Khảo sát đa hình gen CYP2C9 3 và VKORC1 trên bệnh nhân thay van tim sử dụng thuốc chống đông ACENOCOUMAROL

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

----------------------------

Đỗ Thị Lệ Hằng

KHẢO SÁT ĐA HÌNH GEN CYP2C9*3 VÀ VKORC1
TRÊN BỆNH NHÂN THAY VAN TIM SỬ DỤNG
THUỐC CHỐNG ĐÔNG ACENOCOUMAROL

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội - 2018


ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

----------------------------

Đỗ Thị Lệ Hằng

KHẢO SÁT ĐA HÌNH GEN CYP2C9*3 VÀ VKORC1
TRÊN BỆNH NHÂN THAY VAN TIM SỬ DỤNG
THUỐC CHỐNG ĐÔNG ACENOCOUMAROL
Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
Mã số: 8420101.14

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC
Người hướng dẫn khoa học:

TS. Vũ Thị Thơm
PGS.TS. Hoàng Thị Mỹ Nhung
XÁC NHẬN HỌC VIÊN ĐÃ CHỈNH SỬA THEO GÓP Ý CỦA HỘI ĐỒNG

Giáo viên hướng dẫn

Chủ tịch hội đồng chấm luận văn
thạc sĩ khoa học

TS. Vũ Thị Thơm

PGS.TS. Nguyễn Huy Hoàng

Hà Nội - 2018


LỜI CAM ĐOAN
Tôi là Đỗ Thị Lệ Hằng, học viên cao học khóa 25 (2016-2018), chuyên ngành
Sinh học Thực nghiệm, Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự Nhiên - Đại
học Quốc gia Hà Nội, xin cam đoan:
1. Đây là luận văn do bản thân tôi trực tiếp thực hiện dưới sự hướng dẫn của:
TS. Vũ Thị Thơm và PGS.TS. Hoàng Thị Mỹ Nhung.
2. Công trình này không trùng lặp với bất kỳ nghiên cứu nào khác đã được
công bố tại Việt Nam.
3. Các số liệu và thông tin trong nghiên cứu là hoàn toàn chính xác, trung thực
và khách quan, đã được xác nhận và chấp nhận của cơ sở nơi nghiên cứu.
Hà Nội, ngày

tháng

năm 2018

Ngƣời viết cam đoan

Đỗ Thị Lệ Hằng


LỜI CẢM ƠN
Trước hết, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc của mình tới TS. Vũ Thị Thơm
và PGS.TS. Hoàng Thị Mỹ Nhung là những người hướng dẫn khoa học, những
người Thầy đã tận tình hướng dẫn, truyền đạt kiến thức và những kinh nghiệm quý
báu, tạo điều kiện thuận lợi giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện luận văn này.
Tôi xin cảm ơn đề tài khoa học công nghệ cấp Đại học Quốc Gia Hà Nội, mã
số: QG.17.29 đã cung cấp kinh phí, tạo điều kiện để tôi hoàn thành luận văn này.
Tôi xin cảm ơn PGS.TS. Phạm Trung Kiên, chủ nhiệm đề tài đã hỗ trợ và tạo điều
kiện cho tôi thực hiện đề tài này.
Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới các Thầy cô, các nhà Khoa học trong
Hội Đồng chấm đề cương và luận văn tốt nghiệp đã đóng góp những ý kiến quý
báu, giúp tôi hoàn thành luận văn này.
Tôi xin gửi lời biết ơn tới Ban Giám Hiệu nhà trường, phòng Đào Tạo sau Đại
Học, các Thầy Cô Khoa Sinh học và các Thầy Cô bộ môn Sinh học Tế Bào Trường Đại học Khoa học Tự Nhiên, Đại học Quốc Gia Hà Nội đã cho tôi những
kiến thức quý báu, tạo điều kiện thuận lợi để tôi có thể hoàn thành luận văn này.
Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến:
Các cán bộ Bộ môn Y Dược học cơ sở, Ban lãnh đạo Khoa Y Dược - Đại học
Quốc Gia Hà Nội đã giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình học tập.
Các bác sĩ và nhân viên Bệnh viện Tim Hà Nội đã giúp đỡ tôi rất nhiều trong
quá trình hoàn thành luận văn này.
Xin bày tỏ lòng biết ơn đối với Bố Mẹ và những người thân trong gia đình
cùng với bạn bè đồng nghiệp là chỗ dựa vững chắc của tôi, luôn thương yêu,
khuyến khích, động viên và tạo điều kiện tốt nhất về tinh thần giúp tôi hoàn thành

tốt chương trình học tập và thực hiện thành công luận văn này.
Cuối cùng tôi xin gửi lời tri ân tới những bệnh nhân đã tham gia vào nhóm
nghiên cứu, sự đóng góp của các bệnh nhân đã giúp tôi có thành công này.


MỤC LỤC
ĐẶT VẤN ĐỀ ............................................................................................................ 1
Chƣơng 1. TỔNG QUAN ......................................................................................... 3
1.1. Bệnh lý van tim và thay van tim .......................................................................... 3
1.2. Sử dụng thuốc chống đông sau thay van tim ....................................................... 4
1.3. Dược di truyền học của acenocoumarol .............................................................. 6
1.4. Tổng quan về đa hình di truyền gen CYP2C9*3 và gen VKORC1 ...................... 9
1.4.1. Khái niệm về đa hình đơn nucleotide .............................................................. 9
1.4.2. Vị trí, cấu trúc gen CYP2C9 và mối liên quan tới liều thuốc
acenocoumarol .............................................................................................................. 11
1.4.3. Vị trí, cấu trúc gen VKORC1 và mối liên quan tới liều thuốc
acenocoumarol .............................................................................................................. 15
1.4.4. Các phương pháp phân tích xác định kiểu gen của SNP CYP2C9*3 và
SNP rs9923231, SNP rs9934438 trên gen VKORC1 ................................................ 18
1.5. Tình hình nghiên cứu mối liên quan giữa di truyền học và liều thuốc
acenocoumarol trên thế giới và trong nước .............................................................. 21
1.5.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới ............................................................. 21
1.5.2. Tình hình nghiên cứu trong nước ............................................................... 24
Chƣơng 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ....................... 26
2.1. Đối tượng nghiên cứu ....................................................................................... 26
2.1.1. Tiêu chuẩn lựa chọn bệnh nhân .................................................................. 26
2.1.2. Tiêu chuẩn loại trừ ...................................................................................... 26
2.1.3. Thời gian và địa điểm nghiên cứu .............................................................. 26
2.2. Phương pháp nghiên cứu ................................................................................... 27
2.3. Nguyên liệu và phương tiện nghiên cứu ............................................................ 27

