Phân Lập Nấm Paecilomyces Spp Và Xác Định Một Số Đặc Điểm Sinh Học, Khả Năng Phòng Trừ Bọ Phấn Trắng

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HCM

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

PHÂN LẬP NẤM Paecilomyces spp VÀ XÁC ĐỊNH
MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC, KHẢ NĂNG
PHÒNG TRỪ BỌ PHẤN TRẮNG, TUYẾN TRÙNG
CỦA CÁC CHỦNG THU NHẬN ĐƯỢC

Ngành:

Công nghệ sinh học

Chuyên ngành:

Công nghệ sinh học

Giảng viên hướng dẫn: TS. Nguyễn Thị Hai
Sinh viên thực hiện:

Phùng Lê Kim Yến

MSSV: 1051110195

Lớp: 10DSH02

TP. Hồ Chí Minh, 7/2014


Đồ án tốt nghiệp

LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi. Các nội dung nghiên cứu
và kết quả trong đề tài này là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kì công
trình nào trước đây. Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm trước nhà trường về lời cam đoan
này.
Tp. Hồ Chí Minh, ngày 26 tháng 7 năm 2014
Sinh viên thực hiện

Phùng Lê Kim Yến


Đồ án tốt nghiệp

LỜI CÁM ƠN
Lời cám ơn đầu tiên em xin chân thành gửi đến tập thể Quý thầy cô khoa
Công nghệ Sinh học – Thực phẩm – Môi trường, trường Đại Học Công nghệ Thành phố
Hồ Chí Minh đã giảng dạy kiến thức và truyền đạt những kinh nghiệm quý báu cho tôi
trong suốt 4 năm đại học.

Đặc biệt em xin gửi lời cám ơn chân thành đến cô Nguyễn Thị Hai người đã
tận tình dẫn dắt, động viên, tạo điều kiện tốt nhất và giúp đỡ, hướng dẫn em có những
hiểu biết nhiều hơn về kiến thức chuyên ngành để em có thể hoàn thành tốt đồ án tốt
nghiệp.
Em xin gửi lời cám ơn đến thầy Thành, người đã nhiệt tình hỗ trợ về thiết bị, vật tư
giúp đỡ em hoàn thành tốt đồ án tốt nghiệp.
Em xin cám ơn anh Ngô Văn Bình đã tạo điều kiện, giúp đỡ em có thể thực hiện
các thí nghiệm để hoàn thành đồ án tốt nghiệp.
Em cũng cám ơn các bạn ở phòng thí nghiệm và đặc biệt là những người bạn trong
nhóm ESS đã động viên, giúp đỡ tôi.
Và lời cám ơn chân thành, sâu sắc nhất con xin dành cho Ba Mẹ, người đã theo

dõi, ủng hộ và nuôi con khôn lớn đến ngày hôm nay. Cám ơn gia đình đã luôn chia sẻ và
tạo mọi điều kiện để con hoàn thành từng chặng đường học vấn của mình.


Đồ án tốt nghiệp

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH
LỜI MỞ ĐẦU ..........................................................................................................1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN ...................................................................................3
1. 1. Phân lập và tuyển chọn nấm Paecilomyces spp .........................................3
1.1.1. Giới thiệu về nấm thuộc chi Paecilomyces ............................................3
1.1.1.1 Phân loại khoa học ............................................................................3
1.1.1.2 Đặc điểm sinh thái .............................................................................3
1.1.1.3. Đặc điểm hình thái ...........................................................................4
1.1.1.4. Độc tố của nấm Paecilomyces spp....................................................6
1.1.1.5. Chu kỳ sống và cơ chế tác động của Paecilomyces spp đối với ký
chủ .................................................................................................................7
1.1.2. Các chủng nấm Paecilomyces spp. đã được phân lập ........................... 11
1.1.3. Một số ứng dụng của nấm Paecilomyces spp. vào thực tiễn đời sống
.........................................................................................................................13
1.1.3.1. Sản xuất enzyme..............................................................................13
1.1.3.2. Sản xuất kháng sinh và hợp chất thứ cấp ........................................ 14
1.1.3.3. Sản xuất thuốc bảo vệ thực vật ....................................................... 15
1.1.3.4. Xứ lý môi trường ............................................................................ 15
1.1.4. Một số sản phẩm của Paecilomyces spp ................................................ 16
1.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến sự phát triển của nấm Paecilomyces spp ...... 17

1.3. Các nghiên cứu về sử dụng Paecilomyces spp. trong phòng trừ bọ phấn
và tuyến trùng gây hại.......................................................................................20
1.3.1. Tổng quan về bọ phấn trắng ................................................................ 20
1.3.1.1. Phân loại khoa học ......................................................................... 20
1.3.1.2. Đặc điểm sinh thái .......................................................................... 21
1.3.1.3. Đặc điểm hình thái ......................................................................... 22
1.3.1.4. Tổng quan về bệnh vàng lá do bọ phấn trắng gây ra ....................... 23
1.3.2. Tổng quan về tuyến trùng .................................................................... 24
1.3.2.1. Phân loại khoa học ......................................................................... 25
1.3.2.2. Đặc điểm sinh thái .......................................................................... 25
i


Đồ án tốt nghiệp
1.3.2.3. Tổng quan về bệnh sần rễ do tuyến trùng gây ra ............................ 26
1.3.3. Đánh giá khả năng ký sinh của chủng Paecilomyces spp .................. 28
CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ....................... 34
2.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu ............................................................. 34
2.2. Thiết bị - hóa chất - vật liệu nghiên cứu ................................................... 34
2.2.1 Thiết bị - hóa chất ..................................................................................34
2.2.1.1 Thiết bị.............................................................................................34
2.2.1.2 Hóa chất ..........................................................................................34
2.2.2. Vật liệu ..................................................................................................35
2.2.3. Các môi trường sử dụng ....................................................................... 35
2.2.3.1 Môi trường phân lập ban đầu PDA (Potato D - Glucose Agar) ...... 35
2.2.3.2 Môi trường thử nghiệm hoạt tính chitinase, protase sử dụng chitin và
casein làm cơ chất ......................................................................................35
2.2.3.3 Môi trường Sauboraud + Khoáng chất............................................ 36
2.2.3.4 Môi trường Czapeck - Dox .............................................................. 36
2.2.3.5 Môi trường Malt agar ...................................................................... 36

