NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG SINH ENZYME NGOẠI BÀO TỪ CÁC LOÀI NẤM SỢI PHÂN LẬP Ở THÁI NGUYÊN

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI
NGHIÊN CỨU KHOA HỌC SINH VIÊN
NĂM HỌC 2016- 2017

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG SINH ENZYME NGOẠI BÀO
TỪ CÁC LOÀI NẤM SỢI PHÂN LẬP Ở THÁI NGUYÊN

Sinh viên thực hiện: Thân Thị Kim Phượng
Đinh Thị Thùy
Người hướng dẫn: T.S Nguyễn Hữu Quân

Thái Nguyên, tháng 5 năm 2017


ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI
NGHIÊN CỨU KHOA HỌC SINH VIÊN
NĂM HỌC 2016- 2017

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG SINH ENZYME NGOẠI BÀO
TỪ CÁC LOÀI NẤM SỢI PHÂN LẬP Ở THÁI NGUYÊN

Xác nhận của người hướng dẫn

Sinh viên thực hiện

T.S Nguyễn Hữu Quân

Thân Thị Kim Phượng

Đinh Thị Thùy

Thái Nguyên, tháng 5 năm 2017


i

LỜI CẢM ƠN
Chúng em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới thầy giáo TS. Nguyễn Hữu Quân đã
tận tình hướng dẫn và thường xuyên giúp đỡ trong quá trình thực hiện đề tài nghiên
cứu khoa học.
Chúng em xin chân thành cảm ơn cô Trần Thị Hồng đã giúp đỡ trong thời gian
làm thực nghiệm.
Chúng em xin chân thành cảm ơn Ban chủ nhiệm khoa, các thầy cô giáo thuộc bộ
môn Sinh học hiện đại và Giáo dục Sinh học, cùng toàn thể các thầy cô giáo trong
Khoa Sinh học, Trường Đại học sư phạm Thái Nguyên đã tạo điều kiện giúp đỡ để
chúng em hoàn thành đề tài nghiên cứu khoa học.
Chúng em xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè đã động viên, giúp đỡ trong
suốt quá trình thực hiện đề tài.
Thái Nguyên, ngày 10 tháng 4 năm 2017
Sinh viên

Đinh Thị Thùy
Thân Thị Kim Phượng

ii

MỤC LỤC
Trang
Trang bìa phụ
Lời cảm ơn...................................................................................................................... i
Mục lục.......................................................................................................................... ii
Danh mục bảng biểu.....................................................................................................iv
Danh mục các hình........................................................................................................v
Danh mục từ viết tắt.......................................................................................................v
MỞ ĐẦU....................................................................................................................... 1
1. Đặt vấn đề.................................................................................................................. 1
2. Mục tiêu nghiên cứu..................................................................................................1
3. Nội dung nghiên cứu..................................................................................................1
4. Phương pháp nghiên cứu..........................................................................................2
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU.....................................................................3
1.1. Enzyme chitinase....................................................................................................3
1.1.1. Khái niệm và phân loại........................................................................................3
1.1.2. Cơ chế hoạt động của chitinase...........................................................................4
1.1.3. Nguồn thu nhận chitinase....................................................................................5
1.1.4. Yếu tố môi trường ảnh hưởng đến khả năng sinh chitinase của nấm sợi..............7
1.1.5. Nghiên cứu về chitinase:......................................................................................8
1.2. Enzyme protease...................................................................................................10
1.2.1. Khái niệm về protease........................................................................................10
1.2.2. Nguồn gốc của protease.....................................................................................10
1.2.3. Phân loại............................................................................................................11
1.2.4. Đặc điểm và tính chất của protease vi sinh vật...................................................12
1.2.5. Cấu trúc trung tâm hoạt động (TTHĐ) của protease..........................................13
1.2.6. Cơ chế xúc tác của protease...............................................................................14
1.2.7. Ảnh hưởng của môi trường lên khả năng sinh protease.....................................14

1.2.8. Tình hình nghiên cứu protease...........................................................................16
CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP......................................................18
2.1. Vật liệu, hóa chất và thiết bị..................................................................................18
2.1.1. Vật liệu............................................................................................................... 18


iii
2.1.2 Thiết bị................................................................................................................ 18
2.1.3. Hóa chất.............................................................................................................18
2.1.4. Môi trường nuôi cấy..........................................................................................19
2.2. Phương pháp nghiên cứu......................................................................................19
2.2.1. Phân lập nấm......................................................................................................19
2.2.2. Nuôi cấy nấm sinh tổng hợp enzyme.................................................................19
2.2.3. Định tính enzyme trên đĩa thạch........................................................................20
2.2.4. Xác định hoạt tính protease................................................................................20
2.2.5. Tối ưu điều kiện nuôi cấy...................................................................................21
2.2.6. Phương pháp xử lý số liệu..................................................................................22
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN............................................................23
3.1. Phân lập chủng nấm sợi có khả năng sinh tổng hợp chitinase và protease............23
3.2. Xác định đặc điểm hình thái của các chủng nấm..................................................24
3.3. Tối ưu điều kiện nuôi cấy nấm Aspergillus sinh tổng hợp protease......................27
3.3.1. Khả năng sinh protease theo thời gian nuôi cấy.................................................27
3.3.2. Ảnh hưởng của pH nuôi cấy..............................................................................28
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ...................................................................................29
KẾT LUẬN................................................................................................................29
TÀI LIỆU THAM KHẢO.........................................................................................30


iv

DANH MỤC BẢNG BIỂU
Trang
Bảng 2.1 Thiết bị được sử dụng trong thí nghiệm.......................................................18
Bảng 2.2. Các hóa chất được sử dụng trong thí nghiệm..............................................18
Bảng 3.1. Một số đặc điểm hình thái của các chủng nấm phân lập.............................25
Bảng 3.2. Hoạt tính protease theo thời gian từ nấm Aspergillus phân lập ở đất...........27
Bảng 3.3. Hoạt tính protease ở các pH khác nhau từ nấm Aspergillus phân lập ở
đất................................................................................................................................ 28


v

DANH MỤC CÁC HÌNH
Trang
Hình 1.1. Phản ứng thủy phân liên kết peptide............................................................10
Hình 1.2. Cơ chế hai bước hoạt động của serine protease...........................................14
Hình 2.1. Đường chuẩn nồng độ tyrosin.....................................................................21
Hình 3.1. Hoạt tính protease (A) và chitinase (B) của các chủng nấm phân lập được
.................................................................................................................... 23
Hình 3.2. Sợi nấm phát triển trên môi trường PDA và Crapek lỏng............................26


