PHÂN TÍCH CẤU TRÚC MỘT SỐ HỢP CHẤT TRONG CÂY AN XOA (HELICTERES HIRSUTA L.) Ở VIỆT NAM BẰNG CÁC PHƢƠNG PHÁP HÓA LÝ HIỆN ĐẠI

BỘ GIÁO DỤC
VÀ ĐÀO TẠO

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC
VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
-----------------------------

TRẦN THỊ KIM MỴ

PHÂN TÍCH CẤU TRÚC MỘT SỐ HỢP CHẤT TRONG CÂY
AN XOA (HELICTERES HIRSUTA L.) Ở VIỆT NAM BẰNG CÁC
PHƢƠNG PHÁP HÓA LÝ HIỆN ĐẠI

LUẬN VĂN THẠC SỸ HÓA HỌC

HÀ NỘI 2019


BỘ GIÁO DỤC
VÀ ĐÀO TẠO

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC
VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
-----------------------------

TRẦN THỊ KIM MỴ

PHÂN TÍCH CẤU TRÚC MỘT SỐ HỢP CHẤT TRONG CÂY
AN XOA (HELICTERES HIRSUTA L.) Ở VIỆT NAM BẰNG CÁC
PHƢƠNG PHÁP HÓA LÝ HIỆN ĐẠI

CHUYÊN NGÀNH: HÓA PHÂN TÍCH
MÃ NGÀNH: 8440118

LUẬN VĂN THẠC SỸ HÓA HỌC

NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC
TS. NGUYỄN THANH TRÀ

HÀ NỘI 2019


LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đề tài luận văn thạc sỹ: “Phân tích cấu trúc một số
hợp chất trong cây An xoa (Helicteres hirsuta L.) ở Việt Nam bằng các
phương pháp hóa lý hiện đại” là do tôi thực hiện với sự đồng ý và hƣớng dẫn
của TS.Nguyễn Thanh Trà. Đây không phải là bản sao chép của bất kỳ một cá
nhân, tổ chức nào. Các kết quả thực nghiệm, số liệu, nguồn thông tin trong
luận văn là do tôi tiến hành, trích dẫn, tính toán và đánh giá.
Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về những nội dung mà tôi đã trình
bày trong luận văn này.
Hà Nội, ngày 10 tháng 04 năm 2019
Học viên

Trần Thị Kim Mỵ

LỜI CẢM ƠN
Tôi xin gửi lời biết ơn sâu sắc đến TS.Nguyễn Thanh Trà – Phòng Hóa
sinh ứng dụng - Viện Hóa học - Viện Hàn lâm Khoa học & Công nghệ Việt
Nam đã dành rất nhiều thời gian, tâm huyết hƣớng dẫn nghiên cứu và giúp tôi
hoàn thành luận văn tốt nghiệp.
Để hoàn thành bản luận văn này, Tôi xin chân thành cảm ơn sự hỗ trợ
kinh phí của đề tài cấp Viện HLKH & CN Việt Nam thuộc 7 hƣớng ƣu tiên,
MSĐT: VAST 04.03/18.19
Tôi xin chân thành cảm ơn Trung tâm đào tạo Sau đại học Học Viện
Khoa Học và Công Nghệ Việt Nam đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong
quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn.
Tôi xin chân thành cảm ơn Lãnh đạo Viện Hóa học – Viện HLKH &
CN Việt Nam, Các cán bộ phòng Hóa sinh ứng dụng, Trung tâm nghiên cứu
các phƣơng pháp Phổ ứng dụng.
Mặc dù tôi đã có nhiều cố gắng hoàn thiện luận văn này bằng tất cả sự
nhiệt tình và năng lực của mình, tuy nhiên không thể tránh khỏi những thiếu
sót. Rất mong nhận đƣợc những đóng góp quí báu của quí thầy cô và các bạn.
Hà Nội, ngày 10 tháng 04 năm 2019
Học viên

Trần Thị Kim Mỵ


BẢNG KÝ HIỆU CÁC CHỮ VIẾT TẮT
Chữ viết tắt

Tên Tiếng Anh

Tên Tiếng Việt

WHO

World Health Organization

Tổ chức y tế thế giới

CC

Column Chromatography

Sắc ký cột

TLC

Thin layer Chromatography

Sắc ký lớp mỏng

IR

Infrared Spectrometry

Phổ hồng ngoại

MS

Mass Spectrometry

Phổ khối lƣợng

NMR

Nuclear Magnetic Resonance

Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân

1

1

H-NMR

13

C-NMR

H-Nuclear
Magnetic Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân
Resonance Spectrocopy
Proton
13

C-Nuclear
Magnetic Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân
Resonance Spectrocoy
Carbon 13
Tăng cƣờng biến dạng bằng
chuyển phân cực

DEPT

Distortionless Enhancement
by Polarization Transfer

HPLC

High-performance
Chromatography

HPLC-MS

Liquid Chromatography–Mass Sắc ký lỏng ghép khối phổ
Spectrometry

NOESY

Nuclear
Overhauser Phổ tăng cƣờng hạt nhân
Enhancement Spectroscopy

IC50

50% Inhibitory Concentration

Nồng độ ức chế 50%

COSY

Correlation Spectroscopy

Phổ tƣơng tác hai chiều đồng
hạt nhân

HSQC

Heterronuclear
Quantum Coherence

HMBC

Heterronuclear Multiple Bond Phổ tƣơng tác đa liên kết hai
Correlation
chiều dị nhân