2.3.1. Hóa chất ...................................................................................................... 27
2.3.2. Thiết bị ........................................................................................................ 28
2.3.3. Dụng cụ....................................................................................................... 28
2.3.4. Mẫu nghiên cứu .......................................................................................... 28


2.4. Các bước nghiên cứu ......................................................................................... 29
2.4.1. Quy trình nghiên cứu .................................................................................. 29
2.4.2. Thu thập, xử lý và bảo quản mẫu ............................................................... 30
2.4.3. Tách chiết và kiểm tra chất lượng DNA tổng số ........................................ 30
2.4.4. Trình tự mồi cho phản ứng khuếch đại đoạn gen chứa SNP CYP2C9*3 và
SNP rs9923231, SNP rs9934438 trên gen VKORC1 ................................................ 32
2.4.5. Khuếch đại đoạn gen chứa SNP CYP2C9*3 và SNP rs9923231, SNP
rs9934438 trên gen VKORC1 bằng phương pháp PCR ............................................ 32
2.4.6. Tinh sạch sản phẩm PCR ............................................................................ 33
2.4.7. Xác định kiểu gen của SNP CYP2C9*3 sử dụng phương pháp giải
trình tự gen ................................................................................................................ 34
2.4.8. Xác định kiểu gen của SNP rs9923231 và SNP rs9934438 trên gen
VKORC1 sử dụng phương pháp RFLP có đối chiếu với phương pháp giải
trình tự gen ................................................................................................................ 35
2.4.9. Kết quả tần số phân bố alen, kiểu gen của SNP CYP2C9*3 và
SNP rs9923231, SNP rs9934438 trên gen VKORC1 ................................................ 37
2.5. Xử lý và phân tích số liệu .................................................................................. 37
2.6. Các loại sai số và cách khắc phục ...................................................................... 37
2.6.1. Sai số có thể mắc phải ................................................................................ 37
2.6.2. Cách khắc phục sai số................................................................................. 37
2.7. Đạo đức nghiên cứu ........................................................................................... 38
Chƣơng 3. KẾT QUẢ ............................................................................................. 39
3.1. Một số đặc điểm của nhóm bệnh nhân trong nghiên cứu .................................. 39
3.2. Kết quả phân tích kiểu gen của SNP CYP2C9*3 và SNP rs9923231,

SNP rs9934438 trên gen VKOCR1 ........................................................................... 40
3.2.1. Kết quả tách chiết DNA tổng số ................................................................. 40
3.2.2. Tối ưu quy trình PCR khuếch đại đoạn gen chứa SNP CYP2C9*3 và
SNP rs9923231, SNP rs9934438 trên gen VKORC1 ................................................ 41


3.2.3. Kết quả khuếch đại đoạn gen chứa SNP CYP2C9*3 và SNP rs9923231,
SNP rs9934438 trên gen VKORC1 ........................................................................... 47
3.2.4. Kết quả phân tích kiểu gen SNP CYP2C9*3 và SNP rs9923231,
SNP rs9934438 trên gen VKORC1 ........................................................................... 50
3.3. Kết quả tần số phân bố alen, kiểu gen của SNP CYP2C9*3 và SNP rs9923231,
SNP rs9934438 trên gen VKORC1 ........................................................................... 55
3.3.1. Kết quả tần số phân bố alen, kiểu gen của SNP CYP2C9*3 ...................... 55
3.3.2. Kết quả tần số phân bố alen, kiểu gen của SNP rs9923231 và rs99
rs9934438 trên gen VKORC1 ................................................................................... 56
3.4. Tỷ lệ kiểu gen phối hợp của SNP rs9923231 và SNP rs9934438 trên gen
VKORC1 ................................................................................................................... 57
Chƣơng 4. BÀN LUẬN ........................................................................................... 58
4.1. Một số đặc điểm của nhóm bệnh nhân tham gia nghiên cứu............................. 59
4.2. Phân tích kiểu gen SNP CYP2C9*3 và SNP rs9923231, SNP rs9934438
trên gen VKORC1 ..................................................................................................... 60
4.3. Xác định tần số phân bố alen, kiểu gen của SNP CYP2C9*3 và SNP rs9923231,
SNP rs9934348 trên gen VKORC1 ........................................................................... 62
KẾT LUẬN .............................................................................................................. 66
KIẾN NGHỊ ............................................................................................................. 67
TÀI LIỆU THAM KHẢO ...................................................................................... 68
PHỤ LỤC ................................................................................................................. 76


DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

AHA

American Heart Association: Hiệp hội Tim mạch Mỹ

AVK

Anti Vitamin K : Kháng vitamin K

AF

Atrial Fibrillation: Rung nhĩ

bp

Base pair (cặp bazơ)

cs

cộng sự

COA

Thuốc chống đông máu đường uống họ Coumarinic

DVT

Deep Venous Thrombosis: Huyết khối tĩnh mạch sâu

dNTP

Deoxyrinucleotide Triphosphate

ddNTP

Dideoxynucleotide Triphosphate

DNA

Deoxyribonucleic Acid (Acid deoxyribonucleic)