vi

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

Bp

Cặp base

DNS

3,5- Dinitrosalicylic acid

EDTA

Ethylendiamin Tetraacetic Acid

GlcNAc

N-acetylglucosamine

(GlcNAc)2

Diacetylchitobiose

(GluNAc)3

Chitooligomer

kDa

Kilo Dalton

PDA

Potato Dextrose Agar

TCA

Trichloroacetic acid

TTHĐ

trung tâm hoạt động


1

MỞ ĐẦU
1. Đặt vấn đề
Nấm sợi phân bố rộng rãi trong tự nhiên, chúng có rất nhiều ứng dụng trong
nhiều lĩnh vực khác nhau như: y học, nông nghiệp, công nghiệp thực phẩm và tham
gia tích cực vào quá trình chuyển hóa vật chất, khép kín các vòng tuần hoàn vật chất
trong tự nhiên, làm vật chất được ổn định và từ đó bảo vệ sự cân bằng sinh thái. Nấm
sợi được sử dụng vào quá trình phân hủy rác thải hữu cơ trong đất phân hủy các chất
độc hại thành các chất không độc góp phần bảo vệ môi trường. Ngoài ra, nấm sợi còn
được ứng dụng trong sản xuất phân bón và thuốc trừ sâu sinh học nhằm mục đích thay
thế thuốc hóa học. Nhiều enzyme được khai thác từ nấm sợi được ứng dụng trong thời
gian qua như protease, amylase, cellulase, pectinase,…Đặc biệt, protease và chitinase
là hai loại enzyme có vai trò rất lớn trong tự nhiên.
So với nguồn enzyme từ động vật và thực vật, enzyme từ vi sinh vật có nhiều ưu
điểm vượt trội như: dễ sản xuất và thu nhận, môi trường lên men rẻ tiền, năng suất
sinh học cao. Đặc biệt, giá thành của các enzyme từ vi sinh vật rẻ hơn rất nhiều lần so
với các chế phẩm enzyme từ động vật, thực vật và có thể sản xuất cóở quy mô công
nghiệp. Trên thế giới các chế phẩm protease, chitinase tinh khiết thương mại hóa đã
được đưa vào ứng dụng nhưng lại có giá thành khá đắt.
Nhằm mục đích khai thác nguồn enzyme tự nhiên từ nấm sợi, góp phần làm giảm giá
thành và được ứng dụng trong thực tiễn. Xuất phát từ những lý do trên, chúng tôi tiến
hành lựa chọn đề tài: “Nghiên cứu khả năng sinh enzyme ngoại bào từ các loài nấm

sợi phân lập ở Thái Nguyên”.
2. Mục tiêu nghiên cứu
Phân lập được loài nấm sợi có khả năng sinh tổng hợp chitinase và protease tại
Thái Nguyên.
3. Nội dung nghiên cứu
Phân lập một số chủng nấm sợi có khả năng sinh tổng hợp chitinase và protease
ngoại bào.
Xác định đặc điểm hình thái của một số chủng nấm sợi thu được.
Tối ưu thời gian sinh tổng hợp chitinase và protease.


2
4. Phương pháp nghiên cứu
Phân lập nấm
Nuôi cấy nấm sinh tổng hợp enzyme
Định tính enzyme trên đĩa thạch
Xác định hoạt tính enzyme
Tối ưu điều kiện nuôi cấy
Xử lý số liệu bằng phần mềm excel


3

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Enzyme chitinase
1.1.1. Khái niệm và phân loại
Chitinase là enzyme thủy phân chitin thành các đơn phân N-acetyl glucosamine,
chitobiose hay chitotriose qua việc xúc tác sự thủy giải liên kết β-1, 4 glucoside giữa C1
và C4 của hai phân tử N-acetyl glucosamine liên tiếp nhau trong chitin.
Chitinase được chia thành 2 nhóm chính: Endochitinase (EC 3.2.1.14) và

exochitinase. Mỗi loại enzyme tham gia vào thủy phân cơ chất theo một cơ chế nhất
định và nhờ sự phối hợp hoạt động của các enzyme đó mà phân tử cơ chất được thủy
phân hoàn toàn thành các đơn phân N-acetylglucosamine. Các endochitinase phân tách
ngẫu nhiên chitin tại các vị trí nội tại tạo thành dimer dietylchitobiose và các
multimers khối phân tử thấp hòa tan của GlcNAc như chitotriose và chitotetraose.
Các exochitinase được chia thành 2 nhóm: Chitobiosidase (EC 3.2.1.29) liên
quan đến việc xúc tác cho sự giải phóng của các di-acetylchitobiose ở đầu không khử
của chitin và 1-4-β-glucosaminidases (EC 3.2.1.30) khử các sản phẩm oligomer của
endochitinase và chitobiosidase tạo ra monomer của GlcNac dựa vào sự giống nhau
giữa các axit amin của chitinase từ các sinh vật khác nhau.
Dựa vào cấu trúc phân tử, chitinase được sắp xếp vào ba họ là Glycohydrolase 18
, glycohydrolase 19 và glycohydrolase 20 [15]. Họ chitinase 18 phối rộng, có ở hầu hết
sinh vật (thực vật, vi khuẩn, nấm, động vật có vú, và virus). Họ Glycohydrolase 18 là
họ lớn nhất với khoảng 180 chi, được tìm thấy ở hầu hết các loài thuộc Eukaryote,
Prokaryote và virus. Họ này bao gồm chủ yếu là enzyme chitinase, ngoài ra còn có các
enzyme khác như chitodextrinase, chitobiase và N-acetyl glucosaminidase. Các
enzyme chitinase thuộc họ Glycohydrolase 18 có cấu trúc xác định gồm 8 xoắn α/β
cuộn tròn, chúng hoạt động thông qua một cơ chế kiểm soát mà trong đó các đoạn β
polymer bị phân cắt tạo ra sản phẩm là β anomer. Các chitinase thuộc họ
Glycohydrolase 18 được tổng hợp từ các loài như Aeromonas hydrophila, Bacillus
circularis, Trichoderma harzianum, Aphanocladium album, Serratia marcescens,…Họ
glycohydrolase 19 gồm hơn 130 chi, thường thấy chủ yếu ở thực vật, ngoài ra còn có ở
xạ khuẩn Streptomyces griceus, vi khuẩn Haemophilus influenzae,…Chúng có cấu trúc
hình cầu với một vòng xoắn và hoạt động thông qua cơ chế nghịch chuyển. Họ


4
Glycohydrolase 19 bao gồm những chitinase thuộc nhóm I, II, IV. Chitinase loại I có
đặc điểm tương tự với chitinase trong lớp IV, bao gồm các đặc tính miễn dịch, nhưng
chúng nhỏ hơn đáng kể so với các loại chitinase lớp I. Họ Glycohydrolase 20 bao gồm

