Khảo Sát Ảnh Hưởng Của Dịch Chiết Lên Sự Sinh Trưởng Và Phát Triển Của Lan Oncidiumsp. In Vitro

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ TP. HCM

Ngành

: Công Nghệ Sinh Học

Chuyên ngành : Công Nghệ Sinh Học

Giảng viên hướng dẫn

: ThS. Phan Quốc Tâm

Sinh viên thực hiện

: Mai Duy Vinh

MSSV: 107111227

Lớp: 07DSH02

TP. Hồ Chí Minh, năm 2012


Đồ án tốt nghiệp

SVTH : Mai Duy Vinh

GVHD: ThS. Phan Quốc Tâm

Trang 1

Đồ án tốt nghiệp

GVHD: ThS. Phan Quốc Tâm

1.1. Sơ lược về hoa lan
1.1.1. Tình hình sản xuất hoa lan trên thế giới và ở Việt Nam
1.1.1.1. Tình hình sản xuất hoa lan trên
thế giới
Hoa lan được mệnh danh là nữ hoàng của
các loài hoa, thị trường tiêu thụ hoa lan rộng
khắp thế giới, mang lại lợi nhuận kinh tế cao
cho nhiều nước.
Thị trường tiêu thụ hoa lan của khối châu
Âu rất hấp dẫn.

Hình 1.1. Giàn treo lan

Năm 2006 khối EU có sản lượng xuất khẩu hoa lan trên thế giới đạt 55 tỉ sản
phẩm, mang lại giá trị kim ngạch xuất khẩu hoa lan là 73 tỉ EUR. Trong đó, Hà Lan
là một quốc gia duy nhất ở Châu Âu có công nghiệp trồng lan xuất khẩu, do trồng
trong nhà kính nên Hà Lan có thể xuất khẩu hoa quanh năm, đồng thời là đầu mối
trung gian nhập khẩu hoa lan (37%) từ các nước khác trên thế giới. Năm 2006, Hà
Lan xuất khẩu hoa lan chiếm 95% tổng sản lượng hoa lan trong khối EU...
Mặc dù khối Châu Âu có sản lượng xuất khẩu hoa lan cao hơn so với các
khối khác, nhưng do nhu cầu tiêu thụ lan trong khối EU cao nên trong năm 2006
sản lượng nhập khẩu hoa lan từ các nước lên tới trên 155 tỉ sản phẩm, giá trị kinh
ngạch nhập khẩu đạt gần 90 tỉ EUR (International Statistics Flowers and Plants,
2007).

Hoa lan hiện nay đang là mặt hàng xuất khẩu chiến lược, mang nguồn lợi
kinh tế cho nhiều Quốc gia Châu Á. Thái Lan là nước xuất khẩu chủ yếu là hoa lan
nhiệt đới, đặc biệt là Dendrobium, phổ biến nhất là Dendrobium

.

Sonia và Jumbo White. Ngoài ra cũng còn một số loài nổi tiếng khác như Aranda,
Mokara, Oncidium và Vanda. Hơn 80% Dendrobium trên thị trường thế giới là từ
Thái Lan. Chỉ với loại hoa lan chủ lực là Dendrobium, Thái Lan đạt doanh thu mỗi
năm gần 600 triệu USD từ giá trị xuất khẩu loại hoa này.

SVTH : Mai Duy Vinh

Trang 2


Đồ án tốt nghiệp

GVHD: ThS. Phan Quốc Tâm

Giá trị xuất khẩu năm 2000 khoảng 1.765 triệu baht. Dendrobium được chọn
là sản phẩm vô địch bởi vì sản phẩm của nó xuất khẩu liên tục trong năm. Hiện tại,
Thái Lan là nước đứng đầu thế giới về hoa lan. Nó trở thành niềm kiêu hãnh của
người trồng hoa lan ở Thái Lan. Hiện nay Thái Lan có khoảng 24 triệu m2 trang trại
trồng hoa lan.
Đài loan là nước đứng đầu thế giới về sản xuất và xuất khẩu hoa lan Hồ Điệp
bằng qui trình công nghệ cao, giá trị doanh thu từ xuất khẩu loại hoa này hàng năm
khoảng 43 triệu USD. Trên thị trường thế giới, sản phẩm chủ yếu của hoa lan Hồ
Điệp là hoa chậu, sản phẩm này có giá trị kinh tế cao gấp nhiều lần so với hoa Hồ
Điệp cắt cành.

Hàng năm, Đài Loan sản xuất được 36 triệu Phalaenopsis. Trong đó, 12 triệu
hoa lan được xuất khẩu ra các nước như: 3 triệu đến Nhật Bản, 3 triệu đến Trung
Quốc, 2,5 triệu tới Hoa Kì và 3,5 triệu cho các quốc gia khác. Trong tháng 6 năm
2004, Hoa Kì đã cung cấp giấy phép xuất khẩu Phalaenopsis cho Đài Loan trên thị
trường Hoa Kì.
1.1.1.2 . Tình hình sản xuất hoa lan ở Việt Nam
Diện tích trồng hoa ở Việt Nam hiện nay là 2500 ha nhưng hoa lan chỉ chiếm
5 – 6 %. Nước ta bắt đầu sản xuất và thương mại hoa lan tập trung khoảng 6 năm
trở lại đây nhưng tốc độ phát triển khá nhanh. Chỉ riêng Tp.HCM diện tích vườn lan
lên tới 80 ha, hoa lan đang mang lại thu nhập cao cho nhiều nông dân. Tuy nhiên,
do cây giống trong nước không đủ cung cấp cho sản xuất, các nhà vườn nhập cây
giống ồ ạt từ nước ngoài như Thái Lan, Đài Loan, Trung Quốc (Báo cáo điều tra
thống kê của Sở NN&PTNT Tp.HCM, 2008).
Theo thống kê của Sở NN & PTNT Tp.HCM trong năm 2003 doanh số kinh
doanh hoa lan cây kiểng chỉ đạt 200 - 300 tỉ đồng nhưng đến năm 2005 đã tăng đến
600 - 700 tỉ đồng.
Theo TS. Dương Hoa Xô – Trung tâm Công nghệ sinh học, đến nay đã hoàn
thiện quy trình nhân giống in vitro cho 7 nhóm giống hoa lan, có khả năng cung cấp
200.000 cây con hoa lan nuôi cấy mô thuộc các nhóm Mokara, Dendrobium,
SVTH : Mai Duy Vinh

