình Xuân Lộc

Hình 1.2. Quá trình phát triển của A. niger được theo dõi dưới kính hiển vi điện tử
quét [47]
(A) Sợi nấm khí sinh tương tự với sợi nấm sinh dưỡng. (B) Sợi nấm khí sinh dày
hơn loại (A) 2 - 3 lần. (C, D) Đỉnh sợi khí sinh phồng lên để tạo thành bọng bào tử.
(E) Các chồi hình thành trên các bọng bào tử. (F, G) Chồi phát triển thành thể bình
sơ cấp. (H) Thể bình thứ cấp hình thành trên đỉnh của thể bình thứ cấp. (I, J) Các
chuỗi bào tử được tạo thành trên thể bình thứ cấp. Thanh tỷ lệ từ hình A-F tương tự
như hình G
Sau thời kì tăng trưởng sinh dưỡng, A. niger tạo thành hai loại sợi nấm khí
sinh. Một loại khá giống với sợi nấm sinh dưỡng và có đường kính khoảng 2 - 3
µm, loại còn lại có đường kính khoảng 6 - 7 µm. Các sợi nấm khí sinh đường kính 2
- 3 µm của được hình thành sau khi cấy bào tử trên môi trường đầy đủ khoảng 8
giờ. Mặc dù thời gian hình thành sợi nấm khí sinh dường như không phụ thuộc vào
môi trường nuôi cấy nhưng mật độ của chúng trên môi trường tối thiểu thấp hơn so

5


Luận văn tốt nghiệp

Đỗ Thị Bình Xuân Lộc

với môi trường đầy đủ. Sự hình thành của hệ sợi khí sinh bắt đầu ở trung tâm khuẩn
lạc, di chuyển ra ngoài và dừng lại khi cách mép hệ sợi nấm vài milimet. Điều này
có nghĩa rằng khả năng hệ sợi hình thành hệ sợi khí sinh sẽ nhanh hơn khi khuẩn lạc
già hơn [4].
Quá trình sinh trưởng khí sinh đã được đề xuất là liên quan đến tín hiệu mật
độ tế bào của sợi nấm sinh dưỡng [112, 114]. Phân tử tín hiệu sẽ cảm ứng gen kị
nước. Những gen này mã hóa protein làm giảm sức căng bề mặt nước để cho phép
sợi nấm xuyên qua mặt phân cách để phát triển trong không khí và làm cho các cấu
trúc như cấu trúc sinh bào tử và bào tử có tính kị nước. Tính kị nước này đảm bảo
rằng cấu trúc sinh sản không rơi trở lại cơ chất trong điều kiện ẩm ướt và giúp bào
tử phân tán bằng gió hoặc vector. Tuy nhiên, những protein kị nước nào được tiết
vào môi trường nuôi cấy để làm giảm sức căng bề mặt vẫn chưa được biết đến [111,
113].
A. niger cũng như phần lớn các loài thuộc chi Aspergillus được biết mới chỉ
có hình thức sinh sản vô tính với cấu trúc sinh bào tử khá đặc trưng [5]. Cấu trúc
sinh bào tử được biệt hóa từ cuống sinh bào tử. Cuống sinh bào tử đầu tiên của A.
niger hình thành sau 10 giờ và cấu trúc sinh bào tử hình thành sau 20 giờ nuôi cấy ở
30°C. Khi cuống sinh bào tử đạt đến chiều cao tối đa của nó, phần đỉnh sợi sẽ
phồng lên và hình thành bọng bào tử có đường kính 10 μm. Trên các bọng bào tử
này sẽ hình thành các chồi, từ đó phát triển thành thể bình. Thể bình gồm hai lớp,
lớp thể bình sơ cấp hình tam giác cân ngược, lớp thể bình thứ cấp hình chai; bào tử
đính xòe ra, hình cầu xù xì, màu nâu đen đến đen than, đường kính 4 - 5 µm [27].
Các chuỗi bào tử đính được tạo thành trên thể bình thứ cấp và có tới hơn 10000 bào
tử có thể được tạo ra từ một cấu trúc sinh bào tử [47].
1.1.2. Đặc điểm di truyền của nấm sợi A. niger
Kích thước hệ gen của A. niger ước tính vào khoảng từ 35,5 - 38,5 megabase
(Mb) gồm tám nhiễm sắc thể có kích thước khác nhau, dao động từ 3,5 - 6,6 Mb.

