Nghiên cứu tăng cường tích lũy một số Alkaloid có hoạt tính sinh học từ sinh khối rễ tơ cây Bá bệnh (Eurycoma longifolia Jack) nuôi cấy trên hệ thống bioreactor 20 lít) (Luận án tiến sĩ)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC
VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
-----------------------------

TRẦN THU TRANG

NGHIÊN CỨU TĂNG CƯỜNG TÍCH LUỸ MỘT SỐ
ALKALOID CÓ HOẠT TÍNH SINH HỌC TỪ SINH KHỐI
RỄ TƠ CÂY BÁ BỆNH (EURYCOMA LONGIFOLIA
JACK) NUÔI CẤY TRÊN HỆ THỐNG BIOREACTOR 20
LÍT

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

Hà Nội-2020

1


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC
VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
-----------------------------

Trần Thu Trang

NGHIÊN CỨU TĂNG CƯỜNG TÍCH LUỸ MỘT SỐ
ALKALOID CÓ HOẠT TÍNH SINH HỌC TỪ SINH KHỐI
RỄ TƠ CÂY BÁ BỆNH (EURYCOMA LONGIFOLIA
JACK) NUÔI CẤY TRÊN HỆ THỐNG BIOREACTOR 20
LÍT

Chuyên ngành: Hoá sinh học
Mã sỗ: 9 42 01 16

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:
1. TS. Chu Nhật Huy
2. PGS.TS. Phạm Bích Ngọc

Hà Nội, 2020

2


LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan
Luận án “Nghiên cứu tăng cường tích luỹ một số alkaloid có hoạt tính sinh
học từ sinh khối rễ tơ cây Bá bệnh (Eurycoma longifolia Jack) nuôi cấy trên hệ
thống bioreactor 20 lít” là công trình nghiên cứu của tôi và một số kết quả cùng
cộng tác với các cộng sự khác.
Các số liệu và kết quả nghiên cứu được trình bày trong luận án là trung
thực, một phần đã được tác giả công bố trên tạp chí khoa học chuyên ngành với sự

đồng ý và cho phép của các đồng tác giả.
Tôi xin chịu trách nhiệm về tính chính xác và trung thực của luận án.
Hà Nội, ngày

tháng

năm 2020

Tác giả

NCS. Trần Thu
Trang

i


LỜI CẢM ƠN
Trong biển kiến thức bao la, tôi đã thực sự tìm được con thuyền lớn để theo
đuổi đam mê nghiên cứu khoa học. Với vai trò đầu tàu, Thầy, TS. Chu Nhật Huy
và Cô, PGS.TS. Phạm Bích Ngọc đã chèo lái, hướng dẫn và giúp đỡ biết bao nhiêu
thế hệ sinh viên tiến đến với ước mơ và gặt hái thành công trong cuộc sống và trên
con đường nghiên cứu khoa học phục vụ cho sự phát triển của nước nhà. Cảm ơn
Thầy, Cô luôn tận tình hướng dẫn, truyền đạt nhiều kinh nghiệm quý báu, cũng
như không ngừng giúp đỡ để tôi, chỉ dẫn những hướng mới cho nghiên cứu, cũng
như đã luôn nhắc nhở để tôi hoàn thành tốt chương trình học và luận án.
Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến Thầy PGS.TS. Chu Hoàng Hà đã gợi ý,
chỉ dẫn, giúp đỡ tôi trong những năm học vừa qua.
Tôi xin gửi lời cảm ơn đến tập thể cán bộ nghiên cứu Phòng Công nghệ Tế
bào Thực Vật, Phòng Công nghệ Lên men, Phòng Thử nghiệm sinh học, Phòng
Dược liệu biển, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến cơ sở đào tạo, Khoa Công nghệ sinh họcHọc viện khoa học và công nghệ,Viện Công nghệ sinh học đã hướng dẫn và giúp
đỡ tôi trong suốt thời gian học tập này.
Tôi xin gửi lời cảm ơn đến cảm ơn GS. T.Kishimoto, trường Đại học Osaka,
Nhật Bản đã giúp đỡ tôi thực hiện một phần công trình nghiên cứu của luận án
này.
Đặc biêt, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn vô hạn tới các thành viên trong đại gia
đình thân yêu của tôi. Nhờ những động viên, khích lệ, đồng hành và chia sẻ khó
khăn của những người thân trong gia đình mà tôi luôn có sự quyết tâm và nghị lực
cao trong quá trình nghiên cứu.
Hà Nội, ngày tháng

năm 2020

Tác giả

NCS. Trần Thu Trang

ii


MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN................................................................................................. i
LỜI CẢM ƠN ..................................................................................................... ii
MỤC LỤC .......................................................................................................... iii
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT .................................................................. vi
DANH MỤC CÁC BẢNG ................................................................................ vii
DANH MỤC CÁC HÌNH .................................................................................. ix
MỞ ĐẦU ..............................................................................................................1
CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ..............................................................5
1.1.

Giới thiệu chung về cây Bá bệnh ............................................................5

1.1.1.

Đặc điểm sinh học và phân bố ................................................................. 5

1.1.2.

Thành phần hoá học và hoạt tính sinh học các alkaloid của cây Bá bệnh ...6

1.1.3

Tác dụng dược lý của cây Bá bệnh ............................................................9

1.2.

Ứng dụng của cây Bá bệnh trong Y học cổ truyền ..............................13

1.3.

Nuôi cấy sinh khối rễ tơ ........................................................................14

1.3.1.

Giới thiệu về nuôi cấy sinh khối rễ tơ ......................................................14

1.3.2.

Nuôi cấy rễ tơ trên quy mô Bioreactor để thu nhận hợp chất thứ cấp .......18

1.3.3.

Ảnh hưởng của elicitor đến tích luỹ các HCTC trong quá trình nuôi cấy rễ
tơ cây Bá bệnh ........................................................................................20

1.3.4.

Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước về nuôi cấy sinh khối rễ tơ thu
nhận các HCTC .......................................................................................23

CHƯƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...................27
2.1.