Trang 3


Đồ án tốt nghiệp

GVHD: ThS. Phan Quốc Tâm

Phaleanopsis, Catlleya. Năm 2007, đã cung cấp cho các nhà vườn khoảng 50.000
cây hoa lan nuôi cấy mô các loại. Năm 2008, sản xuất 100.000 cây giống hoa lan

cấy mô, tập trung cho nhóm hoa lan cắt cành Mokara, Dendrobium và một số giống
lan rừng quý.
Đến 2009, chiếm lĩnh thị trường hoa Tết là những loại hoa mới là và cao cấp
như tiểu quỳnh, lily, tulip, địa lan, hồ điệp… nhân giống bằng công nghệ in vitro.
Hiện nay, rất nhiều loại hoa đã được sản xuất bằng phương pháp nuôi cấy
mô tại Việt Nam, như lan Dendrobium, phalaenopsis, vanda, catlleya, Oncidium,
vạn thọ Pháp, cúc Đài Loan, hoa salem, cẩm chướng, hoàng thảo, hoa đồng tiền
nhập nội (các giống Tamara, Banesa, Caliente…). Thị trường tiêu thụ hoa trong
nước ngày càng mở rộng, mỗi năm tiêu thụ hàng triệu cây hoa các loại, riêng hoa
lan cũng gần 2 triệu cây.
Đặc biệt Đà Lạt là nơi sản xuất hoa lan sớm nhất cả nước với nguồn cây
giống phong phú săn tìm trong rừng sâu. Lâm Đồng dẫn đầu cả nước về nguồn lợi
lan rừng với 101 chi và 396 loài, chiếm 55,3 % về chi và 76,5 % về loài lan rừng
của Việt Nam. Không ít loài lan được phát hiện lần đầu tiên trên thế giới mang tên
Đà Lạt, 10/12 loài lan quý của Việt Nam phân bố ở vùng rừng Lâm Đồng. Những
năm sau 1980, Đà Lạt đã xuất khẩu số lượng lớn cành hoa sang các nước Đông Âu.
Những năm gần đây, ngành sản xuất hoa lan ở Đà Lạt đã hồi sinh và phát
triển mạnh mẽ nhờ ứng dụng kĩ thuật công nghệ cao và sản xuất. Với công nghệ
hiện đại, đã giúp làm giảm chi phí trồng từ 40.000 - 70.00 đồng/gốc lan trước đây,
xuống chỉ còn 4.000 - 7.000 đồng/gốc. Sử dụng công nghệ nuôi cấy mô, và đặc biệt
bằng phương pháp gây vết thương kết hợp nuôi cấy lỏng.
PGS.TS. Dương Tấn Nhựt và cộng sự ở Viện Sinh học Tây Nguyên đã nhân
giống thành công Hồng hài - loài lan hài duy nhất trên thế giới có hương thơm,
được Tổ chức Bảo vệ động thực vật hoang dã thế giới đưa vào danh mục thực vật
cần bảo vệ bởi chỉ phân bố hẹp ở Việt Nam, khó sống, khó sinh sản.
Theo PGS. TS.Dương Tấn Nhựt, thành phố Đà Lạt là cỗ máy điều hòa khổng
lồ cho phép sản xuất địa lan trong tự nhiên theo hướng công nghiệp với chi phí sản
SVTH : Mai Duy Vinh

Trang 4

Đồ án tốt nghiệp

GVHD: ThS. Phan Quốc Tâm

xuất chỉ bằng 1/10 so với các quốc gia phải trồng lan trong nhà kính, có hệ thống
điều hòa nhiệt độ.
Lan Đà Lạt đã và đang mở rộng thị trường ra nhiều châu lục, trong đó có
những thị trường khó tính như Mĩ, Nhật Bản, Đài Loan… Nhiều doanh nghiệp
trong và ngoài nước đang tiến hành khảo sát lập trang trại sản xuất hoa lan quy mô
lớn bởi tiềm năng, triển vọng đầu tư tại Đà Lạt là rất lớn so với Trung Quốc và các
nước ASEAN khác.

1.1.2. Sơ lược về lan Oncidium
Lan Vũ Nữ (Oncidium) là một loại lan gồm
khoảng chừng 600 giống phân bố rộng rãi ở Nam
Mỹ, với hình dạng và màu sắc hoa rất đẹp và đa
dạng. Loại lan này có những củ bẹ to hoặc nhỏ,
phía trên có 1 hoặc 2 lá.
Hình 1.2. Lan vũ nữ đỏ
Tùy theo từng giống, có loài có lá dầy và cứng, có loài dài và mềm. Dò hoa
có loài dài như Onc. falcipetalum, Onc. carthagenense, Onc. divaricatum v.v… và
cũng có những dò hoa ngắn như Onc. cheirophorum. Mỗi dò mang từ 30 đến 100
hoa và có nhiều giống hoa lớn đến 4-5 cm. Oncidium là giống Lan thích nghi được
với biên độ sinh thái khá rộng, nhiệt độ thích hợp là từ 20 – 25 oC.
1.1.2.1. Phân loại
Vị trí phân loại: Lan Oncidium thuộc:
Giới

: Phantae (Thực vật)

Ngành

: Angiospermatophyta (Hạt kín)

Lớp

: Monodicotyledonae (cây một lá mầm)

Bộ

: Asparagales

Họ

: Orchidaceae

SVTH : Mai Duy Vinh

Trang 5


Đồ án tốt nghiệp

GVHD: ThS. Phan Quốc Tâm

Chi

: Oncidium

Loài

: Oncidium sp.

1.1.2.2 Đặc điểm hình thái của lan
Oncidium
Oncidium có khoảng 750 loài phân bố rộng
rãi nên đặc điểm hình thái đa dạng, với sự phân bố
rộng rãi như vậy nên hoa của các loài lan thuộc
giống Oncidium thường có nhiều màu sắc khác
nhau.
* Rễ Lan
Sự đa dạng về hình thái và cấu trúc rễ làm
cho Oncidium phù hợp với nhiều điều kiện sống:
rễ mảnh mai, thân rễ bò dài hay ngắn khi sống ở
đất.
Hình 1.3. Oncidium Red
Thông thường rễ thường mọc dưới các nách lá cuối cùng đâm sâu xuống đất
hay giá thể. Một vài loài Oncidium: Oncidium sphacelatum rễ mọc thành đám rối
dày đặc .
* Thân lan
Oncidium thuộc nhóm đa thân (còn gọi là nhóm hợp trục). Thân lan có thể
ngắn hay kéo dài, đôi khi phân nhánh, mang lá. Ở nhóm đa thân thì cây vừa có thân
vừa có giả hành. Giả hành là nơi dự trữ chất dinh dưỡng và nước để nuôi cây.
* Giả hành
Giả hành là những đoạn phình, bên trong có các mô mềm chứa dịch nhày
làm giảm sự mất nước và dự trữ chất dinh dưỡng để nuôi cấy trong điều kiện khô
SVTH : Mai Duy Vinh

Trang 6


Đồ án tốt nghiệp

GVHD: ThS. Phan Quốc Tâm

hạn khi cây sống bám trên cao. Ngoài ra giả hành còn chứa diệp lục tố nên có thể
quang hợp được, giả hành có nhiều hình dạng như: hình cầu, thuôn dài, hình trụ xếp
chồng lên nhau
* Lá
Hình dạng và cấu trúc lá rất da dạng, lá có hình kim, trụ có rãnh hay phiến
mỏng, dạng lá mềm mại, có màu xanh bóng, đậm hay nhạt tùy thuộc vị trí sống của
cây. Các lá mọc song song nhau và ôm lấy thân giả.
* Hoa
Hoa có vòng bao quanh và ba mảnh bao gồm ba cánh đài và ba cánh tràng.
Ba cánh đài thường có dạng ba cánh hoa giống nhau hay cánh đài lưng dài hơn cánh
đài bên. Các cánh đài dựng đứng hay trải ra. Ba cánh tràng có hai cánh bên rất
giống với cánh đài, rời hay dính với cánh đài bên, cánh tràng giữa còn được gọi là
cánh môi, có màu sắc biến đổi sặc sỡ, hấp dẫn côn trùng giúp hoa thụ phấn. Sự đa
dạng về màu sắc và hình dạng có sự đóng góp của cánh môi rất lớn. Cánh môi có
các dạng như nguyên chia thuỳ, khía răng, có tua viền hay chia thành các sợi mảnh.
Những bông hoa của giống Oncidium có sắc thái của màu vàng với đốm nâu,
có thể rất dài. Các cánh hoa thường xù trên các cạnh, như là môi . Môi là rất lớn,
một phần ngăn chặn các cánh hoa và đài hoa nhỏ
Một số hoa lan Oncidium là rất dài: Oncidum altissimum và của Oncidium
baueri có thể phát triển lên một tầm cao 5 m, trong khi sarcodes Oncidum có thể đạt
tới 3 m.
* Trái
Họ Orchidaceae đều có quả thuộc loại quả nang. Khi hạt chín, các nang bung

ra chỉ còn đính lại với nhau ở đỉnh và gốc. Ở một số loài, khi quả chín không nứt ra
nên hạt chỉ ra khỏi vỏ khi quả bị mục nát.

