Nghiên cứu phát triển các vector nhị thể ứng dụng trong cải biến di truyền một số loài nấm sợi

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

VŨ XUÂN TẠO

NGHIÊN CỨU PHÁT TRIỂN CÁC VECTOR NHỊ THỂ
ỨNG DỤNG TRONG CẢI BIẾN DI TRUYỀN
MỘT SỐ LOÀI NẤM SỢI

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

HÀ NỘI - 2019


ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

VŨ XUÂN TẠO

NGHIÊN CỨU PHÁT TRIỂN CÁC VECTOR NHỊ THỂ
ỨNG DỤNG TRONG CẢI BIẾN DI TRUYỀN
MỘT SỐ LOÀI NẤM SỢI
CHUYÊN NGÀNH: VI SINH VẬT HỌC
MÃ SỐ

: 9420101.07

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

Ngƣời hƣớng dẫn khoa học:
1. TS. TRẦN VĂN TUẤN

2. PGS.TS. NGUYỄN QUANG HUY

HÀ NỘI – 2019


LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi dƣới sự hƣớng dẫn
của TS. Trần Văn Tuấn và PGS.TS. Nguyễn Quang Huy. Các số liệu, kết quả trình
bày trong luận án là trung thực, một phần đã đƣợc công bố trong các Tạp chí Khoa
học, phần còn lại chƣa từng đƣợc công bố trong bất kỳ công trình nào khác.
Hà Nội, ngày 5 tháng 12 năm 2019
Tác giả luận án

Vũ Xuân Tạo


LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành luận án này, lời đầu tiên tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành
và sâu sắc tới TS. Trần Văn Tuấn, Trƣởng Bộ môn Vi sinh vật học, Khoa Sinh
học, Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQGHN là ngƣời thầy cho tôi cơ hội
đƣợc thực hiện luận án, tận tình hƣớng dẫn, động viên khích lệ và tạo mọi điều kiện
giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện và hoàn thành luận án.
Tôi xin bày tỏ lòng cảm ơn tới PGS.TS. Nguyễn Quang Huy, Trƣởng Khoa
Sinh học, Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQGHN, ngƣời thầy đã tận tình
truyền đạt nhiều kinh nghiệm quý báu, luôn ủng hộ và giúp đỡ tôi trong quá trình
thực hiện luận án.
Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô Bộ môn Vi sinh vật học, Khoa Sinh
học, Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQGHN, đặc biệt là PGS.TS. Bùi Thị
Việt Hà và TS. Phạm Thế Hải đã giảng dạy, truyền đạt cho tôi những kiến thức
mới và luôn luôn tạo mọi điều kiện để tôi có thể hoàn thành đƣợc khóa học này. Tôi

cũng xin gửi lời cảm ơn tới GS.TS. Phan Tuấn Nghĩa, Giám đốc Phòng thí nghiệm
Trọng điểm Công nghệ Enzym và Protein và tập thể cán bộ Phòng Genomic, Phòng
thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Enzym và Protein, Trƣờng Đại học Khoa học Tự
nhiên, ĐHQGHN đã tạo mọi điều kiện để tôi hoàn thành các nghiên cứu.
Để hoàn thành luận án này, tôi đã nhận đƣợc sự hỗ trợ từ đề tài NAFOSTED
(mã số: 106-NN.04-2014.75 và 106.04-2018.36). Tôi luôn trân trọng sự hỗ trợ này.
Tôi xin cảm ơn Ban Giám hiệu, Phòng Sau đại học và Khoa Sinh học,
Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQGHN đã tạo mọi điều kiện thuận lợi cho
tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu tại Trƣờng.
Cuối cùng tôi xin gửi lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè, ngƣời thân những ngƣời luôn luôn ở bên, ủng hộ, động viên, giúp đỡ tôi trong quá trình học tập
và nghiên cứu.
Hà Nội, ngày 5 tháng 12 năm 2019
Tác giả luận án
Vũ Xuân Tạo