HR-MS

High
Resolution
Spectroscopy

δH, - δC

Liquid Sắc ký lỏng hiệu năng cao

Single Phổ tƣơng tác hai chiều dị hạt
nhân

Mass Phổ khối phân giải cao
Độ chuyển dịch hóa học của

proton và cacbon


DANH MỤC CÁC HÌNH, BẢNG, SƠ ĐỒ
Hình 1.1: Một số triterpenoid phân lập từ chi Dó Helicteres................................................ 5
Hình 1.2: Một số cucurbitacin phân lập từ chi Dó Helicteres ............................................... 7
Hình 1.3: Một số coumarin phân lập từ chi Dó Helicteres .................................................... 8
Hình 1.4: Cây An xoa (Helicteres hirsuta Loureiro.) ............................................................ 9
Hình 1.5: Các lignan phân lập từ cây An xoa (Helicteres hirsuta) ........................................ 9
Hình 1.6: Một số hợp chất phân lập từ cây An xoa Helicteres hirsuta L. thu hái ở Kiên
Giang (Hữu Duyên, 2016) ................................................................................................... 10
Hình 1.7: Một số hợp chất phân lập từ cây An xoa Helicteres hirsuta L. thu hái ở Bình
Phƣớc (Ngọc Quang, 2018) ................................................................................................. 11
Hình 1.8: Cách tính giá trị Rf ............................................................................................... 13
Hình 1.9: Các bƣớc tiến hành sắc ký bản mỏng .................................................................. 14
Hình 1.10: Các bƣớc tiến hành sắc ký cột ........................................................................... 15
Hình 2.1.Hình ảnh cây An xoa (Helicteres hirsuta L.) thu hái tại Thừa Thiên-Huế .......... 20
Hình 3.1: Cấu trúc hóa học của 8 hợp chất phân lập từ thân cây An xoa ............................ 31
Hình 3.2: Phổ MS của hợp chất HH01 ................................................................................ 32
Hình 3.3: Phổ 1H của hợp chất HH01 .................................................................................. 33
Hình 3.4: Phổ 13C của hợp chất HH01 ................................................................................. 33
Hình 3.5: Phổ DEPT của hợp chất HH01 ............................................................................ 34
Hình 3.6: Phổ HMBC của hợp chất HH01 .......................................................................... 34
Hình 3.7: Tƣơng tác HMBC của hợp chất HH01 ................................................................ 35
Hình 3.8: Phổ MS của hợp chất HH02 ................................................................................ 36
Hình 3.9: Phổ 1H của hợp chất HH02 .................................................................................. 37
Hình 3.10: Phổ 13C của hợp chất HH02 ............................................................................... 37
Hình 3.11: DEPT của hợp chất HH02 ................................................................................. 38
Hình 3.12: Cấu trúc hóa học của hợp chất HH02 ................................................................ 38
Hình 3.13: Phổ MS của hợp chất HH03 .............................................................................. 39

Hình 3.14: Phổ 1H của hợp chất HH03 ................................................................................ 40
Hình 3.15: Phổ 13C của hợp chất HH03 ............................................................................... 40
Hình 3.16: Phổ DEPT của hợp chất HH03 .......................................................................... 41
Hình 3.17: Cấu trúc hóa học của hợp chất HH03 ................................................................ 41
Hình 3.18: Phổ MS của hợp chất HH04 .............................................................................. 42


Hình 3.19: Phổ 1H của hợp chất HH04 ................................................................................ 43
Hình 3.20: Phổ 13C của hợp chất HH04 ............................................................................... 43
Hình 3.21: Phổ 13C của hợp chất HH04 ............................................................................... 44
Hình 3.22: Cấu trúc của hợp chất HH04.............................................................................. 44
Hình 3.23: Phổ MS của hợp chất HH05 .............................................................................. 45
Hình 3.24: Phổ 1H của hợp chất HH05 ................................................................................ 46
Hình 3.25: Phổ 13C của hợp chất HH05 ............................................................................... 47
Hình 3.26: Cấu trúc hợp chất HH05 .................................................................................... 47
Hình 3.27: Phổ khối phân giải cao HRESI-MS của hợp chất HH06 ................................... 48
Hình 3.28: Phổ 1H-NMR của hợp chất HH06 ..................................................................... 48
Hình 3.29 : Phổ 13C-NMR của hợp chất HH06 ................................................................... 49
Hình 3.30: Phổ HSQC của hợp chất HH06 ......................................................................... 49
Hình 3.31: Phổ HMBC của hợp chất HH06 ........................................................................ 50
Hình 3.32 : Tƣơng tác HMBC của hợp chất HH06 ............................................................. 50
Hình 3.33: Phổ 1H-NMR của HH07 .................................................................................... 51
Hình 3.34: Phổ 13C-NMR của HH07 ................................................................................... 52
Hình 3.35: Phổ DEPT của HH07 ......................................................................................... 52
Hình 3.36: Phổ HMBC của HH07 ....................................................................................... 53
Hình 3.37: Cấu trúc của hợp chất HH07.............................................................................. 54
Hình 3.38: Phổ 1H của hợp chất HH08 ................................................................................ 54
Hình 3.39: Phổ 13C của hợp chất HH08 ............................................................................... 55
Hình 3.40: Phổ DEPT của hợp chất HH08 .......................................................................... 56
Hình 3.41: Cấu trúc của hợp chất HH08.............................................................................. 56

Bảng 2.1: Dữ kiện phổ NMR (1H: 500 MHz,

13

C: 125 MHz) của hợp chất HH06 và của

chất tham khảo [49] (đo trong CD3OD)............................................................................... 29
Sơ đồ 2.1: Sơ đồ điều chế các cặn chiết từ thân cây An xoa ............................................... 22
Sơ đồ 2.2: Sơ đồ điều chế các hợp chất từ cặn chiết EtOAc ............................................... 25


MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN
LỜI CẢM ƠN
BẢNG KÝ HIỆU CÁC CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC HÌNH, BẢNG, SƠ ĐỒ
MỤC LỤC
MỞ ĐẦU .....................................................................................................................1
CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN .......................................................................................3
1.1. GIỚI THIỆU SƠ LƢỢC VỀ CHI DÓ (HELICTERES) ......................................3
1.2. CÁC KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VỀ CHI DÓ (HELICTERES) .........................3
1.2.1. Các triterpenoid .................................................................................................4
1.2.2. Các coumarin ....................................................................................................8
1.3. GIỚI THIỆU VỀ CÂY AN XOA HELICTERES HIRSUTA LOUREIRO
(STERCULIACEAE) ..................................................................................................8
1.4. CÁC PHƢƠNG PHÁP HÓA LÝ DÙNG ĐỂ PHÂN TÍCH CẤU TRÚC CÁC
HỢP CHẤT THIÊN NHIÊN ....................................................................................12
1.4.1. Các phƣơng pháp chiết xuất ............................................................................12
1.4.2. Các phƣơng pháp sắc ký .................................................................................13
1.4.3. Các phƣơng pháp phân tích xác định cấu trúc các chất phân lập đƣợc ..........15

