Đánh Giá Biến Dị Di Truyền Các Nhóm Tôm Sú (Penaeus Monodon) Làm Vật Liệu Ban Đầu

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

ĐÁNH GIÁ BIẾN DỊ DI TRUYỀN CÁC NHÓM TÔM
SÚ (PENAEUS MONODON) LÀM VẬT LIỆU BAN
ĐẦU CHO CHƯƠNG TRÌNH CHỌN GIỐNG.

Ngành:

CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Chuyên ngành:

CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Giảng viên hướng dẫn : Th.s Bùi Thị Liên Hà
Sinh viên thực hiện

: Trần Thị Thanh Trúc

MSSV: 115 111 0388 Lớp: 11DSH02

TP. Hồ Chí Minh, 2015


Đồ án tốt nghiệp

LỜI CAM ĐOAN
Nhóm thực hiện đồ án với đề tài “Đánh giá biến dị di truyền các nhóm tôm sú

(penaeus monodon) làm vật liệu ban đầu cho chương trình chọn giống” cam đoan
rằng nội dung trong đồ án này là do nhóm thực hiện dưới sự hướng dẫn trực tiếp
của Th.s Bùi Thị Liên Hà – cán bộ phòng Sinh học thực nghiệm thuộc Viên Nghiên
Cứu và Nuôi Trồng Thủy Sản II.
Số liệu và kết quả nghiên cứu trong đồ án này là hoàn toàn trung thực chưa từng
được ai sử dụng để công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Mọi tham khảo dùng
trong đồ án này được trích dẫn rõ ràng, tên tác giả, tên công trình, thời gian và địa
điểm công bố.
Mọi hành vi sao chép không hợp lệ hay vi phạm quy chế đào tạo, nhóm thực hiện
đề tài xin chịu hoàn toàn trách nhiệm.
Sinh viên

Trần Thị Thanh Trúc

i


Đồ án tốt nghiệp

LỜI CẢM ƠN
Qua thời gian thực tập tại Viện Nghiên Cứu và Nuôi Trồng Thủy Sản II, em đã học
hỏi được nhiều kinh nghiệm, kiến thức thực tiễn cũng như được thực hành trên các
thiết bị hiện đại mà em đã được học trên lý thuyết.
Trước hết, em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến thầy Th.s Phạm Minh Nhựt đã tạo
điều kiện cho em có cơ hội được thực tập tốt nghiệp tại Viện Nghiên Cứu và Nuôi
Trồng Thủy Sản II.
Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến với các quý thầy cô trường Đại học Công
Nghệ TP.HCM đặc biệt là thầy cô thuộc khoa Công Nghệ Sinh Học – Thực Phẩm –
Môi Trường đã tận tình giảng dạy, trang bị kiến thức giúp em nắm bắt và chủ động
trong quá trình thực tập.

Em xin trân trọng cảm ơn chị Th.s Bùi Thị Liên Hà cùng các anh chị đang công tác
tại phòng Sinh học thực nghiệm thuộc Viện Nghiên Cứu Nuôi Trồng Thủy sản II đã
trực tiếp hướng dẫn cũng như tận tình giúp đỡ em trong suốt thời gian thực tập.
Và cuối cùng em xin gửi lời cảm ơn đến các gia đình, bạn bè đã luôn bên cạnh và
ủng hộ em vượt qua khó khăn để hoàn thành tốt bài báo cáo này.
Tuy đã rất cố gắng nhưng không tránh khỏi thiếu sót, rất mong nhận được sự góp ý
quý báu từ quý thầy cô. Em xin chân thành cảm ơn.

ii


Đồ án tốt nghiệp

MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN ..........................................................................................................i
LỜI CẢM ƠN .............................................................................................................. ii
MỤC LỤC .................................................................................................................. iii
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT................................................................................. vii
DANH MỤC BẢNG .................................................................................................. ix
DANH MỤC BIỂU ĐỒ HÌNH ẢNH ..........................................................................x
MỞ ĐẦU ......................................................................................................................1
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ......................................................................7
1.1 Giới thiệu về tôm sú ............................................................................................8
1.1.1 Vị trí phân loại ..............................................................................................8
1.1.2 Phân bố .........................................................................................................8
1.1.3 Đặc điểm hình thái cấu tạo ...........................................................................9
1.1.4 Chu kì phát triển. ........................................................................................10
1.1.5 Đặc điểm dinh dưỡng. ................................................................................12
1.1.6 Đặc điểm về sinh trưởng, sinh sản và phát triển. .......................................13
1.1.7 Tình hình nuôi trồng tôm sú ở thế giới. .....................................................14

1.1.8 Tình hình nuôi trông tôm sú ở Việt Nam. ..................................................14
1.2 GIỚI THIỆU CHUNG VỀ ĐA DẠNG DI TRUYỀN .....................................15
1.2.1. Đa dạng di truyền. .....................................................................................15
1.2.2. Quần thể .....................................................................................................16
1.2.3 Nguyên nhân xuất hiện đa dạng di truyền trong quần thể. ........................17
1.2.4 Ý nghĩa của đa dạng di truyền trong nuôi trồng thủy sản. ........................18
1.3 KỸ THUẬT MICROSATELLITE ...................................................................19
1.3.1 Khái niệm về kỹ thuật Microsatellite .........................................................19
1.3.2 Tính chất .....................................................................................................20
1.3.3. Ưu - nhược điểm của microsatellite ..........................................................20
1.3.4 Các loại Microsatellite................................................................................21
1.3.5. Cơ chế hình thành và vai trò của Microsatellite .......................................22