Vật liệu nghiên cứu ...............................................................................27

2.1.1.

Đối tượng nghiên cứu..............................................................................28

2.1.2 . Thiết bị và hoá chất nghiên cứu...............................................................28
2.2.

Phương pháp nghiên cứu ......................................................................30

2.2.1.

Phương pháp định tính bằng sắc ký lớp mỏng .........................................30

2.2.2.

Thực nghiệm chiết cao alkaloid và tách chất sạch ..................................31

2.2.3.

Phương pháp xác định cấu trúc hoá học ..................................................33

iii


2.2.4. Nghiên cứu hoạt tính sinh học của các alkaloid phân lập được từ rễ tơ cây Bá
bệnh ........................................................................................................33
2.2.5.

Thực nghiệm và phương pháp định lượng các alkaloid thông qua phương
pháp HPLC-DAD....................................................................................36

2.2.6.

Đánh giá các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tăng trưởng và tích luỹ các
alkaloid của rễ tơ cây Bá bệnh trên bình tam giác 500 ml ........................37

2.2.7.

Xây dựng quy trình nuôi cấy thu nhận sinh khối rễ tơ cây Bá bệnh trên hệ
thống Bioreactor 20 lít ............................................................................41

2.3

Phương pháp xử lý số liệu.....................................................................42

CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ..................................................43
3.1.

Xác định cấu trúc hoá học của các chất phân lập được từ cao chiết
alkaloid ....................................................................................................43

3.2. Kết quả khảo sát hoạt tính sinh học của các chất phân lập được từ cao
chiết alkaloid cảu rễ tơ cây Bá bệnh .......................................................47
3.2.1.

Kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào ung thư của các chất thử (1), (2), (3)
................................................................................................................47

3.2.2.

Thử khả năng ức chế sự sản xuất của IL-6 và TNF-α trên tế bào đại thực
bào chuột và người kích thích bởi LPS của chất (1), (2), (3)....................49

3.3.

Xây dựng đường chuẩn định lượng các alkaloid trong các mẫu Bá bệnh
bằng phương pháp HPLC-DAD ..............................................................54

3.4.

Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tăng trưởng và tích luỹ các chất (1), (2),
(3) của rễ tơ trên bình tam giác 500 ml ....................................................57

3.4.1.

Ảnh hưởng trạng thái môi trường đến sinh trưởng và phát triển của rễ tơ cây
Bá bệnh ..................................................................................................57

3.4.2.

Ảnh hưởng của ánh sáng đến sinh trưởng và phát triển của rễ tơ Bá bệnh
................................................................................................................58

3.4.3.

Ảnh hưởng chiều dài rễ ban đầu đến sinh trưởng và phát triển của rễ tơ cây
Bá bệnh ...................................................................................................59

3.4.4.

Ảnh hưởng khối lượng rễ cấy chuyển đến sinh trưởng và phát triển của rễ
tơ câyBá bệnh .........................................................................................61

iv


3.4.5. Ảnh hưởng của môi trường khoáng đến khả năng sinh trưởng và tích luỹ hợp
chất (1) 7-MCPA, (2) 9-methoxycanthin-6-one, (3) 9-hydroxycanthin-6-one trong
quá trình nuôi cấy rễ tơ cây Bá bệnh..........................................................62
3.4.6. Ảnh hưởng của jasmonic acid (JA) lên sự tăng sinh và tích luỹ chất (1) 7MCPA, (2) 9-methoxycanthin-6-one, (3) 9-hydroxycanthin-6-one trong quá
trình nuôi cấy rễ tơ cây Bá bệnh. ...............................................................69
3.4.7. Ảnh hưởng của salicylic acid (SA) lên sự tăng sinh và tích luỹ chất (1) 7MCPA, (2) 9-methoxycanthin-6-one, (3) 9-hydroxycanthin-6-one trong quá
trình nuôi cấy rễ tơ cây Bá bệnh. ...............................................................72
3.4.8. Ảnh hưởng của dịch chiết nấm men (YE) lên sự tăng sinh và tích luỹ chất (1)

7-MCPA, (2) 9-methoxycanthin-6-one, (3) 9-hydroxycanthin-6-one trong quá
trình nuôi cấy rễ tơ cây Bá bệnh. ...............................................................76
3.5.

Xây dựng quy trình nuôi cấy thu nhận sinh khối rễ tơ Bá bệnh trên hệ
thống bioreactor 20 lít .............................................................................82

3.5.1. Thiết lập hệ thống nuôi cấy .......................................................................82
3.5.2. Đánh giá sự tích luỹ các alkaloid (1), (2), (3) trong quá trình nuôi cấy rễ tơ
trên hệ thống bioreactor 20 lít so với rễ tự nhiên. ......................................87
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ...........................................................................90
DANH MỤC CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ ..................................................92
TÀI LIỆU THAM KHẢO .................................................................................93
MỤC LỤC ........................................................................................................ 103

v


DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

13

C-NMR

: Carbon Magnetic Resonance Spectroscopy
(Phổ cộng hưởng từ hạt nhân cacbon)

1

H-1H-COSY

: 1H-1H Correlated Spectroscopy (Phổ tương tác proton-proton)

1

H-NMR

: Proton Magnetic Resonance Spectroscopy
(Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton)

7-MCPA

: 7-methoxy-(9H-b-carbolin-1-il)-(E)-1-propenoic acid

ATCC

Bảo tàng giống chuẩn Hoa kỳ

CĐHST

: Chất điều hòa sinh trưởng thực vật

Chất (1)

: 7-MCPA

Chất (2)

: 9-methoxycanthin-6-one

Chất (3)

: 9-hydroxycanthin-6-one

d

: Dublet

dd

: Dublet của dublet

DEPT

: Distortionless Enhancement By polarization Transfer (Phổ
DEPT)