MỤC LỤC
MỞ ĐẦU ....................................................................................................................1
Chƣơng 1 TỔNG QUAN CÁC VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU .....................................4
1.1. GIỚI THIỆU CHUNG VỀ NẤM Aspergillus niger, Penicillium chrysogenum
VÀ Penicillium digitatum…………………………………………………………...4
1.1.1. Sơ lƣợc về chi nấm Aspergillus ....................................................................4
1.1.2. Nấm Aspergillus niger ..................................................................................5
1.1.3. Sơ lƣợc về chi nấm Penicillium ....................................................................7
1.1.4. Nấm Penicillium chrysogenum .....................................................................9
1.1.5. Nấm Penicillium digitatum .........................................................................12
1.2. PHƢƠNG PHÁP CHUYỂN GEN VÀO NẤM SỢI THÔNG QUA VI KHUẨN
A. tumefaciens (ATMT) ............................................................................................15
1.2.1. Giới thiệu vi khuẩn A. tumefaciens .............................................................16
1.2.2. Cơ chế chuyển gen bằng vi khuẩn A. tumefaciens ......................................17

1.2.3. Các yếu tố ảnh hƣởng đến hiệu quả chuyển gen vào nấm sợi thông qua vi
khuẩn A. tumefaciens ............................................................................................19
1.2.4. Vector dùng trong chuyển gen bằng vi khuẩn A. tumefaciens ....................20
1.2.5. Marker chọn lọc cho chuyển gen vào nấm thông qua vi khuẩn A.
tumefaciens ............................................................................................................23
1.2.6. Promoter điều hòa biểu hiện gen ở nấm sợi ................................................25
1.2.7. Gen chỉ thị DsRed và GFP dùng trong chuyển gen ở nấm sợi ...................26
1.2.8. Ƣu điểm của phƣơng pháp chuyển gen thông qua vi khuẩn A. tumefaciens
...............................................................................................................................28
1.2.9. Sử dụng phƣơng pháp ATMT trong nghiên cứu chuyển gen ở nấm sợi ....29
1.3. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VỀ GEN laeA Ở NẤM SỢI ..............................32
1.3.1. Protein LaeA và tƣơng tác trong phức hệ protein velvet ở nấm sợi ...........32
1.3.2. Nghiên cứu về vai trò của gen laeA ở nấm sợi ...........................................33
Chƣơng 2 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .............................36


2.1. VẬT LIỆU .........................................................................................................36
2.1.1. Chủng vi sinh vật ........................................................................................36
2.1.2. Các vector sử dụng trong nghiên cứu .........................................................37
2.1.3. Thiết bị và hóa chất .....................................................................................38
2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ......................................................................38
2.2.1. Thu bào tử và hệ sợi nấm ............................................................................39
2.2.2. Đánh giá khả năng mẫn cảm kháng sinh.....................................................40
2.2.3. Tách chiết DNA, RNA và tổng hợp cDNA ................................................40
2.2.4. Tạo các vector nhị thể dùng cho chuyển gen ..............................................41
2.2.5. Tối ƣu quy trình chuyển gen ở nấm A. niger, P. digitatum và P.
chrysogenum thông qua vi khuẩn A. tumefaciens .................................................49
2.2.6. Xóa và phục hồi gen laeA ở các nấm sợi nghiên cứu .................................50
2.2.7. Sàng lọc và xác nhận các thể chuyển gen ...................................................51
2.2.8. Điều tra vai trò của gen laeA ở các loài nấm sợi nghiên cứu ......................52

Chƣơng 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ..............................................................55
3.1. PHÁT TRIỂN HỆ THỐNG CHUYỂN GEN HIỆU QUẢ CAO SỬ DỤNG
MARKER KHÁNG KHÁNG SINH ........................................................................55
3.1.1. Nghiên cứu chuyển gen vào nấm A. niger sử dụng phƣơng pháp ATMT và
marker là gen kháng kháng sinh............................................................................55
3.1.2. Phát triển hệ thống chuyển gen hiệu quả cao ở nấm P. chrysogenum và P.
digitatum sử dụng marker kháng kháng sinh ........................................................57
3.2. PHÁT TRIỂN HỆ THỐNG CHUYỂN GEN SỬ DỤNG MARKER TRỢ
DƢỠNG pyrG Ở A. niger VÀ P. chrysogenum ......................................................68
3.2.1. Tạo thành công chủng A. niger N402 và P. chrysogenum VTCC-F1172 đột
biến khuyết dƣỡng uridine/uracil ..........................................................................68
3.2.2. Xây dựng quy trình chuyển gen tối ƣu vào A. niger và P. chrysogenum
khuyết dƣỡng uridine/uracil ..................................................................................74
3.3. NGHIÊN CỨU VAI TRÒ CỦA GEN laeA Ở A. niger, P. chrysogenum VÀ P.
digitatum....................................................................................................................80