HVR

Heart Valve Replacement: Thay Van Tim

EDTA

Ethylenediaminetetraacetic Acid

INR

International Normalized Ratio: Chỉ số bình thường hoá Quốc Tế

NST

Nhiễm sắc thể

PCR

Polymerase Chain Reaction: Phản ứng chuỗi polymerase

PT

Prothrombin

RE

Restriction Enzym: enzym cắt giới hạn

RFLP

Restriction Fragment Length Polymorphism: Đa hình chiều dài
đoạn cắt giới hạn

SNP

Single Nucleotide Polymorphism: Đa hình đơn nucleotide

TAE

Tris base, acetic acid and EDTA


DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1. Mối liên quan giữa đa hình gen CYP2C9 với liều dùng acenocoumarol ...... 14
Bảng 1.2. Mối liên hệ giữa kiểu gen VKORC1 với liều thuốc acenocoumarol.............. 16
Bảng 1.3. Tần số phân bố alen của gen CYP2C9 ở các quần thể người ......................... 23
Bảng 1.4. Tần số phân bố alen của gen CYP2C9 ở các quần thể người ......................... 23
Bảng 2.1. Trình tự mồi khuếch đại đoạn gen chứa các alen ............................................ 32
Bảng 2.2. Quy trình RFLP phân tích kiểu gen của rs9923231 trên gen VKORC1 ........ 35
Bảng 2.3. Quy trình RFLP phân tích kiểu gen của rs9923231 trên gen VKORC1 ........ 36

Bảng 3.1. Một số đặc điểm chung của nhóm bệnh nhân tham gia nghiên cứu .............. 39
Bảng 3.2. Kết quả kiểm tra nồng độ và độ tinh sạch của DNA tổng số ......................... 41
Bảng 3.3. Quy trình khuếch đại đoạn gen chứa SNP CYP2C9*3................................... 47
Bảng 3.4. Quy trình khuếch đại đoạn gen chứa SNP rs9923231 trên gen VKORC1 .... 48
Bảng 3.5. Quy trình khuếch đại đoạn gen chứa SNP rs9934438 trên gen VKORC1 .... 48
Bảng 3.6. Kết quả tần số phân bố alen, kiểu gen của SNP CYP2C9*3 .......................... 55
Bảng 3.7. Kết quả tần số phân bố alen, kiểu gen của SNP rs9923231 và
SNP rs9934438 trên gen VKORC1 ................................................................................... 56


DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Buồng tim và vị trí các van tim................................................................... 3
Hình 1.2. Cấu trúc hoá học của acenocoumarol ......................................................... 7
Hình 1.3. Ảnh hưởng của gen CYP2C9 và gen VKORC1 tới acenocoumarol ........... 8
Hình 1.4. Mô tả Single nucleotide polymorphisms .................................................... 9
Hình 1.5. Mô tả Haplotype ....................................................................................... 10
Hình 1.6. Vị trí nhiễm sắc thể số 10 trong bộ NST người ........................................ 12
Hình 1.7. Vị trí gen CYP2C9 trên nhiễm sắc thể số 10 ............................................ 12
Hình 1.8. Vai trò của Cytochrome P450 trong chuyển hoá thuốc ............................ 13
Hình 1.9. Vị trí nhiễm sắc thể số 16 trong bộ NST người ........................................ 15
Hình 1.10. Vị trí gen VKORC1 trên nhiễm sắc thể số 16 ......................................... 15
Hình 1.11. Gen VKORC1 .......................................................................................... 15
Hình 1.12. Giải trình tự gen bằng máy tự động ........................................................ 19
Hình 1.13. Enzym cắt tạo đầu dính và cắt tạo đầu bằng ........................................... 20
Hình 3.1. Hình ảnh điện di DNA tổng số trên gel agarose 0,7%.............................. 40
Hình 3.2. Kết quả PCR tối ưu nhiệt độ gắn mồi cho phản ứng khuếch đại đoạn gen
chứa SNP CYP2C9*3 ............................................................................................... 42
Hình 3.3. Kết quả PCR tối ưu nhiệt độ gắn mồi cho phản ứng khuếch đại đoạn gen
chứa SNP rs9923231 trên gen VKORC1 .................................................................. 42
Hình 3.4. Kết quả PCR tối ưu nhiệt độ gắn mồi cho phản ứng khuếch đại đoạn gen

chứa SNP rs9934438 trên gen VKORC1 .................................................................. 43
Hình 3.5. Kết quả PCR tối ưu nồng độ mồi (A) và nồng độ DNA (B) cho phản ứng
khuếch đại đoạn gen chứa SNP CYP2C9*3 ............................................................. 44
Hình 3.6. Kết quả PCR tối ưu nồng độ mồi (A) và nồng độ DNA (B) cho phản ứng
khuếch đại đoạn gen chứa SNP rs9923231 trên gen VKORC1 ................................ 45
Hình 3.7. Kết quả PCR tối ưu nồng độ mồi (A) và nồng độ DNA (B) cho phản ứng
khuếch đại đoạn gen chứa SNP rs9934438 trên gen VKORC1 ................................ 46
Hình 3.8. Điện di sản phẩm phản ứng PCR khuếch đại đoạn gen chứa các SNP
CYP2C9*3, SNP rs9923231, SNP rs9934438 .......................................................... 49


Hình 3.9. Kết quả giải trình tự SNP CYP2C9*3 ....................................................... 50
Hình 3.10. Sản phẩm RFLP của SNP rs9923231 trên gen VKORC1 ....................... 51
Hình 3.11. Sản phẩm RFLP của SNP rs9934438 trên gen VKORC1 ....................... 52
Hình 3.12. Kết quả giải trình tự SNP rs9923231 trên gen VKORC1........................ 53
Hình 3.13. Kết quả giải trình tự SNP rs9934438 trên gen VKORC1........................ 54