2.3. Phương pháp nghiên cứu ........................................................................... 37
2.3.1. Phân lập nấm Paecilomyces spp .......................................................... 37
2.3.1.1. Phân lập nấm Paecilomyces spp. từ chế phẩm .............................. 37
2.3.1.2. Phân lập nấm Paecilomyces spp. từ bọ phấn trắng ....................... 37
2.3.2. Xác định khả năng sinh enzyme ngoại bào của Peacilomyces spp ..... 38
2.3.2.1. Xác định hoạt tính enzyme chitinase ............................................... 38
2.3.2.2. Xác định hoạt tính enzyme protease ............................................... 38
2.3.3. Khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố môi trường đến sự phát triển của
của nấm ..........................................................................................................39
2.3.3.1. Ảnh hưởng của pH đến sự phát triển của nấm Paecilomyces ......... 39
2.3.3.2. Khảo sát sự phát triển của nấm Paecilomyces spp. trong các môi
trường khác nhau ........................................................................................40
2.3.3.3. Khảo sát ảnh hưởng của ánh sáng đến sự phát triển của nấm
Paecilomyces spp ........................................................................................41
2.3.4. Đánh giá khả năng ký sinh bọ phấn của 2 chủng Paecilomyces sp1. và
sp2. ..................................................................................................................41
2.3.5. Đánh giá khả năng ký sinh con cái và tuyến trùng Meloidogyne spp.
.........................................................................................................................42
2.4. Phương pháp xử lý số liệu .......................................................................... 42

ii


Đồ án tốt nghiệp
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ........................................................ 44
3.1. Phân lập nấm ..............................................................................................44
3.1.1. Phân lập nấm có nguồn gốc từ chế phẩm xử lý đất ............................ 44
3.1.2. Phân lập nấm Paecilomyces sp2. ......................................................... 45
3.2. Đặc điểm hình thái của các chủng nấm Paecilomyces phân lập được ... 46
3.3. Định tính hệ enzyme ngoại bào có khả năng đối kháng tuyến trùng và

bọ phấn ...............................................................................................................50
3.3.1. Khả năng tổng hợp enzyme protease của 2 chủng nấm Paecilomyces50
3.3.2. Khả năng tổng hợp enzyme chitinase của 2 chủng nấm Paecilomyces
sp1. và sp2. ......................................................................................................52
3.4. Khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố môi trường sự phát triển của nấm . 54
3.4.1. Khảo sát ảnh hưởng của pH đến sự phát triển nấm của chủng nấm
Paecilomyces spp ............................................................................................54
3.4.1.1. Ảnh hưởng của pH lên sự phát triển của nấm Paecilomyces sp1. .. 54
3.4.1.2. Ảnh hưởng của pH lên sự phát triển của nấm Paecilomyces sp2. .. 56
3.4.2. Khảo sát sự ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy khác nhau đến sự
phát triển của nấm Paecilomyces spp ............................................................ 58
3.4.2.1. Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy khác nhau đến sự phát triển
của nấm Paecilomyces sp1. ......................................................................... 58
3.4.2.2. Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy khác nhau đến sự phát triển
của nấm Paecilomyces sp2. ......................................................................... 61
3.4.3. Khảo sát ảnh hưởng của điều kiện chiếu sáng đến sự phát triển nấm
.........................................................................................................................64
3.4.3.1. Ảnh hưởng điều kiện chiếu sáng đến sự phát triển nấm
Paecilomyces sp1.........................................................................................64
3.4.3.2. Ảnh hưởng điều kiện chiếu sáng đến sự phát triển nấm
Paecilomyces sp2.........................................................................................66
3.5. Khả năng ký sinh bọ phấn của 2 chủng Paecilomyces sp1. và sp2. .......... 68
3.6. Khả năng ký sinh con cái và tuyến trùng Meloidogyne spp của 2 chủng
nấm Paecilomyces ..............................................................................................70
CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ............................................................ 72
4.1. Kết luận .......................................................................................................72
4.2. Đề nghị.........................................................................................................72
TÀI LIỆU THAM KHẢO.....................................................................................73

iii

Đồ án tốt nghiệp

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
PDA: Potato D - Glucose Agar
SB:

Sabouraud + KC

MA: Malt
CZA: Czapeck - Dox

iv


Đồ án tốt nghiệp

DANH MỤC CÁC BẢNG
STT
1

BẢNG
1.1

NỘI DUNG
Hiệu

quả

phòng

trừ

của

TRANG
các

chủng

nấm 29 - 31

Paecilomyces spp. đối với tuyến trùng hại thực vật.
2

3.1

So sánh hình thái của chủng nấm Paecilomyces sp1. 45 - 46

3

3.2

So sánh hình thái của chủng nấm Paecilomyces sp2. 47 - 48

4

3.3

Kết quả sinh tổng hợp enzyme protease của 2 chủng 49
nấm Paecilomyces sp1. và sp2.

5

3.4

Kết quả sinh tổng hợp enzyme chitinase của 2 51
chủng nấm Paecilomycessp1. và sp2.

6

3.5

Sự ảnh hưởng của pH đến đường kính nấm 54
Paecilomyces sp1. qua các ngày

7

3.6

Sự ảnh hưởng của pH đến đường kính nấm 56
Paecilomyces sp2. qua các ngày

8

3.7

Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến sự phát 58
triển đường kính nấm Paecilomyces sp1. qua các

ngày.