iii


Đồ án tốt nghiệp

1.3.5.1. Cơ chế hình thành Microsatellite ........................................................22
1.3.5.2 Vai trò của Microsatellite ....................................................................22
1.3.6. Các phương pháp phát hiện Microsatellite ...............................................23
1.3.6.1. Phương pháp lai ..................................................................................24
1.3.6.2. Phương pháp PCR ...............................................................................24
1.3.6.3. Phát hiện microsatellite bằng mồi microsatellite ...............................25
1.4. ĐỊNH LƯỢNG DNA BẰNG PHƯƠNG PHÁP QUANG PHỔ ....................28
1.5 KỸ THUẬT POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR) ..........................29
1.5.1 Nguyên lý chung của kỹ thuật PCR ...........................................................29
1.5.2 Các yếu tố cần thiết cho phản ứng PCR ....................................................30
2.6 KỸ THUẬT ĐIỆN DI ......................................................................................31
2.6.1 Điện di trên gel agarose. .............................................................................31

2.6.1.1 Khái niệm .............................................................................................31
2.6.1.2 Các bước thực hiện ..............................................................................32
2.6.2 Điện di mao quản Capillary Electrophoresis (CE) ....................................33
2.6.2.1. Nguyên tắc ..........................................................................................33
2.6.2.2. Cơ chế điện di .....................................................................................33
CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP .......................................................34
2.1 Vật liệu ..............................................................................................................35
2.1.1 Vật liệu sinh học .........................................................................................35
2.1.2 Hóa chất ......................................................................................................36
2.1.2.1 Mồi (primer) .......................................................................................36
2.1.2.2 Thang (ladder) ......................................................................................38
2.1.2.3.Hóa chất ly trích DNA. ........................................................................38
2.1.2.4. Hóa chất chạy PCR .............................................................................38
2.1.2.5. Hóa chất chạy điện di agarose ............................................................39
2.1.2.6. Hóa chất chạy điện di mao quản .........................................................39
2.1.2.7. Dụng cụ thí nghiệm.............................................................................39
2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ....................................................................40

iv


Đồ án tốt nghiệp

2.2.1 Phương pháp trích ly DNA tổng số............................................................40
2.2.2 Phương pháp kiểm tra độ tinh sạch và định lượng DNA ..........................43
2.2.3 Phương pháp tối ưu hóa phản ứng PCR và khảo sát tính hoạt động của các
cặp mồi microsatellite..........................................................................................44
2.2.3.1. Khảo sát nhiệt độ bắt cặp của các cặp mồi microsatellite ..................45
2.2.3.2 Khảo sát nồng độ MgCl2 ......................................................................47
2.2.3.3 Khảo sát hàm lượng DNA khuôn ........................................................48

2.2.3.4 Khảo sát tính ổn định của quy trình PCR. ...........................................49
2.3. Phân tích thống kê đa dạng di truyền của bốn quần đàn mẫu tôm sú bằng các
phần mềm Cervus, Fstat, Genepop . .......................................................................50
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN.............................................................52
3.1 Kết quả trích ly DNA ........................................................................................53
3.2 Kết quả nhiệt độ bắt cặp của các cặp mồi microsatellite .................................55
3.2.1 Kết quả nhiệt độ bắt cặp của cặp mồi microsatellite W1 trên bốn mẫu tôm
A09, T30, G30, N03 đại diện cho bốn vùng Ấn Độ Dương, Thái Bình Dương,
Gia Hóa và Nội Địa. ............................................................................................55
3.2.2. Khảo sát nhiệt độ bắt cặp của cặp mồi microsatellite P1 trên bốn mẫu tôm
A09, T30, G30, N03 đại diện cho 4 nhóm Ấn Độ Dương, Thái Bình Dương,
Gia Hóa và Nội Địa .............................................................................................56
3.2.3. Kết quả nhiệt độ bắt cặp của cặp mồi microsatellite L1 trên bốn mẫu tôm
A09, T30, G30, N03 đại diện cho 4 nhóm Ấn Độ Dương, Thái Bình Dương,
Gia Hóa và Nội Địa. ............................................................................................57
3.3 Khảo sát nồng độ MgCl2 tối ưu ........................................................................59
3.3.1 Kết quả tối ưu nồng độ MgCl2 ở microsatellite W1. .................................60
3.3.2 Kết quả tối ưu nồng độ MgCl2 ở microsatellite P1. ...................................60
3.3.3. Kết quả tối ưu nồng độ MgCl2 ở microsatellite L1. ..................................61
3.3.4. Kết quả tối ưu nồng độ MgCl2 ở microsatellite N1 ..................................62
3.4. Kết quả tối ưu hàm lượng DNA khuôn. ..........................................................64
3.4.1. Kết quả tối ưu hàm lượng DNA khuôn cho cặp mồi microsatellite W1 ..64
3.4.2. Kết quả tối ưu hàm lượng DNA khuôn cho cặp mồi microsatellite L1 ...65
3.4.3. Kết quả tối ưu hàm lượng DNA khuôn cho cặp mồi microsatellite P1 ...66