3.3.1. Nghiên cứu vai trò của gen laeA ở A. niger ................................................80
3.3.2. Nghiên cứu vai trò của gen laeA ở P. chrysogenum ...................................94
3.3.3. Nghiên cứu vai trò của gen laeA ở P. digitatum .......................................106
KẾT LUẬN ............................................................................................................117
KIẾN NGHỊ ...........................................................................................................119
DANH MỤC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC CỦA TÁC GIẢ LIÊN QUAN ĐẾN
LUẬN ÁN ...............................................................................................................120
TÀI LIỆU THAM KHẢO ....................................................................................121


DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
5-FOA

5-fluoroorotic acid

A. nidulans

Aspergillus nidulans

A. niger

Aspergillus niger

A. oryzae

Aspergillus oryzae

A. tumefaciens

Agrobacterium tumefaciens

AS

Acetosyringone

ATMT

Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation
(Chuyển gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium
tumefaciens)

CD

Czapek-Dox

cDNA

Complementary deoxyribonucleic acid
(ADN bổ trợ)

DNA

Deoxyribonucleic acid

DsRed

Red fluorescent protein
(Protein huỳnh quang đỏ)

EDTA

Ethylenediaminetetraacetic acid

E. coli

Escherichia coli

FDA

Food and Drug Administration
(Cục Quản lý thực phẩm và dƣợc phẩm Hoa Kỳ)

GFP

Green fluorescent protein
(Protein huỳnh quang xanh)

HEPES

4-(2-hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid

IM

Induction medium (môi trƣờng cảm ứng)

ITS

Internal transcribed spacer

kb

Kilobase pair

LaeA

Loss of aflR-expression A
(Mất biểu hiện aflR)

LB

Luria- Bertani (môi trƣờng LB) /

Left Border (biên trái)
MES

2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid

MM

Minimal medium (môi trƣờng tối thiểu)

ORF

Open reading frame (khung đọc mở)

P. chrysogenum

Penicillium chrysogenum

P. digitatum

Penicillium digitatum

PCR

Polymerase chain reaction
(Phản ứng chuỗi polymerase)

PDA

Potato dextrose agar

PEG

Polyethylen glycol

RB

Right Border (biên phải)

RNA

Ribonucleic acid

SDS

Sodium dodecyl sulfate

S. aureus

Staphylococcus aureus

SM

Synthetic medium
(Môi trƣờng tổng hợp)

ura

Uracil

uri

Uridine

vir

Virulence gene (gen gây bệnh /gen độc lực)

WT

Wild type (chủng tự nhiên)


DANH MỤC BẢNG
Trang
Bảng 2.1. Danh sách các chủng vi sinh vật sử dụng trong nghiên cứu

36

Bảng 2.2. Các vector sử dụng trong nghiên cứu

37

Bảng 3.1. Kết quả xác định số bản sao của gen laeA ở các chủng A. niger

92

biểu hiện quá mức gen laeA


DANH MỤC HÌNH

Trang
Hình 1.1. Một số đại diện thuộc chi nấm Aspergillus

4

Hình 1.2. Hình ảnh hiển vi của A. niger

6

Hình 1.3. Hình thái một số nấm mốc thuộc chi Penicillium

8

Hình 1.4. Hình thái khuẩn lạc P. chrysogenum trên các môi trƣờng

10

Hình 1.5. Hình thái nấm P. digitatum

12

Hình 1.6. Hình thái vi khuẩn A. tumefaciens dƣới kính hiển vi điện tử

17

Hình 1.7. Cơ chế chuyển gen vào vi nấm thông qua vi khuẩn A. tumefaciens

18

Hình 1.8. Mốc thời gian quan trọng về nghiên cứu phát triển vector từ năm

21

1970 đến nay
Hình 1.9. Cấu trúc vector đồng tích hợp

22

Hình 1.10. Mô hình tổng quát về hệ thống vector nhị thể

23

Hình 1.11. Biểu hiện gen GFP ở nấm sợi A. oryzae

27

Hình 1.12. Biểu hiện gen DsRed ở nấm sợi A.oryzae

28

Hình 1.13. Các protein velvet hình thành các phức hệ phân tử và ảnh hƣởng

33

của chúng đến sự phát triển và sản sinh các chất trao đổi bậc hai ở nấm
Hình 2.1. Sơ đồ nghiên cứu