DANH MỤC BIỂU ĐỒ
Biểu đồ 3.1. Tỷ lệ kiểu gen phối hợp của SNP rs9923231 và SNP rs9934431
trên gen VKORC1 ..................................................................................................... 57
Biểu đồ 4.1. Tần số phân bố alen của SNP CYP2C9*3 ở một số quần thể người
khác nhau .................................................................................................................. 63
Biểu đồ 4.2. Tần số phân bố alen của SNP rs9923231 trên gen VKORC1 ở một số
quần thể người khác nhau ......................................................................................... 64
Biểu đồ 4.3. Tần số phân bố alen của SNP rs9934438 trên gen VKORC1 ở một số
quần thể người khác nhau ......................................................................................... 65


ĐẶT VẤN ĐỀ

Bệnh van tim là bệnh khá phổ biến trong cơ cấu bệnh lý tim mạch nói chung
trên thế giới cũng như tại Việt Nam. Nguyên nhân chủ yếu gây bệnh van tim là do
di chứng của tổn thương van tim trong bệnh thấp tim [2]. Bệnh nhân có thể tổn
thương một van hoặc nhiều van, van bị tổn thương nhiều nhất là van hai lá, sau đó
đến van động mạch chủ [7][8]. Từ khi có kỹ thuật sửa và thay van tim, cuộc sống
của bệnh nhân mắc bệnh van tim đã được cải thiện rất nhiều và mang lại cho họ
cuộc sống gần như bình thường [39]. Tuy nhiên, do khi hoạt động các van tim nhân
tạo thường sinh ra các cục máu đông dễ gây biến chứng như: tắc mạch, huyết khối.
Do vậy, ngay sau khi thay van tim bệnh nhân phải sử dụng thuốc chống đông máu
trong một thời gian dài hoặc suốt đời nhằm ngăn ngừa sự hình thành cục máu đông,
tránh các nguy cơ gây huyết khối hoặc tắc mạch [62]. Có rất nhiều loại thuốc chống
đông máu nhưng được sử dụng rộng rãi và nhiều nhất là thuốc chống đông máu
nhóm kháng vitamin K (AVK) [17]. Các thuốc chống đông máu nhóm AVK làm
giảm quá trình sản xuất các yếu tố đông máu (yếu tố II, VII, IX và X) ngăn ngừa sự
hình thành cục máu đông và ngăn cục máu đông có sẵn lớn hơn nữa trong hệ tuần
hoàn. Thuốc chống đông máu đường uống nhóm AVK được sử dụng từ những năm
1940, có một số nhóm thuốc chống đông máu nhóm AVK như: warfarin,
acenocoumarol và phenprocoumon [54].
Hiện nay, ở Việt Nam acenocoumarol (Sintrom) được sử dụng rộng rãi để điều
trị hơn warfarin. Tuy nhiên, trở ngại cho bệnh nhân và các thầy thuốc là khoảng an
toàn của thuốc chống đông máu nhóm AVK rất hẹp, nên việc xác định liều lượng
đủ hiệu lực điều trị nhưng tránh được nguy cơ gây chảy máu là rất khó khăn [56].
Nếu dùng liều thuốc chống đông thấp thì không đạt hiẹu quả kháng đông, nhung
nếu quá liều s gây biến chứng chảy máu đe dọa tính mạng bệnh nhân. Trên lâm
sàng, các bác sĩ thường dò liều điều trị dựa vào kinh nghiệm, lứa tuổi và xét nghiệm
chức năng gan, thận của bệnh nhân và đặc biệt là theo dõi chặt ch chỉ số INR
(International Normalized Ratio - chỉ số bình thường hóa quốc tế) của từng bệnh
1

nhân [63]. Trong các yếu tố kể trên, di truyền học là một trong các yếu tố quan
trọng đóng vai trò tiên lượng và thay đổi liều điều trị để đạt được khoảng INR mong
muốn [62]. Hơn 30 gen đã được tìm thấy s tham gia vào các hoạt động trao đổi
chất của thuốc chống đông máu họ Coumarinic dạng uống (COA), trong đó gen
CYP2C9 (gen mã hóa cho họ enzym chuyển hóa thuốc cytochrome P450) và gen
VKORC1 (gen mã hóa cho enzym đích của thuốc) là quan trọng nhất [20][35][37].
Các nghiên cứu trước đây đã chỉ ra rằng khoảng 30% của phương sai liều phụ thuộc
vào đa hình đơn nucleotide (SNP) của gen VKORC1 và khoảng 12% phụ thuộc vào
hai SNP CYP2C9*2, CYP2C9*3 [33]. Trong bối cảnh của Việt Nam hiện nay, chưa
có thông tin về mặt di truyền học liên quan tới việc chỉ định liều acenocoumarol sử
dụng cho bệnh nhân do đó chúng tôi đề xuất thực hiện đề tài: “Khảo sát đa hình
gen CYP2C9*3 và VKORC1 trên bệnh nhân thay van tim sử dụng thuốc chống
đông Acenocoumarol”.
Đề tài được tiến hành với 2 mục tiêu:
1. Xây dựng đƣợc quy trình phân tích kiểu gen SNP CYP2C9*3 và SNP
rs9923231, SNP rs9934438 trên gen VKORC1.
2. Khảo sát đƣợc tần số phân bố alen của SNP CYP2C9*3 và SNP
rs9923231, SNP rs9934438 trên gen VKORC1 ở quần thể bệnh nhân thay van
tim sử dụng thuốc chống đông Acenocoumarol tại Bệnh Viện Tim Hà Nội.

2


Chƣơng 1. TỔNG QUAN
1.1. Bệnh lý van tim và thay van tim
Bệnh lý van tim là một bệnh phổ biến tại Việt Nam trong cơ cấu bệnh lý tim
mạch nói chung. Nguyên nhân gây tổn thương van tim phần lớn là do di chứng của
bệnh lý thấp tim [2]. Bệnh nhân có tiền sử thấp khớp từ nhỏ hoặc bị tấn công bởi
liên cầu khuẩn gây thấp tim nhưng không có triệu chứng. Bệnh thấp tim gây suy tim
và đe dọa tính mạng người bệnh [7][8][14].