v


Đồ án tốt nghiệp

3.4.4. Kết quả tối ưu hàm lượng DNA khuôn cho cặp mồi microsatellite N1 ...67
3.5. Kết quả kiểm tra tính ổn định của phản ứng PCR và sàng lọc các cặp mồi
microsatellite. ..........................................................................................................69
3.5.1. Kết quả kiểm tra tính ổn định của phản ứng PCR ....................................69
3.5.2 Sàng lọc các cặp mồi microsatellite ...........................................................72
3.6 Kết quả phân tích đa dạng di truyền của bốn quần đàn tôm sú .......................74
3.6.1 Kết quả thông tin đa hình của 4 quần đàn tôm sú: Ấn Độ Dương, Thái
Bình Dương, Gia Hóa và Nội Địa. ......................................................................74
3.6.2 Sự khác biệt di truyền của các quần đàn mẫu phân tích ............................78
CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .............................................................80
4.1 Kết luận .............................................................................................................81
4.2 Kiến nghị ...........................................................................................................82
TÀI LIỆU THAM KHẢO ..........................................................................................83
Tài liệu tiếng việt ....................................................................................................83
Tài tiệu tiếng anh.....................................................................................................85
Tài liệu internet .......................................................................................................87
PHỤ LỤC A .............................................................................................................. A1
PHỤ LỤC B............................................................................................................... B1

vi


Đồ án tốt nghiệp

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
μl : Microlite
μM : Micromol/lite
μg : Microgram
Ar : Allelic richness (mức độ phong phú alen)
bp : Base pair

ctv : cộng tác viên
TP HCM : Thành phố Hồ Chí Minh
DMSO : Dimethyl sulfoxide
DNA : Deoxyribonucleic acid
dNTP : Deoxyribonucleotide triphosphate
EDTA : Ethylene diamine tetraacetic acid
GTE : Glucose-Tris-EDTA
He : Expected heterozygosity (dị hợp tử mong đợi)
Ho : Observed heterrozygosity (dị hợp tử phát hiện)
HWE : Cân bằng Hardy - Weinberg
ISSR : Inter Simple Sequence Repeats
M : Ladder DNA (thang DNA)
Marker : Chỉ thị
mM : Milimolar (milimol/lite)
Na : Number of alleles per locus (số lƣ ợng alen trên locus)
NS : không khác biệt có ý nghĩa
NST : Nhiễm sắc thể
PCR : Polymerase chain reaction
CE : Capillary Electropherosis (Điện di mao quản)
EOF : Electro – Osmotic Flow xi

vii


Đồ án tốt nghiệp

EFF : Electric Field Force
PIC : Polymorphic Information Content (thông tin đa hình)
SDS : Sodium Dodecyl Sulphate
SSR : Single sequence repeat - Microsatellite

STE : Sodium Chloride-Tris-EDTA
RE : Restristion Enzyme (enzyme cắt giới hạn)
Ta : Annealing temperature (nhiệt độ bắt cặp)
TBE : Tris Borate EDTA
Tm : Melting temperature (nhiệt độ nóng chảy)
VNCNTTS II : Viện Nghiên Cứu Nuôi Trồng Thủy Sản II
VNTR : Variable Number Tamdem Repeat

viii


Đồ án tốt nghiệp

DANH MỤC BẢNG
Bảng 2.1 Danh sách 137 mẫu tôm sú. .......................................................................35
Bảng 2.2 Thông tin các cặp mồi. ...............................................................................37
Bảng 2.3 Gradient nhiệt độ lai cho 15 cặp mồi microsatellite ..................................46
Bảng 2.4. Nồng độ MgCl2 khảo sát cho từng cặp mồi microsatellite .......................47
Bảng 2.5. Hàm lượng DNA khuôn khảo sát cho từng cặp mồi microsatellite .........48
Bảng 2.6. Thành phần buffer, dNTP, cặp mồi microsatellite, DNA khuôn, Taq
polymerase cho một phản ứng PCR. ..........................................................................49
Bảng 3.1.Kết quả đo OD kiểm tra độ tinh sạch và nồng độ của DNA .....................54
Bảng 3.2. Nhiệt độ bắt cặp (Ta) sau khi tối ưu của 15 cặp mồi microsatellite.........59
Bảng 3.3. Kết quả tối ưu nồng độ MgCl2 của 15 cặp mồi microsatellite .................64
Bảng 3.4. Kết quả khảo sát hàm lượng DNA khuôn tối ưu của 15 cặp mồi
microsatellite ..............................................................................................................69
Bảng 3.5. Hiệu suất PCR và số allen của 15 cặp mồi microsatellite trên 28 mẫu
DNA tôm sú. ...............................................................................................................72
Bảng 3.6. Thông tin đa dạng di truyền của 4 quần đàn tôm sú. ................................75
Bảng 3.7. Giá trị Fst được phân tích theo nhóm. ......................................................79

Bảng 3.8. Tổng hợp kết quả tối ưu của 10 cặp mồi microsatellite...........................81