SVTH : Mai Duy Vinh

Trang 7


Đồ án tốt nghiệp

GVHD: ThS. Phan Quốc Tâm

* Hạt
Một quả chứa từ 10.000 đến 100.000 hạt. Đôi khi đến 3 triệu hạt nên hạt có
kích thước rất nhỏ (trước đây phong lan còn được xem là họ tử vi – microspermeae)
nên phôi hạt chưa phân hoá. Sau 8 - 12 tháng, hạt chín và phát tán nhờ gió. Khi gặp
nấm cộng sinh tương thích trong điều kiện phù hợp, hạt nảy mầm.

1.1.3. Đặc điểm sinh thái của lan Oncidium
1.1.3.1. Ánh sáng
Oncidium là loài ưa ánh sáng nhưng không chịu được ánh sáng trực tiếp,
những giống này có thể trồng dưới ánh đèn được. Những giống lá to và dày cần
nhiều ánh sáng hơn là những giống lá nhỏ và mềm.
Cường độ ánh sáng khoảng 50%. Ánh sáng yếu hơn cây vẫn phát triển tốt
như thân, lá xanh đẹp, tuy nhiên cho hoa kém. Để cây ra hoa tốt cần 70% ánh sáng.
1.1.3.2. Nhiệt độ
Về nhiệt độ thì cây phát triển rất tốt ở nhiệt độ 15 – 35oC đây là khoảng nhiệt
độ trung bình và ấm, nếu giảm nhiệt độ xuống dưới 15oC một vài giờ cây không
chết nhưng kéo dài cây sẽ không ra hoa, nếu nhiệt độ tăng quá cao cần tăng độ ẩm
và tích cực thông thoáng gió.

1.1.3.3. Ẩm độ
Cần ẩm độ trung bình 50 - 70%. Oncidium là cây cần ẩm độ cao, đặc biệt
trong thời kỳ tăng vì vậy trong suốt mùa sinh trưởng cây cần được tưới 3 lần/ngày
vào mùa khô, 2 lần/ngày trong mùa mưa. Mùa nghỉ (sau khi trổ hoa) chỉ cần tưới
nước cho cây một lần/ngày để duy trì sự sống.

SVTH : Mai Duy Vinh

Trang 8


Đồ án tốt nghiệp

GVHD: ThS. Phan Quốc Tâm

1.1.3.4. pH môi trường
Độ PH của môi trường thích hợp cho mô phát triển, trong khoảng 4,8 - 5,5,
thông thường biên độ pH trong khoảng 5 - 5,2 là tốt nhất.
1.1.3.5. Nước
Nước rất quan trọng cho cây để tăng trưởng. Nếu thiếu nước cây sẽ không
phát triển và có thể bị chết khô. Nhìn thấy thân cây hay lá cây bị nhăn nheo, là cây
thiếu nước. Còn quá nhiều nước cây bị úng, thối rễ, là điều kiện tốt cho vi khuẩn,
nấm xâm nhập làm cây chết.
Nước giúp duy trì độ ẩm trong giai đoạn tăng trưởng. Nếu giữ khô ráo giữa
các lần tưới nước sau giai đoạn tăng trưởng sẽ làm cây cứng cáp hơn.
Chế độ nước tưới cần cung cấp cho cây là khoảng 2 - 3 ngày tưới một lần tùy
thuộc vào điều kiện thời tiết từng ngày, từng mùa trong năm. Vào mùa đông trời rét
cần giảm số lần tưới nước, nước tưới cũng cần phải sạch sẽ tránh nguồn nước ô
nhiễm sẽ làm chết cây.
1.1.3.6. Giá thể

Giá thể dùng trồng lan phải xốp, thoáng khí và không giữ nước quá lâu. Có
thể sử dụng một loại giá thể hoăc trộn các giá thể với nhau như vỏ cây khô, đá núi
lửa, xơ dừa hoặc đá. Để trồng lan Oncidium cần ẩm nhưng thoát nước tốt như than
hoặc xơ dừa.
1.1.3.7. Phân bón
Trong quá trình chăm sóc hoa cần bón phân cho hoa với các loại phân bón
chủ yếu là: phân 20-20-20 và phân 30-10-10 và có thể phun một số loại phân bón
lá hay chất kích thích sinh trưởng để điều khiển ra hoa. Vì cây có giả hành có khả
năng dự trữ dinh dưỡng để nuôi cây. Có thể bón phân mỗi tuần 2 lần, cần tăng
cường phân Kali.
SVTH : Mai Duy Vinh

Trang 9


Đồ án tốt nghiệp

GVHD: ThS. Phan Quốc Tâm

1.1.3.8. Phòng trừ sâu bệnh hại
Sâu bệnh hại chủ yếu trên nhóm lan vũ nữ:
- Ốc: Phòng trừ bằng cách sử dụng Deadline 40 (nồng độ theo khuyến cáo),
Dioto.
- Bệnh thối mềm vi khuẩn: do vi khuẩn Pseudomonas gladioli gây ra. Vết bệnh
có hình dạng bất định, ủng nước, màu trắng đục, thường lan rộng theo chiều rộng
của lá. Gặp thời tiết ẩm ướt mô bệnh bị thối úng, thời tiết khô hanh mô bệnh khô
tóp có màu trắng xám, sử dụng 1 trong 3 hỗn hợp: Saipan + Mexyl.MZ, Saipan +
Alpine, Mexyl.MZ + Alpine.
Tóm lại:
Việc nuôi trồng và chăm sóc hoa lan không thể bỏ qua giai đoạn thay chậu.

thường thay chậu vào mùa xuân khi cây còn non đã mọc được khoảng một gang tay
đây là giai đoạn thay chậu tốt nhất, dùng vỏ cây loại nhỏ cho các giống cây có rễ
nhỏ và những giống có rễ lớn dùng vỏ cây loại trung bình, nén chặt vỏ cây vào chậu
trồng sao cho cây đứng thẳng, vững giữ độ ẩm cao và ngừng tưới nước đến khi cây
ra rễ, một số loài lá cứng, dầy như Oncidium mule ears hay Oncidium amplitum…vv
có thể buộc chặt chúng vào các vỏ cây và thân cây, sau một thời gian chúng bám
vào thân cây và hút chất dinh dưỡng từ đó.
Đối với loài lan vũ nữ hoa có thể nở vào tất cả các mùa trong năm, chúng ưa
bóng mát nên tránh để ngoài trời.
Công việc tưới phân và tưới nước phải được tiến hành vào buổi sáng sớm
hoặc chiều mát nên tưới nước trước khoảng 15 phút sau đó mới tưới phân để cây
hấp thụ tốt.
Tưới đúng liều lượng nếu không cây sẽ chết hoặc rụng lá.