ĐK-Bb

: Xây dựng phương pháp phân tích mẫu Bá bệnh bằng HPLC

DMSO

: Dimethyl sulfoxyde

dq

: Dublet của quartet

dt

: Dublet của triplet

HepG2

: Dòng tế bào ung thư gan

HPLC

: High performance liquid chromatography
(sắc ký lỏng hiệu năng cao)

HSQC

: Heteronuclear Spectroscopy Quantum Coherence
(Phổ tương tác dị hạt nhân)

IC50

: Nồng độ ức chế 50% sự phát triển của cá thể nghiên cứu

J(Hz)

: Hằng số tương tác tính bằng Hz

JA

: Jasmonic acid

KB

: Dòng tế bào ung thư biểu mô

vi


KLK

: Khối lượng khô

KLT

: Khối lượng tươi

LPS

: Escherichia coli 055:B5

LPS

: Lipopolysaccharide

LU-1

: Dòng tế bào ung thư phổi

m

: Multiplet

MCF-7

: Dòng tế bào ung thư vú

MS

: Môi trường Murashige và Skoog – 1962

MS

: Murashige & Skoog, 1962

MTT

:

(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl

bromide)
NMR

: Phổ cộng hưởng từ hạt nhân

PBS

: Huyết thanh bò (fetal bovine serum)

q
Rễ TN

: Quartet
: Rễ tự nhiên

S

: singulet

SA

: Salicylic acid

SH

: Môi trường Schenk và Hildebrandt - 1972

SH

: Schenk and Hidebrandt, 1972

t

: Triplet

TCA

: Acid tricloacetic

TLC

: Thin layer chromatography (sắc ký lớp mỏng)

Trypsin EDTA

: Ethylenediaminetetraacetic acid

WPM

: Môi trường McCown’s Woody Plant - 1981

WPM

: McCown’s Woody Plant, 1981

YE

: Yeast extract (dịch chiết nấm men)

δ (ppm)

: Độ chuyển dịch hóa học tính bằng ppm

vii

tetrazolium


DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1.

Các thành phần hoá học được phân lập từ cây Bá bệnh và tác

dụng dược lý của chúng. ..........................................................

Bảng 1.2

Sản xuất hợp chất thứ cấp bằng kỹ thuật nuôi cấy rễ tơ từ một
số loài cây thuốc.......................................................................

Bảng 3.1.

25

Kết quả thử hoạt tính độc tế bào ung thư của các chất thử (1),
(2), (3) ......................................................................................

Bảng 3.2.

10

47

Kết quả xác định nồng độ ức chế sản xuất 50 % IL-6 và TNF-α
của tế bào .................................................................................

51

Bảng 3.3.

Kết quả xây dựng đường chuẩn ba alkaloid (1), (2), (3)............

55

Bảng 3.4.

Sự phát triển của rễ tơ Bá bệnh trên môi trường lỏng và thạch.

57

Bảng 3.5

Sự phát triển của rễ tơ ở điều kiện tối và sáng ..........................

59

Bảng 3.6.

Ảnh hưởng chiều dài rễ cấy chuyển đến sinh trưởng và phát triển
của rễ tơ ..................................................................................

60

Bảng 3.7.

Sự phát triển của rễ tơ trên 100 ml môi trường .........................

62

Bảng 3.8.

Ảnh hưởng của môi trường khoáng đến sinh trưởng và phát triển

Bảng 3.9.

của rễ tơ ...................................................................................

63

Ảnh hưởng của môi trường khoáng đến tích luỹ chất 7MCPA..

65

Bảng 3.10. Ảnh hưởng của môi trường khoáng

đến tích luỹ 9-

methoxycanthin-6-one ..............................................................

65

Bảng 3.11. Ảnh hưởng của môi trường khoáng đến tích luỹ chất 9hdroxycanthin-6-one ...............................................................

66

Bảng 3.12. Ảnh hưởng của JA lên sự sinh trưởng và tích luỹ các alkaloid
của rễ tơ cây Bá bệnh ...............................................................

70

Bảng 3.13. Ảnh hưởng của SA lên sự sinh trưởng và tích luỹ các alkaloid
của rễ tơ cây Bá bệnh ...............................................................

73

Bảng 3.14. Ảnh hưởng của YE lên sự sinh trưởng và tích luỹ các alkaloid
của rễ tơ cây Bá bệnh ...............................................................

76

Bảng 3.15. Hiệu quả tác động của các elicitor lên tích luỹ các alkaloid ......

80

viii


Bảng 3.16. Kết quả sau 30 ngày nuôi cấy rễ tơ trên hệ thống bioreactor tự
tạo 20 lít ...................................................................................

86

Bảng 3.17. Hàm lượng alkaloid có trong rễ tơ và rễ tự nhiên.....................

87

ix


DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1

Hình thái cây Bá bệnh..............................................................

5

Hình 1.2

Minh hoạ một số sản phẩm được sản xuất từ cây Bá bênh ........

14

Hình 1.3

Hệ thống bioreactor sủi bọt dạng cầu ........................................

18

Hình 1.4

Cơ chế tác động lên tế bào của elicitor ......................................

21

Hình 1.5

Sinh khối rễ tơ cây Bá bệnh 90 g ..............................................

28

Hình 2.1

Rễ tơ nuôi cấy trên môi trường WPM .......................................

27

Hình 2.2

Rễ tơ cây Bá bệnh nuôi cấy trên môi trường WPM ...................

27

Hình 2.3

Quy trình chiết cao alkaloid từ sinh khối rễ tơ cây Bá bệnh ......

31

Hình 2.4

Sơ đồ phân lập các chất từ cao chiết alkaloid ............................

32

Hình 2.5

Mô phỏng các bộ phận của hệ thống bioreactor 20 lít sủi bọt 42
dạng cầu tự tạo .........................................................................

Hình 3.1

Sắc ký cột và sắc ký bản mỏng một số phân đoạn cao chiết 43
alkaloid .....................................................................................

Hình 3.2

Sắc ký bản mỏng của chất (1), (2), (3) phân lập được từ cao chiết 47
methanol của rễ tơ cây Bá bệnh ................................................

