Tách dòng và biểu hiện gen VP1 của Enterovirus 71

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP. HCM
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

NGUYỄN DANH LÂM

TÁCH DÒNG VÀ BIỂU HI ỆN GEN VP1 CỦA
ENTEROVIRUS 71
Chuyên ngành : Công nghệ sinh học
Mã số 60.42.02.01

LUẬN VĂN THẠC SĨ

TP. HỒ Chí Minh, tháng 12 năm 2015


CÔNG TRÌNH ĐƯỢC HOÀN THÀNH TẠI
VIỆN PASTEUR TP. HỒ CHÍ MINH

Cán bộ hướng dẫn khoa học: PGS.TS. CAO THỊ BẢO VÂN

Cán bộ chấm nhận xét 1: PGS.TS. LÊ PHI NGA

Cán bộ chấm nhận xét 2: PGS.TS. NGUYỄN THỦY HƯƠNG

Luận văn thạc sĩ được bảo vệ tại Trường Đại học Bách Khoa, ĐHQG Tp. HCM ngày 08 tháng
01 năm 2016.
Thành phần Hội đồng đánh giả luận vẫn thạc sĩ bao gồm:
1. Chủ tịch: TS. Hoàng Quốc Khánh
2. Phản biện 1: PGS.TS. Lê Phi Nga
3. Phản biện 2: PGS.TS. Nguyễn Thúy Hương
4. ủy viên: TS. Nguyễn Tú Anh

5. Thư ký: TS. Hoàng Mỹ Dung
Xác nhận của Chủ tịch Hội đồng đanh giá luận văn và Trưởng Khoa quản lý chuyên ngành sau
khi luận văn đã được sửa chữa (nếu cố).

CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG

TRƯỞNG KHOA KTHH


ĐẠI HỌC QUÓC GIA TP.HCM
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM
Độc lập - Tự do - Hạnh phúc

NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ
Họ tên học viên: NGUYỄN DANH LÂM ........................................ MSHV: 13310303
Ngày, tháng, năm sinh: 12/10/1983 ................................................... Nơi sinh: Hà Nội
Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học .............................................. Mã số : 60.42.02.01
l.

TÊN ĐỀ TÀI: Tách dòng và biểu hiện gen VP1 của Enterovirus 71

II. NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG:
-

Tạo dòng gen VP1 của EV71 trong hệ thống biểu hiện pET SUMO.

-

Tối ưu hóa biểu hiện protein VP1 trong tế bào E.coli DE3 (E.coli BL21).
- Tinh chế protein VP1 tái tổ hợp bằng phương pháp sắc ký ái lực.

III.

NGÀY GIAO NHIỆM VỤ: 19/01/2015

IV.

NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ: 09/12/2015

V.

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN: PGS.TS. CAO THỊ BẢO VÂN
Tp. HCM, ngày.... tháng.... năm 20....
CÁN BỘ HƯỚNG DẪN
(Họ tên và chữ ký)

CHỦ NHIỆM BỘ MÔN ĐÀO TẠO
(Họ tên và chữ ký)

TRƯỞNG KHOA KTHH
(Họ tên và chữ ký)


-i-

LỜI CẢM ƠN
Với lòng biết ơn sâu sẳc em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới PGS. TS Cao Thị Bảo Vân,
Trưởng phòng sinh học phân tử - Viện Pasteur Thành phố Hồ Chí Minh đã tận tình hướng dẫn,

truyền thụ cho em kiến thức quý báu cũng như lòng nhiệt tình trong suốt quả trình hoàn thành đề
tài.
Em xin gửi lời cảm ơn đến tất cả quí thầy cô trong Ngành Công nghệ sinh học - Khoa Kỹ
thuật Hóa học, trường Đại học Bách khoa Thành phố Hồ Chí Minh, đã cung cấp cho em những
kiến thức bổ ích suốt quá trình học tập ở trường.
Xin cảm ơn các anh, chị Phòng sinh học phân tử - Viện Pasteur Thành phố Hồ Chí Minh,
đặc biệt anh Nguyễn Văn Khoa đã giúp đỡ rẩt nhiều và chia sẻ những kinh nghiêm để tôi hoàn
thành luận văn này.
Xin cảm ơn Lãnh đạo Phân viện Khoa học Hình sự tại Thành phố Hồ Chí Minh đã tạo điều
kiện về thời gian và tinh thần cho tôi hoàn thành tốt chương trình học tập của mình.
Cuối cùng xin cảm ơn gia đình, người thân đã động viên, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình
học tập.
TP.HCM, tháng 12 nãm 2015
Nguyễn Danh Lâm