β-N-acetyl-D-Glucosamine acetylhexosaminidase từ vi khuẩn, Streptomyces và người.
Dựa vào trình tự axit amin, sự định vị enzyme, điểm đẳng điện, peptide nhận biết
và vùng cảm ứng, chitinasae được chia thành 5 nhóm: I, II, III, IV, V. Nhóm I: là
những đồng phân enzyme trong phân tử có đầu N giàu cystein nối với tâm xúc tác
thông qua một đoạn giàu glycin hoặc prolin ở đầu carboxyl (C) (peptide nhận biết).
Vùng gắn chitin này tạo ra các đặc tính sinh học riêng cho chitinase ở nhiều loài sinh
vật khác nhau. Ở nấm men, vùng gắn chitin nằm ở đầu C giúp định vị chitinase trên
thành tế bào nấm men, đóng vai trò trong việc phân tách tế bào mẹ khỏi các tế bào chị
em. Vùng giàu cystein có vai trò quan trọng đối với sự gắn kết enzyme và cơ chất
chitin nhưng không cần cho hoạt động xúc tác.
Nhóm II: Là những đồng phân enzyme trong phân tử chỉ có tâm xúc tác, thiếu
đoạn giàu cystein ở đầu N và peptid nhận biết ở đầu C, có trình tự axit amin tương tự
chitinase ở nhóm I. Chitinase nhóm II có ở thực vật, nấm, và vi khuẩn.
Nhóm III: trình tự amino acid hoàn toàn khác với chitinase nhóm I và II, nhưng
rất giống với trình tự với lysozym, vì thế chúng mang hoạt tính enzyme lysozym.
Nhóm IV: là những đồng phân enzyme chủ yếu có ở lá cây hai lá mầm,
41-47% trình tự amino acid ở tâm xúc tác của chúng tương tự như chitinase nhóm I,
phân tử cũng có đoạn giàu cystein nhưng kích thước phân tử nhỏ hơn đáng kể so với
chitinase nhóm I.
Nhóm V: dựa trên những dữ liệu về trình tự, người ta nhận thấy vùng gắn chitin
(vùng giàu cystein) có thể đã giảm đi nhiều lần trong quá trình tiến hóa ở thực vật bậc
cao [16].
1.1.2. Cơ chế hoạt động của chitinase
Các loại enzyme tham gia phân giải chitin bao gồm: endochitinase, chitin 1-4-βchitobiosidase, N-acetyl-β- D-glucosaminidase (exochitinase) và chitobiase
Endochitinase là enzyme phân cắt nội mạch chitin một cách ngẫu nhiên tạo các
đoạn olygosaccharide, đã được nghiên cứu từ dịch chiết môi trường nuôi cấy nấm
Trichoderma harzianum. Chitin 1, 4-β- chitobiosidase phân cắt chitin tạo thành các sản


5

phẩm chính là các dimer chitobiose, cụ thể enzyme này được thu từ Trichoderma
harzianum.
N-acetyl-β- D - glucosaminidase (exochitinase) là enzyme phân cắt chitin từ một
đầu cho sản phẩm chính là các monomer N-acetyl-D-glucosamine. Chitobiase là
enzyme phân cắt chitobiose thành hai đơn phân N-acetyl-D-glucosamine.
Endochitinase phân cắt ngẫu nhiên trong nội mạch của chitin và chitooligomer,
sản phẩm tạo thành là một hỗn hợp các polymer có trọng lượng phân tử khác nhau,
nhưng chiếm đa số là các diacetylchitobiose (GlcNAc) 2 do hoạt tính endochitinase
không thể phân cắt thêm được nữa. Chitin 1,4-chitobiosidase phân cắt chitin và
chitooligomer ở mức trùng hợp lớn hơn hay bằng 3 [(GlcNAc)n với n ≥ 3] từ đầu
không khử và chỉ phóng thích diacetylchitobiose (GlcNAc)2.
β-N-acetyl hexosaminidase phân cắt các chitooligomer hay chitin một cách liên
tục từ đầu không khử và chỉ phóng thích các đơn phân N-acetyl glucosamine
(GlcNAc). Ngoài ra, để khảo sát kiểu phân cắt, người ta sử dụng
N-acetyl-chito-oligosaccharide làm cơ chất. Các oligsaccharide thường được thủy
phân bên trong trên một vài vị trí xác định hoặc một cách ngẫu nhiên. Một số chitinase
có khả năng thủy phân trisaccharide, một số khác thì không. Có hai dạng chitinase
thủy phân pentasaccharide: một phân cắt bên trong tạo disaccharid và trisaccharid; một
phân cắt bên ngoài tạo các monosaccharid và tetrasaccharid. Tóm lại chitinase thực
chất là enzyme cắt ngẫu nhiên.
Chitin và vách tế bào nấm chứa chitin là những cơ chất thích hợp cho
endochitinase hơn là chitobiosidase và β-N-acetylhexosaminidase. Chitooligomer
(GluNAc)3 và cao hơn nữa là sợi chitin đều là cơ chất của cả 3 loại enzyme trên nhưng
β-N-acetylhexosaminidase thì hoạt động chậm hơn trong việc làm giảm độ đục của
huyền phù chitin. (GlcNAc)2 là cơ chất tốt nhất của β-N-acetylhexosaminidase nhưng
không là cơ chất của endochitinase hay chitobiosidase. Chính vì thế có thể sử dụng để
phân biệt hoạt tính giữa endochitinase, chitobiosidase và β-N- acetylhexosaminidase.
Sản phẩm sau cùng của sự phân cắt là N-acetyl glucosamine.
1.1.3. Nguồn thu nhận chitinase
Chitinase được tìm thấy trong vi khuẩn như Chromobacterium, Klebsiella,

Pseudomonas, Clostridium, Vibrio, Bacillus và đặc biệt ở xạ khuẩn Streptomycetes. Vi
khuẩn tổng hợp chitinase nhằm phân giải các loại chitin trong môi trường nhằm sử