6


Luận văn tốt nghiệp

Đỗ Thị Bình Xuân Lộc

Năm 2007, trình tự toàn bộ hệ gen của chủng A. niger CBS 513.88 đã được công bố
và dữ liệu hệ gen được lưu trữ tại .

Hình 1.3. So sánh các nhóm protein chức năng ở A. niger với một số loài nấm khác
[79]. Sce, Saccharomyces cerevisiae; Mgi, Magnaporthe grisea; Ncr, Neurospora
crassa; Sno, Stagonospora nodulum; Ani, Aspergillus nidulans; Afu, Aspergillus
fumigatus; Aor, Aspergillus oryzae; Ang, Aspergillus niger. Chuyển hóa (01):
chuyển hóa cacbon và hợp chất carbohydrate (01.05), chuyển hóa lipit, axit béo và
isoprenoid (01.06), chuyển hóa thứ cấp (01.20). Vận chuyển nội bào (08): vận
chuyển bằng bóng bào (08.07), vận chuyển ngoại bào, xuất bào và quá trình tiết
(08.16), nhập bào (08.19). Số phận protein (06): quá trình tiết protein và số phận
(06.04) và vận chuyển nội bào (06.07). Độ dài của các thanh tỷ lệ thuận với số
lượng gen trong mỗi nhóm.
Kích thước hệ gen của chủng CBS 513.88 là 33,9 Mb; gồm 14165 gen được
dự đoán là mã hóa cho protein. Trong đó, khoảng 6505 protein có thể thuộc các
nhóm protein chức năng liên quan đến chuyển hóa, vận chuyển nội bào và số phận
(cuộn gập, chỉnh sửa và hướng đích) của protein [79]. Số lượng dữ liệu phong phú
thu được từ các trình tự hệ gen của A. niger sẽ được sử dụng cho các chương trình
nghiên cứu cơ bản và ứng dụng, phát triển quy trình lên men, hình thái và khả năng
gây bệnh [8].
Một so sánh chi tiết về các nhóm protein chức năng đã được thực hiện giữa
A. niger và một số loài nấm sợi khác (Hình 1.3). Kết quả cho thấy, so với các loài

nấm sợi khác, A. niger chứa một lượng đáng kể các protein đặc trưng liên quan đến

7


Luận văn tốt nghiệp

Đỗ Thị Bình Xuân Lộc

chuyển hóa các hợp chất cacbon, cacbohydrate, lipit, axit béo, isoprenoid và chuyển
hóa thứ cấp. Trong khi đó, số lượng protein đặc trưng liên quan đến vận chuyển tế
bào, quá trình tiết và số phận của protein là khá ổn định giữa các loài nấm sợi khác
nhau. Như vậy, A. niger rõ ràng có thể sử dụng bộ máy tiết protein của nó một cách
rất hiệu quả và linh hoạt như một nhà máy tế bào đầy triển vọng cho ngành công
nghiệp công nghệ sinh học [79].
1.1.3. Vai trò của nấm sợi A. niger
Aspergillus niger là một trong những vi sinh vật quan trọng nhất được sử
dụng rộng rãi trong công nghệ sinh học để sản xuất công nghiệp phụ gia thực phẩm,
axit hữu cơ và các enzym ngoại bào [9, 92]. A. niger sử dụng an toàn và có lịch sử
lâu đời trong sản xuất enzym và axit hữu cơ. Nhiều sản phẩm trong số này được
công nhận là an toàn (GRAS) bởi cục quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Hoa Kỳ
(FDA) [92].
Sản xuất axit hữu cơ có một vị trí quan trọng trong sản xuất công nghệ sinh
học của hóa chất hàng hóa – hóa chất được sản xuất với quy mô rất lớn để đáp ứng
thị trường toàn cầu. Một số axit hữu cơ hiện đang được sản xuất thông qua các quá
trình công nghệ sinh học sử dụng các chủng A. niger như axit citric hay axit
gluconic. Năm 1784, axit citric được phân lập lần đầu tiên từ nước chanh bởi nhà
hóa học người Thụy Điển Carl Scheele. Axit này được sản xuất thương mại đầu tiên
ở Anh sử dụng chanh nhập khẩu từ Ý vào khoảng năm 1826. Nước chanh vẫn là
nguồn sản xuất axit citric thương mại cho đến khi A. niger được sử dụng để sản xuất

axit citric trong công nghiệp lần đầu tiên vào năm 1919 ở Bỉ. Từ đó đến nay, A.
niger vẫn là vi sinh vật sản xuất công nghiệp axit citric hàng đầu mặc dù nhiều loài
khác cũng được sử dụng để sản xuất axit này như A. wentii, A. awamori, A. foetidus,
Candida lipolytica, C. tropicalis, C. guilliermondii, ... [75]. Axit citric (kí hiệu
thương mại là E330) với sản lượng toàn cầu đạt tới 2 triệu tấn/năm, được sử dụng
như là chất tạo hương vị và chất bảo quản trong thực phẩm và nước giải khát công
nghiệp, làm giảm độ ngọt trong các sản phẩm như bánh kẹo, các loại nước ép trái