TÓM TẮT LUẬN VĂN
Enterovirus 71 là tác nhân gây ra bệnh Tay Chân Miệng có khả năng gây ra những biến
chứng thần kinh nghiêm trọng và thường dẫn đến tử vong. Để ngăn ngừa và theo dõi sự truyền
nhiễm cũng như biến đổi di truyền của EV71 cần phải có phương pháp kịp thời và hiệu quả.
Việc xác ên cứu bước đầu, chúng tôi đã thu được một số thành công nhất định:
-

Đoạn gen VP1 đã được phân lập từ chủng Enterovirus 71 phân nhóm C4 (VND11/202N2) và

nối thành công vào vector pET SUMO tạo vector tái tổ hợp pET SƯMO-VP1. Vector tái tổ hợp này
sau đó đã được biến nạp và nhân lên ửong tế bào E.coli Machl™ - T1R để bảo quản cũng như làm
nguồn nguyên liệu cung cấp plasmid tái tổ hợp cho các nghiên cứu biểu hiện tiếp theo.
-

Chúng tôi đã biểu hiện thành công protein VP1 tái tổ hợp trong tế bào E.coli DE3 (BL21).

Protein tái tổ hợp biểu hiện chủ yếu nằm ở dạng thể vùi. Chúng tôi đã khảo sát các điều kiện biểu hiện
và tìm được điều kiện biểu hiện tối ưu protein VP1 tái tổ hợp ở nồng độ IPTG tối ưu 0.6 mM và ở
thời điểm 3 giờ sau cảm ứng.
-

Đã xây dựng được quy trình tinh chế protein VP1 tái tổ hợp với hàm lượng và độ tinh sạch

như mong đợi. Thể vùi đã được hòa tan trong dung dịch chứa Na3PŨ4 0.02M, NaCl 0.5 M, Imidazole
0.015M và Urea 8M. Protein VP1 tái tổ hợp được rửa giải khỏi cột Nikel bằng dung dịch chứa
Na3PŨ4 0.02M, NaCl 0.5 M, Imidazole 0.5M và Urea 8M.
5.2.

Đề nghị

Kết quả đạt được là thu protein VP1 có hoạt tính sinh học. Do đó, chúng tôi đề nghị tiếp tục tái
gấp cuộn và thử nghiệm hoạt tính của protein VP1 tái tổ hợp tiến tới những ứng dụng sâu hom.

TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tài liệu tiếng Việt
1. Bộ Y tế. Hướng dẫn Chẩn đoán, điều trị bệnh tay-chân-miệng. Ban hành kèm theo Quyết định
số: 1732 /QĐ-BYT ngày 16 tháng 5 năm 2008 của Bộ trưởng Bộ Y tế.
2. Cao Đăng Nguyên, Đỗ Qúi Hải (2002), Công nghệ protein, Nhà xuất bản Đại học Huế.
3. N.T.H.Thanh., et al., (2010), Bệnh tay chân miệng ở người năm 2008 do virus đường ruột tuy
71 và virus Coxsackie A16, Tạp chí Y học dự phòng, Tập XX số 6 (114), tr: 46-52.
4. Nguyễn Thanh Thủy, Trần Quang Huy. Alas vi rút gây bệnh cho người. Nhà xuất bản khoa
Luận văn Thạc sỹ