9

3.8

Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến sự phát 61
triển đường kính nấm Paecilomyces sp2. qua các
ngày.

10

3.9

Ảnh hưởng của điều kiện chiếu sáng đến sự phát 63
triển đường kính của Paecilomyces sp1.

11

3.10

Số liệu sự phát triển của nấm dưới các điều kiện 66

v


Đồ án tốt nghiệp
chiếu sáng qua các ngày nuôi cấy.

12

3.11

Hiệu lực diệt bọ phấn

67

13

3.12

Đánh giá khả năng ký sinh tuyến trùng của 2 chủng 69
Paecilomycessp1. và sp2.

DANH MỤC CÁC HÌNH
STT

1

HÌNH

1.1

NỘI DUNG
Đặc điểm đại thể của Paecilomyces spp.

TRANG

5

Đặc điểm vi thể của Paecilomyces spp.
2

1.2

3

1.3

4

1.4

5

1.5

6

1.6

7

1.7

8

1.8

6

Cấu tạo hóa học của độc tố paecilotoxin
Bio Nematon - Sản phẩm của công ty T.Stanes có khả
năng trừ tuyến trùng
Sản phẩm trừ bọ phấn

7

16

17

Sự ảnh hưởng của nhiệt độ môi trường đến sự phát
triển của tản nấm Paecilomyces
Các giai đoạn trong vòng đời của bọ phấn trắng
Đặc điểm tuyến trùng hại rễ được quan sát dưới kính
hiển vi quang học ×10

vi

19

21

25


Đồ án tốt nghiệp

Vòng đời của tuyến trùng hại rễ

9

1.9

27

10

2.1

Chế phẩm xử lý đất

37

11

2.2

Các lọ thủy tinh dùng để bố trí thí nghiệm

38

Dịch chế phẩm được trang ra đĩa PDA ở nồng độpha
loãng 10-4 vào ngày thứ 3.

12

3.1

13

3.2

14

3.3

Sự phân giải casein của chủng Paecilomyces sp1.

50

15

3.4

Sự phân giải casein của chủng Paecilomyces sp2.

50

16

3.5

Sự phân giải chitin của chủng Paecilomyces sp1.

52

17

3.6

Sự phân giải chitin của chủng Paecilomyces sp2.

52

18

3.7

19

3.8

20

3.9

21

3.10

Nấm nghi ngờ mọc lên từ bọ phấn trên môi trường
PDA.

Sự phát triển của Paecilomyces sp1. trên môi trường có
pH khác nhau ở 14 ngày nuôi cấy.
Đường kính tản nấm chủng Paecilomyces sp1. ở các
pH môi trường 5, 6 ,7, 8 qua các ngày nuôi cấy
Nấm Paecilomyces sp2. ở pH 5,6,7,8 14 ngày sau cấy

Đường kính tản nấm chủng Paecilomyces sp2. ở các
pH môi trường 5, 6 ,7, 8 qua các ngày nuôi cấy

vii

43

44

53

54

55

56


Đồ án tốt nghiệp

Nấm Paecilomyces sp1. ở ngày thứ 14 sau khi cấy
22

3.11

57

Sự phát triển của Paecilomyces sp1. trên các môi
23

3.12

24

3.13

25

3.14

26

3.15

trường khác nhau qua các ngày.

Nấm Paecilomyces sp2. ở ngày thứ 14 sau khi cấy
Sự phát triển của Paecilomyces sp2. trên các môi
trường khác nhau qua các ngày.

59

60

62

Tản nấm Paecilomyces sp1. ở ngày thứ 14 sau nuôi cấy 63
Sự phát triển của Paecilomyces sp1. ở các điều kiện

27

3.16

28

3.17

29

3.18

64

chiếu sáng khác nhau

Tản nấm Paecilomyces sp2. ở ngày thứ 14 sau nuôi cấy 65
Sự phát triển của Paecilomyces sp2. ở các điều kiện
chiếu sáng khác nhau

66

Mẫu bọ phấn không bị ký sinh được soi bằng kính hiển
30

3.19

vi quang học

68

31

3.20

Mẫu tuyến trùng được soi bằng kính hiển vi quang học

69

Tuyến trùng được soi bằng kính hiển vi sau khi bị gây
32

3.21

nhiễm bởi nấm Paecilomyces sp2.

viii

70


Đồ án tốt nghiệp

1


Đồ án tốt nghiệp

LỜI MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết của đề tài
Việt Nam là đất nước của nền nông nghiệp và nằm trong vùng khí hậu nhiệt
đới nên thích hợp cho nhiều mầm bệnh sinh sôi nảy nở. Trong số đó có bệnh héo lá