6
dụng nguồn cacbon cho sự sinh trưởng và phát triển. Trong quá trình nuôi cấy vi sinh
vật người ta thường bổ sung thêm cơ chất làm tăng khả năng sinh tổng hợp chitinase
và ổn định hoạt tính của enzyme sau tách chiết. Vi khuẩn sinh chitinase nhằm đáp ứng
nhu cầu dinh dưỡng. Chúng thường tổng hợp nhiều loại chitinase để có thể phân cắt
được các loại chitin đa dạng trong tự nhiên. Như vậy, chitinase vi khuẩn đóng vai trò
quan trọng trong chu trình chitin trong tự nhiên.
Chitinase cũng được sinh ra bởi các loài nấm sợi. Các chủng nấm sợi sinh
chitinase cao như: Trichoderma, Gliocladium, Calvatia, …Đặc biệt là ở các loài nấm
lớn như Lycoperdon, Coprinus. Chitinase của nấm cũng đóng vai trò quan trọng về
mặt dinh dưỡng nhưng khác là hoạt động của chúng rất linh hoạt trong quá trình phát
triển và trong sự phát sinh hình thái của nấm bởi vì chitin là thành phần chính của vách
tế bào nấm. Trong các môi trường nuôi cấy vi sinh vật, người ta đều cho thêm chitincơ chất của chitinase để làm tăng khả năng tổng hợp chitinase, đồng thời ổn định hoạt
tính chitinase sau quá trình chiết tách.
Các thực vật bậc cao có khả năng sinh chitinase như: lúa, lúa mì, lúa mạch, lúa
mạch đen, cao su, thuốc lá,cà rốt, bắp cải, bắp, khoai tây, đậu Hà Lan, đậu nành, củ từ
và một số loài tảo biển. Chitinase ở thực vật tồn tại chủ yếu trong các mô nhất định
hoặc cơ quan sinh sản như hạt giống, củ, hoa và được cảm ứng bởi côn trùng, cũng
như các tác nhân gây hại trên thực vật. Ví dụ, các endochitinase mang tính base trong
lá đậu tập trung trong không bào và có chứa hầu hết các hoạt tính chitinase nội bào.
Các protein kháng khuẩn khác nhau được phân lập từ thực vật bao gồm thionin,
protein bất hoạt ribosome, defensin và các enzyme phân giải như β-1,3-glucanase và
chitinase. Nhiều chitinase, giống như các protein khác đóng vai trò bảo vệ, có thể chịu
được các protease ngoại bào, mang tính axit hoặc base.
Từ một số động vật nguyên sinh và từ các mô, tuyến khác nhau trong hệ tiêu hóa
của nhiều loài động vật không xương: ruột khoang, giun tròn, thân mềm, chân đốt (ví

dụ trong dịch ruột của ốc sên Helix aspersa), ta có thể thu nhận được chitinase. Đối
với động vật có xương sống, chitinase được tiết ra từ tuyến tụy và dịch dạ dày của các
loài cá, lưỡng cư, bò sát ăn sâu bọ, trong dung dịch dạ dày của những loài chim, thú ăn
sâu bọ. Chitinase còn được thu nhận từ dịch biểu bì của giun tròn trong suốt quá trình
phát triển và dịch tiết biểu bì của các loài chân đốt vào thời điểm thay vỏ lột da.


7
Chitinase giúp côn trùng tiêu hóa màng ngoài (cuticle) trong quá trình biến thái hay lột
xác.
1.1.4. Yếu tố môi trường ảnh hưởng đến khả năng sinh chitinase của nấm sợi
1.1.4.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ
Nhiệt độ ảnh hưởng lớn đến tốc độ sinh trưởng và khả năng sinh enzyme của
nấm sợi. Enzyme xúc tác phản ứng hoạt động thích hợp ở dải nhiệt độ từ 20-50°C.
Nhiệt độ tối ưu cho sự sinh trưởng của đa số nấm sợi từ 28-32°C. Nhiệt độ quá cao
hoặc quá thấp làm biến đổi cấu trúc của enzyme có thể kìm hãm sự sinh trưởng, thậm
chí có thể giết chết sợi nấm, quá trình tổng hợp enzyme sẽ bị ức chế. Mỗi chủng vi
khuẩn khác nhau sẽ có giá trị nhiệt độ tối ưu cho enzyme hoạt động là khác nhau.
Những nghiên cứu trước đây cho thấy, nhiệt độ thích hợp cho sinh tổng hợp chitinase
từ nấm T. harzianusm là 28°C [28], Streptomyces sp. ANU 6277 là 35°C [20].
Aspergillus sp. tổng hợp chitinase có hoạt tính cao nhất ở điều kiện nhiệt độ 37°C.
Lorito (1998) đã khảo sát hoạt tính chitinase từ nấm Trichoderma harzianum, nhận
thấy enzyme này có khả năng hoạt động trong khoảng nhiệt độ rộng từ 25-60°C,
nhiệt độ tối ưu là 40°C [4] . Chitinase từ các chủng nấm sợi khác như Penicillium sp.
LYG 0704, Aspergillus carneus hoạt động tối ưu ở 40°C và Penicillium aculeatum ở
50°C [2].
1.1.4.2. Ảnh hưởng của độ ẩm
Độ ẩm có ý nghĩa trong nuôi cấy trên môi trường bán rắn. Theo Matsumoto và
cộng sự (2001) nhận thấy độ ẩm 75% nấm Verticillium lecanii ATCC 26854 sinh
chitinase cao nhất. Takashi và cộng sự (2002) nhận thấy, nấm sợi Aspergillus sp. tổng

hợp chitinase có hoạt tính cao ở điều kiện độ ẩm môi trường 57%.
1.1.4.3. Ảnh hưởng của pH
Giá trị pH môi trường ban đầu ảnh hưởng quan trọng đến khả năng sinh tổng hợp
chitinase của các chủng nấm sợi. Tùy thuộc vào từng loài, từng chủng mà pH môi
trường ban đầu thích hợp là axit, trung tính hay kiềm. Giá trị tối ưu của chitinase từ vi
sinh vật là 3,5-8,0. Nấm Aspergillus sp. tổng hợp chitinase có hoạt tính cao nhất ở điều
kiện pH = 5-6 [17]. Nhiều nghiên cứu trước đây cho thấy, chitinase từ một số loài như
nấm Penicillium chrochloron MTCC517 [23], L. psaliotae [17] và vi khuẩn S.