ix


Đồ án tốt nghiệp

DANH MỤC BIỂU ĐỒ HÌNH ẢNH
Hình 1.1. Tôm sú (Penaeus monodon)........................................................................8
Hình 1.2. Đặc điểm cấu tạo bên ngoài của tôm sú (Penaeus monodon) ....................9
Hình 1.3. Vòng đời tôm sú (Penaeus monodon).......................................................12
Hình 1.4. Quá trình giao vĩ của tôm sú (Penaeus monodon) ....................................13
Hình 1.5. Phát hiện microsatellite từ DNA tổng số. .................................................25
Hình 1.6. Vùng flanking (vùng sườn) ở 2 bên trình tự microsatellite. .....................26
Hình 2.1. Thang chuẩn DNA 100bp..........................................................................38
Hình 2.2 Chu trình nhiệt của máy PCR sau khi tối ưu nhiệt độ bắt cặp các cặp mồi
.....................................................................................................................................50
Hình 3.2. Tối ưu nhiệt độ bắt cặp ở cặp mồi microsatellite W1 khi tiến hành phản
ứng PCR theo gradient nhiệt độ .................................................................................56
Hình 3.3. Tối ưu nhiệt độ bắt cặp ở cặp mồi microsatellite P1 khi tiến hành phản
ứng PCR theo gradient nhiệt độ .................................................................................57
Hình 3.4. Tối ưu nhiệt độ bắt cặp ở cặp mồi microsatellite L1 khi tiến hành phản
ứng PCR theo gradient nhiệt độ .................................................................................58
Hình 3.5. Tối ưu nồng độ MgCl2 ở cặp mồi microsatellite W1 khi tiến hành phản
ứng PCR theo nhiệt độ tối ưu. ....................................................................................60
Hình 3.6. Tối ưu nồng độ MgCl2 ở cặp mồi microsatellite P1 khi tiến hành phản
ứng PCR theo nhiệt độ tối ưu. ....................................................................................60
Hình 3.6. Tối ưu nồng độ MgCl2 ở cặp mồi microsatellite P1 khi tiến hành phản
ứng PCR theo nhiệt độ tối ưu. ....................................................................................61
Hình 3.7. Tối ưu nồng độ MgCl2 ở cặp mồi microsatellite L1 khi tiến hành phản

ứng PCR theo nhiệt độ tối ưu. ....................................................................................62
Hình 3.8. Tối ưu nồng độ MgCl2 ở cặp mồi microsatellite N1 khi tiến hành phản
ứng PCR theo nhiệt độ tối ưu. ....................................................................................63
Hình 3.9. Kết quả tối ưu hàm lượng DNA khuôn của cặp mồi microsatellite W1 ..65
Hình 3.10. Kết quả tối ưu hàm lượng DNA khuôn của cặp mồi microsatellite L1 .66
Hình 3.11. Kết quả tối ưu hàm lượng DNA khuôn của cặp mồi microsatellite P1.67

x


Đồ án tốt nghiệp

Hình 3.12. Kết quả tối ưu hàm lượng DNA khuôn của cặp mồi microsatellite N1 .67
Hình 3.12. Kết quả tối ưu hàm lượng DNA khuôn của cặp mồi microsatellite N1 .68
Hình 3.13. Kết quả kiểm tra tính ổn định của phản ứng PCR với cặp mồi
microsatellite W1........................................................................................................70
Hình 3.14. Kết quả kiểm tra tính ổn định của phản ứng PCR với cặp mồi
microsatellite P1 .........................................................................................................70
Hình 3.15. Kết quả kiểm tra tính ổn định của phản ứng PCR với cặp mồi
microsatellite N1 ........................................................................................................71
Hình 3.16. Kết quả kiểm tra tính ổn định của phản ứng PCR với cặp mồi
microsatellite L1 .........................................................................................................71
Hình 3.17. Biểu đồ thể hiện hiệu suất PCR (%) của 15 cặp mồi microsatellite .......73
Hình 3.18. Biểu đồ thể hiện số allen của 15 cặp mồi microsatellite ........................73
Hình 3.19. Biểu đồ thể hiện giá trị Ho và He theo từng quần đàn tôm sú ...............78

xi


Đồ án tốt nghiệp

MỞ ĐẦU
1.Tính cấp thiết của đề tài
Tôm sú là đối tượng nuôi phổ biến ở các vùng nước lợ, mặn trên toàn quốc. Trong
báo cáo tổng kết ngành thủy sản 2004 và kế hoạch 2005 của Bộ Thủy Sản cho biết
hằng năm, ước tính có khoảng hơn 10 tỷ tôm sú giống giai đoạn PL15 được sản
xuất từ hàng nghìn trại sản xuất tôm giống. Tôm bố mẹ cung cấp cho các trại sản
xuất tôm giống hiện nay hầu như hoàn toàn phụ thuộc vào nguồn tôm bố mẹ khai
thác tự nhiên và nhập nội. Sử dụng nguồn tôm bố mẹ còn mang tính thụ động, tự
nhiên, cộng với những yếu tố khác do chính điều kiện sản xuất, kinh doanh tại các
trại sản xuất tôm giống không được đảm bảo, có dấu hiệu suy giảm sinh trưởng,
mang mầm bệnh, tiềm ẩn rủi ro lớn cho người nuôi tôm.
Do đó, để có được nguồn giống tăng trưởng tốt, sức chống chịu, kháng bệnh tốt
cung cấp cho người nuôi trồng tôm sú, không phải phụ thuộc vào nguồn tự nhiên
hay nhập nội thì việc nghiên cứu sản xuất giống tôm sú cung cấp cho người nuôi
sản phẩm giống tốt, có tốc độ sinh trưởng nhanh, chống chịu tốt là điều hết sức cần
thiết.
Nước ta có diện tích mặt nước ngọt, lợ, biển khá lớn, bao gồm các sông, suối, ao, hồ
chứa nước... với thành phần giống loài thủy sản phong phú là tiềm năng to lớn để
phát triển và nuôi trồng thủy sản. Năm 2012, diện tích nuôi trồng thủy sản toàn
quốc ước tính 1.200.000 ha, trong đó diện tích nuôi tôm sú chiếm phần lớn với
622.118 ha chiếm 88,1%, hàng thủy sản Việt Nam đã có mặt ở trên 164 quốc gia và
vùng lãnh thổ trên thế giới. Kim ngạch xuất khẩu năm 2014 đạt 7,9 tỷ USD, tăng
gấp 18% lần so với cùng kì năm trước. Sự tăng trưởng này chủ yếu nhờ vào kết quả
xuất khẩu của mặt hàng tôm, với giá trị xuất khẩu cao nhất từ trước tới nay khoảng
4,1 tỷ USD, tăng 25% so với năm 2013 ( />
1