39

Hình 3.1. Chuyển gen vào A. niger thông qua vi khuẩn A. tumefaciens sử

56

dụng marker là gen kháng hygromycin
Hình 3.2. Sơ đồ và kiểm tra vector pPK2-Red, pGreen3 và pPK2-Red2 bằng

58

cắt với enzym giới hạn
Hình 3.3. Quy trình chuyển gen tối ƣu vào nấm P. chrysogenum và P.

60

digitatum
Hình 3.4. Biểu hiện gen huỳnh quang DsRed và GFP ở P. digitatum PdVN1

63

Hình 3.5. Xác nhận biểu hiện gen GFP ở P. chrysogenum VTCC-F1172

64

Hình 3.6. Biểu hiện gen huỳnh quang đỏ DsRed sử dụng marker là gen

65

kháng phleomycin ở P. digitatum PdVN1 và P. chrysogenum VTCC-F1172


Hình 3.7. Sự xâm nhiễm của nấm P. digitatum PdVN1 mang gen DsRed và

67

GFP trên cam dƣới kính hiển vi huỳnh quang
Hình 3.8. Cấu trúc xóa gen pyrG ở A. niger và P. chrysogenum

69

Hình 3.9. Xác nhận các chủng xóa gen pyrG ở A. niger N402

71

Hình 3.10. Khả năng khuyết dƣỡng uridine/uracil và kháng 5-FOA của các

73

chủng P. chrysogenum chuyển gen xóa pyrG
Hình 3.11. Cấu trúc và cắt kiểm tra vector pEX2A bằng enzym giới hạn

75

Hình 3.12. Quy trình chuyển gen hiệu quả cao cho nấm A. niger và P.

78

chrysogenum khuyết dƣỡng uridine/uracil
Hình 3.13. Biểu hiện gen huỳnh quang đỏ DsRed ở chủng A. niger khuyết

79

dƣỡng uridine/uracil
Hình 3.14. Sơ đồ tạo cấu trúc xóa gen laeA ở A. niger

81

Hình 3.15. Xác nhận xóa gen laeA ở A. niger

83

Hình 3.16. Cắt kiểm tra vector phục hồi gen laeA ở A. niger

85

Hình 3.17. Xác nhận phục hồi gen laeA ở A. niger

86

Hình 3.18. Xác nhận biểu hiện quá mức gen laeA ở A. niger

87

Hình 3.19. Sự sinh trƣởng của các chủng A. niger trên các nguồn cacbon

88

Hình 3.20. Sự hình thành bào tử của các chủng A. niger trên các nguồn

89

cacbon

Hình 3.21. Sự sinh trƣởng và hình thành bào tử của các chủng A. niger trên

90

nguồn nitơ là nitrat và amon
Hình 3.22. Khả năng tạo tủa sữa của các chủng A. niger xóa và phục hồi gen

90

laeA
Hình 3.23. Khả năng tạo tủa sữa của các chủng A. niger biểu hiện quá mức

91

gen laeA
Hình 3.24. Biểu hiện của một số gen ở chủng xóa gen laeA so với chủng tự

93

nhiên N402
Hình 3.25. Tạo cấu trúc xóa gen laeA ở P. chrysogenum

94


Hình 3.26. Xác nhận chủng xóa gen laeA bằng PCR

96

Hình 3.27. Xác nhận phục hồi gen laeA ở nấm P. chrysogenum

98

Hình 3.28. Xác nhận biểu hiện quá mức gen laeA ở nấm P. chrysogenum

99

khuyết dƣỡng uridine/uracil
Hình 3.29. Sự hình thành bào tử của các chủng P. chrysogenum trên nguồn

101

nitơ là nitrat và amon
Hình 3.30. Khả năng chịu stress của các chủng P. chrysogenum trên nguồn

103

nitơ là nitrat và amon
Hình 3.31. Sự sinh trƣởng và sinh kháng sinh kháng khuẩn của các chủng P.