Hình 3.4

Ảnh hưởng của chất 7-MCPA trên dòng tế bào ung thư vú MCF-7. 49

Hình 3.5

Ảnh hưởng của chất 9-methoxycanthin-6-one trên dòng tế bào 49
ung thư vú MCF-7 ....................................................................

Hình 3.5

Kết quả ảnh hưởng của chất (1), (2), (3) lên sự sống của tế bào
đại thực bào chuột và người ......................................................

Hình 3.6

Chất 7-MCPA ức chế sản xuất IL-6 và TNF-α trên tế bào đại
thực vào chuột và người được kích hoạt bởi LPS ......................

Hình 3.7

Hình 3.9

52

Chất 9-methoxycanthin-6-one ức chế sản xuất IL-6 và TNF-α
trên tế bào đại thực vào chuột và người được kích hoạt bởi LPS.

Hình 3.8

50

52

Chất 9-hydroxycanthin-6-one ức chế sản xuất IL-6 và TNF-α
trên tế bào đại thực bào chuột và người được kích hoạt bởi LPS

53

Sắc ký đồ của các chất chuẩn (1), (2), (3),.................................

54

Hình 3.10 Đường chuẩn biểu diễn mối tương quan giữa diện tích pic với
nồng độ chất chuẩn ...................................................................

x

56


Hình 3.11 Sự phát triển của rễ tơ trên môi trường lỏng và thạch ................

57

Hình 3.12 Sự phát triển của rễ tơ ở điều kiện tối và sáng ...........................

59

Hình 3.13 Quá trình mọc đầu sinh trưởng của các đoạn rễ tơ được cắt với
kích thước khác nhau ................................................................

60

Hình 3.14 Ảnh hưởng chiều dài rễ cấy chuyển đến sinh trưởng và phát triển
của rễ tơ ...................................................................................

60

Hình 3.15 Sự phát triển của rễ tơ trên 100 ml môi trường với lượng rễ ban
đầu khác nhau. ..........................................................................

62

Hình 3.16 Ảnh hưởng của môi trường khoáng đến sinh trưởng và phát triển
của rễ tơ ....................................................................................

64

Hình 3.17 Sắc ký HPLC của rễ tơ được nuôi cấy trên môi trường WP ......

68

Hình 3.18 Ảnh hưởng của JA lên sự sinh trưởng và tích luỹ các alkaloid

của rễ tơ Bá bệnh ......................................................................

71

Hình 3.19 Sắc ký HPLC thể hiện hàm lượng alkaloid trong có trong rễ tơ
nuôi cấy trên môi trường WPM bổ sung 8 mg/l JA ...................

72

Hình 3.20 Ảnh hưởng của SA lên sự sinh trưởng và tích luỹ các alkaloid
của rễ tơ Bá bệnh ......................................................................

75

Hình 3.21 Sắc ký HPLC thể hiện hàm lượng các alkaloid có trong rễ tơ
nuôi cấy trên môi trường WPM bổ sung 5 mg/l SA...................

75

Hình 3.22 Ảnh hưởng của dịch chiết nấm men lên sự sinh trưởng và tích
luỹ các alkaloid của rễ tơ cây Bá bệnh. .....................................

77

Hình 3.23 Sắc ký HPLC thể hiện hàm lượng alkaloid của mẫu rễ tơ nuôi
cấy trên môi trường WPM bổ sung 40 mg/l YE ........................

79

Hình 3.24 Nguồn mẫu ban đầu….. ............................................................

82

Hình 3.25 Chuẩn bị bình nuôi cấy bioreactor 20 lít ...................................

82

Hình 3.26 Bình thuỷ tinh 20 lít chứa 9,8 lít môi trường .............................

83

Hình 3.27 Chuyển môi trường vào bình bioreactor 20 lít ...........................

83

Hình 3.28 Quy trình nuôi cấy rễ tơ trên hệ thống Bioreactor 20 lít ............

85

Hình 3.29 Nuôi cấy rễ tơ trên hệ thống bioreactor 20 lít ............................

86

Hình 3.30 Hàm lượng các alkaloid tích luỹ trong rễ tơ và ở rễ tự nhiên .....

87

xi

Hình 3.31 Sắc ký bản mỏng các alkaloid, cao chiết tổng MeOH của rễ tơ

88

và rễ TN cây Bá bệnh. ..............................................................
Hình 3.32 (A) và (B) Sắc ký HPLC của mẫu rễ tơ được nuôi cấy trên hệ
thống bioreactor 20 lít và rễ tự nhiên cây Bá bệnh ....................

xii

89


MỞ ĐẦU
Tính cấp thiết của đề tài
Cây Bá bệnh (Eurycoma longifolia Jack) là cây thuốc phổ biến ở nước ta,
phân bố chủ yếu ở các tỉnh miền Trung, Kon tum, Đồng Nai, Phú Quốc và Vườn
quốc gia Bái Tử Long. Cây Bá bệnh được dùng bồi bổ sức khoẻ, tăng lượng
testosterone ở nam giới, có hoạt tính kháng viêm mạnh, chống ung thư tốt và một
số tác dụng khác như chữa sốt rét, chống loãng xương, trị tiểu đường...Các công
trình nghiên cứu về cây Bá bệnh cho thấy cây có chứa nhiều hoạt chất alkaloid có
giá trị trong kháng sốt rét, chống viêm, gây độc tế bào ung thư và tăng cường sinh
lực… Hiện nay, cây Bá bệnh đang bị khai thác quá mức ngoài tự nhiên do nhu cầu
sử dụng thảo dược ngày càng tăng. Hơn nữa, Bá bệnh khó nuôi trồng và nhân rộng,
với thời gian thu hoạch được rễ có chất lượng phải cần ít nhất 5-6 năm dẫn tới
nguồn nguyên liệu cung cấp cho sản xuất dược phẩm còn gặp nhiều khó khăn. Đến
nay, nuôi cấy rễ được xem là một giải pháp thay thế đầy tiềm năng để thu nhận ổn
định được một lượng lớn sinh khối sạch trong thời gian ngắn từ 30-40 ngày, làm
nguồn nguyên liệu cho sản xuất dược liệu. Công nghệ nuôi cấy mô sẹo hay nuôi
cấy huyền phù tế bào cần phải bổ sung chất điều hoà sinh trưởng (CĐHST). Tuy