Đồ án tốt nghiệp

Trong những năm gần đây, đã có nhiều nghiên cứu chú ý đến nâng cao chất lượng
di truyền, tăng khả năng chống chịu ở tôm sú đã được thực hiện nhằm đặt ra cơ sở
khoa học, kỹ thuật để có thể nâng cao chất lượng của loài thủy sản giá trị cao này
như “Nghiên cứu buồng trứng và khả năng sinh sản của các dòng tôm sú gia hóa”
(Nguyễn Văn Bình, 2012), “Đánh giá tính đa hình của ba quần đàn tôm sú
(Penaeus monodon) nuôi ở Việt Nam bằng phương pháp microsatellite” (Nguyễn
Thị Thảo và ctv, 2004) với mục tiêu có được sản phẩm giống tôm sú tốt, cải thiện di
truyền sản phẩm giống, tập trung cao vào các tính trạng kinh tế quan trọng là sức
sinh trưởng, kháng bệnh, chống chịu và phải đa hình di truyền.
Các nghiên cứu xác định biến dị di truyền kết hợp với các biến dị hình thái thể hiện
về sinh trưởng, sức sống với các chỉ thị ở mức độ phân tử của các quần thể tôm sú,
giữa các cá thể trong cùng một quần đàn là hướng nghiên cứu phù hợp cần thiết,
ứng dụng cao. Chính vì thế, Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn giao cho Viện
Nghiên cứu và Nuôi trồng thủy sản II thực hiện đề tài cấp nhà nước “Ứng dụng di
truyền số lượng và di truyền phân tử để tạo vật liệu ban đầu cho chọn giống tôm sú
(Penaeus monodon) theo tính trạng tăng trưởng”, đề tài này được thực hiện trong 4
năm (1/2012 – 12/2015) và nhóm thực hiện đồ án tham gia vào một phần nhỏ với đề
tài “Đánh giá biến dị di truyền các nhóm tôm sú (Penaeus monodon) làm vật liệu
ban đầu cho chương trình chọn giống” nhằm cung cấp cơ sở khoa học cho chương
trình chọn giống tôm sú quốc gia. Đề tài được thực hiện ở Viện Nghiên cứu Nuôi
trồng Thủy sản II dưới sự hướng dẫn của Thạc sĩ Bùi Thị Liên Hà.
2. Tình hình nghiên cứu
Trên thế giới
Trên thế giới, có những đề tài nghiên cứu về đa dạng di truyền đã được thực hiện
như:
-“Sử dụng chỉ thị microsatellite phân tích đa dạng di truyền tôm sú (Penaeus
monodon) ở Philippines” (Zhenkang Xu và ctv, 2001). Trong nghiên cứu này đã

2

Đồ án tốt nghiệp

phân lập được 49 cặp mồi microsatellite từ ngân hàng gen của loài tôm sú (Penaeus
monodon), qua sàng lọc đã chọn ra được 36 cặp tốt nhất được sử dụng để đánh giá
đa dạng di truyền quần đàn tôm sú nuôi tự nhiên cho kết quả thông tin đa hình dao
động trong khoảng từ 0,63 – 0,96.
-“Sử dụng các chỉ thị microsatellite trong chọn giống tôm sú (Penaeus monodon)”
(Wuthisuthimethavee và ctv, 2003). Nghiên cứu này được tác giả thực hiện trên
quần đàn tôm sú hoang dã ở Thái Lan, sử dụng 30 cặp mồi microsatellite tự thiết kế
để đánh giá tính đa hình. Kết quả cho thấy thông tin đa hình (PIC) dao động trong
khoảng từ 0,4275 – 0,9264.
-“Sử dụng các chỉ thị microsatellite để phân tích sự khác biệt di truyền giữa các
quần đàn tôm sú vùng Ấn Độ Dương và Thái Bình Dương” (En-Min You và ctv,
2005). Trong bài báo này, các tác giả đã sử dụng 10 cặp mồi microsatellite có số dị
hợp tử mong đợi >0,92 của Pan và ctv (2004) để phân tích khác biệt di truyền của
330 cá thể tôm sú thuộc 2 vùng Ấn Độ Dương và Thái Bình Dương. Kết quả phân
tích thông tin đa dạng di truyền cho thấy: số dị hợp tử quan sát được dao động từ
0,638 – 0,743. Sự khác biệt có ý nghĩa về cân bằng di truyền Hardy – Weinberg
(p<0,05). Giá trị sai khác di truyền (Fst) giữa quần đàn tôm sú Ấn Độ Dương và
Thái Bình Dương là khá cao (Fst=0,069; p≤ 0,0067).
-“Đánh giá đa dạng di truyền của quần đàn tôm sú (Penaeus monodon) nuôi tự
nhiên và hoang dã bằng chỉ thị microsatellite” (D.Aziz và ctv, 2011). Tác giả và
cộng sự đã tiến hành thu mẫu tôm sú nuôi tự nhiên và hoang dã ở Malaysia, bằng 30
cặp mồi microsatellite được lấy từ ngân hàng gen Biobasic, Canada, các tác giả đã
công bố kết quả phân tích đa dạng di truyền của mẫu tôm sú trên. Số lượng allen
trên mỗi cặp mồi là từ 3 – 36, số dị hợp tử quan sát He= 0,5166 nhỏ hơn so với dị
hợp tử mong đợi He=0,5552. Giá trị sai khác di truyền (Fst) giữa quần đàn tôm sú
nuôi tự nhiên và hoang dã là rất cao (Fst=0,6308; p≤ 0,009).