SVTH : Mai Duy Vinh

Trang 10


Đồ án tốt nghiệp

GVHD: ThS. Phan Quốc Tâm

1.2. Nhân giống vô tính in vitro
1.2.1. Khái niệm
Nhân giống in vitro hay nuôi cấy mô đều là thuật ngữ mô tả các phương
pháp nuôi cấy các bộ phận thực vật trong ống nghiệm có chứa môi trường dinh
dưỡng trong điều kiện vô trùng (Dương Công Kiên, 2003). Môi trường có chứa các
chất dinh dưỡng thích hợp như muối khoáng, vitamin, các hormone tăng trưởng và
đường.

Kỹ thuật nuôi cấy mô cho phép tái sinh chồi hoặc cơ quan (sự phát sinh cơ
quan) từ các mô như: lá, thân, hoa hoặc rễ.
Trước kia người ta thường dùng phương pháp nuôi cấy tế bào và mô thực vật
để nghiên cứu về đặc tính cơ bản của tế bào như sự phân chia, sự di truyền và tác
dụng của các hóa chất đối với tế bào và mô trong quá trình nuôi cấy (Dương Công
Kiên, 2003). Ngày nay phương pháp nuôi cấy mô thực vật đã hướng về những ứng
dụng thực tiễn, vì nó liên hệ mật thiết với các giống cây trồng.
1.2.2. Lịch sử
Những mốc chính trong lịch sử phát triển của công nghệ tế bào thực vật:
-

1665, Robert Hooke quan sát được tế bào sống dưới kính hiển vi và đưa ra

khái niệm tế bào.
-

1838, Matthias Schleiden và Theodore Schwann đề xướng học thuyết tế bào.

-

1902, Haberlandt lần đầu thí nghiệm nuôi cấy mô cây một lá mầm trong ống

nghiệm nhưng không thành công.
-

1922, Kotte (học trò của Haberlandt) và Robbins đã thành công trong việc

lặp lại thí nghiệm của Haberlandt.
-

1926, FW Went chứng minh trong lá bao mầm của lúa mạch có mặt các chất

sinh trưởng.
-

1934, White thành công khi nuôi cấy mô rễ cà chua trong thời gian dài. Kogl

F và cộng sự xác định loại hormone thực vật đầu tiên là IAA.
-

1939, Gautheret, Nobecourt và White lần đầu tiên nuôi cấy mô sẹo thành

công trong thời gian dài từ mô thượng tầng ở cà rốt và cây thuốc lá.
SVTH : Mai Duy Vinh

Trang 11


Đồ án tốt nghiệp

-

GVHD: ThS. Phan Quốc Tâm

1940, Gautheret nghiên cứu sự hình thành chồi bất định trong nuôi cấy mô tế

bào thượng tầng cây Ulmus.
-

1941, Overbeek và cộng sự đã sử dụng nước dừa trong nuôi cấy phôi non ở

cà rốt.
Sau chiến tranh thế giới thứ hai, lĩnh vực này phát triển nhanh và nhiều kết
quả nghiên cứu quan trọng trong nông nghiệp được công bố.
1.2.3.Ưu điểm và hạn chế của vi nhân giống
1.2.3.1. Ưu điểm
-

Nâng cao chất lượng cây giống: loại trừ virus, nấm. Cây giống sạch bệnh

được tạo ra thường tăng năng suất 15 - 30% so với giống gốc.
-

Đưa ra sản phẩm nhanh hơn: từ một cây ưu việt bất kì đều có thể tạo ra một

quần thể có độ đồng đều cao với số lượng không hạn chế, phục vụ sản xuất thương
mại, dù cây đó là dị hợp về mặt di truyền.
-

Có khả năng tái sinh cây con từ các vùng mô và các cơ quan khác nhau của

cây như trục thân, lóng thân, phiến lá, cuống lá, chồi phát hoa… mà ngoài tự nhiên
không thể thực hiện được.
-

Nhân nhanh với hệ số nhân giống cao, sản xuất được số lượng lớn cây giống

trong thời gian ngắn nhằm đáp ứng nhu cầu cho những người trồng thương mại. Từ
một cây trong vòng 2 - 3 năm có thể tạo thành hàng triệu cây.
-

Sản phẩm cây đồng nhất: vi nhân giống về cơ bản là công nghệ nhân dòng.

Nó tạo ra quần thể có độ đều cao dù xuất phát từ cây mẹ có kiểu gen dị hợp hay
đồng hợp.
-

Tạo được dòng toàn cây cái (cây chà là) hay toàn cây đực (cây măng tây)

theo mong muốn.
-

Tiết kiệm thời gian: mật độ cây tạo ra trên một đơn vị diện tích lớn hơn rất

nhiều so với sản xuất trên đồng ruộng và trong nhà kính theo phương pháp truyền
thống.
-

Dễ dàng vận chuyển.

SVTH : Mai Duy Vinh

Trang 12


Đồ án tốt nghiệp

-

GVHD: ThS. Phan Quốc Tâm

Sản xuất quanh năm và chủ động kiểm soát được các yếu tố ngoại cảnh,

không phụ thuộc mùa vụ.
Vì nhân giống được xem là công cụ tối ưu phục vụ cho công nghệ di truyền.
Giảm được nhiều công sức chăm sóc, nguồn mẫu dự trữ lâu dài và chiếm ít không
gian so với phương pháp nhân giống truyền thống.
1.2.3.2. Hạn chế
-

Hạn chế về chủng loại sản phẩm: nhiều loại cây trồng có giá trị kinh tế hoặc

quý hiếm chưa được nhân nhanh.
-

Chi phí sản xuất cao, đòi hỏi trình độ khoa học kĩ thuật cao, chi phí cho công

nhân thường chiếm khoảng 60% hoặc cao hơn trên tổng giá trị toàn sản phẩm.
-

Giá thành cao, cao hơn so với các phương pháp truyền thống như chiết,

ghép, nhân giống bằng hạt… nên thường khó áp dụng để thương mại hóa.
-

Hiện tượng biến đổi kiểu hình: do hiện tượng biến dị tế bào soma. Tỉ lệ biến

dị thường thấp ở giai đoạn đầu nhân giống, nhưng sau đó có chiều hướng tăng lên
khi nuôi cấy kéo dài và tăng hàm lượng các chất kích thích sinh trưởng.
-

Quá trình nhân giống phức tạp gồm nhiều giai đoạn liên quan và cần khoảng

thời gian dài trước khi có thể thích ứng trồng ngoài vườn ươm.
1.2.4. Các bước trong kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật
- Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng
- Tạo thể nhân giống in vitro
- Nhân giống in vitro
- Tái sinh thành cây hoàn chỉnh in vitro
- Chuyển cây ra vườn ươm để thuần hóa
- Nhân giống in vitro
- Tạo cây con bầu đất
- Đưa các cây ra đồng ruộng
- Chọn lọc cây đầu dòng