8
marcescens MO-1 hoạt động tốt nhất ở pH 7,0. Trong khi, chitinase từ nấm L.
chlamydosporium và L. suchlasporium, M. anisopliae [27] hoạt động tốt nhất ở pH
5,2-5,7 . Hoạt tính của chitinase sẽ nhanh chóng bị ức chế ở pH < 4,5, ngoại trừ
chitinase trong dạ dày của động vật có xương sống vẫn hoạt động ở pH 3,0.
1.1.4.4. Ảnh hưởng của cơ chất cảm ứng
Trong các môi trường nuôi cấy vi sinh vật người ta đều bổ sung thêm cơ chất
chitin nhằm tăng khả năng tạo chitinase. Nhìn chung sự có mặt của chitin trong môi
trường nuôi cấy hữu ích cho việc tạo chitinase. Năm 2003, Binod và cộng sự đã sử
dụng nhiều cơ chất khác nhau (như vách tế bào nấm, vỏ tôm, cua) để tạo chitinase từ
nấm sợi nuôi cấy trên môi trường bán rắn. Nghiên cứu của Đinh Minh Hiệp và các
cộng sự (2003) chỉ ra rằng hệ enzym chitinase của Trichoderma sp. có thể được cảm
ứng bởi vách tế bào vi nấm (Curvularia oryzae, Phytophthoraprimulae), vách tế bào
nấm lớn (Schizophyllum commune, Trametes versicolor) hoặc chitin vỏ tôm, trong đó
vách tế bào nấm cảm ứng quá trình sinh tổng hợp hệ enzyme chitinase của
Trichoderma tốt hơn chitin vỏ tôm. Goma (2012) khi tối ưu điều kiện nuôi cấy vi
khuẩn B. thuringiensis và B. licheniformis nhận thấy, nguồn nitơ là casein thích hợp
cho sự sinh trưởng và sinh tổng hợp chitinase. [4]
1.1.5. Nghiên cứu về chitinase:
1.1.5.1. Trên thế giới

Đối tượng được nghiên cứu sớm nhất và khá nhiều là xạ khuẩn Streptomyces.
Những nghiên cứu trên đối tượng này nhằm thu nhận chitinase ứng dụng chủ yếu vào
việc phá vỡ vách tế bào nấm. Năm 1978, Carroad và Tom có công trình nghiên cứu
việc sử dụng phương pháp sinh học trong xử lý chất thải chứa chitin, và tiếp đó là
nghiên cứu của Cosio và Fisher (1982) đề cập đến quá trình sản xuất enzyme nhằm xử
lý chất thải chứa chitin. Những năm gần đây, chitinase được nghiên cứu nhiều trên đối
tượng nấm sợi Trichoderma. Năm 1991, Ulhoa và Peberdy nghiên cứu sự điều hòa
quá trình sinh tổng hợp chitinase từ nấm Trichoderma harzianum cho thấy,
Trichoderma là chi nấm đến nay được phát hiện có hoạt tính chitinase khá cao, ứng
dụng nhiều trong các lĩnh vực, đặc biệt trong bảo vệ thực vật. Đối với chi nấm


9
Aspergillus cũng đã có một số công trình nghiên cứu về khả năng sinh chitinase của
chúng trên môi trường bán rắn.
Từ nấm Paecilomyces javanicus, Chen và đồng tác giả (2007) đã phân lập được
gen mã hóa chitinase từ DNA có chiều dài 1035 bp, không chứa intron, mã hóa cho
phân tử protein gồm 344 amino acid với khối lượng 37 kDa. Như vậy, gen mã hóa
chitinase từ một số chủng nấm là khác nhau về số lượng, kích thước và trình tự sắp
xếp của các nucleotide [8].
1.1.5.2. Trong nước
Nguyễn Thị Tuyết Nhung và cộng sự (2004) khi nghiên cứu khả năng đối kháng
nấm F. oxysporum và Phytophthora của một số chủng vi khuẩn đã phân lập được vi
khuẩn S. liquefaciens 1A8 có khả năng sinh tổng hợp chitinase cao trong môi trường
có chứa chitin keo, ở 20°C và pH 7,0 [7] . Năm 2008, Đinh Minh Hiệp và cộng sự đã
khảo sát hoạt tính chitinase từ một số chủng nấm Trichoderma phân lập tại Việt Nam.
Kết quả cho thấy, có 24/92 chủng nấm Trichoderma cho hoạt tính chitinase cao (hoạt
tính ≥ 14x10-2 đvht/ml). Trong số 36 chủng nấm Trichoderma phân lập từ đất vùng
Đông Nam Bộ, chủng Trichoderma TĐ14 sinh chitinase cao nhất sau 7 ngày nuôi
được sử dụng để tạo chitinase [3]. Năm 2008, Nguyễn Đình Nga và cộng sự khảo sát

khả năng tác động lên nấm Candida albicans của chitinase thu nhận từ thực vật và từ
nấm Trichoderma. Trên thực vật, năm 2008, Đặng Trung Thành đã nghiên cứu quá
trình thu nhận chitinase từ cây khoai lang Ipomoea batatas thu được chitinase có hoạt
tính khá cao (đạt 192 UI/ml) là 4 mg/ml.
Quá trình tối ưu sinh tổng hợp chitinase cũng là hướng nghiên cứu được thực
hiện. Năm 2012, bằng phương pháp quy hoạch thực nghiệm, Quách Ngọc Tùng và
cộng sự đã lựa chọn được môi trường tối ưu cho vi khuẩn B. licheniformis DS23 sinh
tổng hợp chitinase cao nhất. Năm 2013, Vũ Thị Thanh và cộng sự đã phân lập được
chủng nấm Penicillium sp. M4 có hiệu lực diệt rệp ngô cao (đạt 92,3% sau 7 ngày
phun) và được sử dụng để nghiên cứu khả năng sinh chitinase [9]. Ở Việt Nam,
nghiên cứu chitinase chủ yếu tập chung vào quá trình tối ưu khả năng sinh chitinase
trên một số chủng vi sinh vật và sử dụng chitinase để ức chế sự phát triển, cũng như
nghiên cứu biểu hiện gen chitinase trong lĩnh vực bảo vệ thực vật và khởi đầu trong
lĩnh vực y dược.


10
1.2. Enzyme protease
1.2.1. Khái niệm về protease
Protease là nhóm enzyme xúc tác quá trình thủy phân liên kết peptid trong phân
tử protein và polypeptid đến các sản phẩm cuối cùng là các axit amin. Ngoài ra, nhiều
protease cũng có khả năng thủy phân liên kết este và vận chuyển axit amin (Hình 1.1).
[31]