do bọ phấn trắng và bệnh sần rễ do tuyến trùng gây ra. Hai mầm bệnh ấy đang
mang lại những tổn thất nặng nề về sản lượng nông nghiệp hiện nay. Vì vậy, việc
tìm ra giải pháp để kiểm soát hai tác nhân gây bệnh này rất quan trọng. Đa số người
nông dân hiện nay thường dùng các loại thuốc hóa học để phòng trừ các loài gây hại
này. Tuy nhiên, thuốc hóa học không những để lại tồn lưu cao trong nông san3anh3
hưởng đến sức khỏe người tiêu dùng, đến môi trường sống mà còn tăng tính kháng
thuốc của sâu hại, làm cho việc phòng trừ ngay càng khó khăn hơn. Vì vậy, hiện
nay người ta đang tìm kiếm các tác nhân sinh học để sử dụng thay thế một phần
hoặc hoàn toàn thuốc hóa học trong quản lý các loài sâu bệnh và tuyến trùng gây
hại.
Trong những năm gần đây, nhiều nghiên cứu ở các nước trên thế giới như
Úc, Brasil, Mỹ, Pháp, Colombia, Venezuela đã cho thấy việc sử dụng các loại nấm
ký sinh côn trùng, tuyến trùng trong phòng trừ các loài gây hại đã mang lại hiệu quả
cao (Burges H. D., 1998; Butt T. M and Copping L., 2000). Trong đó, Paecilomyces
là một trong những loài nấm tiềm năng đã được nghiên cứu và ứng dụng rộng rãi
trên thế giới. Tuy nhiên, ở Việt Nam, những nghiên cứu và ứng dụng về loài này
vẫn còn khá hạn chế. Xuất phát từ vấn đề trên, sinh viên quyết định chọn nghiên
cứu đề tài: "Phân lập nấm Paecilomyces spp. và xác định một số đặc điểm sinh
học, khả năng phòng trừ bọ phấn trắng, tuyến trùng của các chủng thu nhận
được".
2. Mục đích nghiên cứu
Phân lập được các chủng Paecilomyces spp. và bước đầu đánh giá khả năng
ký sinh của các chủng Paecilomyces spp. phân lập được trên bọ phấn trắng, tuyến
trùng nhằm phòng trừ bệnh hại thực vật.

1


Đồ án tốt nghiệp

3. Nội dung nghiên cứu
− Phân lập các chủng Paecilomyces từ chế phẩm và bọ phấn trắng thu thập
được
− Định tính hệ enzyme ngoại bào có khả năng đối kháng tuyến trùng và bọ
phấn trắng
− Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến sự phát triển của nấm Paecilomyces
spp. phân lập được
− Đánh giá khả năng ký sinh bọ phấn và tuyến trùng của nấm Paecilomyces
spp. phân lập được

2


Đồ án tốt nghiệp

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN
1. 1. Phân lập và tuyển chọn nấm Paecilomyces spp.
1.1.1. Giới thiệu về nấm thuộc chi Paecilomyces
1.1.1.1 Phân loại khoa học
Giới:

Fungi

Ngành:

Ascomycota

Lớp:

Eurotiomycetes

Bộ:

Eurotiales

Họ:

Trichocomaceae

Chi:

Paecilomyces

Chi Paecilomyces do Bainier mô tả vào 1907, sau đó được nhiều tác giả chấp
nhận chi mới này và bổ sung nhiều loài mới. Chuyên luận về chi nấm này của
Samson (1974) chấp nhận 16 loài đã mô tả, đồng thời tổ hợp mới 9 loài và đề nghị 6
loài mới, tất cả tập hợp trong 2 nhóm loài. Nhóm loài thứ nhất là nhóm loài
Paecilomyces có các giai đoạn bào tử túi thuộc các chi Byssochlamys Westling,
Talaromyces C.R.Benjamin và Thermoascus Miehe, gồm các loài ưa nhiệt ôn hòa
(mesophile), chịu nhiệt và ưa nhiệt, có khuẩn lạc màu nâu vàng hay các màu nâu
khác. Nhóm loài thứ hai là nhóm loài Isarioides gồm các loài không có giai đoạn
bào tử túi, ưa nhiệt ôn hòa và có khuẩn lạc màu tím hồng, màu lục và màu vàng.
Nhiều loài trong nhóm hai này ký sinh gây bệnh côn trùng.
1.1.1.2 Đặc điểm sinh thái
Nấm Paecilomyces spp. có rất nhiều loài, có phổ ký sinh côn trùng rất rộng,
cả ở vùng nhiệt đới và ôn đới (Trần Văn Mão, 2002). Ngoài ra, có thể tìm thấy loài
nấm này ở các loại đất nông nghiệp (Brand et al., 2010). Chúng hiện diện ở những
nơi khá ẩm ướt, trong đất, không khí, trong phòng thí nghiệm hay ngoài tự nhiên.
Ký chủ của nấm bao gồm hơn 25 họ côn trùng và nhiều loại ve khác nhau. Trong
đó, những loài ký chủ là côn trùng dễ bị nhiễm nấm đó là: bọ phấn trắng, rệp, bướm

đêm...; còn những loài ký chủ là ve thì có: ve nâu, ve đỏ châu Âu... Còn đối với ký
chủ là tuyến trùng thì thường phân lập được chủng nấm Paecilomyces lilacinus,

3


Đồ án tốt nghiệp

một loài có trong đất và thảm thực vật (Jatala, 1986). Trong nghiên cứu của Eng
(2001), có 82,9% trong số 41 nông trại được khảo sát ở Sarawalk có sự hiện diện
của P.lilacinus, mặc dù người ta đã sử dụng các loại thuốc diệt nấm. Từ đó có thể
nhận thấy P.lilacinus có khả năng thích ứng cao với điều kiện sống, có phạm vi
thích ứng rộng và có khả năng phát triển tốt ở 26 – 300C.
Chi Paecilomyces có nhiều loài nhưng chủ yếu là hai loài Paecilomyces
lilacinus và Paecilomyce variotii. Một vài loài Paecilomyces spp. có khả năng chịu
nhiệt như: nhiệt độ tối ưu của Paecilomyces fulvus là 450C, Paecilomyces
crustaceous là dưới 550C (Samson, 1974). Hai loài nấm chịu nhiệt trên có khả năng
làm hư hỏng thực phẩm nhưng cũng là loài quan trọng ứng dụng trong công nghiệp
sản xuất các enzyme chịu nhiệt. Những nghiên cứu gần đây cho thấy nhiều loài
Paecilomyces đem lại nhiều hợp chất có hoạt tính sinh học hữu ích (Liang et al.,
2003) . Một số loài Paecilomyces spp. phổ biến:
− Paecilomyces carneus: phân lập từ đất và xác chết côn trùng.
− Paecilomyces farinosus: phân lập từ đất.
− Paecilomyces fumosoroseus: phân lập từ đất, bơ, gelatin, côn trùng.
− Paecilomyces lilacinus phân lập được từ xác bã hữu cơ, trứng tuyến trùng và
đôi khi còn ở côn trùng chết, rừng cao su. (Crop Protection Compennium,
2002).
1.1.1.3. Đặc điểm hình thái
a. Đặc điểm đại thể
Paecilomyces spp. là loại nấm sợi được tìm thấy trong đất hay xác côn trùng.