SVTH : Mai Duy Vinh

Trang 13


Đồ án tốt nghiệp

GVHD: ThS. Phan Quốc Tâm

♦ Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng

Hình 1.4. Sơ đồ lát cắt dọc đỉnh sinh trưởng chồi lan
Mẫu được nuôi cấy thường còn ở giai đoạn non, quá trình phân chia và phân
hóa mạnh. Đỉnh sinh trưởng và chồi bên được sử dụng ở hầu hết các loại cây trồng.
Ngoài ra, chồi đỉnh và chồi non của hạt mới nảy mầm cũng được sử dụng. Đỉnh

sinh trưởng nhỏ được tách bằng kính lúp. Môi trường được sử dụng rộng rãi trong
nhân giống hiện nay là môi trường MS. Đối với mẫu dễ bị hóa nâu môi trường
thường được bổ sung than hoạt tính hay ngâm mẫu với hỗn hợp ascorbic acid và
citric acid (25 - 150 mg/l).
♦ Tạo thể nhân giống in vitro
Mẫu nuôi cấy được cấy trên môi trường chọn lọc đặc biệt nhằm mục đích tạo
thể nhân giống in vitro. Có hai thể nhân giống in vitro: thể chồi (multiple shoot) và
thể cắt (cutting) đốt ngoài ra còn có thể giò (protocorm). Tạo thể nhân giống in vitro
dựa vào đặc điểm nhân giống ngoài tự nhiên của cây trồng. Tuy nhiên có những cây
trồng không có khả năng nhân giống người ta thường nhân giống bằng cách tạo cụm
chồi bằng mô sẹo. Để tạo thể nhân giống trong môi trường thường bổ sung
Cytokinin, Auxin, GA3 và các chất hữu cơ khác.
♦ Nhân giống in vitro
Là giai đoạn quan trọng trong việc nhân giống cây trồng bằng phương pháp
nuôi cấy mô tế bào thực vật nhằm mục đích tăng sinh khối thể nhân giống. Vật liệu
SVTH : Mai Duy Vinh

Trang 14


Đồ án tốt nghiệp

GVHD: ThS. Phan Quốc Tâm

nuôi cấy là những thể chồi, đôi khi nồng độ chất sinh trưởng giảm thấp cho phù hợp
với quá trình nuôi cấy kéo dài. Điều kiện nuôi cấy thích hợp giúp cho quá trình
tăng sinh được nhanh chóng. Cây nhân giống in vitro có trạng thái sinh lý trẻ và
được duy trì trong thời gian vô hạn.
♦ Tái sinh cây hoàn chỉnh in vitro
Đây là giai đoạn tạo cây con hoàn chỉnh có đầy đủ thân lá và rễ chuẩn bị

chuyển ra vườn ươm. Cây con phải khỏe mạnh nhằm nâng cao sức sống khi ra
ngoài môi trường bên ngoài. Các chất có tác dụng tạo chồi được loại bỏ thay vào đó
là các chất kích thích quá trình tạo rễ. Điều kiện nuôi cấy tương tự với quá trình
nuôi cấy ngoài tự nhiên, một bước thuần hóa trước khi được tách ra khỏi điều kiện
in vitro. Thường dung các chất thuộc nhóm auxin kích thích ra rễ.
♦ Chuyển cây in vitro ra vườn ươm
Đây là giai đoạn khó khăn nhất trong quá trình nhân giống vô tính. Cây in
vitro được nuôi cấy trong điều kiện ổn định về dinh dưỡng, ánh sáng, nhiệt độ. Khi
chuyển ra đất với điều kiện tự nhiên hoàn toàn khác hẳn, cây con dễ bị mất nước,
mau bị héo. Để tránh tình trạng này, vườn ươm nuôi cấy mô phải mát, cường độ
chiếu sáng thấp, nhiệt độ không khí mát, độ ẩm cao… Cây con thường được cấy
trong luống ươm có cơ chất dễ thoát nước, tơi xốp giữ được ẩm. Trong những ngày
đầu cần được phủ nilon để giảm quá trình thoát hơi nước. Rễ được tạo ra trong quá
trình nuôi cấy mô sẽ dần lụi đi và rễ mới xuất hiện. Cây con thường được xử lý với
chất kích thích ra rễ bằng cách ngâm hay phun lên lá để rút ngắn thời gian ra rễ.
♦ Nhân giống in vitro
Cây con sau khi được chuyển ra luống ươm hay cấy vào bầu đất sau 7 - 10
ngày thì bắt đầu ra rễ. Sau đó được phun dinh dưỡng với hỗn hợp N, P, K (1g/l cho
mỗi loại). Tuy nhiên do quá trình nhân giống in vitro có nhiều tốn kém thì cây con
được sử dụng như là cây mẹ và được tiếp tục nhân giống trên luống ươm. Điều kiện
nhân giống trên luống ươm phải tiếp tục đảm bảo cây mẹ ở trạng thái bằng cách
điều kiện khống chế bằng cách giảm dinh dưỡng, duy trì độ ẩm cao, nhiệt độ không
khí thấp… Hệ số nhân giống trên luống ươm phải tiếp tục đảm bảo cây mẹ ở trạng
SVTH : Mai Duy Vinh

Trang 15


Đồ án tốt nghiệp

GVHD: ThS. Phan Quốc Tâm

thái cân bằng, khống chế bằng cách giảm dinh dưỡng, duy trì độ ẩm cao, nhiệt độ
không khí thấp… Hệ số nhân giống trên luống ươm càng cao giúp cho việc giảm
giá thành càng có ý nghĩa.
♦ Cây con bầu đất
Cây con từ ống nghiệm hay được nhân giống trên luống ươm được cấy trên
luống đất 15 - 20 ngày cho cây ra rễ và phát triển khỏe, sau đó được cấy vào bầu đất
(cây chuối). Bầu đất có cơ chất xốp đầy đủ chất dinh dưỡng tỉ lệ đất/phân là 1/1,
ngoài ra hàng tuần được phun dinh dưỡng khoáng 1 - 2 lần/tuần thường dùng phân
khoáng có tỉ lệ N - P - K: 20-20-20. Thời gian cây con ở giai đoạn bầu đất phụ
thuộc đặc điểm cây trồng khoảng 20 ngày (khoai tây) đến 2,5 tháng (cây chuối).
Cây bầu đất được đặt ở nơi có nhiều ánh sáng, độ ẩm cao, nhiệt độ không khí mát
để cây phát triển nhanh và khỏe.
♦ Chọn lọc cây đầu dòng
Là vấn đề quan trọng đối với cây ăn trái nhằm tạo ra một quần thể đồng đều
có năng suất cao và ổn định. Những cây được chọn đầu dòng được đưa vào nhân
giống trở lại bằng nuôi cấy mô.
Hiện tại công nghiệp nhân giống được ứng dụng nhiều trong kinh tế để giải
quyết nhu cầu về giống cho sản xuất, giống cho cây lâm nghiệp, trồng rừng, rau,
ngũ cốc, cây ăn trái, hoa và cây dược liệu.
1.2.5. Các phương pháp nhân giống in vitro
-