nhiên, sự tồn dư CĐHST ảnh hưởng trực tiếp đến sức khoẻ người sử dụng. Vấn đề
này có thể khắc phục trong nuôi cấy sinh khối rễ tơ do rễ tơ có thể sinh trưởng và
phát triển liên tục không cần bổ sung CĐHST. Hơn thế, rễ tơ có nhiều ưu điểm
khác như có thể sản xuất một lượng lớn các hợp chất thứ cấp và có sự di truyền
ổn định hơn nuôi cấy tế bào huyền phù và mô sẹo.
Trong nuôi cấy in vitro, việc gây kích kháng hay bổ sung các elicitor giúp
tăng đáng kể khả năng tích lũy các hợp chất thứ cấp trong quá trình nhân nhanh
sinh khối rễ. Nuôi cấy rễ tơ cây Bá bệnh in vitro, dù môi trường giàu dinh dưỡng
giúp rễ phát triển nhanh, nhưng hàm lượng alkaloid phân tích được rất thấp. Hơn
nữa, quá trình tích lũy một số chất không diễn ra do thiếu một số yếu tố kích kháng,
dẫn đến hàm lượng alkaloid nội sinh thấp hơn so với rễ thu ngoài tự nhiên. Kể từ
khi các stress do sự thay đổi về ánh sáng, nhiệt độ hay tác động từ các tác nhân
gây hại cây trồng được phát hiện làm kích thích tích lũy các hợp chất thứ cấp thông
qua con đường truyền tín hiệu của các elicitor như jasmonic acid (JA), salicylic

1


acid (SA), yeast extract (YE)… lần lượt kích hoạt biểu hiện các gen phòng vệ,
đồng thời sinh tổng hợp các hợp chất thứ cấp . Các elicitor đã được ứng dụng rộng
rãi vào nuôi cấy để gia tăng hoạt chất saponin trong nuôi cấy nhiều loài cây dược
liệu quý. Việc nghiên cứu bổ sung các elicitor trong việc tăng cường khả năng tích
lũy các hợp chất thứ cấp trong nuôi cấy in vitro vẫn chưa có.
Kỹ thuật nuôi cấy mô ra đời đã mở ra một cuộc cách mạng trong nhân giống
thực vật. Nhưng với phương pháp truyền thống nuôi cấy trên môi trường thạch thì
khó đáp ứng được nhu cầu giống cây trồng cung cấp trên thị trường, giá thành lại
cao; do việc phải cấy chuyền, tách mẫu bên trong tủ cấy hầu như đều thực hiện
bằng tay, tốn nhiều lao động lại dễ bị nhiễm. Chính vì vậy cần phải có một hệ
thống nuôi cấy mới làm sao có thể tự động hóa giúp giảm thiểu nhân công, thời
gian và số lượng cây nhiều. Trong nuôi cấy lỏng người ta chia ra ba loại là nuôi

cấy lỏng tĩnh, nuôi cấy lỏng lắc và nuôi cấy Bioreactor, tất cả đều được dùng để
nuôi cấy huyền phù tế bào, phát sinh cơ quan. Hiện nay đang có xu hướng dùng
Bioreactor để nhân sinh khối rễ tơ nhằm thu nhận hoạt chất thứ cấp.
Xuất phát từ các cơ sở khoa học và luận cứ trên, tôi tiến hành thực hiện đề
tài nhằm tìm kiếm những alkaloid có hoạt tính sinh học đồng thời nghiên cứu
những hoạt tính mới từ những alkaloid từ đó nghiên cứu nuôi cấy tăng tích luỹ
hàm lượng các alkaloid bằng cách bổ sung các elicitor. Sau đó, rễ tơ được nghiên
cứu nhân sinh khối lớn phục vụ định hướng làm dược liệu bằng cách tối ưu hoá hệ
thống bioreactor 20 lít "Nghiên cứu tăng cường tích luỹ một số alkaloid có hoạt
tính sinh học từ sinh khối rễ tơ cây Bá bệnh (Eurycoma longifolia Jack) nuôi cấy trên
hệ thống bioreactor 20 lít”.
Mục tiêu nghiên cứu
Khảo sát hoạt tính sinh học của các alkaloid phân lập từ rễ tơ cây Bá bệnh
để tìm ra những hoạt tính mới.
Xác định điều kiện nuôi cấy tối ưu để rễ tơ cây Bá bệnh sinh trưởng và
phát triển.
Xác định nồng độ của ba elicitor (Salicylic acid, Jasmonic acid và Yeat
extract lên quá trình sản xuất và tích luỹ các alkaloid phân lập được từ rễ tơ cây

2


Bá bệnh in vitro
Xây dựng được thống bioreactor 20 lít để nhân sinh khối rễ tơ.
Nội dung nghiên cứu
Nội dung 1: Nghiên cứu thành phần hoá học và hoạt tính sinh học của cao chiết
alkaloid trong sinh khối rễ tơ cây Bá bệnh
Nội dung 2: Nghiên cứu một số điều kiện nuôi cấy ảnh hưởng đến sinh trưởng rễ
tơ và tích luỹ các alkaloid (1) 7-methoxy-(9H-β-carbolin-1-il)-(E)-1-propenoic
acid) (7-MCPA), (2) 9-methoxycanthin-one, (3) 9-hydroxycanthin-6-one trong rễ