Hình 1.1. Phản ứng thủy phân liên kết peptide
1.2.2. Nguồn gốc của protease
Protease thường có ở thực vật, động vật và vi sinh vật. Tuy nhiên nguồn protease
ở vi sinh vật (vi khuẩn, nấm mốc và xạ khuẩn) là phong phú nhất.
Ở động vật, protease thường có ở tụy tạng, niêm mạc ruột non, niêm mạc dạ dày
trong đường tiêu hóa. Hệ protease ở tụy tạng gồm các loại như trypsin, chymotrypsin

và một số enzyme khác được tiết ra ngoài tế bào cùng với dịch tụy; pepsin có ở niêm
mạc dạ dày được tiết ra ngoài tế bào cùng với dịch vị tham gia vào quá trình tiêu hóa
thức ăn. Ở dạ dày bê non dưới 5 tháng tuổi có chứa renin, một loại enzyme đông tụ sữa
điển hình, được sử dụng phổ biến trong công nghệ sản xuất phomat. [6]
Bên cạnh đó, thực vật cũng được coi là nguồn sinh tổng hợp protease cao. Hệ
protease ở thực vật gồm các loại như papain có trong mủ cây đu đủ, quả đu đủ còn
xanh; Bromelain có ở quả, chồi và vỏ quả dứa; Các enzyme này được sử dụng để
chống lại hiện tượng tủa trắng của bia khi làm lạnh do kết tủa protein [16][26]. Fixcin
có trong mủ cây sung, quả sung, quả vả là nguồn enzyme được sử dụng để phân hủy
protein trong tự nhiên. Hiện nay, các nhà khoa học đã tạo ra được các giống đu đủ có
sản lượng mủ và hoạt tính papain cao để có thể khai thác hiệu quả nguồn enzyme này.
Ở họ dứa: Bao gồm tất cả các nòi dứa trồng lấy quả, lấy sợi (kể cả các nòi dứa dại).
Trong các bộ phận khác nhau của cây dứa (vỏ, lõi, chồi, thân, lá) đều có chứa
bromelain; sản lượng enzyme này phụ thuộc nhiều vào trạng thái và điều kiện bảo
quản nguyên liệu. Một số nghiên cứu đã chứng minh, các nguyên liệu khi sấy khô ở


11
nhiệt độ 40°C sẽ giữ được hoạt tính protease tốt hơn so với nguyên liệu đã được bảo
quản lạnh ở 4°C [6].
Protease từ nguồn động vật và thực vật được loài người khai thác và ứng dụng
hàng ngàn năm để sản xuất và phục vụ trong cuộc sống. Nhưng hiện nay lượng
enzyme thu nhận từ thực vật và động vật được thay thế dần bằng enzyme từ vi sinh
vật. Enzyme thu nhận từ vi sinh vật có hoạt tính cao; tốc độ sinh sản của vi sinh vật
mạnh, trong thời gian ngắn có thể thu được lượng sinh khối vi sinh vật rất lớn, lượng
enzyme nhiều hoặc lượng các sản phẩm trao đổi chất cao.
Protease được sinh ra từ vi sinh vật gồm các nhóm như vi khuẩn, xạ khuẩn và
nấm mốc.Vi khuẩn là một trong những nhóm vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp
protease mạnh nhất. Các vi khuẩn thuộc các chi như: Bacillus [14], Clostridium [25],
Aeromonas [15], Micrococcus [22] và Serratia [30]. Bên cạnh đó, nấm mốc cũng được

xem là đối tượng có khả năng sinh protease khá phong phú. Protease được sinh ra từ
các loài nấm thuộc các chi như Aspergillus [29], Trichoderma [13], Metharhizium
[24] và Penicillium [19]. Ngoài ra, xạ khuẩn cũng được coi là đối tượng có khả năng
sinh protase. Các xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces sinh tổng hợp protease gồm các
loài như: Streptomyces griseus, S. fradiae và S. gulbargensis. Đặc biệt, nấm men cũng
là nhóm có khả năng sinh tổng hợp protease mạnh, gồm các chi như Mitochondria.
Protease được tạo ra từ vi sinh vật có vai trò phân giải protein trong môi trường
để tạo nên các phân tử lượng nhỏ tham gia vào quá trình trao đổi chất của cơ thể.
Protease là một enzyme không thể thiếu đối với cơ thể vi sinh vật. Có thể nói, vi sinh
vật là nguồn nguyên liệu thích hợp nhất để sản xuất protease ở qui mô lớn dùng trong
công nghệ và đời sống.
1.2.3. Phân loại
Protease (peptidase) thuộc phân lớp 4 của lớp thứ 3 (E.C.3.4.) trong hệ thống
phân loại enzyme.
Dựa vào vị trí tác động của protease lên các peptide trong phân tử protein,
protease được chia thành 2 loại là endopeptidase (E.C.3.4.21-99) và exopeptidase
(E.C.3.4.11-17).
Exopeptidase gồm hai loại: loại 1 là aminopeptidase là enzyme xúc tác thủy
phân liên kết ở đầu N tự do của chuỗi polypeptide để giải phóng ra các axit amin,


12
dipeptide hoặc tripeptide. Loại 2 là carboxypeptidase là enzyme xúc tác thủy phân liên
kết peptide ở đầu C của chuỗi polypeptide và giải phóng ra một axit amin hoặc một
dipeptide.
Endopeptidase gồm 4 loại là serin protease, cysteine protease, aspartic protease
và metallo protease.
Loại 1: Serin protease là những protease chứa nhóm –OH của gốc serine trong
trung tâm hoạt động và có vai trò đặc biệt quan trọng đối với hoạt động xúc tác của
enzyme. Nhóm này bao gồm hai nhóm nhỏ là chymotrypsin và subtilisin. Nhóm

chymotrypsin bao gồm các emzyme động vật như chymotrypsin, trypsin, elastase.
Nhóm subtilisin bao gồm hai loại enzyme từ vi khuẩn như subtilisin Carlsberg,
subtilisin BPN. Các serin protease thường hoạt động mạnh ở vùng kiềm tính và thể
hiện tính đặc hiệu cơ chất tương đối rộng.
Loại 2: Cysteine protease là các protease chứa nhóm -SH trong trung tâm hoạt
động. Cysteine protease bao gồm các protease thực vật như papain, bromelin, một vài
protein động vật và protein ký sinh trùng. Các cysteine protease thường hoạt động ở
vùng pH trung tính, có tính đặc hiệu cơ chất rộng.
Loại 3: Hầu hết các aspartic protease thuộc nhóm pepsin. Nhóm pepsin gồm các
enzyme tiêu hóa như pepsin, chymosin, cathepsin, renin. Các aspartic protease có chứa
nhóm carboxyl trong trung tâm hoạt động và thường hoạt động ở pH trung tính.
Loại 4: Metallo protease là nhóm protease được tìm thấy ở vi khuẩn, nấm mốc
cũng như các vi sinh vật bậc cao hơn. Các metallo protease thường hoạt động mạnh ở
vùng pH trung tính và hoạt độ giảm mạnh dưới tác dụng của EDTA.
Dựa vào điểm đẳng điện, protease được chia thành 3 nhóm là: Protease axit với
pH từ 2-4 có nhiều ở tế bào động vật, nấm men nhưng ít thấy ở vi khuẩn. Protease
trung tính với pH từ 7-8 có ở động vật, thực vật và vi khuẩn. Protease kiềm với pH từ
9-11.
1.2.4. Đặc điểm và tính chất của protease vi sinh vật
Các công trình nghiên cứu protease từ vi sinh vật ngày càng nhiều. Các kết quả
nghiên cứu cho thấy ngay cả protease của cùng 1 loài vi sinh vật cũng có thể khác
nhau về nhiều tính chất. Căn cứ vào cơ chất phản ứng, pH hoạt động protease từ vi