Gieo hạt in vitro

-

Nhân giống bằng chồi nách

-

Nhân giống bằng chồi đỉnh

-

Nhân giống bằng chồi bất định

-

Nhân giống qua nuôi cấy mô sẹo

-

Nhân giống bằng các đoạn giả hành

-

Nuôi cấy bao phấn và hạt phấn

-

Nuôi cấy tế bào trần (protoplast)

SVTH : Mai Duy Vinh

Trang 16


Đồ án tốt nghiệp

GVHD: ThS. Phan Quốc Tâm

1.2.6. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy mô thực vật
1.2.6.1. Ảnh hưởng của mẫu cấy
- Kiểu di truyền
- Tuổi của cây
- Tuổi của mô và cơ quan
- Tình trạng sinh lí
- Vị trí của mẫu cấy trên cây
- Kích thước mẫu cấy
- Vết thương
- Phương pháp cấy
Không có hướng dẫn cụ thể trong việc chọn mô cấy. Về nguyên tắc, trừ
những mô cấy đã hóa gỗ, các mô khác trong cơ thể thực vật đều có thể làm mô cấy.
Tuy nhiên, có thể nhận xét chung là các mô đang phát triển, thịt quả non, lá non,
cuống hoa, đế hoa, mô phân sinh... khi đặt vào môi trường có chứa một lượng chất
sinh trưởng thích hợp đều có khả năng phân chia và phân hóa. Để bắt đầu nghiên
cứu nhân giống vô tính một cây nhất định, trước tiên phải chú ý đến các chồi nách
và mô phân sinh ngọn.
Tuy mang một lượng thông tin di truyền như nhau, các mô khác nhau trên
cùng một cây có thể sinh trưởng và phát triển với khả năng tái sinh chồi, rễ hay cây
hoàn chỉnh rất khác nhau.
Vì vậy, khi khởi sự chọn giống, nhân giống một cây cụ thể bằng phương
pháp nuôi cấy mô và tế bào thực vật, trước hết cần thí nghiệm tìm hiểu phản ứng
của các bộ phận khác nhau của cây trong nuôi cấy ở các nồng độ chất sinh trưởng
khác nhau.
Sau khi cấy, mô cấy cần được đặt trong điều kiện nhiệt độ và ánh sáng ổn
định. Tùy vào các mục đích nghiên cứu mà có các chế độ chiếu sáng khác nhau,
chẳng hạn quá trình tạo callus có thể cần bóng tối hoặc chiếu sáng nhưng quá trình

tái sinh và nhân giống vô tính nhất thiết cần ánh sáng. Nhiệt độ phòng nuôi nên giữ
ổn định bằng máy điều hòa nhiệt độ. Cường độ chiếu sáng khoảng 2000 - 3000 lux.
SVTH : Mai Duy Vinh

Trang 17


Đồ án tốt nghiệp

GVHD: ThS. Phan Quốc Tâm

♦ Một số điểm cần lưu ý
-

Các dụng cụ dùng cho thí nghiệm nuôi cấy mô sau khi tiệt trùng ở nồi khử

trùng đều phải được tiệt trùng sau mỗi lần dùng đến bằng cách nhúng vào cồn 90o
rồi hơ trên ngọn lửa đèn cồn.
-

Trước khi cấy, phải vệ sinh toàn bộ khu vực cấy bằng cồn 70o.

-

Nên để số mẫu cấy trong đĩa petri từ 4 - 5 mẫu, tránh để nhiều không kịp cấy

sẽ bị khô.
-

Cồn dùng để đốt dụng cụ phải được thay sau mỗi đợt cấy.

1.2.6.2. Ảnh hưởng của môi trường
Khi bắt đầu nuôi cấy mô và tế bào một số đối tượng nhất định, vấn đề đặt ra

là chọn môi trường nào và trên cơ sở nào để phối hợp tỉ lệ các chất dinh dưỡng.
Cách thường làm là qua các tài liệu đã xuất bản, xem các tác giả nuôi cấy mô trên
cùng đối tượng ấy hoặc các đối tượng gần gũi về mặt phân loại đã dùng môi trường
gì. Bước đầu có thể giữ nguyên môi trường của các tác giả đó hoặc trên cơ sở đó mà
cải tiến cho phù hợp.
Trong hàng trăm môi trường do nhiều tác giả đề nghị cho nhiều loại cây khác
nhau, nhiều mục đích khác nhau, có thể chia ra làm 3 loại:
-

Môi trường nghèo dinh dưỡng: Môi trường White, Knop, Knudson C.

-

Môi trường trung bình: Môi trường B5 của Gamborg.

-

Môi trường giàu dinh dưỡng: Môi trường Murashige và Linsmaier - Skoog.
Vì vậy, khi bắt đầu nghiên cứu nuôi cấy mô một số đối tượng mới, chưa có

tài liệu trước thì nên thăm dò so sánh ba loại môi trường trên xem đối tượng nghiên
cứu thích hợp với môi trường nào nhất.
Hiện nay, môi trường MS được coi là môi trường thích hợp với nhiều loại
cây. Vì vậy, người mới bắt đầu nuôi cấy thường bắt đầu với môi trường này trước
khi tìm ra được môi trường riêng của mình.

SVTH : Mai Duy Vinh

Trang 18


Đồ án tốt nghiệp

GVHD: ThS. Phan Quốc Tâm

1.2.6.3. Đảm bảo điều kiện vô trùng
♦ Vô trùng mô nuôi cấy
Mô nuôi cấy có thể là hầu hết các bộ phận khác nhau của thực vật như hạt
giống, phôi, noãn sào, đế hoa, lá, đỉnh sinh trưởng, đầu rễ, thân củ… Tùy theo sự
tiếp xúc với điều kiện bên ngoài, các bộ phận này chứa ít hay nhiều vi khuẩn và
nấm. Hầu như không thể vô trùng mô nuôi cấy được nếu nấm khuẩn nằm sâu ở các
tế bào bên trong chứ không hạn chế ở bề mặt.
Phương thức vô trùng mô nuôi cấy thông dụng nhất hiện nay là dùng các hóa
chất có hoạt tính diệt nấm khuẩn. Hiệu lực diệt nấm khuẩn của các chất này phụ
thuộc vào thời gian xử lí, nồng độ và khả năng xâm nhập của chúng vào các kẻ
ngách lồi lõm trên bề mặt mô nuôi cấy, khả năng đẩy hết các bọt khí bám trên bề
mặt mô nuôi cấy.
Để tăng tính linh động và khả năng xâm nhập của chất diệt khuẩn, thông
thường người ta xử lí mô nuôi cấy trong vòng 30 giây trong cồn 70o sau đó mới xử
lí trong dung dịch diệt khuẩn.
Các chất kháng sinh trên thực tế ít được sử dụng vì tác dụng không triệt để
và có ảnh hưởng xấu ngay lên sự sinh trưởng của mô cấy.
Trong thời gian xử lí, mô cấy phải ngập hoàn toàn trong dung dịch diệt
khuẩn. Đối với các bộ phận thực vật có nhiều bụi đất, trước khi xử lí nên rửa kĩ
bằng xà phòng dưới dòng nước chảy. Khi xử lí xong, mô cấy được rửa nhiều lần
bằng nước cất vô trùng (3 - 5 lần). Những phần trên mô cấy bị tác nhân vô trùng
làm cho trắng ra cần phải cắt bỏ trước khi đặt mô cấy lên môi trường. Để tránh ảnh

hưởng trực tiếp của các tác nhân vô trùng lên mô cấy, nên chú ý để lại một lớp bọc
ngoài khi ngâm mô vào dung dịch diệt khuẩn. Lớp cuối cùng này sẽ được cắt bỏ
hoặc bóc đi trước khi đặt mô cấy lên môi trường.
Vô trùng mô cấy là một thao tác khó, ít khi thành công ngay lần đầu. Tuy
nhiên nếu kiên trì tìm được nồng độ và thời gian vô trùng thích hợp thì sau vài lần
thử, chắc sẽ đạt kết quả.