tơ cây Bá bệnh.
Nội dung 3: Xây dựng kỹ thuật nuôi cấy thu nhận sinh khối rễ tơ cây Bá bệnh trên
hệ thống bioreactor 20 lít. Đánh giá hàm lượng của các alkaloid (1) 7-MCPA, (2)
9-methoxycanthin-one, (3) 9-hydroxycanthin-6-one có trong sinh khối thu được
nuôi cấy ở hệ thống bioreactor 20 lít so với rễ tự nhiên.
Ý nghĩa khoa học và thực tiễn
Ý nghĩa thực tiễn
Luận án xác định được môi trường nuôi cấy, điều kiện nuôi cấy và hệ thống
nuôi cấy tối ưu cho rễ tơ cây Bá bệnh tăng sinh khối. Đồng thời, luận án giúp nâng
cao chất lượng rễ thông qua việc sử dụng các elicitor để tăng hàm lượng các
alkaloid như 7-MCPA, 9-methoxycanthin-one và 9-hydroxycanthin-6-one. Làm
chủ được công nghệ nuôi cấy sinh khối rễ tơ cây Bá bệnh trên hệ thống bioreactor
20 lít. Kết quả của luận án có thể ứng dụng vào sản xuất sinh khối rễ tơ cây Bá
bệnh trên quy mô lớn nhằm giải quyết vấn đề khan hiếm nguồn nguyên liệu cho
sản xuất dược phẩm.
Ý nghĩa khoa học
Luận án cung cấp các dẫn liệu khoa học mới có giá trị về các nghiên cứu
hoạt tính sinh học và tăng cường tích lũy các hợp chất alkaloid trong rễ tơ cây
Bá bệnh. Luận án thiết lập được những phương pháp nghiên cứu tăng sinh khối rễ
tơ cây Bá bệnh. Đồng thời luận án cũng là tài liệu tham khảo hữu ích cho việc
nghiên cứu và giảng dạy về lĩnh vực hoá sinh, sinh lý thực vật và nuôi cấy mô tế
bào thực vật.
Những đóng góp mới của luận án

3


Đã phân lập và xác định cấu trúc hoá học được một chất mới (7-MCPA ) từ cao
chiết alkaloid của rễ tơ cây Bá bệnh.
Đánh giá được hoạt tính mới của ba alkaloid (1) 7-MCPA, (2) 9methoxycanthin-one, (3) 9-hydroxycanthin-6-one như hoạt tính kháng viêm trên

dòng tế bào chuột RAW264.7, đại thực bào của chuột và dòng tế bào người THP1 có giá trị IC50 từ 0,95–16,0 µM; hoạt tính gây độc của chất (1), (2) trên các dòng
tế bào ung thư KB, MCF-7, Hep-G2, LU-1 và chất (3) trên dòng LU-1.
Lần đầu tiên tìm được điều kiện nuôi cấy thích hợp cho rễ tơ cây Bá bệnh
tăng trưởng để thu sinh khối và tăng tích luỹ ba hoạt chất

7-MCPA , 9-

methoxycanthin-6-one và 9-hydroxycanthin-6-one.
Xây dựng được hệ thống bioreactor sục khí dạng cầu 20 lít sử dụng cho
nhân sinh khối rễ tơ cây Bá bệnh với các điều kiện tối ưu.

4


CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Giới thiệu chung về cây Bá bệnh
1.1.1. Đặc điểm sinh học và phân bố
Bá bệnh, còn gọi là mật nhân, bách bệnh, mật nhơn, bá bịnh có tên khoa học
là Eurycoma longifolia Jack, thuộc họ Simaroubaceae. Phân bố phổ biến nhất ở Miền
Trung, cây mọc ở ven rừng còi Kon tum, từ Đồng Nai đến Phú Quốc, cây cũng được
tìm thấy tại Vườn quốc gia Bái Tử Long, mọc tự nhiên ở hầu hết các diện tích đất
rừng tại đây [1]. Ngoài ra, cây còn có ở một số nước Đông Nam Á như Indonesia,
Malaysia, Lào, Campuchia và Philippines và vùng ranh giới Ấn Độ - Trung Quốc.
Phân loại Phân loại

Giới: Plantae
Giới: Plantae
Ngành:
Magnoliophyta
Ngành: Magnoliophyta

Lớp:
Magnoliopsida
Lớp:Magnoliopsida
Bộ:
Sapindales
Bộ: Sapindales
Họ: Simaroubaceae
Simaroubaceae
Họ:
Chi: Eurycoma
Eurycoma
Chi:
Loài: Longifoloa
Loài: Longifolia

A

D
C
A
A – Cây; B - Hoa C - Quả; D - rễ BáA bệnh (Eurycoma longifolia
Jack)
Hình 1.1. Hình thái của cây Bá bệnh (Eurycoma longifolia Jack)
B

A-Cây; B-Hoa; C-Quả; D-Rễ
Về đặc điểm hình thái thực vật, Bá bệnh là loại cây gỗ nhỏ, thân nhỏ, cao 2-8
m ít phân cành, lúc nhỏ ít khi có nhánh, vỏ và rễ rất đắng. Lá dài, gồm hơn 10 cặp lá
chét, mọc đối, hình bầu dục, cuống lá rất ngắn, gốc lá thuôn, đầu nhọn, mặt trên bóng,
mặt dưới có lông màu xám. Hoa chùm kép mọc ở thân hoặc đầu cành, hoa màu vàng,

ra hoa vào tháng 3-11, 5 cánh hoa, đài hoa có 5-6 lá đài hình tam giác, 5 tiểu nhuỵ.
Quả hình trứng dài 1-2 cm, rộng 0,5- 1cm, vỏ nhẵn có rãnh dọc, khi chín quả màu đỏ