8


Luận văn tốt nghiệp

Đỗ Thị Bình Xuân Lộc

cây, mứt, thạch và nhiều mặt hàng khác [90]. Trong công nghiệp dược phẩm, axit
citric được sử dụng như một chất bảo quản để lưu trữ máu và trong các ngành công
nghiệp mỹ phẩm được sử dụng như một bộ đệm và chất chống oxy hóa [85].
Một axit hữu cơ khác cũng được sản xuất thương mại bởi A. niger là axit
gluconic. Axit gluconic với sản lượng toàn cầu hằng năm ước tính khoảng 100000
tấn, được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực công nghiệp và trong gia đình.
Axit gluconic được sử dụng làm chất phụ gia trong thực phẩm (kí hiệu thương mại
là E574) và đặc biệt trong các chế phẩm dược phẩm rất tinh khiết. Axit gluconic
được dùng như một chất tạo phức giúp làm sạch kim loại trong ngành công nghiệp
sữa, làm sạch bề mặt trong chất tẩy rửa, khử kiềm trong ngành luyện kim và chống
lắng đọng sắt trong ngành công nghiệp dệt và là một tác nhân tạo phức cho việc
khai thác các ion như canxi, đồng và sắt. Hơn nữa, muối natri của axit gluconic có
thể được sử dụng như một chất phụ gia trong hỗn hợp xi măng trong ngành xây
dựng, tăng cường tính ổn định của xi măng trong điều kiện khí hậu khắc nghiệt [6].
Ngoài ra, A. niger cũng được cho là nhà máy tế bào thích hợp để sản xuất các axit

hữu cơ khác, chẳng hạn như axit lactic và axit itaconic [23, 49].
Trong môi trường sống tự nhiên, các chủng A. niger tiết ra một lượng lớn các
enzym cần thiết để giải phóng các chất dinh dưỡng từ các chất sinh học. Khả năng
bài tiết cao này được khai thác ở cả ngành công nghiệp lên men rắn và lên men
chìm [74]. A. niger chiếm gần 95% sản lượng thương mại của các enzym [27]. Các
enzym từ A. niger được sử dụng trong các ngành công nghiệp chế biến tinh bột, làm
bánh, sản xuất đồ uống có cồn và nước giải khát, trong thức ăn gia súc và trong
ngành công nghiệp giấy và bột giấy. Hơn nữa, A. niger được sử dụng làm vật chủ để
sản xuất các protein ngoại lai [80].
Phytate là dạng lưu trữ chính của phốt pho và chiếm hơn 80% tổng phospho
trong ngũ cốc và các loại đậu – nguyên liệu chính của thức ăn chăn nuôi. Tuy nhiên,
những động vật dạ dày đơn như lợn và gia cầm lại không có khả năng sử dụng
phospho dưới dạng phytate. Điều này dẫn đến ô nhiễm phospho ở các khu vực có

9


Luận văn tốt nghiệp

Đỗ Thị Bình Xuân Lộc

ngành chăn nuôi phát triển vì gần như toàn bộ lượng phospho dạng phytate trong
khẩu phần ăn của các loài này sẽ bài tiết ra ngoài môi trường. Hơn nữa, phytate có
thể hình thành các phức không tan với khoáng kim loại và có thể là protein, gây nên
hiện tượng kháng dinh dưỡng và ngăn cản sự hấp thu các chất dinh dưỡng này [34].
Để phân giải phytate, cần phải có sự xúc tác của enzym phytase. Phytase xúc tác
cho phản ứng thủy phân phytate thành myo-inositol và một số gốc phosphate vô cơ.
Thức ăn chăn nuôi có bổ sung phytase không những giúp cải thiện hiệu quả hấp thu
lượng phospho và một số thành phần khác có sẵn trong thức ăn mà còn giúp giảm
thiểu ô nhiễm môi trường [48]. Có nhiều báo cáo về sản xuất enzym phytase từ vi