1.4.3.1. Phân tích cấu trúc hợp chất bằng phổ hồng ngoại IR (Infrared Spectroscopy)
...................................................................................................................................16
1.4.3.2. Phổ khối lƣợng MS (Mass spectrometry) ....................................................17
1.4.3.3. Phân tích cấu trúc hợp chất bằng phổ cộng hƣởng từ hạt nhân (NMR) ......17
CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................20
2.1. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU ..............................................................................20
2.2. HÓA CHẤT, DỤNG CỤ VÀ THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU .................................20
2.2.2. Thiết bị nghiên cứu .........................................................................................21
2.3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ......................................................................21


2.3.1. Xử lý mẫu thực vật ..........................................................................................21
2.3.2. Điều chế các cặn chiết .....................................................................................21
2.3.3. Phƣơng pháp phân lập và phân tích cấu trúc hóa học của các hợp chất tự
nhiên [35,36] .............................................................................................................22
2.3.4. Chiết xuất, phân lập các hợp chất tự nhiên từ thân cây An xoa ......................24
2.4. DỮ KIỆN PHỔ VÀ HẰNG SỐ VẬT LÝ CỦA CÁC HỢP CHẤT PHÂN LẬP
ĐƢỢC .......................................................................................................................25
2.4.1. Betulin (HH01)................................................................................................25
2.4.2. Axit betulinic (HH02) .....................................................................................26
2.4.3. Axit alphitolic (HH03) ....................................................................................27
2.4.4. Axit oleanolic (HH04).....................................................................................27
2.4.5. Hibiscolactone A (HH05) ...............................................................................28
2.4.6. Heliclactone (HH06) .......................................................................................28
2.4.7. Stigmast-4-ene-6β-ol-3-one (HH07) ...............................................................29
2.4.8. β-sitostenone (HH08): .....................................................................................30
CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ...........................................................31
3.1. KẾT QUẢ PHÂN TÍCH CẤU TRÚC HỢP CHẤT HH01 (betulin) ................31
3.2. KẾT QUẢ PHÂN TÍCH CẤU TRÚC HỢP CHẤT HH02 (axit betulinic) ......35
3.4. KẾT QUẢ PHÂN TÍCH CẤU TRÚC HỢP CHẤT HH04 (axit oleanolic) ......41

3.5. KẾT QUẢ PHÂN TÍCH CẤU TRÚC HỢP CHẤT HH05 (3, 9 –dihydroxy1,3,5,7,9 cadinapentaene-14,2-olide hay hibiscolactone A) ....................................44
3.6.KẾT QUẢ PHÂN TÍCH CẤU TRÚC HỢP CHẤT HH06 (heliclacton) ...........47
3.7.KẾT QUẢ PHÂN TÍCH CẤU TRÚC HỢP CHẤT HH07 (6β-hydroxyenone) 51
3.8. KẾT QUẢ PHÂN TÍCH CẤU TRÚC CỦA HỢP CHẤT HH08 βSITOSTENONE ........................................................................................................54
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ...................................................................................57
TÀI LIỆU THAM KHẢO .........................................................................................58


1

MỞ ĐẦU

Cho tới nay, cây dƣợc liệu vẫn đóng một vai trò quan trọng trong chăm
sóc sức khoẻ con ngƣời. Theo thống kê của tổ chức y tế thế giới (WHO) hiện
có khoảng 80% dân số thế giới vẫn tin dùng các thuốc có nguồn gốc tự nhiên,
trong đó chủ yếu từ thực vật [1]. Trên thế giới, từ các thảo dƣợc các nhà khoa
học đã tìm ra nhiều loại thuốc mới có hoạt tính cao và đƣợc sử dụng rộng rãi
trong việc điều trị bệnh. Ví dụ nổi bật là việc phát hiện ra hai hoạt chất
Vinblastine và Vincristine từ cây Dừa cạn (Catharanthus roseus (L.) G. Don),
họ Trúc đào (Apocynaceae) và Taxol từ cây Thông đỏ (Taxus brevifolia), họ
Thông (Pinaceae). Cùng với các dẫn xuất bán tổng hợp nhƣ Taxotere từ 10deacetyl bacatin III, hay gần đây hoạt chất Vinflunine từ Vinorelbine cũng đã
chính thức đƣợc sử dụng để điều trị cho bệnh nhân ung thƣ.
Việt Nam là quốc gia nằm trong vành đai khí hậu nhiệt đới gió mùa nên có
hệ thực vật vô cùng phong phú và đa dạng. Trong số này, nguồn tài nguyên cây
làm thuốc chiếm khoảng 30%. Trong những năm gần đây, rất nhiều công trình
nghiên cứu về cây thuốc của hệ thực vật Việt nam đã đƣợc thực hiện và đã có
những đóng góp quan trọng vào việc chăm sóc và bảo vệ sức khoẻ cộng đồng.
Những loài thực vật có tác dụng chữa bệnh là nguồn dƣợc liệu quý giá bởi
chúng có khả năng chữa bệnh cho con ngƣời và để lại ít tác dụng phụ hơn các
thuốc có nguồn gốc tổng hợp. Ngày nay, với mối hiểm họa về tình trạng gia

tăng bệnh tật đặc biệt là các bệnh hiểm nghèo nhƣ ung thƣ, tim mạch…thì việc
nghiên cứu tác dụng làm thuốc của các loài thực vật mang tính ý nghĩa khoa
học và thời sự [2].
Cây An xoa đã đƣợc nhắc đến trong danh mục Thực vật chí ở Việt Nam
và trên thế giới, dùng để chữa nhiều bệnh khác nhau nhƣ cảm cúm, sởi, ung
nhọt, kiết lỵ, trong đó có tác dụng với các bệnh về gan. Ở nƣớc ta, cây mọc
nhiều ở Bình Phƣớc, ven các sông suối, ngoài ra còn tìm thấy ở Lâm Đồng và
các tỉnh miền núi phía Bắc. Theo y học cổ truyền, từ xa xƣa, cây An xoa đƣợc
xem nhƣ là một bài thuốc gia truyền hỗ trợ điều trị xơ gan của ngƣời dân tộc
thiểu số Camphuchia. Tuy nhiên, các nghiên cứu về thành phần hóa học hoàn