Khi được nuôi cấy trong môi trường nhân tạo nấm thường phát triển khá chậm, có
dạng thảm nhung, dạng bó sợi và thường lúc đầu có màu trắng sau đó khi bào tử
phát triển thì chuyển sang màu hồng nhạt, màu tím hay màu lục nhạt (nên thường
được gọi là nấm tím) tùy vào từng loài. Cũng có loài màu nâu hay vàng sẫm. Sợi
nấm mềm, có vách, trong suốt và rộng từ 2,5 - 4 µm (Wikipedia). Khuẩn lạc thường
4


Đồ án tốt nghiệp

mọc theo hình tròn đồng tâm. Có thể phân biệt các loài khác nhau của Paecilomyces
thông qua hình thái đại thể và vi thể.

Hình 1.1. Đặc điểm đại thể của Paecilomyces spp.
(Nguồn: www.pf.chiba-u.ac.jp)
b. Đặc điểm vi thể
Cuống bào tử đính thường phân nhánh và mức độ phân nhánh của nấm
Paecilomyces spp. thường lớn hơn nấm mốc xanh Penicillium spp. Cuống bào tử
hình thành từ phần gốc hay giữa sợi nấm, dài 400 - 600 µm. Paecilomyces spp. có
thể bình trên đầu của cuống với kích thước 3 - 4 × 400 - 600 µm. Thể bình nhỏ,
phồng lên ở phần gốc, thon dài, nhỏ và uốn cong ở phần đầu. Thường phần gốc
chụm lại thành nhóm như cây chổi tương tự như cấu trúc ở phần đuôi của cuống
bào tử đính. Bào tử phân sinh đơn bào, có dạng hình oval đến hình thoi, trong suốt
đến nâu, có hình thành dạng chuỗi, bề mặt nhẵn hoặc có gai (Trần Văn Mão, 2002).
Giá bào tử trần, đơn độc hoặc bó thành giá, phân nhánh không đều hoặc
thành vòng. Nhánh mang ở đỉnh thể bình mọc thành vòng. Thể bình đôi khi đơn độc
trên các sợi nấm không phân hóa. Thể bình gồm phần gốc hình trụ hoặc hình gần
trứng và phần ngọn thon nhỏ đột ngột thành một cổ dài. Bào tử trần thuộc tip
phialoconidi (tip cơ bản euconidi), không ngăn vách, không màu hoặc màu nhạt,

5


Đồ án tốt nghiệp

nhẵn hoặc có gai, thành chuỗi gốc non. Các chuỗi bào tử trần tách xa nhau, ít khi tụ
họp thành khối.

Hình 1.2. Đặc điểm vi thể của Paecilomyces spp.
(Nguồn: />1.1.1.4. Độc tố của nấm Paecilomyces spp.
Độc tố chính của nấm Paecilomyces spp. là paecilotoxin (leucinostatins), là
một trong các tác nhân gây ra cái chết cho kí chủ. Paecilotoxin có cấu trúc cực kỳ
phức tạp, là một chuỗi peptide thẳng gồm nhiều acid béo chưa bão hòa ở đầu N và
amine ở đầu C. Paecilotoxin có pháp danh hóa học là (2S)-N-[(1S)-1-[[(1S)-1[[(1S)-1-[2[2-(3-arbamoylpropylcarbomoyl)propan-2-ylcarbamoyl]
ylcarbamoy]-3-methylbutyl]

propan-2-

carbomoyl]-3-methyl-butyl]carbomoyl]propan-2-

ycarbomoyl]-2-hydroxy-3-methyl-butul]

carbomyl]-5-hydroxy-3-methyl-7-oxo-

nonyl]-4-methyl-1-[(E,4S)-4-methylhex-2-enoyl]

pyrrolidin-2-carboxamide.

(Nevalainen Helena, 1977).
Sản phẩm của paecilotoxin có rất nhiều dạng, nhưng khá giống nhau ở mỗi

chủng, thường thì độc tố chính là Paecilotoxin A hoặc Paecilotoxin B. Tùy từng loài
khác nhau mà có sinh ra các độc tố khác như: bysochlamic acid, variotin, ferriubin,
viriditoxin, indole-3-acetic acid, fusigen và patulin. Các hợp chất chuyển hoá thứ
cấp này có thể gây ra tác động diệt tuyến trùng.