Trong nước

3


Đồ án tốt nghiệp

Những nghiên cứu đa dạng di truyền đã được thực hiện như: Trường Đại học quốc
gia TP HCM, Viện NCNTTS I và Viện NCNTTS II đã có những khảo sát đa dạng
di truyền một số quần thể đàn tôm sú (Penaeus monodon) bằng hai kỹ thuật RAPD
và mtDNA PCR-RFLP. Theo đó, kết quả chỉ đánh giá khả năng ứng dụng từng kỹ
thuật vào các mục đích tìm hiểu khác nhau, nhưng đây là một nỗ lực trong đánh giá
di truyền một số quần thể tự nhiên.
Để đánh giá sự khác biệt di truyền giữa hai quần đàn tôm càng xanh Việt Nam và
Trung Quốc và làm cơ sở cho việc quản lý, bảo tồn nguồn gen tôm càng xanh tại
Việt Nam. Nghiên cứu “So sánh sự đa dạng di truyền giữa tôm càng xanh Việt Nam
và tôm càng xanh Trung Quốc sử dụng phương pháp Microsatellite và RAPD”
(Nguyễn Thành Tâm và Phạm Thanh Liêm, 2012) nhằm kiểm tra sự khác biệt di
truyền của hai quần đàn tôm càng xanh Việt Nam và Trung Quốc cùng với 6 cặp
mồi microsatellite và 5 mồi ngẫu nhiên RAPD. Theo kết quả báo cáo không có sự
khác biệt di truyền giữa quần đàn tôm càng xanh Việt Nam và Trung Quốc khi phân
tích bằng chỉ thị microssatellite tuy nhiên với 5 mồi ngẫu nhiên RAPD cho kết quả
thông tin đa hình (PIC) của quần đàn tôm càng xanh Việt Nam và Trung Quốc lần
lượt là 0,84 và 0,88.
Một số các nghiên cứu thăm dò khác: “Microsatellite nghiên cứu biến dị về màu sắc
thịt trắng và thịt vàng của cá Tra (Pangasianodon hypophthalmus)” (Nguyễn Hữu
Ninh, 2003); “Bước đầu thăm dò, ứng dụng một số chỉ thị DNA phân tích đa dạng
di truyền cá Tra (Pangasianodon hypophthalmus)” (Bùi Thị Liên Hà, 2004).v.v…
3. Mục đích nghiên cứu
- Tìm được một số chỉ thị microsatellite phù hợp và tiềm năng trong việc đánh giá

đa dạng di truyền giữa các quần đàn tôm sú Ấn Độ Dương, Thái Bình Dương, Gia
Hóa và Nội Địa.
- Cung cấp thông tin di truyền cho chương trình chọn giống quốc gia.

4


Đồ án tốt nghiệp

4. Nhiệm vụ nghiên cứu
- Khảo sát tính hoạt động của các cặp mồi microsatellite qua quy trình PCR.
- Phân tích đa dạng di truyền của các mẫu tôm sú thuộc 4 nhóm khác nhau trong
chọn giống thông qua chỉ thị microsatellite nhằm phục vụ cải tạo giống tôm sú.
5. Phương pháp nghiên cứu
- Phương pháp trích ly DNA tổng số dựa trên quy trình tách chiết DNA Salt
extraction (Miller và ctv, 1988).
- Phương pháp kiểm tra độ tinh sạch và định lượng DNA
- Phương pháp tối ưu hóa phản ứng PCR và khảo sát tính hoạt động của các cặp mồi
microsatellite
- Phân tích thống kê đa dạng di truyền của bốn quần đàn mẫu tôm sú bằng các phần
mềm Cervus 3.0.3, Fstat, Genepop.
6. Các kết quả đạt được của đề tài
- Tối ưu hóa các phản ứng khuếch đại của các chỉ thị microsatellite.
- Kiểm tra độ ổn định và tính chính xác của các chỉ thị microsatellite lựa chọn.
- Phân tích đa dạng di truyền của các nhóm mẫu tôm sú chọn giống.
- Đưa ra nhận định hỗ trợ cho chương trình chọn giống tôm sú.
7. Kết cấu của đồ án tốt nghiệp
Đồ án tốt nghiệp “Đánh giá biến dị di truyền các nhóm tôm sú (Penaeus monodon)
làm vật liệu ban đầu cho chương trình chọn giống” bao gồm 4 chương:

5


Đồ án tốt nghiệp

Chương 1. Tổng quan tài liệu: tóm tắt về các đặc điểm, đặc tính của đối tượng
nghiên cứu là loài tôm sú (Penaeus monodon). Giới thiệu về kỹ thuật microsatellite
và các cặp mồi microsatellite sử dụng trong báo cáo này.
Chương 2.Vật liệu và phương pháp: nêu ra các vật liệu sử dụng và những phương
pháp dùng để phân tích trong đề tài.
Chương 3. Kết quả và thảo luận: báo cáo về các kết quả đã đạt được trong đề tài và
đưa ra nhận xét, so sánh với các nghiên cứu liên quan.
Chương 4. Kết luận và kiến nghị: đưa ra các kết luận chung về các kết quả đã đạt
được và đề xuất các hướng giải quyết tiếp theo để hoàn thiện hơn.