Tim người bình thường có 4 buồng tim, 2 tâm nhĩ (nhĩ phải, nhĩ trái) và 2 tâm
thất (thất phải, thất trái). Ngăn cách giữa các buồng tim là các van tim, van 2 lá giữa
nhĩ trái và thất trái, van 3 lá giữa nhĩ phải và thất phải. Có 2 đại động mạch đi ra từ
tim là động mạch chủ và động mạch phổi. Ngăn cách giữa tim với 2 đại động mạch
này là van động mạch chủ và van động mạch phổi [1] (Hình 1.1).

Hình 1.1. Buồng tim và vị trí các van tim [2]
Tổn thương van tim có 2 dạng chính là hở van tim hoặc hẹp van tim. Với tổn
thương do bệnh lý thấp tim thường có cả 2 dạng tổn thương trên kết hợp. Khi tổn
thương hẹp hoặc hở van tim ở mức nặng s làm suy giảm chức năng tim và gây ra
những triệu chứng khó chịu cho người bệnh [14].
3


Kỹ thuật sửa và thay van tim đã cứu sống được hàng triệu bệnh nhân mắc
bệnh van tim và trả lại cho họ cuộc sống bình thường [39]. Năm 1923, Elliot Cuttler
đã thực hiện tách van tim kín bằng dụng cụ [43]. Năm 1925, Henry Souttar đã tách
van tim kín bằng tay [26]. Đến năm 1948, Wright Harken và Charler Bailey đã hoàn
thiện kỹ thuật tách van hai lá bằng tay [66]. Năm 1959, Nina Braunwald đã thực
hiện ca thay van tim nhân tạo đầu tiên trên thế giới, kể từ đó hàng năm có hàng trăm
ngàn bệnh nhân mắc bệnh van tim được thay van tim nhân tạo [64]. Tại các nước
Bắc Mỹ, hàng năm có khoảng 100.000 trường hợp bệnh nhân phải thay van tim với
bệnh lý chủ yếu là tổn thương van tim do thấp tim [28].
1.2. Sử dụng thuốc chống đông sau thay van tim
Sau thay van tim bệnh nhân có thể gặp một số biến chứng như: liên quan đến
sau phẫu thuật, do hoạt động của van nhân tạo, nhưng biến chứng hay gặp nhất là
do việc sử dụng các thuốc chống đông máu sau thay van tim. Có thể nói thay van
tim là thay một “bệnh van tim” bằng một “bệnh van tim nhân tạo”. Nguyên nhân là
do van tim mới được cơ thể người nhận biết như một “yếu tố lạ”, sau khi tiếp xúc
với dòng máu trong cơ thể s kích thích quá trình đông máu nội sinh. Bên cạnh đó,

sự rối loạn dòng chảy của máu quanh van cơ học (dòng chảy rối, rối loạn dòng
chảy) cũng là một yếu tố góp phần hình thành cục máu đông [62][63]. Do vậy, tất
cả bệnh nhân sau thay van tim đều phải sử dụng thuốc chống đông máu (thuốc
loãng máu) trong một thời gian dài hoặc cả đời để dự phòng việc hình thành cục
máu đông gây các biến chứng tắc mạch cho bệnh nhân. Hiện tại, ở Việt Nam các
dạng thuốc chống đông máu được bác sĩ chỉ định cho bệnh nhân dùng sau thay van
tim phần lớn đều thuộc nhóm AVK. Thuốc chống đông máu nhóm AVK đã được sử
dụng từ rất lâu (từ những năm 1940) [17]. Hai dạng thuốc chống đông máu nhóm
AVK thường gặp là: Sintrom (hoạt chất: acenocoumarol) và Coumadine (warfarin).
Cơ chế tác dụng của nhóm thuốc này: làm giảm quá trình sản xuất các yếu tố đông
máu như II, VII, IX và X, ngăn ngừa hình thành cục máu đông và ngăn cục máu
đông có sẵn lớn hơn nữa trong hệ tuần hoàn [54]. Tuy được dùng từ lâu và rộng rãi
nhưng việc sử dụng thuốc chống đông máu nhóm AVK hiệu quả lại có nhiều khó
khăn cho người bệnh do khoảng tác dụng của loại thuốc này hẹp, liều dùng thuốc ở
4


mỗi bệnh nhân phụ thuộc vào nhiều yếu tố như: cơ địa bệnh nhân, chế độ dinh
dưỡng, ảnh hưởng của các loại thuốc khác kèm theo, các bệnh khác đi kèm. Vì vậy
khi bệnh nhân sử dụng thuốc chống đông máu nhóm AVK thì bệnh nhân phải được
sự chỉ định liều dùng của bác sĩ điều trị, phải thường xuyên theo dõi và xét nghiệm
thời gian đông máu prothrombin (PT) và chỉ số INR [56][63].
INR (International normalized radio), đuợc xây dựng bởi tổ chức y tế thế giới
và uỷ ban quốc gia về chứng huyết khối và cầm máu với nhiệm vụ báo cáo các kết
quả kiểm tra sự đông máu. Tất cả các kết quả đuợc tiêu chuẩn hoá bằng việc sử
dụng các chỉ số quốc tế cho thuốc thử đông máu thông thuờng và các thiết bị thống
nhất để thực hiện việc kiểm tra [30][46][73 . Ví dụ một nguời đang uống thuốc
chống đông máu có thể có chỉ số INR từ 2 - 3, thì bất kể phòng thí nghiệm nào kiểm
tra INR kết quả cần phải nhu nhau dù dùng thuốc loại gì và dụng cụ gì để kiểm tra.
Nguời ta sử dụng chỉ số INR để thăm dò toàn bộ yếu tố đông máu ngoại sinh (yếu