6


Đồ án tốt nghiệp

Hình 1.3. Cấu tạo hóa học của độc tố paecilotoxin.
1.1.1.5. Chu kỳ sống và cơ chế tác động của Paecilomyces spp. đối với ký chủ
a. Chu kỳ sống và cơ chế tác động của nấm Paecilomyces spp. đối với bọ phấn trắng
Chu kỳ sống của Paecilomyces spp. có thể chia làm 3 giai đoạn: đầu tiên các
bào tử sẽ tiếp xúc với côn trùng qua lớp vỏ và lớp chân lông. Các bào tử bám váo
lớp vỏ của côn trùng, nảy mầm và phát triển một ống mầm trong 8 - 16 giờ. Ống
mầm phát triển dưới dạng một vòi bám xuyên qua biểu bì côn trùng và đi vào trong
xoang máu. Vòi bám là một tế bào có kích thước gấp 2 - 3 lần bào tử, có dịch nhầy
để bám vào vỏ côn trùng. Sự xâm nhập của nấm đạt được bằng cách tiết ra hỗn hợp
enzyme bao gồm chitinase, protease và áp lực cơ học. Sau khi tế bào đơn nảy mầm,
bào tử sẽ xâm nhập và lưu thông trong xoang máu của côn trùng, nhân lên, và sử
dụng chất dự trữ trong cơ thể côn trùng để sinh trưởng và sinh sản. Các sợi nấm
phân nhánh tạo thành một mạng lưới chằng chịt trong cơ thể côn trùng.
Paecilomyces spp. sản sinh ra các hợp chất, phá bỏ hệ thống miễn dịch của
côn trùng, cạnh tranh với các vi sinh vật tiềm tàng, giết chết vật chủ trong 7 - 14
ngày. Cuối cùng sau khi ký chủ chết, nấm sẽ lan ra khỏi biểu bì rồi bao lấy cơ thể
của côn trùng và phát triển thành đảm bào tử. Khi gặp điều kiện phù hợp sẽ sản sinh
ra bào tử, bào tử sẽ được phát tán rồi lây nhiễm cho các vi sinh vật khác. Tuy nhiên,

7

Đồ án tốt nghiệp

chu kỳ sống được hoàn thành trong điều kiện phải thích hợp, trong khoảng 48 - 72
giờ và không có sự có mặt của vi sinh vật hoại sinh.
Thông thường đối với các loại bệnh truyền nhiễm do vi khuẩn hay do virus
thì chúng lây truyền thông qua đường ruột hay đường thức ăn, nhưng đối với nguồn
bệnh là vi nấm thì chủ yếu là do sự tiếp xúc trực tiếp hay qua trung gian truyền
bệnh. Trung gian đó có thể là những loài ký sinh hay côn trùng ăn thịt.
Nấm Paecilomyces spp. tấn công vào xoang máu của bọ phấn thông qua lớp
biểu bì hoặc đường miệng. Bọ phấn chết là sự kết hợp của nhiều yếu tố như tổn
thương mô cơ do sự xâm chiếm, suy giảm nguồn dinh dưỡng và nhiễm độc tố do
nấm tiết ra khi ở trong cơ thể côn trùng.
Quá trình bám của bào tử nấm vào cơ thể của côn trùng là một quá trình thụ
động nhờ gió và nước. Đầu tiên bào tử của nấm sẽ bám lên thành biểu bì. Bào tử
của nấm có một lớp bên ngoài là bó sợi đan xen là các đuôi kị nước. Độ bám dính
của bào tử trên bề mặt biểu bì một phần là nhờ các đuôi kị nước. Lectins, một loại
cacborhydrate glycoprotein được phát hiện có trên bào tử, giúp cho việc bám vào bề
mặt biểu bì côn trùng dễ hơn. Khi đạt tới điều kiện thích hợp bào tử sẽ nảy mầm và
tăng trưởng nhanh chóng với sự tác động của các điều kiện sẵn có của nước, chất
dinh dưỡng, oxy cũng như pH, nhiệt độ và bởi sự tác động của hợp chất độc tố trên
bề mặt côn trùng. Nấm nảy mầm trong phạm vi có đủ nguồn Carbon và Nitơ.
Nấm xâm nhập vào côn trùng bằng quá trình lây nhiễm, xâm nhập qua lớp
biểu bì hay tạo áp lực cơ học nhờ giác bám. Lớp biểu bì của côn trùng có hai lớp:
ngoài là epicuticle và trong là procuticle. Epicuticle có cấu trúc phức tạp là một lớp
mỏng không có chitin nhưng chứa protein, phenol ổn định và được bao phủ bởi một
lớp sáp có chứa acid béo, lipid, sterol.Các procuticle phần lớn có các sợi chitin bên
trong hỗn hợp protein, lipid, quinon. Nấm cần xuyên qua lớp biểu bì vào cơ thể côn
trùng để có thể lấy được chất dinh dưỡng cần cho sự tăng trưởng và sinh sản. Sự

xâm nhập vào cơ thể côn trùng bao gồm cả sự phân hủy của enzyme do nấm tiết ra
và nhờ áp lực cơ học.

8


Đồ án tốt nghiệp

Khởi đầu cho quá trình xâm nhiễm, nấm xâm nhập tại những vị trí dễ bị tổn
thương trên lớp biểu bì. Nấm sẽ xuyên qua lớp biểu bì ngoài nhờ áp lực cơ học. Bào
tử nảy mầm và hình thành các giác bám trên bề mặt biểu bì. Giác bám là đầu tận
cùng của ống mầm phát sinh từ bào tử. Giác bám gắn vào biểu bì côn trùng là nhờ
tương tác kị nước giữa các thành bào tử và các lipid nằm trong lớp biểu bì trên. Sau
đó, ống mầm xuyên qua lớp biểu bì dưới, nội bì rồi vào xoang máu. Các nghiên cứu
còn cho thấy có sự tham gia của các chất truyền tin nội bào như Ca2+ và cAMP
(cyclicadenosine monophosphate) trong sự hình thành giác bám trong trường hợp
khi lớp biểu bì cứng khó xuyên qua. Sau khi xâm nhập vào trong cơ thể côn trùng,
nấm thường tạo ra rất nhiều sợi nấm ngắn. Những sợi nấm này được phân tán khắp
cơ thể theo dịch máu, chúng tiêu diệt dần các tế bào bạch huyết.
Sau đó, sợi nấm xâm nhập mô, phá hủy tất cả các tế bào bạch huyết rồi làm
chết vật chủ. Sự sinh sản của nấm trước hết là sự biến đổi thành phần dịch thể làm
giảm tác dụng oxy hóa khử lympo trong máu. Do nấm sinh sản nhiều sẽ làm tắc hệ
tuần hoàn của côn trùng, làm côn trùng biếng ăn; đồng thời chất độc sinh ra làm
thay đổi sinh hóa của cơ thể và làm tê liệt thần kinh, từ đó làm rối loạn và mất chức
năng sinh lý. Sau khi côn trùng chết, nấm tiếp tục hoại sinh cơ thể côn trùng rồi phát
triển sợi nấm ra toàn bộ cơ thể côn trùng và hình thành bào tử.
Quá trình xâm nhập vào cơ thể côn trùng còn nhờ vào sự hỗ trợ mạnh mẽ của
các enzyme và hệ enzyme. Một loạt các loại enzyme ngoại bào có thể thủy phân các
thành phần chính của lớp biểu bì côn trùng như chitinase, lipase, esterase,
lipoxygenase và ít nhất bốn loại protease khác nhau đã được ghi nhận có vai trò