13
sinh vật được chia thành 4 nhóm: protease-xerin, protease-thiol, protease-kim loại,
protease-axit.
Trong bốn protease trên, protease-xerin và protease-thiol có khả năng phân giải
liên kết este và liên kết amit của các dẫn xuất axit của axit amin. Ngược lại các
protease kim loại và protease axit thường không có hoạt tính esterase của các dẫn xuất

axit amin. Nhiều protease ngoại bào của vi sinh vật đã được nghiên cứu tương đối kỹ
về cấu tạo phân tử, một số tính chất hóa lý và cơ chế tác dụng. Kết quả cho thấy, khối
lượng phân tử của các enzyme này tương đối nhỏ, nhất là các protease-xerin. Các
protease-xerin có khối lượng phân tử thấp khoảng 20.000-27.000 Dalton. Tuy nhiên
một số protease-xerin có trọng lượng phân tử lớn hơn như các enzyme từ nấm
Penicilium cyoneofulvum (44.000), A. oryzae OUT 5038 (52.000). Khối lượng phân tử
của các protease kim loại lớn hơn so với protease-xerin (33.800- 48.400). Protease
thiol và nhiều protease axit khác cũng có trọng lượng phân tử vào khoảng 30.0040.000 Dalton.[31]
1.2.5. Cấu trúc trung tâm hoạt động (TTHĐ) của protease
Trong TTHĐ của protease từ vi sinh vật, ngoài gốc axit amin đặc trưng cho từng
nhóm còn có một số gốc axit amin khác. Các kết quả nghiên cứu về TTHĐ của một số
protease từ vi sinh vật cho thấy: TTHĐ của protease đủ lớn và bao gồm một số gốc
axit amin và trong một số trường hợp còn có cả cofactơ kim loại.
Các Protease kim loại có TTHĐ lớn hơn vào khoảng 21Å, có thể phân biệt thành
sáu phần dưới TTHĐ (subsite), mỗi phần dưới TTHĐ tương ứng với mỗi gốc axit
amin trong phân tử cơ chất.
Đối với các protease axit, cấu trúc TTHĐ gồm có hai hạt, giữa chúng có khe hở
vào khoảng 20Å. Khe hở này là phần xúc tác của các enzym, các gốc Asp- 35 và Asp215 xếp đối diện nhau trong khe ấy.
Đối với các protease không chứa cysteine, TTHĐ của chúng có tính mềm dẻo
hơn vì cấu trúc không gian của chúng không được giữ vững bởi các cầu disulphit.
Mặc dù TTHĐ của các protease từ vi sinh vật khác nhau nhưng các enzyme này
đều xúc tác cho phản ứng thủy phân liên kết peptide theo cùng một cơ chế chung như
sau: E + S → enzyme-S → enzyme-S + P1 → enzyme + P2


14
Trong đó: E là enzyme, S là cơ chất, enzyme - S: Phức chất enzym - cơ chất, P 1:
Là sản phẩm đầu tiên của phản ứng, P2: Là sản phẩm thứ hai của phản ứng.
1.2.6. Cơ chế xúc tác của protease
Dựa vào động học của cơ chế xúc tác, endopeptidase được chia thành 4 nhóm:

Serine protease, cysteine protease, aspartic protease và metallo protease [11]. Serine
protease là nhóm peptidase lớn nhất và được phát hiện ở mọi giới vi sinh vật. Những
enzyme này đều có chung một cơ chế xúc tác phản ứng thủy phân thông qua hai bước
chính:
Bước 1: Acyl hóa hình thành liên kết cộng hóa trị giữa nhóm -OH của serine với
nguyên tử cacbon trong nhóm cacboxyl của phân tử cơ chất nhờ sự hỗ trợ của nhóm
imidazol từ histidin. Kết quả phản ứng này là tạo ra một hợp chất trung gian và một
ion imidazol (phản ứng cộng). Hợp chất trung gian không bền này nhanh chóng bị
thủy phân thành một acyl-enzyme, vòng imidazol và một amin (phản ứng khử).
Bước 2: Khử acyl hóa, phức hệ acyl-enzyme bị thủy phân bởi phân tử H 2O theo
chiều ngược lại của bước 1. Trong đó, nhóm imidazole chuyển proton của gốc -OH từ
serine cho nhóm amin để tái sinh lại enzyme (Hình 1.2).

Hình 1.2. Cơ chế hai bước hoạt động của serine protease
1.2.7. Ảnh hưởng của môi trường lên khả năng sinh protease
1.2.7.1. Nguồn cacbon
Tùy loài sinh vật mà nguồn cacbon được sử dụng để sinh protease là khác nhau.
Có loài chỉ thích hợp với một hoặc một số ít nguồn cacbon, có loài lại thích hợp với
nhiều nguồn cacbon. Nguồn cacbon thuộc loại đơn giản như đường đơn, đường đôi
hoặc phức tạp như cellulose, tinh bột, xylan. Nguồn cacbon phức tạp có ở hầu hết các
sản phẩm, phế phẩm như trấu cám, vỏ quýt, sơ dừa, lõi ngô, bã mía, vỏ cà phê, mùn
cưa. Những chất này thường được sử dụng làm nguồn cacbon thích hợp cho quá trình
tổng hợp protease.


15
Muthu và Williams (2012) nhận thấy, trong số các nguồn cacbon khác nhau (tinh
bột, glucose, fructose, sucrose, lactose, maltose và galactose) được khảo sát cho quá
trình tổng hợp protease từ vi khuẩn B. subtilis, tinh bột được coi là nguồn cacbon thích
hợp nhất, hoạt tính tạo ra cao nhất đạt 339,632 U/ml [21].