6


Đồ án tốt nghiệp

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

7


Đồ án tốt nghiệp

1.1 Giới thiệu về tôm sú
1.1.1 Vị trí phân loại
Tôm sú (tên khoa học: Penaeus monodon) là một loài động vật giáp xác đại dương

được nuôi để dùng làm thực phẩm, là đối tượng rất quan trọng trong lĩnh vực
nghiên cứu và nuôi trồng thủy sản. Theo Hothuis (1980) và Barnes (1987) (trích dẫn
bởi Nguyễn Văn Chung và Trần Ngọc Hải, 2004) tôm được phân loại trong hệ
thống phân loại như sau:
Ngành: Arthropoda
Lớp

: Malacostraca

Bộ

: Decapoda

Họ

: Penaeidae
Giống : Penaeus
Loài

: Penaeus monodon (Fabricius, 1798).

Hình 1.1. Tôm sú (Penaeus monodon)
1.1.2 Phân bố
Trên thế giới, tôm sú được phân bố chủ yếu ở Ấn Độ - Tây Thái Bình Dương, Đông
và Đông Nam Châu Phi, Pakistan, Nhật Bản, Malaysia. Đặc biệt, bắt gặp nhiều nhất
ở vùng Đông Nam Á như: Philippins, Indonesia, Thái Lan, Việt Nam… Tôm

8

Đồ án tốt nghiệp

trưởng thành có tập tính sống ở biển khơi, thường được tìm thấy ở độ sâu 180m,
nhưng tôm giống thường xuất hiện ở vùng ven bờ. ( Nguyễn Văn Thường và
Trương Quốc Phú, 2004).
Ở Việt Nam, theo Nguyễn Văn Chung (1995) (được trích dẫn bởi Nguyễn Đel,
2009). Tôm sú phân bố ở vịnh Bắc Bộ, ven biển Nam Trung Bộ, vùng Tây Nam Bộ,
sông Ông Đốc, Khánh Hội, Kim Quy, Hòn Chông, Hà Tiên… Tôm sống ở độ sâu từ
0 – 126m, đáy cát bùn hay bùn cát, thích hợp nhất là các thủy vực có độ mặn cao,
ổn định.
1.1.3 Đặc điểm hình thái cấu tạo

Hình 1.2. Đặc điểm cấu tạo bên ngoài của tôm sú (Penaeus monodon)
Quan sát cơ quan bên ngoài của tôm sú gồm các bộ phận sau:
Chủy: tôm sú có chủy dài kéo dài đến rìa của cuốn râu I, hơi cong lên ở vuốt, hình
dạng như lưỡi kiếm, có răng cưa ở phía trên lưng và cả phần phía dưới, nhờ có răng
cưa này mà ta phân biệt được các loài tôm khác nhau trong giống penaeus. Với tôm
sú, phía trên chủy có 7-8 răng và phía dưới chủy có 3 răng:

9


Đồ án tốt nghiệp

Antennule và Antennae là cơ quan nhận biết và giữ thăng bằng cho cơ thể của tôm.
3 cặp châm hàm: giúp cho việc ăn
5 cặp chân ngực: giúp để ăn và bò
5 cặp chân bụng: dùng để bơi.
Hai đôi mắt kép có 2 cuống mắt
Carapace có gai râu và gai gan nhưng không có gai hốc mắt.

Đuôi có một cặp chân đuôi giúp cho tôm có thể bơi lên cao hay bơi xuống thấp.
Cơ quan sinh dục nằm ở dưới bụng: tôm sú thuộc loại dị hình phái tính, con cái có
kích thước to hơn con đực. Khi tôm trưởng thành phân biệt rõ đực cái thông qua cơ
quan sinh dục phụ bên ngoài. Petasma và thelycum là cơ quan phân biệt đực cái ở
tôm, Petasma có ở con đực và thelycum có ở con cái.
Con đực: cơ quan sinh dục chính của con đực nằm ở phía trong phần đầu ngực, bên
ngoài có cơ quan giao phối phụ nằm ở nhánh ngoài đôi chân ngực thứ 2, lỗ sinh dục
đực mở ra hốc háng đôi chân ngực thứ 5. Tinh trùng thuộc dạng chứa trong túi.
Con cái: buống trứng nằm dọc theo mặt lưng phía trên, hai ống dẫn trứng mở ra ở
khớp háng đôi chân ngực thứ 3. Thelycum nằm giữa gốc đôi chân bò thứ 4 và 5.
1.1.4 Chu kì phát triển.
Vòng đời của tôm sú chia làm 6 thời kì: phát triển phôi, ấu trùng và hậu ấu trùng,
giai đoạn ấu niên, giai đoạn thiếu niên, giai đoạn sắp trưởng thành, giai đoạn trưởng
thành (Nguyễn Văn Chung và ctv, 1997)
Phát triển phôi: trứng tôm sú hình cầu, màu vàng xanh, đường kính trung bình
0,3mm. Thời gian để phôi phát triển qua 2 giai đoạn tế bào, giai đoạn phôi nang và
thời điểm xuất hiện Nauplius trong trứng là 0,5; 1,5; 8 giờ sau khi đẻ xong.

10


Đồ án tốt nghiệp

Ấu trùng và hậu ấu trùng: ấu trùng và hậu ấu trùng tôm lột xác nhiều lần, phát
triển qua các giai đoạn Nauplius, Zoea, Mysis, Postlarvae.
-

Giai đoạn Nauplius: nauplius mới nở hình quả lê, qua 5 lần lột xác biến đổi
dần và trở nên dài ra. Nauplius sống phù du trôi nổi ở tầng trên, dinh dưỡng
chủ yếu bằng noãn hoàng, vận động theo kiểu zích zắc, không định hướng,

không liên tục, hướng quang mạnh.