5


sẫm chứa 1 hạt. Toàn cây (trừ quả chín) có vị đắng [1].
Cây Bá bệnh non cần nhiều ánh sáng để sinh trưởng. Cây có dạng rễ chùm,
lan rộng bám chặt vào đất. Cây thường mọc ở vùng đồi núi có sườn dốc cao hơn mực
nước biển chừng 700 m, vùng đất cát có tính axít, nghèo chất dinh dưỡng mọc dưới
tán cây, thích hợp ở những nơi có nhiệt độ trung bình 250C và độ ẩm khoảng 86%
mọc trong các khu rừng ven bờ biển hoặc rừng nguyên sinh, rừng tái sinh và các khu
rừng hỗn tạp, rừng thưa, cây ưa axít và đất cát ở độ cao khoảng 700 m so với mực
nước biển [1].
1.1.2 Thành phần hoá học và hoạt tính sinh học các alkaloid của cây Bá bệnh
Với việc được sử dụng khá phổ biến và hiệu quả trong y học cổ truyền, cây Bá
bệnh đã sớm được các nhà khoa học trên thế giới để ý. Từ cây này, rất nhiều các hợp
chất sinh học thứ cấp đã được tách chiết, tinh sạch, sàng lọc hoạt tính và nhiều trong
số chúng có hoạt tính tốt, hứa hẹn khả năng được áp dụng vào thực tiễn. Các hoạt tính
thường được thăm dò là: hoạt tính gây độc với các tế bào ung thư, hoạt tính kháng
viêm, khả năng chống các gốc oxy hóa… Ngoài ra, tùy theo những tác dụng của loài
trong y học dân gian, tùy theo tính chất của các chất, người ta có thể thăm dò các hoạt
tính khác như: tính tăng cường sinh lực cho nam giới, ức chế phóng xạ, chống tiểu
đường… Dưới đây, chúng tôi xin giới thiệu về những hoạt tính sinh học của các hợp
chất alkaloid đã được tách từ loài cây Bá bệnh này.
Năm 2004, Kuo và cs đã tách được một số hợp chất từ rễ cây Bá bệnh E.
longifolia. Trong đó, có alkaloid 9-methoxycanthin-6-one (1) và canthin-6-one (2) đã
chứng minh độc tính mạnh đối với A-549 và các dòng tế bào MCF-7 [2].

(1)

(2)

Từ loài E. longifolia, Tran Thi Van Anh và cs đã tách được một chất mới
eurycomalide C cùng với 27 hợp chất đã biết bao gồm 11 quassinoids, 6 alkaloids, 2
coumarins, 1 squalene derivative, 1 triterpenoid, and 6 phenolic. Các hợp chất

6


alkaloid

9-methoxycanthin-6-one

(1);

9-hydroxycanthin-6-one

(3);

1-

methoxycarbonyl-β-carboline (4); 9,10-dimethoxycanthin-6-one (5) thể hiện là chất
ức chế NF-κB mạnh, với giá trị IC50 lần lượt là 29,3; 3,8; 7,4; 19,5 µM [3].

(3)
Ba chất mới

(4)

(5)

n-pentyl-b-Carboline-1-propionate (6), 5-hydroxymethyl-9-

methoxycanthin-6-one (7), 1-hydroxy-9-methoxycanthin-6-one (8) và các chất
alkaloid cũ 9-methoxycanthin-6-one (1), canthin-6-one (2), canthin-6-one 9-O-bglucopyranoside (9), 9-mehthoxycanthin-6-one 3N-oxide (10), b-carboline-1propionic acid (11), 7-methoxy-b-carboline-1-propionic acid (12) được phân lập từ
rễ của E. longifolia. Các hợp chất này đã được sàng lọc trong in vitro gây độc tế bào
ung thư và chống sốt rét kết quả cho thấy chất (1) và (2) gây độc tính tế bào đáng kể
chống lại ung thư phổi ở người (A-549) và ung thư vú ở người (MCF-7) đạt giá trị
IC50 lần lượt với các dòng tế bào trên là chất (1) (<2,5 và 4,5 µg/ml); chất (2) (3,6 và
7,3 µg/ml). [4] .

(6)

(7)

(8)

(9)

7


(10)

(11)

(12)

K Miyake và cs, năm 2010 đã phân lập được hai loại alkaloid canthin-6-one

mới là 4,9-dimethoxycanthin-6-one (13) và 10-hydroxy-11-methoxycanthin-6-one
(2) cùng với 37 hợp chất đã biết từ thân cây Bá bệnh. Tất cả các chất phân lập được
đánh giá hoạt tính gây độc tế bào trên dòng tế bào sợi HT-1080 của người. Trong số
đó,

có

hai

alkaloid

9,10-dimethoxycanthin-6-one

(14),

10-hydroxy-9-

methoxycanthin-6-one (15) có hoạt tính gây độc tế bào đạt giá trị IC50 lần lượt là 5,0
và 7,2 µM [5].

(13)

(14)

(15)

Trong một nghiên cứu khác của K Mitsunaga và cs năm 1994, các chất alkaloid
phân lập từ vỏ và thân cây E. longifolia bao gồm: chất mới canthin-6-one (2), 9,10dimethoxycanthin-6-one

(14),

10-hydroxy-9-methoxycanthin-6-one

(15),

11-

hydroxy-10-methoxycanthin-6-one (16); 5,9-dimethoxycanthin-6-one (17) và 9methoxy-3-methylcanthin-5,6-dione (18). Cấu trúc của chúng được xác định bằng
phương pháp phổ cộng hưởng từ 1 chiều và 2 chiều NMR [6].

(16)

(17)

8

(18)


LB Kardono và cs 1991, tiến hành tách chiết rễ của cây Bá bệnh được thu thập
ở Kalimantan, Indonesia. Kết quả thu được bốn alkaloid canthin-6-one là 9methoxycanthin-6-one (1), 9-methoxycanthin-6-one-Noxide (19), 9-hydroxycanthin6-one (3), b-carboline-1-propionic axit (20). Các hợp chất này được đánh giá hoạt
tính gây độc tế bào ung thư vú, đại tràng, u xơ, phổi, khối u ác tính, KB và KB-VI.
Kết quả nghiên cứu cho thấy, các alkaloid từ (1), (3), (19) có hoạt động với tất cả các
dòng tế bào được kiểm tra ngoại trừ dòng tế bào KB-V1. Alkaloid (20) không hoạt
động đáng kể với các tế bào thử nghiệm [7].