2

chỉnh và tác dụng dƣợc lý của cây An Xoa ở Việt Nam và trên thế giới vẫn
còn rất hạn chế. Chính vì thế, chúng tôi đề xuất đề tài luận văn: “Phân tích
cấu trúc một số hợp chất trong cây An xoa (Helicteres hirsuta L.) ở Việt
Nam bằng các phƣơng pháp hóa lý hiện đại” với mục tiêu nghiên cứu
thành phần hóa học trong cây An xoa nhằm làm cơ sở khoa học cho việc sử
dụng cây thuốc một cách hợp lý và hiệu quả.
*Mục tiêu nghiên cứu:
Nghiên cứu thành phần hóa học của thân cây An xoa (Helicteres
hirsuta L.) thu hái ở Việt Nam
*Nội dung nghiên cứu:
- Thu hái mẫu cây An xoa tại Thừa Thiên, Huế.
- Phân lập các hợp chất tử thân cây An xoa bằng các phƣơng pháp sắc ký.
- Xác định cấu trúc hóa học của các chất phân lập đƣợc bằng các phƣơng
pháp phổ hiện đại: MS, 1D, 2D-NMR.

3

CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN

1.1. GIỚI THIỆU SƠ LƢỢC VỀ CHI DÓ (HELICTERES)
Thành phần loài: Chi Dó (Helicteres) là một chi thuộc họ Trôm
(Sterculiaceae) bao gồm khoảng 40 loài đƣợc tìm thấy ở các vùng nhiệt đới
thuộc châu Á và châu Mỹ. Theo tác giả Phạm Hoàng Hộ [3], chi Dó
(Helicteres) ở Việt Nam bao gồm 9 loài, đó là: Helicteres viscida Bl…(dó
trỉn, dó chuột), H. angustifolia L.. (dó hẹp, ổ kén), H. angustifolia var.
glaucoides Pierre (dó mốc), H. angustifolia var. obtusa Pierre (ổ kén hẹp), H.
angustifolia glabriuscula Wall (ổ kén không lông), H. isora L. (dó tròn), H.
lanceolata DC.. (dó thon), H. plebeja Kurz (dó thƣờng) và dó lông hay An
xoa. H. hirsuta Lour.
Về mặt hình thái: Cây gỗ hay cây bụi, có lông hình sao. Lá đơn, có
cuống. Cụm hoa ở nách lá; nhiều hoa. Đài hình ống có 5 răng, thƣờng chia 2
môi. Cánh hoa 5, hình dải thuôn, thẳng hay gấp khúc, thon thành hình móng
dài ở nửa dƣới, thƣờng có tai ở trên móng, không giống nhau. Nhị 10, đính
trên một cột hay nhụy dài, chỉ nhị 10, dính nhau nhiều hay ít; bao phấn lắc lƣ,
thƣờng ngoại hƣớng, rồi nội hƣớng, 2 ô. Nhị lép 5, ở trong xen kẽ với nhị.
Bầu đính ở giữa các nhị; 5 ô; lá noãn 5, phân cách bởi các rãnh quả; noãn
nhiều, đảo, xếp thành 2 dãy dọc; vòi thành cột; đầu nhụy không rõ. Qủa nang,
có lông, hạt nhiều, hình tháp.
Thành phần hóa học và tác dụng dược lý: Một số loài của chi này đƣợc
sử dụng trong y học dân tộc, nhƣ: rễ của loài Helicteres isora đƣợc dùng để
trị chứng mƣng mủ, viêm dạ dày, nhiễm trùng ruột, tiểu đƣờng. Loài H. ovata
và H. sacarolha đƣợc dùng để trị bệnh giang mai, và rễ của loài H. hirsuta
đƣợc dùng để trị đau dạ con.
1.2. CÁC KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VỀ CHI DÓ (HELICTERES)
Các nghiên cứu sinh học của một số loài thuộc chi này đã chứng tỏ