-

Giai đoạn Zoea: cơ thể bao gồm 3 phần rõ rệt (đầu- ngực- bụng). Zoea bơi
nhờ 2 đôi râu (đôi 1 phân đốt, đôi 2 phân nhánh) bơi lội có định hướng về
phía trước. Ấu trùng Zoea bắt đầu ăn thức ăn ngoài bằng hình thức ăn lọc.
Do chúng bắt mồi liên tục nên chúng có phần đuôi phân dài (Lục Minh Diệp
(2003) trích dẫn bởi Nguyễn Văn Bình, 2012). Ba giai đoạn phụ của ấu trùng
Zoea phân biệt nhờ sự xuất hiện của chùy trán, cuống mắt kép, sự phân đốt
của phần bụng và sự phát triển của gai cứng, gai bên các đốt bụng. Thời gian
phát triển các giai đoạn phụ là từ 30-48 h tùy theo nhiệt độ.

-

Giai đoạn Mysis: trải qua 3 giai đoạn biến thái phụ. Cơ thể tôm sú đã giống
dạng trưởng thành hơn so với Zoea. Mysis sống ở tầng trên, đặc trưng của
Mysis là bơi ngược về sau, đầu chúc xuống dưới. Phân biệt các giai đoạn phụ
của Mysis dựa vào sự xuất hiện và phân đốt của chân bơi.

-

Giai đoạn ấu hậu ấu trùng Postlarvae: hình dạng giống tôm trưởng thành
nhưng chưa hoàn thiện về màu sắc. Postlarvae bơi thẳng, có định hướng về
phía trước, hoạt động bơi lội chủ yếu nhờ vào chân bụng. Tuổi của
Postlarvae được tính theo ngày kể từ khi biến thành Postlarvae đầu tiên. Từ
P1-P5 chúng sống trôi nổi, từ P5 trở đi chúng sống đáy.

Giai đoạn ấu niên: từ P5-P20 tôm chuyển sang sống đáy, giai đoạn này tôm bắt
đầu bò bằng chân bò và bơi bằng chân bơi.

11


Đồ án tốt nghiệp

Giai đoạn thiếu niên: tôm bắt đầu ổn định về tỷ lệ và bây giờ có thể phân biệt được
tôm đực và tôm cái dựa vào petasma của con đực và thelycum của con cái.
Giai đoạn sắp trưởng thành: giai đoạn này đặc trưng bởi sự phát triển của tuyến
sinh dục đực, con đực đã bắt đầu có tinh trùng nằm trong túi tinh và con cái có
buồng trứng phát triển, khi con cái giao vĩ thì nó có túi tinh.
Giai đoạn trưởng thành: là giai đoạn chín sinh dục hoàn toàn, di cư xa bờ tới vùng
biể sâu để sinh sản.

Hình 1.3. Vòng đời tôm sú (Penaeus monodon)
1.1.5 Đặc điểm dinh dưỡng.
Tôm sú là loài ăn tạp, thức ăn của tôm bao gồm giáp xác, giun nhiều tơ, nhuyễn thể,
các côn trùng, tảo và các mảnh thực vật. Tính ăn của chúng thay đổi theo giai đoạn,
ở giai đoạn tôm bột và tôm giống chúng ăn nhiều các mảnh thực vật, vi tảo… Khi
tôm lớn chúng ăn các loại động vật không xương sống như ruốc, mọi giáp xác chân
đều, giun nhiều tơ… Ở giai đoạn thành thục, trong suốt mùa sinh sản tôm ăn nhiều
nhuyễn thể trong khi những tháng khác tôm ăn nhiều cá hơn (Dall, 1998), được
trích dẫn bởi Nguyễn Thanh Phương và Trần Ngọc Hải, 2004).

12


Đồ án tốt nghiệp

Tôm ăn suốt ngày đêm nhưng ăn nhiều vào ban đêm, tôm giảm ăn vào những lúc lột

xác, khả năng bắt mồi của tôm còn phụ thuộc rất lớn vào môi trường sống (Nguyễn
Thanh Phương và Trần Ngọc Hải, 2004).
1.1.6 Đặc điểm về sinh trưởng, sinh sản và phát triển.
Hiện tượng lột xác: trong quá trình tăng trưởng, khi trọng lượng và kích thước tăng
lên đến mức độ nhất định, tôm phải lột bỏ lớp vỏ cũ để lớn lên. Sự lột xác thường
xảy ra vào ban đêm. Sự lột xác đi đôi với việc tăng thể trọng, cũng có trường hợp
nhưng không tăng thể trọng. Khi quan sát tôm nuôi trong bể, hiện tượng lột xác xảy
ra như sau: lớp biểu bì giữa khớp đầu ngực và phần bụng bị nứt ra, các phần phụ
của đầu ngực rút ra trước, theo sau là phần bụng và các phần phụ phía sau rút ra
khỏi lớp vỏ cứng, với động tác uốn cong mình toàn cơ thể. Lớp vỏ mới mềm sẽ
cứng lại sau 1-2h đối với tôm nhỏ, 1-2 ngày đối với tôm lớn.
Hiện tượng giao vĩ và đẻ trứng: khi tôm cái vừa lột xác, tôm đực thường giao vĩ,
các túi tinh với sự giúp đỡ của petasma sẽ được đưa vào thelycum của con cái. Hoạt
động giao vĩ thường diễn ra vào ban đêm, sức sinh sản của tôm sú là khoảng
200.000- 1.700.000 trứng.

Hình 1.4. Quá trình giao vĩ của tôm sú (Penaeus monodon)

13