quan trọng trong việc xâm nhiễm. Do cấu trúc phức tạp của lớp biểu bì côn trùng
nên cần có sự phối hợp hoạt động của nhiều enzyme khác nhau. Trong đó, chitanase
và endoprotease là hai enzyme giữ vai trò quan trọng nhất.

9


Đồ án tốt nghiệp

b. Chu kỳ sống và tác động của nấm Paecilomyces spp. tác động đối với tuyến
trùng

Thuật ngữ “nematophagous fungi – nấm kí sinh tuyến trùng” được dùng để
mô tả một nhóm đa dạng các loài nấm có khả năng xâm nhiễm và ký sinh tuyến
trùng.
Nhiều loại vi nấm đã được phân lập từ trứng tuyến trùng sần rễ (Stirling và
West, 1991). Được nghiên cứu nhiều nhất là Paecilomyces lilacinus, có thể kí sinh
cả trứng lẫn con cái (Siddiqui và Mahmood,1996).
Có hai rào cản đối với nấm kí sinh tuyến trùng khi xâm nhiễm kí chủ là lớp
biểu bì ấu trùng tuổi 2 (J2) và vỏ trứng. Có rất nhiều loài Paecilomyces có khả năng
ký sinh tuyến trùng, trong đó có Paecilomyces lilacinus và Paecilomyces
chlamydosporia được xem là nấm kí sinh trứng tuyến trùng hiệu quả. Một trong
những yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến quá trình xâm nhiễm là enzyme protease và
chitinase, bởi vì vỏ trứng được cấu tạo bởi ba lớp riêng biệt: một lớp vitelline bên
ngoài, một lớp chitin và một lớp lipoprotein bên trong. Các thí nghiệm đã cho thấy
trong giai đoạn đầu của quá trình xâm nhiễm, một mạng lưới sợi nấm phân nhánh
tiếp xúc với vỏ trứng, sau đó chúng tiết enzyme để phân hủy vỏ trứng (Llorca và
Claugher, 1990) dẫn đến sự tan rã của lớp vitelline, phân hủy của lớp chitin và
lipoprotein (Morton et al., 2004). Các loại nấm có sự khác nhau về khả năng phân
hủy vỏ trứng tuyến trùng, và quá trình xâm nhiễm được tìm thấy bị ảnh hưởng bởi

kí chủ tuyến trùng (Segers et al., 1998).
Sự xâm nhiễm tuyến trùng và trứng của chúng bởi các nấm khác nhau thì có
thể theo các phương thức khác nhau.
Ban đầu, các bào tử và sợi nấm sẽ tiếp xúc với vỏ trứng. Khi bào tử nấm bám
trên bề mặt kí chủ, bào tử sẽ mọc mầm xuyên qua lớp vỏ trứng. Như trong các cách
xâm nhập bề mặt kí chủ của các nấm kí sinh côn trùng khác, nấm kí sinh trứng
tuyến trùng sử dụng cả cách thức hóa học (enzyme) và cơ học. Nấm tiết ra các
enzyme làm mềm lớp vỏ trứng và tạo thành một lỗ thủng tại nơi bào tử mọc mầm

10


Đồ án tốt nghiệp

rồi thông qua lớp lổ thủng đó mầm của bào tử nấm sẽ xâm nhập vào bên trong trứng
tuyến trùng (Perry và Starr, 2009).
Vỏ trứng tuyến trùng có chứa chitin và protein được tổ chức thành một cấu
trúc sợi nhỏ và vô định hình (Wharton, 1980), do đó chitinase và protease giữ một
vị trí quan trọng trong quá trình xâm nhập tuyến trùng (Tikhonov et al., 2002). Để
chứng minh tầm quan trọng của enzyme trong quá trình phân hủy các polymer trong
trứng tuyến trùng, một nghiên cứu về các enzyme ngoại bào phân hủy các polymer
này đã được thực hiện trên một chất ngoại bào (ECM - extracellular material chứa
protease P32) hoặc chất kết dính được tiết ra từ nấm P.rubescens có liên quan đến
lectin Concanavalin A (Con A). Trong nghiên cứu đó, protein serine 32 kDa đã
được ly trích từ P. rubescens kí sinh trứng. Sự tham gia của enzyme trong quá trình
này đã được kiểm tra trên các protein vỏ trứng Globodera pallid (Llorca, 1990).
Người ta cho rằng mặc dù quá trình gây bệnh phức tạp và liên quan tới nhiều yếu tố,
nhưng ức chế P32 bằng hóa chất và kháng thể đa dòng làm giảm sự nhiễm trùng và
xâm nhập trứng (Llorca et al., 2002). Các loài tương tự P. chlamydosporia cũng tiết
ra enzyme protease ngoại bào (VcP1) liên quan với P32 và các enzyme tương tự từ

nấm nội kí sinh (Segers et al., 1994). Trứng được xử lý với VcP1 bị xâm nhiễm dễ
hơn trứng chưa được xử lý, điều này cho thấy vai trò của enzyme trong quá trình kí
sinh vỏ trứng bởi nấm kí sinh trứng.
1.1.2. Các chủng nấm Paecilomyces đã được phân lập
Nấm Paecilomyces spp. có rất nhiều loài trên thế giới, khoảng 83 loài phân
bố trên diện rộng, trong đó có thể kế đến là Paecilomyces

fumosoroseus,

Paecilomyces

amoeneroseu, Paecilomyces javanicus, Paecilomyces tenuipes,

Paecilomyces

cicadae, Paecilomyces

variotii, Paecilomyces

K.Arora, P.D.Bridge, Deepak Bhatnagar, 2004).