(19)

(20)

1.1.3. Tác dụng dược lý của cây Bá bệnh
Bá bệnh là một cây có giá trị phong phú về thành phần hoác học cũng như
hoạt tính sinh học. Trong bảng 1.1 thể hiện rất nhiều công trình nghiên cứu về tác
dụng của các chất phân lập từ cây này.
Ngoài ra, còn rất nhiều công trình nghiên cứu về tác dụng của từng bộ phận
cũng như cao chiết tổng của cây như:
Cao chiết cây Bá bệnh có khả năng tăng cường sức khoẻ tình dục cho nam giới,
kích thích cơ thể tăng tiết hormon giới tính nam (testosteron) một cách tự nhiên, duy
trì sự hưng phấn và phong độ tình dục ở nam giới, ngăn chặn các dấu hiệu suy giảm
khi bước vào tuổi trung niên [8-12].
Cao chiết Bá bệnh được sử dụng phổ biến cho chống sốt rét và có tác
dụng tốt chống lại P. falciparum. [7,13,14].
Cao chiết Bá bệnh có tác dụng chống tăng sinh các dòng tế bào ung thư khác
nhau của người, cũng như các khối u rắn, bao gồm ung thư phổi, ung thư vú và cổ tử
cung [15, 16].
Lá và rễ cây Bá bệnh đã được dùng để kiểm soát đường huyết [17]. Chiết xuất
từ rễ Bá bệnh làm tăng độ nhạy cảm insulin thông qua việc tăng cường sự hấp thu
glucose nhiều hơn 200 % tại 50 mg/ml và ức chế sự tích tụ lipid, cho thấy Bá bệnh

9


ngăn chặn sản xuất lipid sẽ cung cấp thêm các lợi ích trong điều trị bệnh tiểu đường [18].
Lá và rễ cây Bá bệnh đã được dùng để kiểm soát đường huyết. Nhóm của
Husen đã thử dịch chiết nước của rễ Bá bệnh ở 3 liều (50; 100 và 150 mg/kg) theo
mô hình Steptozotocin trên chuột bình thường và chuột có đường huyết cao. Kết quả
cho thấy ở nồng độ 150 mg/kg cao nước rễ Bá bệnh có khả năng làm hạ đường huyết
ở lô thử và không gây giảm có ý nghĩa ở lô chứng [17].
Các thành phần khác của Bá bệnh như alkaloids và triterpenes, cũng có thể
làm giảm mất xương và duy trì các tỷ lệ hình thành xương [19]. Cao chiết rễ Bá bệnh

cho tác dụng tăng androgenic (chống loãng xương và có khả năng thay thế cho
testosterol) [20]. Do vậy, Bá bệnh có thể dùng như một liệu pháp thay thế triển vọng
ở người loãng xương do thiếu hụt hay suy giảm androgen.
Bảng 1.1.Các thành phần hoá học được phân lập từ cây Bá bệnh và tác dụng dược
lý của chúng [21]
Bộ
Các hợp chất hoá học

phận

Tác dụng dược lý

Eurycomanone (C20)

Tăng sản xuất testosterone

13a,21-Dihydroeurycomanone

Cải thiện tinh trùng. Ức chế

13a (21)-Epoxyeurycomanone

khối u, ung thư phổi, gây độc tế
Rễ

13b-Methyl,21-dihydroeurycomanone

bào ung thư phổi ở người (A-

12-Acetyl-13,21-dihydoeurycomanone

549) và ung thư vú (MCF-7).

15-Acetyl-13a (21)-epoxyeurycomanone

Thuốc chống sốt rét chống lại P.
falciparum. Chất ức chế NF-

12,15-Diacetyl-13a(21)-

kB. Chống Estrogen

epoxyeurycomanone
Eurycomanol (C20)
Eurycomanol-2-O-b-D-glucoside
Rễ

13b,18-Dihydroeurycomanol

Thuốc chống sốt rét chống lại P.
falciparum

13b,21-Dihydroxyeurycomanol
5a,14b,15b-Trihydroxyklaineanone
11-Dehydroklaineanone
12-epi-11-Dehydroklaineanone

10

14,15b-Dihydroxyklaineanone

Lá,

Gây độc tế bào ung thư phổi ở

15b-Hydroxyklaineanone

rễ

người (A-549) và ung thư vú
(MCF - 7)
Chất ức chế NF-kB

Laurycolactones A and B (C18)

Rễ

Gây độc tế bào HT 1080

Eurycomalactone (C19)

Gây độc tế bào ung thư phổi ở

6a-Hydroxyeurycomalactone

người (A-549) và ung thư vú

7a-Hydroxyeurycomalactone

(MCF - 7) và ung thư dạ dày
Rễ

5,6-Dehydroeurycomalactone

(MGC - 803). Gây độc tế bào

Eurycomadilactone (C20)

HT 1080 của người. Thuốc

5-iso-Eurycomadilactone

chống sốt rét chống lại P.

13-epi- Eurycomadilactone

falciparum

Eurycomalides A and B (C19)

Gây độc tế bào ung thư phổi ở

Eurycomalide C

người (A-549) và ung thư vú

Eurycomalide D

Rễ

(MCF - 7). Chất ức chế NF-kB
Gây độc tế bào HT 1080 của

Longilactone (C19)

người. Các hợp chất có khả

6-Dehydroxylongilactone

Lá,

năng chống u bướu, kháng lại

11-Dehydroklaineanone

rễ

tĩnh mạch và chống lại ký sinh
trùng. Chất ức chế NF-kB

Eurycolactone A(C20)
Eurycolactone B(C18)
Eurycolactone D (C18)
Eurycolactones E, F (C19)

Rễ

Cytotoxicity against human HT1080

Gây độc tế bào HT 1080 của
người. Chất ức chế NF-kB

NF-kB inhibitor [42,44,45,51,74]
Eurylactones A and B (C18)
Eurylactones E, F and G (C19)
Canthin-6-one alkaloids

Chống ung thư, chống sốt rét,

9-Methoxycanthin-6-one

chống HIV và chống tiểu

11