Kết luận và đề nghị

-51học tự nhiên và công nghệ (2010) tr. 190.
5. PGS.TS. Trần Đình Bình - Bộ môn Vi sinh vật Y học, Trường Đại học Y Dược Huế.
Coxsackievirus và bệnh tay chân miệng. Thông tin khoa học 2011.
6. Trần Ngọc Hữu. 2012. Đặc điểm dịch tễ học bệnh tay chân miệng ở 20 tỉnh thành phía Nam
Việt Nam, giai đoạn 2005-2011. Tạp chí ung thư học Việt Nam, số 1-2012.
Tài liệu tiếng Anh
7. Amersham Pharmacia biotech, pGEX vectors (GST Gene Fusion System), Third Edition, Rev.
2, 18-1123-20 ().
8. Amersham, GST Gene Fusion System Handbook, Edition AA, 18-1157- 58 (http://www.
amershambiosciences .com).
9. Cardosa, M.J., et al., Molecular epidemiology of human enterovirus 71 strains and recent
outbreaks in the Asia-Pacific region: comparative analysis of the VP1 and VP4 genes. Emerg
Infect Dis, 2003. 9(4): p. 461-8.
10.Chan, Y.F. and s. AbuBaker, Recombinant human enterovirus 71 in hand, foot and mouth
disease patients. Emerg Infect Dis, 2004. 10(8): p. 1468-70.
11.Chen, H.L., et al., Expression ofVPl protein in the milk of transgenic mice: a potential oral
vaccine protects against enterovirus 71 infection. Vaccine, 2008. 26(23): p. 2882-9.
12.Chen, X., et al., A new baculovirus of cultured shrimps. Sci China c Life Sci, 1997. 40(6): p.
630-5.
13.De Jesus, N.H., Epidemics to eradication: the modem history of poliomyelitis. Vhol J, 2007.
4: p. 70.
14.Fernandez, J.M. and J.p. Hoeffler, Gene expression systems : using nature for the art of
expressionl999, San Diego: Academic Press, xii, 480 p.
15.Fikrig, E., et al., Protection of mice against the Lyme disease agent by immunizing with
recombinant OspA. Science, 1990. 250(4980): p. 553-6.
16.1nvitrogen (2006, Ni-NTA purification system for purification of polyhistidine-containing
recombinant proteins, User manual, Invitrogen corporation, USA
17.1nvitrogen. 2010. Champion™ pET SUMO Protein Expression System For high-level

expression and enhanced solubility of recombinant proteins in E. coli and cleavage of native
protein. Catalog no. K300-01.


-5218.K.P. Chan, KT Goh, c Y Chong, ES Teo, G Lau, A E Ling (2003), Epidemic hand, footh and
mouth disease caused by human Enterovirus 71 Singapore, Emerg Infect Dis, 9, pp. 78-85
19.Kaelin, W.G., Jr., et al., Expression cloning of a cDNA encoding a retinoblastoma-binding
protein with E2F-like properties. Cell, 1992. 70(2): p. 351-64.
20.Ke, Y.Y., Y.c. Chen, and T.H. Lin, Structure of the virus capsid protein VP1 of enterovirus 71
predicted by some homology modeling and molecular docking studies. J Comput Chem, 2006.
27(13): p. 1556-70.
21.Kew, O.M., et al., Prolonged replication of a type 1 vaccine-derived poliovirus in an
immunodeficient patient. J Clin Microbiol, 1998. 36(10): p. 2893-9.
22. Lightner D.v. (1996), a handbook of shrimp pathology and diagnostic procedures for for
disease of cultured penaeid shrimp, World aquaculture Society, Baton Rouge, Lousiana, USA.
23. McMinn, P.C., An overview of the evolution of enterovirus 71 and its clinical and public health
significance. FEMS Microbiol Rev, 2002. 26(1): p. 91- 107.
24. Mierendorf R., Yeager K., Novy R. (1994), “pET system: Your choice for expression’’, News
letter of Novagen Inc., 1(1).
25. Nasri, D., et al., Basic rationale, current methods and future directions for molecular typing
of human enterovirus. Expert Rev Mol Diagn, 2007. 7(4): p. 419-34.
26. New England Biolabs (2005), Tools for Protein Research, New England Biolabs Inc., Ipswich,
USA
27. New England Biolabs, IMPACTTM I; One-Step protein purification system, Purification of
recombinant by a self- cleavable affinity tag, version 1.8, New England Biolabs Inc., Ipswich,
USA.
28. Nilsson, J., et al., Affinity fusion strategies for detection, purification, and immobilization of
recombinant proteins. Protein Expr Purif, 1997. 11(1): p. 1-16.
29. Novagen (2006), pET System Manual, TB055 11th Edition, Rev.B 0403, USA 800-207-0144.
30. Ooi, M.H., et al., Clinical features, diagnosis, and management of enterovirus 71. Lancet

Neurol, 2010. 9(11): p. 1097-105.
31. QIAGEN. 2006. QIAprep® Miniprep Handbook.
32. QIAGEN. 2007. QIAamp® Vữal RNA Mini Handbook.