sinh vật; trong đó phytase có nguồn gốc từ nấm mốc, đặc biệt là A. niger được sử
dụng rộng rãi trong thức ăn chăn nuôi do enzym có khả năng chịu axit và cho năng
suất cao hơn [10, 106].
Ứng dụng đa năng nhất của A. niger là trong việc sản xuất thương mại các
enzym dùng trong công nghệ thực phẩm. Amylase có nguồn gốc từ A. niger được
sử dụng cho quá trình thủy phân tinh bột trong sản xuất bánh mì, sản xuất bia,
chưng cất, dệt, thuộc da và công nghiệp dược phẩm [73, 84]. Enzym protease từ A.
niger được ứng dụng trong nhiều ngành công nghiệp khác nhau như chất tẩy rửa,
thực phẩm, dược phẩm, da thuộc, lụa và thu hồi bạc từ các phim X-quang đã qua sử
dụng [94]. Loài nấm sợi này còn sản sinh nhiều enzym có lợi khác như αgalactosidase là thành phần chính của thuốc chống đầy hơi; glucose oxidase ứng
dụng trong chẩn đoán lượng glucose tự do trong dịch cơ thể, trong nguyên liệu thực
vật và trong công nghiệp thực phẩm [81]. Ngoài ra, A. niger còn có khả năng tổng
hợp hàng loạt enzym khác như pectinase, cellulase, xylanase, lipase, mannanase, …
[53, 54, 70, 88].
A. niger thể hiện sự trao đổi chất rất linh hoạt, chúng có thể sinh trưởng trên
một loạt các cơ chất trong các điều kiện môi trường khác nhau. A. niger là một
thành viên của quần xã vi sinh vật trong đất và chúng đóng vai trò quan trọng trong
chu trình chuyển hóa vật chất toàn cầu. Loài nấm này là vi sinh vật hoại sinh, chúng

10


Luận văn tốt nghiệp

Đỗ Thị Bình Xuân Lộc

tiết các enzym thủy phân và oxy hóa tham gia vào sự phân hủy của thực vật. Khả
năng phân giải một loạt các chất lạ sinh học (xenobiotics) thông qua các phản ứng
oxy hóa, hydroxyl hóa và methyl hóa khác nhau của A. niger cho thấy tiềm năng sử
dụng chúng trong phục hồi sinh học (bioremediation) [82].

Bên cạnh đó, A. niger cũng là một sinh vật mô hình quan trọng đối với một
số các lĩnh vực nghiên cứu quan trọng bao gồm nghiên cứu tiết protein ở sinh vật
nhân chuẩn nói chung, ảnh hưởng của các yếu tố môi trường khác nhau đến việc ức
chế hoặc kích hoạt sản sinh các loại enzym phân hủy sinh khối khác nhau hay cơ
chế phân tử quan trọng của quá trình lên men và các cơ chế liên quan trong kiểm
soát hình thái nấm [8].
1.2. Phƣơng pháp chuyển gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens
Nấm sợi được sử dụng rộng rãi trong công nghệ sinh học như các nhà máy tế
bào để sản xuất hóa chất, dược phẩm và enzym. Để tăng cường năng lực sinh tổng
hợp của chúng, việc cải biến di truyền nấm sợi sử dụng kỹ thuật di truyền được xem
là phương pháp tiếp cận đầy triển vọng và có ý nghĩa thực tiễn cao. Nhiều phương
pháp chuyển gen khác nhau đã được xây dựng và phát triển cho các loài nấm sợi
quan trọng, trong đó phổ biến nhất gồm chuyển gen bằng tế bào trần, điện biến nạp
và chuyển gen thông qua vi khuẩn A. tumefaciens [59].
Chuyển gen bằng tế bào trần sử dụng CaCl2/polyethylene glycol (PEG)
thường xảy ra trong thời gian ủ 15 - 30 phút ở nhiệt độ phòng với sự hiện diện của
10 - 50 mM CaCl2 và nồng độ PEG cao. Điện biến nạp thường được sử dụng để
chuyển gen bằng tế bào trần, đôi khi bào tử nảy mầm cũng được sử dụng. Trong
điện biến nạp, tế bào trần hoặc bào tử được tiếp xúc với xung điện cao thế trong
thời gian rất ngắn (vài phần nghìn giây) tạo ra các lỗ thủng tạm thời giúp cho các
phân tử DNA ngoại lai từ môi trường có thể xâm nhập vào bên trong tế bào. Mặc dù
được sử dụng rộng rãi nhưng hạn chế lớn của các phương pháp này là chúng đòi hỏi
phải chuẩn bị tế bào trần với quy trình phức tạp, sử dụng enzym đắt tiền, hơn nữa tế
bào trần phải được sử dụng ngay sau khi chuẩn bị [51, 55].