11

lilacinus (Dilip


Đồ án tốt nghiệp

Một số loài quan trọng trong phòng trừ sinh học như:
- Paecilomyces lilacinus

Được tìm thấy đầu tiên trong trứng tuyến trùng vào năm 1966 và sau này
được phát hiện ký sinh trên trứng của tuyến trùng Meloidogyne incognita ở Peru.
Hiện tại, có thể phân lập loài nấm này ở trong đất và thỉnh thoảng là ở cả trong côn
trùng. Đường kính khuẩn lạc dao động trong khoảng 5 - 7cm trong 14 ngày ủ ở
nhiệt độ phòng 270C ± 20C. Sợi nấm ban đầu có màu trắng sau đó chuyển sang màu
hồng khi sinh bào tử. Sợi nấm trong suốt và sinh ra các thể hình bình cổ hẹp với số
lượng lớn các bào tử gắn lỏng lẻo tạo thành hình chuỗi dài. Các thể bình phình ra ở
phần gốc và thon nhỏ lại ở cổ. Bào tử trần hình elip đến hình thoi (Samson, 1975).
- Paecilomyces fumosoroseus
Khuẩn lạc trên môi trường MEA (Malt extract agar) có màu xám. Sau 14
ngày đường kính khuẩn lạc đạt 15 mm. Cuống bào tử trần đơn độc, kích thước 40 60 × 2 - 3µm. Bào tử có dạng hình trụ, kích thước 3 - 4 × 1 - 2µm và tạo thành
chuỗi dài. Loài này có khả năng ký sinh trên các loài côn trùng.
- Paecilomyces variotii Bainier
Paecilomyces variotii Bainier là loài thường gặp nhất ở không khí, đất và
trên các sản phẩm công nông nghiệp ở nước ta (D.H.Miên, 1960), có khả năng sinh
ra kháng sinh variotin (kháng sinh chống nấm), ngoài ra còn tạo thành mycotoxin là
acid byssochlamic và một số sản phẩm trao đổi chất khác. Thường sống hoại sinh
trên các loại gỗ, đồ thuộc da, sách, đồ bằng sợi nilon hay sợi đay. Nhưng loài nấm
này có khả năng gây bệnh trên người và thực vật.
- Paecilomyces inflatus
Khuẩn lạc trên môi trường MEA (Malt extract agar) phát triển chậm, đường
kính từ 33 - 35mm ở 14 ngày và ở nhiệt độ 280C. Khuẩn lạc mịn, mềm như bông
khi mới phân lập. Phát triển thành sợi nấm trong suốt và mịn vài ngày sau đó.

12


Đồ án tốt nghiệp

Khuẩn lạc trên PDA cũng phát triển chậm, khoảng 33 - 35mm ở 14 ngày và

ở nhiệt độ 250C. Khuẩn lạc có màu trắng hơi vàng nhạt. Nhiệt độ tối ưu cho sự phát
triển của nấm là ở 250C.
Cuống bào tử có cấu trúc không đều thường gồm 1 - 3 thể bình trên nhánh
ngắn của sợi nấm.
Thể bình, bào tử: chủ yếu là các thể bình đơn có cấu trúc không đều trên sợi
nấm hoặc ngẫu nhiên có 2 – 3 thể bình nằm trên sợi nấm. Thể bình có dạng bình,
với phần gốc phình to, phần đầu nhọn. Thể bình dài khoảng 12,8 – 2,3 µm, trong
suốt và mịn. Bào tử độc lập, hình chanh.
1.1.3. Một số ứng dụng của nấm Paecilomyces spp. vào thực tiễn đời sống
1.1.3.1. Sản xuất enzyme
Paecilomyces spp. được biết đến như một chủng nấm sản xuất và cung cấp
nguồn enzyme tiềm năng. Paecilomyces spp. tiết ra enzyme để dễ xâm nhập vào ký
chủ hơn và giúp chúng phát triển nhờ thủy phân cơ chất hay thâm chí còn lấn át các
loài vi sinh vật khác phát triển. Đã có nhiều nghiên cứu về sự sản sinh enzyme của
Paecilomyces spp., nhiều nhất là về các enzyme hydrolase: protease, cellulase,
dextranase...
Paecilomyces spp. sinh ra ba loại protease: acid, trung tính và kiềm. Các
protease acid và trung tính có thể ứng dụng trong công nghệ sản xuất bia và bánh
kẹo. Protease kiềm thì ứng dụng trong công nghiệp thuộc da.
Paecilomyces spp. thuộc nhóm nấm Ascomycetes có mặt trong đất, nước,
không khí, gỗ, tàn dư thực vật, đất… Paecilomyces spp. còn gọi là nấm thối mềm,
vì chúng có khả năng phân hủy cellulose.
Dextranase (α -1,6-D-glucan, 6 glucanohydrolase; EC: 3.2.1.11) có nhiều
ứng dụng trong y học và nền công nghiệp vì nó thủy phân dextran. Sự hiện diện của
dextran có nhiều tác động tiêu cực ở mức độ chế biến như mất sucrose, tăng độ nhớt
của quá trình siro và phục hồi kém của sucrose. Sử dụng dextran sẽ giải quyết được
các vấn đề này. Dextranase có thể thủy phân hay ức chế quá trình tổng hợp glucans,
13