tố II, V, VII và X) [73]. Chỉ số INR đuợc tính bằng công thức:
INR = [PT bệnh nhân/PT chứng]ISI
Việc kiểm soát và điều chỉnh liều luợng dùng thuốc đuợc thực hiện bằng cách
kiểm tra và theo d i chỉ số INR của một nguời đang uống thuốc chống đông thường
xuyên. Khi INR tren 6,0 xuất hiện nguy co xuất huyết ở người bệnh. Các loại thuốc
chống đông máu giúp ngăn chặn sự đông và vón cục của máu [30], đuợc kê dùng
dài ngày cho những bệnh nhân có các triệu chứng đông máu không bình thuờng,
bao gồm: các bệnh nhân tim, đột quỵ hoặc tắc ngh n mạch và đuợc dùng cho từng
giai đoạn ngắn đối với bệnh nhân đã điều trị qua phẫu thuật thay van tim. Chất
chống đông máu cần đuợc kiểm soát cẩn thận để giữ đuợc cân bằng giữa việc chống
đông máu với việc gây nên biến chứng chảy máu quá mức. X t nghiẹm chỉ số INR
không phức tạp, bệnh nhân thuờng lấy máu vào buổi sáng, lấy khoảng 4,5 ml máu
0,5 ml Citrate để làm x t nghiệm [36][56]. Bệnh nhân cần đo chỉ số INR mỗi 1 - 2
ngày trong 2 tuần đầu sau khi sử dụng đến khi INR đạt mục tiêu 2 lần liên tiếp, khi
INR ổn định bệnh nhân nên đo INR mỗi 2 - 4 tuần 1 lần. Ngoài ra mỗi lần tái khám
bệnh nhân cũng phải đo INR để đánh giá hiệu quả liều thuốc dùng và điều chỉnh
liều thuốc:

5


+ INR mục tiêu: mỗi bệnh nhân tuỳ theo tình trạng bệnh lý cụ thể mà phân
loại INR mục tiêu. Bệnh nhân thay van 2 lá cơ học, INR mục tiêu = 2,5 - 3,5. Bệnh
nhân thay van cơ học kèm tiền sử kẹt van thì INR mục tiêu = 3,5 - 4,5. Bệnh nhân
lớn tuổi, có nguy cơ xuất huyết cao thì INR mục tiêu = 2,0 [11].
+ INR thấp: không đạt mục tiêu điều trị, dễ tạo cục máu đông gây kẹt van tim
hay những biến chứng gây tắc mạch khác [11].
+ INR cao: gây biến chứng xuất huyết như bầm dưới da, chảy máu chân răng,
chảy máu cam, tiểu máu, nặng nhất là chảy máu não [11].
1.3. Dƣợc di truyền học của acenocoumarol

Thuốc chống đông máu nhóm AVK thông dụng như: warfarin, acenocoumarol
và phenprocoumon là những loại thuốc thường được kê đơn nhiều nhất cho việc xử
lý các vấn đề liên quan đến chống đông máu ở bệnh nhân: rung nhĩ (AF), thay van
tim (HVR), huyết khối tĩnh mạch (DVT), phổi thuyên tắc, tăng áp động mạch phổi
và với những bệnh nhân đã trải qua phẫu thuật chỉnh hình [18]. Ở Việt Nam,
acenocoumarol được sử dụng rộng rãi trong điều trị các vấn đề về huyết khối của
bệnh nhân sau thay van tim hơn warfarin [24].
Cấu trúc hoá học của acenocoumarol được đặc trưng bởi nhóm nitro ở vị trí
para của vòng phenyl và tồn tại ở hai dạng đồng phân R(+) và S(-), trong đó R( )
acenocoumarol có tác dụng chống đông mạnh hơn so với acenocoumarol S(-).
Acenocoumarol ức chế quá trình khử vitamin K, qua đó ngăn ngừa phản ứng
carboxyl hóa đuôi axit amin glutamic của các yếu tố đông máu phụ thuộc vitamin
K. Sự carboxyl hóa rất quan trọng cho sự tương tác giữa các yếu tố đông máu và
canxi. Nếu không có sự tương tác này, quá trình đông máu không thể xảy ra. Cả yếu
tố bên ngoài thông qua yếu tố VII, X và II [21][32][34].
Acenocoumarol được hấp thu nhanh chóng qua đường uống và đạt nồng độ
tối đa (Cmax = 0,3 ± 0,05 mcg/ml) trong 2 - 3 giờ. Acenocoumarol trong huyết
tương đa phần ở dạng liên kết với protein chỉ 1,52% tồn tại ở trạng thái tự do. Sau
khi uống, nồng độ thuốc trung bình đạt được trong huyết tương và thời gian bán
thải của thuốc lần lượt là 3,9 ± 0,7 mcg ml/giờ và 10,9 ± 1,5 mcg ml/giờ. Thời
6


gian để đạt được hiệu quả tối ưu trong việc làm tăng thời gian PT là từ 24 - 30 giờ
[21]. Acenocoumarol là thuốc có thời gian bán thải ngắn, do vậy nó được đào thải
ra ngoài một cách nhanh chóng. Do đó, việc xác định liều lượng sử dụng cho từng
bệnh nhân một cách ổn định là điều hết sức có ý nghĩa. Vì nếu bệnh nhân sử dụng
liều thấp có thể gây giảm hiệu quả chống đông của thuốc, còn sử dụng liều cao có
thể gây nguy cơ biến chứng chảy máu. Quan trọng hơn, giai đoạn đầu của điều trị
rất dễ bị các biến chứng lâm sàng liên quan tới việc sử dụng trên hoặc dưới liều.

Trong những tuần đầu điều trị, giá trị INR thường rối loạn và có nguy cơ chảy
máu nhiều hơn. Để tránh nguy cơ này bác sĩ nên có những tính toán cho liều dung
nạp thuốc đầu tiên và duy trì liều sau đó đối với thuốc [36]. Liều thuốc
acenocoumarol cũng tùy thuộc vào mỗi cá thể và phụ thuộc vào chỉ số INR. Liều
dùng thường vào ngày thứ nhất từ 8 - 12 mg, trong ngày thứ hai là từ 4 - 8 mg.
Liều duy trì từ 1 - 10 mg hàng ngày. Uống acenocoumarol vào cùng thời điểm
hàng ngày [35][61].