SVTH : Mai Duy Vinh

Trang 19


Đồ án tốt nghiệp

GVHD: ThS. Phan Quốc Tâm

♦ Vô trùng nơi thao tác cấy và tủ cấy vô trùng
Nguồn nhiễm tạp quan trọng và thường xuyên nhất là bụi rơi vào dụng cụ
thủy tinh chứa môi trường trong khi mở nắp hoặc nút bông để thao tác cấy.
Buồng cấy thường có diện tích hẹp, rộng từ 10 – 15 m2, có 2 lớp cửa để tránh
không khí chuyển động từ bên ngoài vào. Sàn và tường lát gạch men để có thể lau
chùi thường xuyên. Trước khi đưa vào sử dụng, buồng cấy cần được xử lí hơi
formol bằng cách rót formaldehyde (formalin) 4 % ra một số nắp đĩa petri để rải vài
nơi trong phòng cho bốc hơi tự do. Đóng kín cửa phòng cấy trong 24h, sau đó bỏ
formaldehyde đi, khử hơi formaldehyde thừa bằng dung dịch NH3 25% trong 24h.
Mặt bàn cấy, trước khi làm việc phải lau mặt bàn bằng cồn 70o.
Các dụng cụ mang vào buồng cấy phải vô trùng trước: áo choàng, mũ vải,
khẩu trang của người cấy, đến dao, kéo, forceps, giấy lọc, bình đựng nước cất…
Trên bàn thường xuyên có 1 đèn cồn(hay đèn gas) để sử dụng khi cấy và một cốc
đựng đèn cồn 90o để nhúng các dụng cụ làm việc.

Trước khi cấy, người cấy cần rửa tay bằng xà phòng và lau kĩ đến khuỷu tay
bằng cồn 70o. Để đảm bảo mức độ vô trùng cao trong phòng cấy cần có một đèn tử
ngoại 40W treo trên trần. Chỉ cho đèn này làm việc khi không có người trong phòng
cấy. Nên bật đèn tử ngoại 30 phút trước khi cấy. Cần giảm sự chuyển động của
không khí trong buồng cấy đến mức tối thiểu, vì vậy tất cả các dụng cụ phục vụ cấy
đều phải chuẩn bị đầy đủ để trong khi cấy tránh đi lại.
1.2.7. Những vấn đề thường gặp trong nuôi cấy mô
♦ Sự tạp nhiễm
Nhiễm là vấn đề rất được quan tâm và dễ xảy ra trong nuôi cấy mô thực vật,
gây hậu quả nghiêm trọng đến hiệu suất nuôi cấy. Một số nguồn gây tạp nhiễm như
từ mẫu cấy, thao tác trong quá trình cấy, từ côn trùng, môi trường, dụng cụ và các
máy móc thiết bị như màng lọc của tủ cấy, hệ thống thông khí trong phòng cấy.
-

Trong giai đoạn vô mẫu, mẫu cấy là nguồn gây nhiễm chính và đây cũng

được xem là giai đoạn khó nhất trong vi nhân giống. Mẫu cấy có thể là đốt thân,
đỉnh sinh trưởng, mẫu lá, phát hoa hay rễ non. Tuy nhiên để mẫu sống và phát triển
SVTH : Mai Duy Vinh

Trang 20


Đồ án tốt nghiệp

GVHD: ThS. Phan Quốc Tâm

trong điều kiện vô trùng thì không phải dễ. Môi trường bên ngoài luôn có rất nhiều
vi sinh vật bám trên bề mặt, các rãnh nhỏ, nách lá, lớp vẩy… của cây mẹ, đây là nơi
cư ngụ khá vững chắc mà chất khử trùng không dễ tiếp xúc được chúng. Đặc biệt,

vi khuẩn thường nhiễm vào hệ thống mô mạch và gây nhiễm môi trường sau 1 tuần
nuôi cấy. Nhiễm khuẩn trong trường hợp này thường gây những vệt trắng sữa xuất
phát từ mô cấy và quan sát rõ nhất khi xem từ dưới đáy chai nuôi cấy. Vài loài vi
khuẩn thường gây nhiễm: Acinebacter, Aerococcus, Agrobacterium, Bacillus,
Clostridium, Curtobacterium, Erwinia, Pseudomonas…
-

Điều kiện trồng cây mẹ và vị trí lấy mẫu từ cây mẹ là yếu tố quan trọng thiết

lập quá trình nuôi cấy sạch. Cây trồng trong nhà kính ít nhiễm vi sinh vật hơn ngoài
đồng ruộng. Các bộ phận như rễ, củ, thân bò thì thường khó làm sạch hơn các bộ
phận khác.
-

Môi trường không khí phòng sáng, phòng cấy gây nhiễm nghiêm trọng nếu

không được xử lý kịp thời, nấm thường là nguyên nhân gây nhiễm chính trong
trường hợp này. Nấm thường tồn tại dạng bào tử lơ lửng trong không khí, khi phòng
nuôi có nhiều người ra vào tạo điều kiện tích lũy vi sinh vật càng nhiều. Nếu màng
lọc tủ cấy không tốt sẽ gây nhiễm mẫu hàng loạt ngay trong quá trình cấy. Ngoài ra,
bào tử nấm còn tấn công gây nhiễm những chai môi trường chưa sử dụng hoặc
những bình đã được nuôi 2 - 3 tháng. Các loài nấm thường gặp: Aspergillus,
Candida, Cladosporium, Microsprium và Phialophra.
-

Côn trùng, đặc biệt là ve bét là mối nguy hiểm, chúng có nhiều loài khác

nhau: Dermataphagoides pteronyssimus, Dermataphagoides farinae và Tyropharus
putrescentiae… Ve bét có thể sống trong ống dẫn của máy điều hòa không khí, góc
phòng, dưới kệ nuôi cấy. Nó hoạt động tích cực hơn vào lúc xế chiều ở những nơi

có độ ẩm và chất hữu cơ. Vòng đời của chúng kéo dài 2 tuần. Khi cấy, ta thường
không phát hiện nhiễm chúng, nhưng sau vài ngày ta sẽ thấy những rãnh đường trên
bề mặt bình nuôi cấy và trên bề mặt môi trường, đó là đường di chuyển của chúng.
Ve bét xâm nhập vào vào bình nuôi cấy bằng cách chui qua các khe hở miệng bình,
khi chúng xâm nhập chúng cũng mang theo nấm làm bình nuôi cấy vừa nhiễm nấm
SVTH : Mai Duy Vinh