11


Luận văn tốt nghiệp

Đỗ Thị Bình Xuân Lộc

Năm 1995, phương pháp chuyển gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium
tumefaciens (ATMT) lần đầu tiên được công bố ở nấm men Saccharomyces
cerevisiae và năm 1998 đã áp dụng thành công trên nấm sợi lần đầu tiên [25].
Phương pháp ATMT tỏ ra có nhiều ưu điểm vượt trội hơn so với các phương pháp
khác và đã áp dụng thành công để chuyển gen vào nhiều loài nấm sợi khác nhau.
Nhiều loài nấm chỉ chuyển gen thành công khi đồng nuôi cấy với Agrobacterium
trong khi điều này không thể thực hiện với các phương pháp khác [61]. ATMT là
một hệ thống chuyển gen tương đối đơn giản, không yêu cầu tạo tế bào trần, phù
hợp với cả đột biến chèn bằng cách tích hợp ngẫu nhiên và xóa gen bằng tái tổ hợp
tương đồng [21, 118].
1.2.1. Giới thiệu về vi khuẩn A. tumefaciens
Vi khuẩn A. tumefaciens là loài vi khuẩn Gram âm, hình que, sống trong đất,
thuộc họ Rhizobiaceae, chi Agrobacterium. A. tumefaciens là tác nhân gây ra khối u
ở thực vật do chúng có khả năng chuyển một phần DNA (T-DNA) nằm trên
plasmid cảm ứng khối u (Ti plasmid) vào tế bào chủ. T-DNA chứa hai loại gen: các
gen gây khối u mã hóa cho các enzym tham gia vào quá trình tổng hợp auxin và
cytokinin, chịu trách nhiệm hình thành khối u và các gen mã hóa để tổng hợp opine
[56]. Các opine, tạo ra bởi sự ngưng tụ giữa các axit amin và đường, được tổng hợp
và tiết ra bởi khối u và được A. tumefaciens sử dụng làm nguồn cacbon và nitơ. Do
đó, các opine được coi là nguồn dinh dưỡng cho sự sinh trưởng của vi khuẩn. Ngoài
T-DNA, trên Ti plasmid còn chứa các gen phân giải opine, vị trí bắt đầu sao chép
(ori) và các gen liên quan đến quá trình chuyển T-DNA từ vi khuẩn sang tế bào vật
chủ (vùng độc lực). Sau khi tích hợp vào hệ gen của tế bào chủ, các gen mã hóa
enzym sản xuất chất tăng trưởng thực vật nằm trên T-DNA sẽ được biểu hiện, từ đó
dẫn đến sự tăng trưởng không kiểm soát của tế bào thực vật và hình thành khối u.
Sau khi hình thành, sự tăng sinh khối u vẫn diễn ra ngay cả khi không có mặt vi
khuẩn và mô khối u có thể sinh trưởng khi nuôi cấy trên môi trường thiếu các yếu tố
tăng trưởng in vitro cần thiết như auxin và cytokinin [97].

12


Luận văn tốt nghiệp

Đỗ Thị Bình Xuân Lộc

Hình 1.4. Vi khuẩn A. tumefaciens dưới kính hiển vi điện tử (A) và cấu trúc của Ti
plasmid (B) [72]
Vùng độc lực trên Ti plasmid gồm một lượng lớn các gen vir cần thiết cho
việc hình thành khối u. Protein được mã hóa bởi vùng độc lực liên quan đến sự hình
thành, vận chuyển và tích hợp T-DNA vào tế bào chủ [36]. T-DNA được giới hạn
bởi hai biên có trình tự lặp lại dài 24 bp (biên trái và biên phải), là trình tự nhận biết
cho việc cắt T-DNA. Chỉ các gen nằm giữa hai biên này mới được chuyển vào tế
bào nấm, tích hợp vào hệ gen ở một vị trí ngẫu nhiên. Do vậy, khi thực hiện chuyển
gen, các gen gây khối u trên T-DNA sẽ bị loại bỏ và thay thế bằng gen mong muốn.
Ngày nay, hệ thống vector nhị thể thường được sử dụng để chuyển gen vào nấm sợi.
Trong đó, vùng T-DNA và vùng độc lực nằm ở hai plasmid riêng biệt, cho phép
thao tác di truyền đối với T-DNA kích thước nhỏ trong vector nhị thể [35].