Hình 1.2. Cấu trúc hóa học của acenocoumarol [21]

7


Hình 1.3. Ảnh hưởng của gen CYP2C9 và gen VKORC1 tới acenocoumarol
[53][69][76]
Trong tất cả các yếu tố có nguy cơ gây ảnh hưởng đến liều dùng thuốc
acenocoumarol của bệnh nhân như trên thì yếu tố di truyền học là một yếu tố được
đánh giá là rất quan trọng và đóng vai trò tiên lượng và thay đổi liều điều trị để đạt
được khoảng INR mong muốn [37]. Một số nghiên cứu cũng chỉ ra rằng gen
VKORC1, gen CYP2C9 và gen CYP4F2 là các yếu tố di truyền chủ yếu chịu trách
nhiệm cho sự thay đổi liều dùng thuốc chống đông nhóm AVK ở bệnh nhân da
trắng và trong đó các SNP của gen VKORC1 (gen mã hóa cho enzym đích của
thuốc) và gen CYP2C9 (gen mã hóa cho siêu họ enzym chuyển hóa thuốc
cytochrome P450) có vai trò quan trọng nhất [20][54][70]. Xét về sự ảnh hưởng đến
liều dùng thuốc acenocoumarol, gen VKORC1 được cho là có ảnh hưởng hơn gen
CYP2C9 trong một số nghiên cứu gần đây [17][24][25][33]. Vì vậy, trong những
năm gần đây, các nhà khoa học đã nỗ lực nghiên cứu để phát triển các thuật toán
hướng dẫn liều sử dụng acenocoumarol dựa trên các yếu tố di truyền cũng như lâm
sàng [22]. Điều này cho thấy dược di truyền đóng vai trò quan trọng trong việc
hướng dẫn liều điều trị cho các thuốc chống đông máu thuộc nhóm AVK. Theo

8


nghiên cứu của tác giả Verde và cs (2010) đã chỉ ra mối liên hệ giữa đa hình di
truyền gen VKORC1, gen CYP4F2 và gen CYP2C9*2*3 với liều thuốc
acenocoumarol sử dụng cho bệnh nhân sau thay van tim [76]. Một nghiên cứu khác
của tác giả Van Schie và cs (2011) cũng công bố chi tiết về các thuật toán tiên
lượng liều sử dụng cho acenocoumarol và phenprocoumon có sự khác biệt đáng kể
so với thuật toán tiên lượng liều sử dụng cho warfarin [60].
1.4. Tổng quan về đa hình di truyền gen CYP2C9*3 và gen VKORC1
1.4.1. Khái niệm về đa hình đơn nucleotide
Đa hình đơn nucleotide (Single Nucleotide Polymorphism-SNP, đọc là “snip”)
là những vị trí nằm trong hệ gen của người, mà ở những cá thể khác nhau lại xuất
hiện một loại nucleotide khác nhau (A, T, G hoặc C). Mỗi vị trí được coi là một
SNP chỉ khi tần số ít nhất xuất hiện một alen phải lớn hơn hoặc bằng 1%. Mỗi gen
là một đoạn ngắn trong chuỗi xoắn kép DNA, tạo nên một bộ gen của con người.
Đoạn ngắn đó lại là một chuỗi rất nhiều các nucleotide, các biến động về một gen
giữa các cá thể chỉ do sự khác nhau của một nucleotide trong gen đang x t, đó chính
là tính đa hình đơn nucleotide [17].

Hình 1.4. Mô tả Single nucleotide polymorphisms [17]
Mặc dù về lý thuyết, có thể xuất hiện 1 trong 4 loại nucleotide, song thông
thường SNP lại chỉ xuất hiện 2 loại alen. Nguyên nhân là do SNP bắt nguồn từ một
đột biến điểm xảy ra trong hệ gen, chuyển một nucleotide này sang một nucleotide
khác [15]. Nếu đột biến được xảy ra trong tế bào sinh sản của cơ thể, thì s có các
thế hệ sau ra đời mang đột biến này và qua nhiều thế hệ s hình thành SNP trong

9

quần thể. Nhưng chỉ có 2 alen - một alen gốc và một alen đột biến. Nếu muốn có
alen thứ 3, s cần có một đột biến mới xảy ra ở đúng vị trí trước đó trong hệ gen và
cá thể mang đột biến phải di truyền lại được cho các thế hệ sau. Điều này vẫn có thể
xảy ra nhưng rất hiếm, do đó phần lớn SNP chỉ có 2 alen [15]. Đa hình thái được
gọi là đột biến khi có tỉ lệ <1% trong quần thể [58]. Các trường hợp có thể xảy ra khi
đột biến tại 1 nucleotide:
- Ở đoạn trình tự mã hóa, SNP có thể dẫn đến thay đổi trình tự axit amin, độ
dài chuỗi polypeptide nếu một bộ ba nucleotide (codon) kết thúc bị biến đổi.
- Ở các vị trí không thuộc các trình tự mã hóa nhưng vẫn có thể chi phối đến
mức độ biểu hiện của gen, SNP ảnh hưởng đến sự biểu hiện của sản phẩm protein.
- Nhiều SNP thuộc các vùng mã hóa hay không mã hóa các gen không gây ảnh
hưởng đến cấu trúc hay sự biểu hiện hoạt động của các gen.
Biến thể di truyền phổ biến nhất trong DNA của con người là các SNP. Mỗi
SNP lại có thể liên kết với các SNP khác trên cùng một nhiễm sắc thể. Các SNP liên
kết đó thường có xu hướng tạo thành một tập hợp di truyền cùng nhau vì ít khả năng
trao đổi chéo tạo ra những tập hợp mới, và được gọi là haplotype. Trong tiến hóa, dĩ
nhiên các haplotype cũng có thể bị thay đổi do trao đổi chéo tạo thành các
haplotype mới [26]. Tính đến thời điểm này, có hơn bốn triệu SNP trong hệ gen của
con người đã được xác định. Các SNP xảy ra khi một cặp nucleotide bị thay thế. Do
đó, các SNP là sự khác biệt duy nhất, cơ sở tồn tại giữa các cá nhân [15].