rằng dịch chiết của loài H. isora có hoạt tính chống tiểu đƣờng, giảm mỡ máu


4

[4-6]; dịch chiết của H. hirsuta có hoạt tính độc tế bào [7] và dịch chiết của H.
gardneriana thể hiện hoạt tính kháng ký sinh trùng gây bệnh sốt rét,
leishmania…[8].
Các nghiên cứu về hóa thực vật của các loài Helicteres đã chỉ ra đƣợc
việc phân lập các hợp chất: triterpenoid, flavonoid, lignan, neolignan và các
dẫn xuất của axit rosmarinic.
1.2.1. Các triterpenoid
Từ rễ của loài H. angustifolia. Các nhà khoa học Đài Loan [9] đã tách và
định lƣợng bằng phƣơng pháp HPLC ba triterpenoid có khung lupan đó là:
3β-acetoxy-27-benzoyloxylup-20(29)-en-28-oic acid methyl ester (1), 3βacetoxy-27-benzoyloxylup-20(29)-en-28-oic acid (2) và 3β-acetoxy-27- (phydroxyl) benzoyloxylup -20(29)-en-28-oic acid methyl ester (3).
Tiếp theo nghiên cứu trên, vào năm 2008, khi nghiên cứu rễ của loài H.
angustifolia, nhóm tác giả Min-Hsiung Pan và cộng sự [10] đã công bố các
kết quả phân lập, và xác định cấu trúc của 3 triterpen mới đó là 3β-acetoxy27-[(E)-cinamoyloxy]lup-20(29)-en-28-oic acid methyl este (4), 3β-acetoxy27-[4-hydroxybezoyl)oxy]lup-20(29)-en-28-oic acid (5), 3β-acetoxy-27-[(4hydroxybezoyl)oxy]olean-12-en-28-oic acid methyl este (6), cùng với 8
triterpen có cấu trúc đã biết là 3β-acetoxy-27-(benzoyloxy)_olean-12-en-28oic acid methyl este (7), cylicodiscic acid (3β,27-dihydroxylup-20(29)-en-28oic acid) (8), 3β-O-(trans-coumaroyl)_betulinic acid (9), pyracrenic acid (3βO-(trans-caffeoyl)_betulinic acid) (10), 3β-O-(trans-feruloyl)betulinic acid
(11), 3β-O-(trans-coumaroyl)_betulin (12), 3β-O-(cis-coumaroyl)_betulin
(13), 3β-O-(trans-caffeoyl)_betulin (14), và 3β-O-(trans-feruloyl)_betulin
(15).
Ngoài ra, một số triterpenoid có khung lupan cũng đƣợc công bố bởi
các nhóm tác giả khác nhau khi nghiên cứu loài H. angustifolia nhƣ 3βacetoxylup-20 (29)-en-28-ol (16) [10], 3β-hydroxylup-20(29)-en-28-oic acid
3-caffeate (17) [12], axit betulinic (18).


5

Hình 1.1: Một số triterpenoid phân lập từ chi Dó Helicteres

Ngoài ra, các hợp chất cucurbitacin cũng đƣợc tìm thấy trong một số loài
của chi Helicteres. Về mặt hóa học, các cucurbitacin đƣợc xếp vào lớp chất
triterpenoid, các cucurbitacin thƣờng có nhiều ở các cây trong họ
Cucurbitaceae (họ bầu bí).
Từ rễ của loài H. angustifolia thu hái ở Đài Loan, các nhà khoa học Đài
Loan đã phân lập đƣợc 2 cucurbitacin mới là cucurbitacin B2-sunfate (19) và


6

cucurbitacin glucoside (20) cùng với 2 cucurbitacin glucoside đã biết là
arvenin I (21) và arvenin III (22) [14].
Một nghiên cứu khác từ rễ của loài H. angustifolia của nhóm tác giả
Trung Quốc [15] đã công bố việc phân lập và xác định cấu trúc của
cucurbitacin D (23) và cucurbitacin J (24) vào năm 2006, hai chất này có hoạt
tính tốt đối với cả hai dòng tế bào ung thƣ: tế bào ung thƣ gan BEL-7402 (với
giá trị IC50 của hai chất lần lƣợt là 1,41 và 1,37 µM) và ung thƣ sắc tố da SKMEL-28 (với IC50 tƣơng ứng là 1,22 và 1,28 µM).
Từ loài H. isora, nhóm tác giả Bean, M. F và cộng sự [16] đã phân lập
đƣợc cucurbitacin B (25) và isocucurbitacin B (26), đây là hai hợp chất đƣợc
phát hiện là có độc tính trên dòng tế bào ung thƣ KB với giá trị ED50= <10-5
µg/ml (cucurbitacin B), và ED50= 7.6×10-5 µg/ml (isocucurbitacin B).


7

Hình 1.2: Một số cucurbitacin phân lập từ chi Dó Helicteres
Cũng từ rễ của loài H. angustifolia [15], các tác giả Trung Quốc đã phân
lập đƣợc một steroit có khung pregnan tên là 2α,7β,20α-trihydroxy-3β,21dimethoxy-5-pregnanene (27).

8

1.2.2. Các coumarin
Từ rễ loài H. angustifolia, nhóm tác giả Wenliang Chen và cộng sự đã
phân lập đƣợc một coumarin mới có tên là 6,7,9α-trihydroxy-3,8,11αtrimethylcyclohexo-[d,e]-coumarin (28) [15]. Cũng từ loài H. angustifolia,
Wang và cộng sự [17] đã phân lập ra một hợp chất coumarin mới và đặt tên là
heliclacton (29)

Hình 1.3: Một số coumarin phân lập từ chi Dó Helicteres
Ngoải ra, chi Helicteres còn có chứa các hợp chất khác nhƣ
sesquiterpenoid quinon [19, 20], lignan [21], neolignan [22, 23], acid
rosmarinic [24] và flavonoid [25,26].
1.3. GIỚI THIỆU VỀ CÂY AN XOA HELICTERES HIRSUTA LOUREIRO
(STERCULIACEAE)
Cây An xoa (hay còn gọi là Dó lông, Tổ kén cái) có tên khoa học là
Helicteres hirsuta Loureiro thuộc Họ Trôm Sterculiaceae. An xoa là cây bụi,
cao khoảng 1-3m, nhánh hình trụ, có lông. Lá hình trái xoan, dài 5-17cm,
rộng 2,5-7,5cm. Gốc cụt hay hình tim, đầu thon thành mũi nhọn. Mép có răng
không đều. Mặt dƣới màu trắng, cả hai mặt phủ đầy lông hình sao; gân gốc 5,
cuống lá dài 0,8-4cm, lá kèm hình dải, có lông, dễ rụng. Cụm hoa là những
bông ngắn, đơn hay xếp đôi ở nách lá. Hoa màu hồng hay đỏ, cuống hoa có
khớp và có lá bắc dễ rụng, đài hình ống phủ lông hình sao, màu đo đỏ, chia 5
răng. Cánh hoa 5, cuống bộ nhị có vân đỏ, nhị 10, nhị lép bằng chỉ nhị, bầu có
nhiều gợn, chứa 25-30 noãn trong mỗi lá noãn. Quả nang hình trụ nhọn, hạt
nhiều, hình lăng trụ. Ra hoa kết quả từ tháng 7 đến tháng 11 [27].