104

chrysogenum trên nguồn nitơ là nitrat và amon
Hình 3.32. Khả năng sinh kháng sinh kháng khuẩn của các chủng

P.

106

chrysogenum biểu hiện quá mức gen laeA

Hình 3.33. Sơ đồ tạo vector xóa gen laeA ở nấm sợi P. digitatum

107

Hình 3.34. Sơ đồ tạo vector phục hồi gen laeA ở nấm sợi P. digitatum

108

Hình 3.35. Xác nhận xóa và phục hồi gen laeA ở P. digitatum

110

Hình 3.36. Xác nhận biểu hiện quá mức gen laeA ở P. digitatum

111

Hình 3.37. Sự sinh trƣởng của các chủng P. digitatum trên các nguồn cacbon

112

Hình 3.38. Sự hình thành bào tử của các chủng P. digitatum dƣới sự tác động

113

của D-sorbitol
Hình 3.39. pH dịch nuôi cấy các chủng nấm P. digitatum

114

Hình 3.40. Khả năng gây hỏng cam của các chủng nấm P. digitatum

115

Hình 3.41. Khả năng gây hỏng cam của chủng biểu hiện quá mức gen laeA

116


MỞ ĐẦU
1. TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI
Nấm sợi là những loài mang lại nhiều lợi ích thiết thực cho con ngƣời nhƣ
enzym, protein, chất có hoạt tính sinh học, nhƣng chúng cũng gây ra những thiệt hại
khôn lƣờng nhƣ tàn phá cây trồng, gây hỏng thực phẩm, sinh độc tố, gây bệnh cho
ngƣời và động vật. Các nghiên cứu trên thế giới về nấm sợi đã bƣớc qua nhiều giai
đoạn khác nhau từ những điều tra cơ bản sử dụng các phƣơng pháp truyền thống
cho đến các nghiên cứu hiện đại ở mức độ gen và protein. Nhiều loài nấm có lợi
đƣợc xếp vào diện an toàn đã đƣợc giải trình tự hệ gen hoàn toàn nhƣ Aspergillus
niger và Penicillium chrysogenum. Bên cạnh đó, hệ gen của nấm bệnh thực vật
Penicillium digitatum cũng đã đƣợc giải trình và phân tích. Dữ liệu chi tiết về hệ
gen của nấm sẽ giúp chúng ta có một cái nhìn tổng quát về các gen chịu trách nhiệm
cho sinh tổng hợp các chất, cũng nhƣ các gen giữ những vai trò quan trọng trong
quá trình lây nhiễm của nấm bệnh thực vật.
A. niger là một trong những loài phổ biến và quan trọng nhất về mặt công
nghiệp thuộc chi Aspergillus. Loài nấm này đƣợc sử dụng rộng rãi trong sản xuất
nhiều loại enzym và axit hữu cơ. Gần 99% lƣợng axit citric đƣợc sản xuất trên thế
giới là nhờ A. niger. Trong số những loài nấm đƣợc ứng dụng nhiều trong sản xuất
công nghiệp, P. chrysogenum nổi tiếng với khả năng sinh tổng hợp kháng sinh
penicillin, kháng sinh đầu tiên thuộc họ β-lactam đƣợc phát hiện bởi Alexander
Fleming. Nhiều chủng P. chrysogenum tự nhiên đã đƣợc gây đột biến thành công để
tạo ra các chủng công nghiệp có hiệu suất sinh tổng hợp penicillin rất cao. Tuy

nhiên, năng lực sinh tổng hợp các chất có lợi của các chủng phân lập từ tự nhiên
thƣờng tƣơng đối thấp. Để nâng cấp năng lực cho các chủng tự nhiên, các kỹ thuật
về cải biến chỉnh sửa hệ gen thƣờng đƣợc áp dụng.
Bên cạnh những loài nấm mang lại nhiều lợi ích thiết thực, cũng có nhiều loài
gây hại đặc biệt nghiêm trọng đối với sản xuất nông nghiệp. Nấm P. digitatum là tác
nhân gây hỏng nhiều loại quả có múi ở giai đoạn sau thu hoạch. Loài nấm này tồn