-5333. QIAGEN. 2008. QIAquick® Gel Exttaction Handbook.
34. Qi-han LI, et al., Genetic analysis of the VP1 region of human enterovirus 71 strains isolated
in Fuyang, China, during 2008. VIROLOGICA SINICA, June 2009, 24 (3):162-170.
35. Shi, M., et al., Expression of enterovirus 71 capsid protein VP1 in Escherichia coli and its
clinical application. Braz J Microbiol, 2013. 44(4): p. 1215-22.
36. Shih, S.R., et al., Expression of capsid [correction ofcaspid] protein VPỈ for use as antigen
for the diagnosis of enterovirus 71 infection. J Med Vữol, 2000. 61(2): p. 228-34.
37. Solomon, T., et al., Virology, epidemiology, pathogenesis, and control of enterovirus 71.
Lancet Infect Dis, 2010. 10(11): p. 778-90.
38. Tee, K.K., et al., Evolutionary genetics of human enterovirus 71: origin, population dynamics,
natural selection, and seasonal periodicity of the VP1 gene. J Vừol, 2010. 84(7): p. 3339-50.
39. Tu, P.V., et al., Epidemiologic and virologic investigation of hand, foot, and mouth disease,
southern Vietnam, 2005. Emerg Infect Dis, 2007. 13(11): p. 1733-41.
40. Tung, W.S., et al., DNA vaccine constructs against enterovirus 71 elicit immune response in
mice. Genet Vaccines Ther, 2007. 5: p. 6.
41.77ỈC QIAexpressionistTM (2003), A handbook for high-level expression and purification of
6xHis-taggedproteins, Fifth edition, QIAGEN, Germany.
42. ThermoFisher Scientific User Guide: Random Hexamer Primer. Catalog number: so 142
43. Western Blotting Handbook and Troubleshooting Guide
44. WHO (World Health Organization). 2011.A Guide to Clinical Management and Public Health
Response for Hand, Foot and Mouth Disease (HFMD).
45. Zhang, Y.X., et al., Construction and characterization of an infectious cDNA clone of
enterovirus type 71 subgenotype C4. Virus Genes, 2013. 47(2): p. 235-43.
Tài liệu Internet
46. httD://www. unÌDrot.ors/unĨDrot/066478

PHỤ LỤC
1. Trình tự VP1 phân nhóm C4 phân lập ở Việt Nam
GGAGATAGGGTGGCAGATGTGATTGAAAGTTCCATAGGAGATAGC


-54GTGAGCAGAGCCCTCACTCACGCTCTACCAGCACCCACAGGCCAGA
ACACACAGGTGAGCAGTCATCGACTGGATACGGGCAAGGTTCCAG
CACTCCAAGCTGCTGAAATTGGAGCATCATCAAATGCTAGTGACGA
GAGTATGATTGAGACACGCTGTGTTCTCAACTCGCACAGTACAGCA
GAGACCACTCTTGATAGTTTCTTCAGCAGGGCGGGATTAGTTGGAG
AGATAGATCTCCCTCTTGAGGGCACAACTAACCCAAATGGTTATGC
CAACTGGGACATAGATATAACAGGTTACGCGCAAATGCGTAGAAA
GGTAGAGCTATTCACCTACATGCGCTTTGATGCAGAGTTCACTTTTG
TTGCGTGCACACCTACCGGGGAAGTTGTCCCACAATTGCTCCAATA
TATGTTTGTGCCACCTGGAGCCCCTAAGCCAGATTCTAGGGAATCC
CTTGCATGGCAAACCGCCACTAACCCCTCAGTTTTTGTCAAGCTGTC
AGACCCTCCAGCGCAGGTTTCAGTGCCATTCATGTCACCTGCGAGT
GCTTATCAATGGTTTTATGACGGATATCCCACATTCGGAGAACACA
AACAGGAGAAAGATCTTGAATACGGGGCATGTCCTAATAACATGA
TGGGCACGTTCTCAGTGCGGACTGTAGGGACCTCCAAGTCCAAGTA
CCCTTTAGTGGTTAGGATTTACATGAGAATGAAGCACGTCAGGGCG
TGGATACCTCGCCCGATGCGTAACCAGAACTACCTATTCAAAGCCA
ACCCAAATTATGCTGGCAACTCCGTTAAGCCAACTGGTGCCAGTCG
CACAGCGATCACCACTCTT
2. Trình tự acid amin của protein VP1 sau khi được dịch mã bằng phần mềm Bioedit
GDRVADVIESSIGDSVSRALTHALPAPTGQNTQVSSHRLDTGKVPALQ
AAEIGASSNASDESMIETRCVLNSHSTAETTLDSFFSRAGLVGEIDLPLE
GTTNPNGYANWDIDITGYAQMRRKVELFTYMRFDAEFTFVACTPTGE
VVPQLLQYMFVPPGAPKPDSRESLAWQTATNPSVFVKLSDPPAQVSVP

FMSPASAYQWFYDGYPTFGEHKQEKDLEYGACPNNMMGTFSVRTVG
TSKSKYPLVVRIYMRMKHVRAWIPRPMRNQNYLFKANPNYAGNSVK
PTGASRTAITTL

Luận văn Thạc sỹ

Phụ lục