9

Hình 1.4: Cây An xoa (Helicteres hirsuta Loureiro.)

Cây An xoa phân bố ở Nam Trung Quốc và nhiều nƣớc Nam Á nhƣ Ấn
Độ, Camphuchia, Thái Lan, Việt Nam, Malaysia, Philippine...Ở Việt Nam,
cây thƣờng gặp trên các đồi cây bụi, rừng thƣa, ven rừng, phổ biến từ Bắc tới
Nam, nhƣ ở Bình Phƣớc, Lâm Đồng và các tỉnh miền núi phía Bắc [28]. Cây
An xoa đã đƣợc nhắc đến trong danh mục Thực vật chí ở Việt Nam và trên
thế giới, dùng để chữa nhiều bệnh khác nhau nhƣ cảm cúm, sởi, ung nhọt, kiết
lỵ, trong đó có tác dụng với các bệnh về gan [29,30].
Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước
Khi nghiên cứu loài An xoa Helicteres hirsuta có nguồn gốc từ
Indonexia, nhóm tác giả Young-Won Chin (2006) đã phân lập đƣợc 6 lignan
có tên là (±)-pinoresinol (30); (±)-medioresinol (31); (±)- syringaresinol (32);
(-)-boehmenan (33); (-)-boehmenan H (34) và (±)-trans-dihydro diconiferyl
alcohol (35) [21].

Hình 1.5: Các lignan phân lập từ cây An xoa (Helicteres hirsuta)


10

Trong số 6 lignan tách ra từ loài này thì có 3 chất là 1, 4 và 5 là có hoạt
tính ức chế 3 dòng tế bào ung thƣ là: ung thƣ phổi (Lu1), ung thƣ tuyến tiền
liệt (LNCaP) và ung thƣ vú (MCF-7), trong đó, (±)-pinoresinol (30) thể hiện
khả năng gây độc tế bào mạnh trên dòng ung thƣ phổi Lu1, ung thƣ tuyến tiền
liệt (LNCaP), ung thƣ vú MCF-7, với IC50 từ 0,5-1,7µg/ml.
Gần đây, cây An xoa cũng thu hút sự quan tâm của các nhà khoa học
trong nƣớc. Nhóm tác giả Hồng Ngọc (2015, 2016) đã công bố cặn chiết nƣớc
và cặn chiết methanol từ lá và thân cây An xoa thu hái ở Khánh Hòa, Việt
Nam giàu nhóm chất phenol và flavonoid có tác dụng chống oxy hóa invitro
trên hệ DPPH, ABTS, FRAP [31, 32]. Nhóm tác giả Hữu Duyên (2016) đã
phân lập đƣợc 4 hợp chất từ cặn petroleum ether (PE) cây An xoa thu hái ở

Kiên Giang: lupeol (36), stigmasterol (37), tiliroside (38) và apigenin (39), kết
quả thử nghiệm gây độc tế bào cho thấy: cao chiết PE và cao chiết
dichloromethane (DC) có hoạt tính ức chế tế bào ung thƣ gan HepG 2 với IC50
lần lƣợt là 28,29 và 30,30 µg/ml [33].

Hình 1.6: Một số hợp chất phân lập từ cây An xoa Helicteres hirsuta L. thu
hái ở Kiên Giang (Hữu Duyên, 2016)
Ngoài ra, nhóm tác giả Ngọc Quang (2018) đã phân lập đƣợc 12 hợp
chất từ loài An xoa H.hirsuta thu hái ở Bình Phƣớc bao gồm: 3-Otranscaffeoylbetulinic acid (40), 3b-benzoylbetulinic acid (41), betulinic acid
methyl
ester
(42),
betulinic
acid
(43),
lupeol
(44),
4-hydroxybenzoic acid (45), 3,4-dihydroxybenzoic acid methyl ester


11

(46), 4-hydroxy-3,5-dimethoxybenzoic acid (47), 5,8-dihydroxy-7,40dimethoxyflavone
(48),
isoscutellarein
4’-methyl
ether
8-O-bDglucopyranoside (49), methyl caffeate (50) and stigmasterol (51) [34].

Hình 1.7: Một số hợp chất phân lập từ cây An xoa Helicteres hirsuta L. thu

hái ở Bình Phƣớc (Ngọc Quang, 2018)
Từ tổng quan tài liệu trên đây, chúng ta thấy chi Dó (Helicteres ) có
phong phú các lớp chất giàu hoạt tính sinh học nhƣ: terpenoid, lignan,
polyphenol, flavone, courmarin...trong đó các công trình công bố cho tới nay
về cây An xoa còn khá ít ỏi. Vì vậy, các nghiên cứu sâu rộng hơn nữa là việc
làm cần thiết để chứng minh tác dụng chữa bệnh của loài thực vật này.


12

1.4. CÁC PHƢƠNG PHÁP HÓA LÝ DÙNG ĐỂ PHÂN TÍCH CẤU TRÚC
CÁC HỢP CHẤT THIÊN NHIÊN
1.4.1. Các phƣơng pháp chiết xuất
Phƣơng pháp chiết xuất là bao gồm cả việc chọn dung môi, dụng cụ và
cách chiết. Một phƣơng pháp chiết xuất thích hợp chỉ có thể đƣợc hoạch định
khi biết rõ thành phần của các chất cần biết trong cây ra. Mỗi loại hợp chất có
độ hòa tan khác nhau trong từng loại dung môi. Vì vậy không thể có một
phƣơng pháp chiết xuất chung cho tất cả các dƣợc liệu.
Phƣơng pháp chiết có hai phƣơng pháp chiết:
Phương pháp 1: Phƣơng pháp chiết xuất nhằm mục đích nghiên cứu
sơ bộ khi chƣa biết rõ thành phần hóa học của dƣợc liệu, dùng phƣơng pháp
cổ điển là sử dụng một dãy dung môi từ không phân cực đến phân cực mạnh
để phân đoạn các hợp chất ra khỏi dƣợc liệu. Ví dụ: sử dụng dãy dung môi:
ether dầu, ether, chloroform, cồn và cuối cùng là nƣớc.