1


tại phổ biến ở các nƣớc nhiệt đới, trong đó có Việt Nam. Bên cạnh việc tấn công
làm hỏng quả, gây tổn thất về kinh tế, các sản phẩm trao đổi chất bậc hai do nấm
sinh ra có thể gây nên những ảnh hƣởng tiêu cực đối với sức khỏe ngƣời tiêu dùng.
Nghiên cứu làm sáng tỏ vai trò của các gen liên quan đến gây bệnh ở vi nấm có thể
góp phần tạo dựng nền tảng phục vụ phát triển các giải pháp hiệu quả nhằm kiểm
soát các vi nấm gây hại.
Để cải biến di truyền vi nấm, nhiều phƣơng pháp chuyển gen đã đƣợc phát
triển nhƣ chuyển gen qua tế bào trần, chuyển gen bằng xung điện và chuyển gen
trung gian qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens. Phƣơng pháp chuyển gen qua
tế bào trần và chuyển gen bằng xung điện có nhiều hạn chế nhƣ kỹ thuật thực hiện
phức tạp, chi phí cao và không ổn định. Trong khi đó, phƣơng pháp chuyển gen nhờ
vi khuẩn A. tumefaciens đƣợc chứng minh là hiệu quả và có tính ổn định cao.
Nghiên cứu phát triển đƣợc các hệ thống chuyển gen mới với hiệu quả cao, chi phí
thấp và có thể sử dụng chung cho nhiều loài nấm sợi là hết sức cần thiết. Hệ thống
chuyển gen là sự kết hợp giữa phƣơng pháp chuyển gen tối ƣu nhờ vi khuẩn A.
tumefaciens và các vector nhị thể mới đƣợc thiết lập sẽ hỗ trợ tích cực cho các
nghiên cứu về cải biến di truyền và điều tra vai trò của các gen quan trọng ở vi nấm.
Từ những lý do trên, đề tài luận án đƣợc tiến hành với tiêu đề: “Nghiên cứu phát
triển các vector nhị thể ứng dụng trong cải biến di truyền một số loài nấm sợi”.
2. MỤC TIÊU CỦA ĐỀ TÀI

- Tạo đƣợc các vector nhị thể mới và thiết lập đƣợc hệ thống chuyển gen tối
ƣu sử dụng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens cho ba loài nấm sợi là Aspergillus
niger, Penicillium chrysogenum và Penicillium digitatum.
- Điều tra đƣợc vai trò của gen laeA ở cả ba loài nấm sợi nghiên cứu nhờ áp
dụng hệ thống chuyển gen tối ƣu đã thiết lập.
3. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
- Tạo các vector nhị thể mang marker kháng kháng sinh, marker trợ dƣỡng
phục vụ chuyển gen vào ba loài nấm sợi (A. niger, P. chrysogenum và P. digitatum)
sử dụng vi khuẩn A. tumefaciens.

2


- Xây dựng hệ thống chuyển gen tối ƣu dựa trên cơ chế kháng kháng sinh và
cơ chế trợ dƣỡng.
- Xóa, phục hồi, biểu hiện quá mức gen laeA và điều tra vai trò của gen laeA
ở cả ba loài nấm sợi.
4. Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI
Đây là công trình đầu tiên phát triển đƣợc các hệ thống chuyển gen tối ƣu
nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens với các vector nhị thể mới để phục vụ cho
nghiên cứu cải biến di truyền ba loài nấm sợi quan trọng là Aspergillus niger,
Penicillium chrysogenum và Penicillium digitatum. Đề tài luận án cũng đã chứng
minh hiệu quả của hệ thống vector nhị thể tạo đƣợc bằng cách áp dụng trực tiếp vào
việc biểu hiện gen, xóa gen ở ba loài nấm sợi khác nhau. Kết quả nghiên cứu của đề
tài cũng cung cấp thêm các dữ liệu mới về vai trò của gen laeA trong điều hòa biệt
hóa tế bào và trao đổi chất ở các loài nấm sợi nghiên cứu.
5. NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN
* Đã tạo thành công 13 vector nhị thể mới dùng cho biểu hiện gen, xóa gen
và bổ trợ gen ở ba loài nấm sợi gồm A. niger, P. chrysogenum và P. digitatum.
* Phát triển thành công hệ thống chuyển gen hiệu quả cao sử dụng vi khuẩn