1.2.7.2. Nguồn nitơ
Nguồn nitơ tồn tại ở dạng vô cơ như: urê, ammonium sulfate, natri nitrate và ở
các dạng hợp chất hữu cơ cao phân tử như: cao thịt bò, cao thịt, bột đậu tương, bột cá
hay pepton. Nguồn nitơ ảnh hưởng mạnh tới tốc độ tiết enzyme của các loài vi sinh
vật. Tùy từng loài vi sinh vật mà nguồn nitơ được sử dụng là khác nhau. Đa số các loài
có khả năng sử dụng cả nguồn nitơ vô cơ và hữu cơ, tuy nhiên mức độ đồng hóa từng
loại nitơ để sinh enzyme lại khác nhau.
Đối với một số loài nấm thuộc chi Aspergillus như nấm A. oryzae,
A. awamori, A. niger, A. flavus, trên môi trường có các nguồn nitơ hữu cơ lượng
protease axit được sinh tổng hợp cao. Trong môi trường Crapek, NaNO 3 được thay
bằng casein làm hoạt tính protease của nấm mốc được sinh ra tăng lên 3,5 lần; còn khi
thay tinh bột bằng glucose và bổ sung pepton làm nguồn nitơ thì hoạt tính enzyme tăng
6 lần. Nhiều kết quả nghiên cứu cho thấy, quá trình sinh tổng hợp enzyme ở vi sinh vật
được nâng cao khi trong môi trường có đồng thời cả nguồn nitơ vô cơ và nitơ hữu cơ.
Khi môi trường được bổ sung thêm cám mì, bột đậu tương đã tách chất béo, các nguồn
nitơ vô cơ và hữu cơ lượng protease sinh ra có hoạt tính tăng 22-74%. Trong khi, môi
trường chỉ bổ sung nguồn nitơ vô cơ duy nhất sẽ dẫn đến ngừng quá trình sinh tổng
hợp protease nói chung.
Trong quá trình nuôi cấy vi khuẩn B. subtilis và B. mesentericus, các hợp chất
nitơ vô cơ và hữu cơ được phối trộn bổ sung trong môi trường sẽ tạo điều kiện thuận
lợi cho sinh tổng hợp protease. Trong khi môi trường chỉ có nguồn nitơ hữu cơ thì
lượng protease sinh ra thấp hơn so với môi trường bổ sung (NH 4)2HPO4. Đối với các
xạ khuẩn ưa nhiệt như Actynomyces Vulgaris U2 thì pepton là chất cảm ứng để sinh
tổng hợp protease tốt nhất [5].
1.2.7.3. Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy
Nhiệt độ ảnh hưởng sâu sắc tới quá trình sống của vi sinh vật nói chung và các
loài nấm mốc nói riêng. Mỗi loài sinh vật thích nghi với một vùng nhiệt độ khác nhau.


16

Căn cứ vào sự thích nghi nhiệt độ, các loài vi sinh vật được chia làm 3 nhóm: nhóm vi
sinh vật ưa lạnh và chịu lạnh, nhóm ưa ấm và nhóm chịu nhiệt. Hầu hết, các loài vi
sinh vật sinh protease đều thuộc nhóm ưa ấm.
1.2.8. Tình hình nghiên cứu protease
1.2.8.1. Trong nước
Hầu như mọi phản ứng hóa học trong cơ thể sống đều cần phải có vai trò xúc tác
của enzyme. Vì vậy, các nghiên cứu về enzyme đã thu hút sự quan tâm của nhiều nhà
nghiên cứu. Các nghiên cứu tiến hành theo các hướng: Tách và tinh sạch enzyme
nhằm tạo chế phẩm có độ sạch khác nhau, nghiên cứu cấu trúc và mối liên quan giữa
cấu trúc và hoạt tính sinh học của enzyme cũng như khả năng ứng dụng của enzyme
trong thực tế.
Năm 2007, Quyền Đình Thi và cộng sự đã tối ưu một số điều kiện nuôi cấy
chủng vi sinh vật biển Acinetobacter sp. QN6 nhằm mục đích sinh tổng hợp protease
cao [10]. Phan Thị Bích Trâm và cộng sự (2007), tiến hành tinh sạch và khảo sát đặc
điểm của các serine protease từ Trùng Quắn. Kết quả đề tài nghiên cứu cho thấy hoạt
tính của protease từ dịch trích enzyme thô của trùn quắn trên cả hai cơ chất casein va
fibrin đều mạnh hơn so với trùn hổ, trùn quế, trùn cơm và trùn chỉ. Thời gian thích hợp
cho quá trình tự thủy phân để đạt hoạt tính protease cao nhất là 4 ngày. Nhiệt độ tối ưu
là 55oC, và pH tối ưu là 8 và 10. Enzyme bền trong khoảng nhiệt độ 25-55oC, ở pH 7
và 11 [12]. Vũ Ngọc Bội đã nghiên cứu ứng dụng protease từ vi khuẩn B. subtilis trong
sản xuất bột đạm thủy phân từ cá Mối” nhận thấy protease có thể thủy phân mạnh thịt
cá mối và hoàn toàn có thể sử dụng enzyme này trong sản xuất bột đạm thủy phân [1].
1.2.8.2. Trên thế giới
Từ thế kỷ 18, Reomur đã phát hiện trong dịch dạ dày của chim ăn thịt có khả
năng tiêu hóa thịt. Sau đó, Schwan (1836) đã chứng minh được hoạt động phân giải
protein của dịch vị. Năm 1896, enzym phân giải protein trong dịch vị đã được phân lập
và có tên gọi là pepsin.
Năm 1957, Corvisart tách được trypsin từ dịch tụy đó là protease đầu tiên ở dạng
chế phẩm nhưng chưa được tinh sạch. Brucke (1861) tách được pepsin từ dịch dạ dày
của chó ở dạng tương đối tinh khiết. Danilevxki (1862) dùng phương pháp hấp phụ

trên colodion đã tách được trypsin với amylase tụy tạng. Phương pháp nghiên cứu hấp


17
phụ này có ý nghĩa lớn trong nghiên cứu tinh chế enzyme cũng như protein. Sau đó
hàng loạt các protease được nghiên cứu và tách ra ở dạng chế phẩm như: chymotrypsin
được Hommarsten tách ra vào năm 1872; papain được Wurtz tách ra từ các phần khác
nhau của cây đu đủ; bromelin được Willstatter, Grassmann, Ambros tách ra từ các
phần của cây dứa; cathepsin của mô động vật được Willstatter Bamann tách ra vào
năm 1929.
Summer (1926) kết tinh được urease từ đậu tương, các nhà khoa học đã kết tinh
được hàng loạt các protease. Nhờ kết tinh được enzym có độ tinh sạch cao nên người
ta đã nghiên cứu được cấu trúc phân tử, cấu trúc trung tâm hoạt động, tính chất hóa lý
và tính đặc hiệu của các protease.
Năm 1959, Ryle và Porter dùng phương pháp sắc ký trao đổi ion đã tách được
pepsin B và pepsin C từ lợn. Metrione và Fruton (1966) dùng phương pháp lọc qua gel
sephadex kết hợp với sắc ký trao đổi ion đã thu được chế phẩm cathepsin đồng nhất.
Năm 1950, Giintelberg và Ottesen tách được protease kiềm từ vi khuẩn
B. subtilis . Năm 1967, Danno và Yoshimura tách được protease từ nấm A. sydowi
[14].