Phương pháp 2: Phƣơng pháp chiết xuất khi cần chiết lấy toàn bộ
thành phần trong dƣợc liệu thì dung môi thích hợp nhất methanol hoặc
ethanol (80%). Nhất là methanol đƣợc xem nhƣ là dung môi vạn năng, nó hòa
tan đƣợc chất không phân cực đồng thời cũng có khả năng tạo dây nối hydro
với các nhóm phân cực khác. Dịch chiết với methanol thu đƣợc, đem loại hết

dung môi thu đƣợc cao toàn phần chứa hầu hết hợp chất của dƣợc liệu. Khi
cần tách phân đoạn các hợp chất trong cao thì sử dụng dung môi không hòa
lẫn với nƣớc và có độ phân cực từ yếu đến mạnh. Ví dụ dãy dung môi: ether
dầu, ether, chloroform, ethyl axetate, n-buthanol.
Về cách chiết có hai cách chiết:
Chiết ngâm lạnh: là phƣơng pháp đơn giản nhất và đã có từ thời cổ
xƣa. Sau khi chuẩn bị dƣợc liệu, tiến hành đổ dung môi ngập dƣợc liệu
trong bình chiết xuất, sau một thời gian ngâm nhất định, rút lấy dịch chiết.
Để tăng cƣờng hiệu quả chiết xuất, có thể tiến hành khuấy trộn hoặc rút
dịch chiết ở dƣới rồi đổ lên trên. Có thể ngâm một lần hoặc nhiều lần.
Chiết bằng siêu âm: Sóng siêu âm gây ra sự phá vỡ cấu trúc vật lý
một cách mãnh liệt- gây ra sự khuyếch tán vào trong dung môi của các chất
-


13

cần chiết xuất. Phƣơng pháp siêu âm hiệu quả hơn và nhanh hơn phƣơng
pháp chiết xuất bằng ngâm lạnh nhƣng có nhƣợc điểm là chỉ áp dụng đƣợc
với quy mô nhỏ.
1.4.2. Các phƣơng pháp sắc ký
 Phương pháp sắc ký lớp mỏng (TLC)
Sắc ký lớp mỏng là công cụ đắc lực trong nghiên cứu dƣợc liệu vì đơn
giản, ít tốn thiết bị và dung môi mà lại đạt hiệu quả cao.
Sắc ký lớp mỏng là kỹ thuật tách các chất đƣợc tiến hành khi cho pha
động di chuyển qua pha tĩnh đã đặt sẵn hỗn hợp chất cần phân tích. Pha tĩnh
là chất hấp phụ đƣợc lựa chọn tùy theo yêu cầu phân tích, đƣợc trải mỏng
đồng nhất và đƣợc cố định trên các phiến kính hoặc kim loại. Pha động là một
hệ dung môi đơn hoặc đa thành phần đƣợc trộn với nhau theo tỷ lệ nhất định
tùy theo mục đích cụ thể. Trong quá trình di chuyển qua lớp hấp phụ, các cấu

tử trong hỗn hợp mẫu thử đƣợc di chuyển trên lớp mỏng theo hƣớng pha
động, với những tốc độ khác nhau. Kết quả, thu đƣợc một sắc ký đồ trên lớp
mỏng.
Đại lƣợng đặc trƣng cho mức độ di chuyển của chất phân tích là hệ số
di chuyển Rf đƣợc tính bằng tỷ lệ giữa khoảng dịch chuyển của chất thử và
khoảng dịch chuyển của dung môi (Hình 1.8). Có nhiều yếu tố ảnh hƣởng đến
giá trị Rf.

Hình 1.8: Cách tính giá trị Rf


Các bƣớc trong kỹ thuật sắc ký lớp mỏng (Hình 1.9):

Chuẩn bị bản mỏng: Bản mỏng trƣớc khi dùng phải hoạt hóa trong tủ
sấy và sấy ở 105-110°C trong một giờ. Để nguội và bảo quản trong bình hút
ẩm. Dùng bút chì mềm kẻ bản mỏng. Vạch đƣờng chấm chất phân tích (cách


14

mép dƣới của bản mỏng 1,2 cm), đƣờng giới hạn di chuyển của dung môi
(cách mép trên của bản mỏng 0,8 cm) và đánh dấu vị trí chấm chất (các vết
chấm cách nhau 0,5 cm và cách hai bờ bên của bản mỏng ít nhất 1 cm).

Chấm chất phân tích lên bản mỏng: Dùng ống mao quản hoặc
micropipet chấm chất lên các vị trí đã đánh dấu. Các vết chấm phải nhỏ,
lƣợng chất phải đồng đều, không quá lớn dễ kéo vết hoặc chồng vết, cũng
không quá nhỏ khó hiện vết bằng thuốc thử.
Triển khai sắc ký: Bình triển khai thƣờng là bình thủy tinh, có nắp đậy
kín và đáy phải bằng. Lót giấy lọc xung quanh thành trong của bình. Pha hệ

dung môi với tỷ lệ thích hợp và vừa đủ, rót vào bình triển khai. Lắc rồi để
giấy lọc thấm đều dung môi. Đặt bản mỏng gần nhƣ thẳng đứng với bình triển
khai, các vết chấm phải ở trên bề mặt của lớp dung môi triển khai. Đậy kín
bình và để yên ở nhiệt độ không đổi. Khi dung môi chạy đến đƣờng giới hạn,
lấy bản mỏng ra khỏi bình và sấy khô bản mỏng rồi hiện vết.

Hiện vết trên bản mỏng: Có thể hiện vết bằng cách soi UV (bƣớc sóng
254 và 365 nm) hoặc phun thuốc thử (thuốc thử dùng trong đồ án là
Ce(SO4)2).

Hình 1.9: Các bƣớc tiến hành sắc ký bản mỏng
Hiện nay, chủ yếu sử dụng bản mỏng tráng sẵn silica gel Merck 60 F254,
kích thƣớc 20×20 cm, dày 0,2 mm.