A. tumefaciens ở ba loài nấm sợi nghiên cứu. Lần đầu tiên, hệ thống chuyển gen
hoàn toàn mới dựa trên cơ chế trợ dƣỡng uridine/uracil đƣợc thiết lập ở nấm sợi A.
niger và P. chrysogenum. Đồng thời, hệ thống chuyển gen sử dụng marker kháng
kháng sinh ở P. chrysogenum và P. digitatum đƣợc tối ƣu và hiệu quả chuyển gen
đạt đƣợc cao hơn từ 10 đến 20 lần so với các nghiên cứu trƣớc đây.
* Xóa, phục hồi và biểu hiện quá mức thành công gen laeA ở ba loài nấm sợi
A. niger, P. chrysogenum và P. digitatum nhờ sử dụng phƣơng pháp chuyển gen
thông qua vi khuẩn A. tumefaciens. Đặc biệt nghiên cứu này đã phát hiện ra các vai
trò hoàn toàn mới của gen laeA liên quan tới biệt hóa hình thái tế bào nấm, trao đổi
chất và kiểm soát khả năng gây hỏng quả sau thu hoạch.

3


Chƣơng 1
TỔNG QUAN CÁC VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU
1.1. GIỚI THIỆU CHUNG VỀ NẤM Aspergillus niger, Penicillium chrysogenum
VÀ Penicillium digitatum
1.1.1. Sơ lƣợc về chi nấm Aspergillus
Chi Aspergillus là một trong những nhóm nấm mốc phổ biến và phân bố
rộng rãi nhất trên hành tinh và đóng vai trò quan trọng trong công nghiệp. Năm
1729, nhà sinh học ngƣời Italia Pier Antonio Micheli đã quan sát cấu tạo cuống sinh
bào tử của một số loài nấm và phát hiện chúng có chung đặc điểm hình thái giống
nhƣ “bình nƣớc thánh”. Từ đó, ông đặt tên chi nấm theo từ Latin spargere [20].

Hình 1.1. Một số đại diện thuộc chi nấm Aspergillus [171]
Về mặt hình thái, khuẩn lạc của các loài thuộc chi Aspergillus có màu sắc đa
dạng, khá đặc trƣng (Hình 1.1). Hệ sợi nấm có vách ngăn, có thể dài tới vài chục
centimet. Các sợi nấm phát triển theo chiều dài từ đỉnh sợi và có thể phân nhánh
liên tiếp tạo ra hệ sợi (mycelium) khí sinh xù xì nhƣ bông. Trên môi trƣờng đặc và

trên một số cơ chất trong tự nhiên, có thể quan sát nấm phát triển thành dạng khuẩn
lạc đặc trƣng. Khuẩn lạc thƣờng mang màu sắc của bào tử. Việc tạo màu sắc cũng là
4