Trang 21


Đồ án tốt nghiệp

GVHD: ThS. Phan Quốc Tâm

và ve bét cùng lúc. Một điều thường thấy là mẫu cấy bị thối nhũn và chết khi chúng
xâm nhập sau khoảng 2 tuần.
♦ Tính bất định về mặt di truyền
Kỹ thuật nhân giống vô tính áp dụng với mục đích tạo quần thể cây trồng
đồng nhất với số lượng lớn nhưng phương pháp cũng tạo ra những biến dị tế bào
soma qua nuôi cấy mô sẹo. Những biến dị này cũng là cơ sở nghiên cứu ứng dụng
vào cải thiện giống cây trồng nhưng thực tế có rất ít biến dị có lợi được báo cáo.
Tần số biến dị thì hoàn toàn khác nhau và không lặp lại (Creissen and Karp 1985;
Fish and Karp 1986). Nuôi cấy mô sẹo cho biến dị nhiều hơn nuôi cấy chồi đỉnh.
Cây trồng bị biến dị dòng soma qua nuôi cấy thường là biến dị về chất lượng, số
lượng và năng suất và biến dị này không di truyền. Đến nay việc gây ra biến dị chưa
được làm sáng tỏ nhưng được đồng ý nhất là do thay đổi vị trí DNA. Nhân tố
thường gây ra biến dị tế bào là số lần cấy chuyền. Số lần cấy chuyền càng nhiều
càng cho độ biến dị cao. Biến dị nhiễm sắc thể nhiều hơn khi nuôi cấy kéo dài
(Amstrong and Phillips, 1988). Số lần cấy chuyền ít và thời gian giữa hai lần cấy
chuyền ngắn làm giảm sự biến dị.

♦ Việc sản xuất các chất gây độc từ mẫu cấy
Thường chúng ta hay thấy hiện tượng hóa nâu hay hoá đen mẫu làm sinh
trưởng của mẫu bị ngăn chặn hay hư mẫu. Hiện tượng này là do mẫu nuôi cấy có
chứa các hợp chất Tannin và Hydroxyphenol, có nhiều trong mô già hơn trong mô
non. Các phân tử Phenol làm nâu mẫu Cattleya là Eucomic acid và Tyramine. Có
vài phương pháp làm giảm sự hóa nâu mẫu:
-

Than hoạt tính đưa vào môi trường giúp ngăn cản quá trình hóa nâu hay đen,

đặc biệt có hiệu quả trên các loài phong lan Phalaenopsis, Cattleya và Aerides với
nồng độ thường dùng 0,1 – 0,3 %. Tuy nhiên than hoạt tính cũng làm chậm quá
trình phát triển của mô do hấp thu các chất kích thích tăng trưởng và các chất khác.
-

Polyvinylpyrolidone (PVP), một chất thuộc loại polyamide hấp thu phenol

qua vòng hydrogen ngăn chặn sự hóa nâu ở nhiều loại cây trồng khác nhau.

SVTH : Mai Duy Vinh

Trang 22


Đồ án tốt nghiệp

-

GVHD: ThS. Phan Quốc Tâm

Giảm sự hóa nâu bằng cách cho các chất khử quá trình oxy hóa vào môi

trường ngăn chặn quá trình oxy hóa phenol, chất khử thường được dùng như
ascorbic acid, citric acid, L-cystein hydrochloride, ditheithreitol, glutathione và
mecaptoethanol.
Để hạn chế ảnh hưởng phenol các nhà khoa học đưa ra một số phương pháp
khi thao tác trên mẫu:
-

Sử dụng mẫu nuôi cấy nhỏ từ mô non

-

Ngâm mẫu vào dung dịch ascorbic acid, citric acid vài giờ trước khi cấy

-

Nuôi cấy mẫu trong môi trường lỏng, oxy thấp, không có đèn 1 - 2 tuần
♦ Hiện tượng thủy tinh thể
Trong nuôi cấy mô cũng thường gặp hiện tượng thủy tinh thể mẫu nuôi cấy.

Khi chuyển ra khỏi bình nuôi cấy, cây con dễ bị mất nước và tỷ lệ sống sót thấp.
Dạng này thường thấy khi nuôi cấy trên môi trường lỏng hay môi trường bán rắn,
đặc biệt khi sự trao đổi khí thấp, quá trình thoát hơi nước tập trung trong cây.
Để hạn chế quá trình thủy tinh thể một phương pháp hiệu quả nhất được
nhiều người ủng hộ là làm giảm ảnh hưởng của hàm lượng nước trong môi trường
nuôi cấy bằng cách:
-

Tăng nồng độ đường và tạo điều kiện môi trường nuôi (nhiệt độ, ánh sáng,

trao đổi khí) thích hợp.
-

Giảm nồng độ các chất chứa nitơ trong môi trường

-

Giảm sự sản sinh ethylene trong bình nuôi cấy

-

Xử lí acid absixic hay một số chất ức chế sinh trưởng

-

Tăng cường độ ánh sang và giảm nhiệt độ phòng nuôi

1.3. Thành phần môi trường nuôi cấy
Thành công chính trong các thí nghiệm nuôi cấy mô và tế bào thực vật là tìm
ra thành phần vật chất của môi trường dinh dưỡng cần thiết để tế bào có thể sinh
trưởng và phát triển được. Thành phần của môi trường dinh dưỡng thay đổi theo
loài và bộ phận nuôi cấy, tùy theo sự phát triển và phân hóa của mô cấy, tùy theo

SVTH : Mai Duy Vinh

Trang 23


Đồ án tốt nghiệp

GVHD: ThS. Phan Quốc Tâm

việc muốn duy trì mô ở trạng thái callus, muốn tạo rễ, tạo mầm hay muốn tái sinh
cây hoàn chỉnh.
Người ta đã đưa ra đất nhiều loại môi trường khác nhau cho các thí nghiệm
nuôi cấy mô. Đa số chúng có tính đặc hiệu cao, có nghĩa là chúng được nghiên cứu
ra để nuôi cấy những mô đặc hiệu nào đó. Một số môi trường khác có ứng dụng
rộng hơn và đảm bảo sinh trưởng tốt cho nhiều loài cây, tuy nhiên không có những
chỉ dẫn chung nào cho rằng môi trường nào trong chúng đảm bảo sinh trưởng tốt
hơn. Để bắt đầu, cần phải thử trong những môi trường thông dụng nào đó, chẳng
hạn môi trường MS nếu không thành công thì sau đó thử trên các môi trường khác.
Tuy vậy, tất cả những môi trường nuôi cấy thì bao giờ cũng gồm 5 thành
phần chính:
-

Các muối khoáng đa lượng và vi lượng

-

Các vitamin

-

Các amino acid

-

Nguồn carbon: đường

-

Các chất điều khiển sinh trưởng

-

Các chất hữu cơ bổ sung: nước dừa, lòng trắng trứng , lòng đỏ trứng , dịch

chiết cá nục , sữa tươi.
-

Agar

1.3.1. Các khoáng vô cơ
Với MS: Murashige và Skoog (1962); White (1963); B5: Gamborg (1968);
N6: Nitsch và Nisch (1969); WP: Loyd và McCown (1980).
1.3.1.1. Nhóm đa lượng
Nhu cầu muối khoáng của mô và tế bào thực vật tách rời không khác nhiều
so với cây trồng trong điều kiện tự nhiên. Trong nhóm này gồm 3 nguyên tố chính:
N, P, K.

SVTH : Mai Duy Vinh

Trang 24