Phương pháp sắc ký cột (CC)

Sắc ký cột là một dạng của sắc ký bản mỏng. Trong sắc ký cột, chất
hấp phụ pha tĩnh đƣợc nhồi trong các ống hình trụ gọi là “cột”. Nhờ vậy mà
có thể triển khai nhiều hệ dung môi khác nhau từ phân cực yếu đến mạnh.
Giống nhƣ sắc ký lớp mỏng, phƣơng pháp này cũng dựa vào độ phân
cực của các chất, những chất có ái lực lớn hơn đối với chất hấp phụ sẽ ra khỏi
cột chậm hơn và những chất có ái lực yếu hơn sẽ ra khỏi cột nhanh hơn trong


15

quá trình sắc ký. Sự tách trong cột xảy ra chủ yếu theo cơ chế hấp phụ hoặc
phân bố tùy theo tính chất của chất đƣợc sử dụng làm cột.


Kỹ thuật sắc ký cột (Hình 1.10):

Chuẩn bị chất hấp phụ và cột: Silicagel phải đƣợc hoạt hóa ở 120°C
trong 4 giờ trƣớc khi đƣa lên cột. Cột sắc ký phải là một khối đồng nhất, phải
thật khô và lắp thẳng đứng trên một giá cố định vững chắc.

Nhồi cột: Chất hấp phụ phải đƣợc phân tán đồng đều trong cột. Có 2
cách nhồi cột: nhồi khô và nhồi ƣớt với dung môi. Sau khi đƣa chất hấp phụ
lên cột, rót dung môi vào cột và để chạy liên tục một thời gian để ổn định cột
và không đƣợc để khô dung môi trong cột.

Đưa chất cần phân tách lên cột: Phải đƣa chất lên cột sao cho chất
phân tán thành một lớp mỏng đồng đều trên mặt cột bằng phẳng. Có nhiều
cách đƣa chất lên cột: phƣơng pháp dùng đĩa giấy, cho thẳng dung dịch chất
cần phân tách lên cột, trộn chất cần phân tách với một lƣợng chất hấp phụ…

Rửa cột: Tùy theo chất hấp phụ dùng và yêu cầu tốc độ chảy của cột
mà áp dụng cách rửa cột bằng áp suất thƣờng hoặc áp xuất nén. Hứng dịch
chảy ra ở đáy cột theo phân đoạn, theo thời gian hoặc bằng ống nghiệm cùng
thể tích.

Hình 1.10: Các bƣớc tiến hành sắc ký cột
1.4.3. Các phƣơng pháp phân tích xác định cấu trúc các chất phân
lập đƣợc
Quá trình xác định cấu trúc của một chất là một quá trình tập hợp và phân
tích các dữ liệu từ nhiều nguồn khác nhau, mỗi nguồn cung cấp một số thông
tin về cấu trúc của chất. Cấu trúc của chất đƣợc xác định phải phù hợp với tất

16

cả các thông tin cấu trúc từ các nguồn trên. Hiện nay, các phƣơng pháp phân
tích cấu trúc hiện đại đã đƣợc sử dụng để xác định cấu trúc gồm có: các
phƣơng pháp phổ hấp thụ nhƣ phổ tử ngoại (UV)/khả kiến (Vis) và phổ hồng
ngoại (IR), các phổ cộng hƣởng từ hạt nhân (NMR), phổ khối lƣợng (MS).
Ngoài ra, sự phát triển và ứng dụng các phƣơng pháp “ghép-nối" giữa sắc kí
lỏng hiệu năng cao (HPLC) với các phƣơng pháp khác nhƣ HPLC-MS,
HPLC-NMR,… đã làm tăng tốc độ và độ nhạy của các phƣơng pháp xác định
cấu trúc.
Phƣơng pháp chung để xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất là
kết hợp giữa việc xác định các thông số vật lý với các phƣơng pháp phổ hiện
đại. Tuy nhiên, phƣơng pháp phổ biến nhất là các phƣơng pháp đo phổ: phổ
hồng ngoại (IR), phổ khối (MS), phổ cộng hƣởng từ hạt nhân 1 chiều và 2
chiều (1H-NMR, 13C-NMR, DEPT, HSQC, HMBC…).
1.4.3.1. Phân tích cấu trúc hợp chất bằng phổ hồng ngoại IR (Infrared
Spectroscopy)
Phƣơng pháp phân tích theo phổ hồng ngoại là một trong những kỹ
thuật phân tích rất hiệu quả, cung cấp thông tin nhanh về cấu trúc phân tử mà
không đòi hỏi các phƣơng pháp tính toán phức tạp. Kỹ thuật này dựa trên
nguyên lí là các phân tử khác nhau sẽ hấp thụ ở các vùng bức xạ khác nhau.
Sau khi hấp thụ các bức xạ hồng ngoại, các phân tử ở trạng thái kích thích sẽ
dao động với nhiều vận tốc dao động và xuất hiện dải phổ hấp thụ gọi là phổ
hấp thụ bức xạ hồng ngoại. Các đám phổ khác nhau có mặt trong phổ hồng
ngoại tƣơng ứng với các nhóm chức đặc trƣng và các liên kết có trong phân
tử.
Các hợp chất hữu cơ hấp thụ bức xạ hồng ngoại ở những tần số trong
vùng từ 10000 đến 100 cm-1 và biến thành năng lƣợng của dao động phân tử.
Sự biến đổi năng lƣợng dao động này luôn đi kèm với sự biến đổi năng lƣợng
quay. Sự hấp thụ này có định lƣợng và biểu hiện thành các dải hấp thụ với

cƣờng độ khác nhau, gọi là phổ hấp thụ bức xạ hồng ngoại (IR). Mỗi loại dao
động hấp thụ ở một tần số hay độ dài sóng xác định, phụ thuộc vào khối
lƣợng tƣơng đối của các nguyên tử, hằng số lực các dây nối và cấu trúc hình