13


Luận văn tốt nghiệp

Đỗ Thị Bình Xuân Lộc

Hình 1.5. Sơ đồ hệ thống vector nhị thể dùng cho ATMT [64]
Trong hệ thống vector nhị thể, vi khuẩn A. tumefaciens ngoài DNA nhiễm

sắc thể của nó còn chứa hai plasmid: một là Ti plasmid đã được loại bỏ T-DNA tự
nhiên những vẫn giữ nguyên vùng độc lực chứa các gen vir giúp chuyển T-DNA
vào tế bào chủ, hai là vector nhị thể chứa đoạn T-DNA đã được cải biến phù hợp
với mục đích chuyển gen, nằm giữa biên trái và biên phải [65]. Vector nhị thể chứa
hai điểm bắt đầu sao chép nên nó có thể tái bản ở cả Escherichia coli và A.
tumefaciens cùng với hai marker kháng kháng sinh, một để chọn lọc ở vi khuẩn và
một để chọn lọc ở nấm [35, 77].
1.2.2. Cơ chế chuyển gen vào nấm thông qua vi khuẩn A. tumefaciens
Ti plasmid chứa 35 gen vir được sắp xếp thành 8 operon. Operon virA, virG
và virF chỉ mang một gen, trong khi operon virE, virC và virH mang hai gen,
operon virD mang 4 gen và operon virB mang 11 gen. Các hợp chất phenolic, chẳng
hạn như acetosyringone được sử dụng để cảm ứng các gen vir mã hóa bộ máy
chuyển T-DNA của A. tumefaciens. Hệ thống điều hòa hai thành phần gồm hai
protein VirA và VirG được kích hoạt khi có mặt chất cảm ứng. Protein mã hóa
nhiễm sắc thể, ChvE, tương tác với protein VirA để kích thích cảm ứng gen vir khi
nồng độ acetosyringone thấp và có mặt của đường [109]. Protein VirA tương tác
với các phân tử chất cảm ứng và sau đó phosphoryl hoá protein VirG. VirG sau khi

14


Luận văn tốt nghiệp

Đỗ Thị Bình Xuân Lộc

được kích hoạt bởi phosphoryl hóa sẽ hoạt hóa phiên mã của chính nó và các gen
vir khác trong vùng độc lực. Các sản phẩm của gen virC và virD cần cho quá trình
tạo bản sao sợi đơn của T-DNA (sợi T). Protein VirC1 có thể liên kết với trình tự
―overdrive‖ dài 25 bp ở gần biên phải và kích thích sản xuất sợi T [101]. Protein
VirD2 (được hỗ trợ bởi protein VirD1) có hoạt tính endonuclease, cắt đặc hiệu sợi T

ở vị trí biên phải và trái của T-DNA. Sau đó, bằng cơ chế tự sửa chữa DNA, TDNA hoàn chỉnh được tổng hợp từ sợi đơn còn lại. Ngoài ra, protein VirD2 gắn vào
đầu 5’ của sợi T đã được cắt ra bằng liên kết cộng hóa trị, tạo phức hệ DNA-protein
được chuyển vào tế bào nấm [31, 38].

Hình 1.6. Cơ chế chuyển gen vào tế bào nấm nhờ vi khuẩn A. tumefaciens [65]
Bước tiếp theo trong quá trình chuyển T-DNA là đưa sợi T qua màng tế bào
vi khuẩn và thành tế bào nấm thông qua cơ chế tiết loại IV. Các protein độc lực
VirB và VirD4 tham gia vào quá trình này. Các protein VirB tạo thành lỗ vận
chuyển và cấu trúc bề mặt T-pilus được cấu tạo từ T-pilin, một dạng của VirB2
[44]. Protein bên trong màng tế bào VirD4 thuộc về một họ protein được gọi là
ghép nối, tương tác trung gian giữa sợi T và phức hợp VirB. Ngoài phức hợp
VirD2/sợi T, các protein độc lực VirE2, VirE3 và VirF cũng được tiết qua hệ thống
tiết loại IV [83, 91, 105]. VirE2 là protein liên kết với DNA sợi đơn và bảo vệ sợi T

15