Hình 1.5. Mô tả Haplotype [26]
10


Với tần suất lớn và sự phân bố khắp hệ gen người, mặc dù hầu hết các SNP
không gây ảnh hưởng đến sức khỏe của con người, nhưng chúng lại là những công
cụ quan trọng trong nghiên cứu di truyền. Ví dụ như SNP là cơ sở cho phương pháp
GWAS, cho phép các nhà nghiên cứu xác định vùng gen quan trọng với tiến triển

bệnh tật. Nhiều SNP có thể giúp dự đoán đáp ứng của từng cá nhân với các loại
thuốc điều trị, tính nhạy cảm với các yếu tố môi trường và nguy cơ mắc một số
bệnh, cũng như theo d i các bệnh lý di truyền theo gia đình [51]. Việc xác định các
đột biến gây bệnh cũng là bước đầu tiên quan trọng trong liệu pháp điều trị, từ đó có
lời khuyên thích hợp trong vấn đề phòng bệnh đối với từng cá thể [51].

1.4.2. Vị trí, cấu trúc gen CYP2C9 và mối liên quan tới liều thuốc
acenocoumarol
Cytochrome P450 (CYP) là siêu họ enzym tham gia vào quá trình chuyển hóa
phần lớn các thuốc được sử dụng trong lâm sàng hiện nay như: thuốc chống ngưng
tập tiểu cầu (clopidogrel), thuốc chống động kinh (mephenytoin, diazepam) và các
thuốc an thần. Enzym CYP bao gồm: CYP3A4, CYP2D6, CYP2C9, CYP2C19,
CYP1A2 và CYP2E1 [57]. Trong đó, CYP2C9 là enzym đóng vai trò quan trọng
trong việc oxy hoá các hợp chất nội sinh và ngoại sinh đồng thời cũng chính là
enzym tham gia vào quá trình chuyển hóa thuốc acenocoumarol [69].
Hàng trăm loại thuốc điều trị các loại bệnh khác nhau được chuyển hóa bởi
CYP2C9 tại gan, bao gồm cả các loại thuốc chống đông máu có chỉ định điều trị hẹp
như: acenocoumarol, warfarin và phenytoin và các loại thuốc điều trị thường xuyên
theo chỉ định khác như: tolbutamide, losartan, glipizide...cũng như một số loại thuốc
chống viêm không steroid. Không chỉ ở gan, CYP2C9 còn tham gia chuyển hóa các
hợp chất nội sinh quan trọng như 5-hydroxytryptamine thành epoxygenase hoạt
động, hay các axit béo không bão hòa thành một loạt các sản phẩm có hoạt tính sinh
học [45][47].
Gen CYP2C9 nằm trên nhánh dài nhiễm sắc thể số 10 ở người (10q23.33), từ
cặp nucleotide 94,762,624 đến 94,853,260 [26].

11


Hình 1.6. Vị trí nhiễm sắc thế số 10 trong bộ NST Người [26]

Hình 1.7. Vị trí gen CYP2C9 trên nhiễm sắc thể số 10 [26]
Quá trình chuyển hóa thuốc trải qua hai giai đoạn: pha I và pha II. Pha I: xảy
ra các phản ứng sinh hóa như phản ứng khử, phản ứng thủy phân, nhưng chủ yếu là
phản ứng oxy hóa có sự tham gia của enzym cytochrome P450 [52]. Pha II: các
phản ứng ở pha II đều là các phản ứng liên hợp: một phân tử nội sinh (acid
glucuronic, glutathion, sulfat, glycin, acetyl) s ghép với một nhóm hóa học của
thuốc để tạo thành các phức hợp tan mạnh trong nước. Thông thường, các phản ứng
ở pha I s tạo ra các nhóm chức cần thiết cho các phản ứng ở pha II, đó là các
nhóm: -OH, -COOH, -NH2, -S [27][50][58]. Phản ứng được thực hiện theo nhiều
bước (Hình 1.8) [19][28]:
1. Thuốc (drug) phản ứng với dạng oxy hóa của Cytochrome P450 (Fe3+) tạo
thành phức hợp Drug-P450 (Fe3+).
2. Phức hợp Drug- P450 (Fe3+) nhận 1 electron từ NADPH, bị khử thành Drug P450 (Fe2+).
3. Sau đó, phức hợp Drug- P450 (Fe2+) phản ứng với 1 phân tử oxy để tạo thành
phức hợp oxy hoạt hóa.

12


4. Cuối cùng, 1 nguyên tử oxy được giải phóng, tạo H2O. Còn nguyên tử oxy
thứ 2 s oxy hóa thuốc: Drug  Drug-OH, và Cyt. P450 (Fe3+) được tái tạo.
Kết quả của quá trình chuyển hóa làm thuốc không có hoạt tính trở thành chất
có hoạt tính.

Hình 1.8. Vai trò của Cytochrome P450 trong chuyển hóa thuốc [19][28]
Gen CYP2C9 có tính đa hình cao, hơn 50 nucleotide polymorphisms (SNPs)
đã được tìm thấy trên vùng mã hóa của gen CYP2C9 [26]. Một số SNP đã được
chứng minh là có liên quan tới việc làm giảm hoạt tính khử của enzym so với dạng
kiểu dại. Theo kết quả nghiên cứu của Saraevaf và cs (2007) đã xác định được gen

CYP2C9 là enzym chuyển hóa acenocoumarol, trong đó alen CYP2C9*3 có vai trò
quan trọng trong quyết định liều lượng sử dụng acenocoumarol [58]. Một nghiên
cứu khác của Tassies và cs (2002) cũng cho rằng người mang alen CYP2C9*2,
CYP2C9*3 chỉ cần liều thuốc acenocoumarol thấp hơn từ 16 - 27% [24].

13