đặc điểm quan trọng để phân loại nấm mốc, có khi chỉ xuất hiện ở khuẩn lạc, có khi
hòa tan vào trong nƣớc và khuếch tán ra môi trƣờng xung quanh [1].
Nấm Aspergillus sinh sản chủ yếu bằng phƣơng thức hình thành bào tử vô
tính. Trong số 250 loài thuộc chi Aspergillus, khoảng 64% chƣa phát hiện có giai
đoạn sinh sản hữu tính. Các loài đƣợc biết có sinh sản hữu tính ít gây bệnh cho con
ngƣời hơn những loài chỉ đƣợc phát hiện sinh sản nhờ bào tử vô tính [61].
Chi Aspergillus đƣợc ứng dụng rộng rãi trong công nghệ sinh học và công
nghiệp. Trong công nghệ sinh học, một số loài thuộc chi Aspergillus đã và đang
đƣợc sử dụng: A. niger, A. oryzae trong sản xuất thực phẩm và enzym. Tuy nhiên,
bên cạnh đó, các loài thuộc chi này cũng gây một số bệnh nhất định cho vật nuôi và
động vật hoang dã. Khả năng phát tán bào tử mạnh mẽ của một vài đại diện trong
không khí, nƣớc, hạt sấy khô và nguyên liệu thực vật khiến chúng thƣờng xuyên có
cơ hội tiếp xúc với động vật. Chúng có thể gây nhiễm trùng cũng nhƣ nhiễm độc.
Một số độc tố đáng lƣu ý ở Aspergillus là aflatoxin, axit cyclopiazonic, glyotoxin,
patulin…[21]. Trong chi Aspergillus, A. niger là loài nấm đƣợc quan tâm nghiên
cứu nhiều nhất.
1.1.2. Nấm Aspergillus niger
1.1.2.1. Phân loại và đặc điểm sinh học của nấm A. niger
Aspergillus niger là một trong những loài phổ biến nhất trong khoảng 250
loài thuộc chi Aspergillus. A. niger đƣợc mô tả vào năm 1867 trong bản thảo
“physiologie des mucédinées” bởi nhà thực vật học ngƣời Pháp Philippe Edouard
Léon van Tieghem. Ông phân lập loài nấm này với mục đích nghiên cứu việc sản
xuất axit gallic từ quá trình lên men của nấm. Khi đó, ông phân lập đƣợc
Penicillium glaucum và Aspergillus sp. có bào tử tƣơng tự Aspergillus glaucus
nhƣng có màu đen trên các môi trƣờng khác nhau, tạo ra mùi mốc và một số đặc

điểm khác. Ông đã đặt tên nó là A. niger [49].
A. niger thuộc giới nấm, ngành Ascomycota, lớp Euascomycetes, bộ
Eurotiales, họ Trichocomaceae, chi Aspergillus, nhóm Aspergillus phân nhóm

5


Nigri, còn gọi là phân nhóm Aspergillus đen. Trong phân nhóm này còn có 14 loài
khác cũng có bào tử màu đen, rất dễ nhầm lẫn với A. niger [87].
Khuẩn lạc của nấm A. niger có màu trắng hoặc vàng, bị che khuất bởi màu
đen của bào tử sinh sản vô tính mọc trên bề mặt. Hệ sợi nấm kéo dài, có vách ngăn
và trong suốt (Hình 1.2). Bào tử đính thƣờng dài từ 900-1600 µm và chứa các bọng
bào tử dài khoảng 40-60 µm [46].

Hình 1.2. Hình ảnh hiển vi của A. niger [80, 136]
A. niger có khả năng sinh trƣởng mạnh mẽ với giới hạn nhiệt rộng từ 6-47°C.
Khoảng nhiệt độ từ 35 tới 37°C là khoảng mà loài nấm này phát triển mạnh mẽ
nhất. Độ ẩm cần thiết cho A. niger so với các loài khác cùng chi lại khá cao, đạt
0,88. Khoảng pH cho nấm phát triển rất rộng, trải dài từ 1,4 tới 9,8. Những đặc
điểm trên giúp cho A. niger có khả năng sinh trƣởng tốt ở nhiều điều kiện khác
nhau, tạo lƣợng lớn bào tử, phát tán dễ dàng trong không khí, có khả năng lây
nhiễm và ức chế nhiều loài nấm khác, đặc biệt là khi ở trong môi trƣờng nóng và
ẩm ƣớt. A. niger sinh sản chủ yếu bằng bào tử vô tính. Chƣa phát hiện thấy giai
đoạn hữu tính tồn tại ở nấm này [148].
A. niger là một vi nấm mô hình quan trọng đối với một số lĩnh vực nghiên
cứu, bao gồm nghiên cứu về quá trình sinh tổng hợp protein, enzym, cơ chế phân tử
và các cơ chế liên quan tới việc kiểm soát đặc điểm hình thái nấm. Kích thƣớc hệ
gen của A. niger đƣợc ƣớc tính có kích thƣớc khoảng 35,5-38,5 Mb, chia thành 8
nhiễm sắc thể/nhóm liên kết có kích thƣớc khác nhau (từ 3,5-6,6 Mb). Hiện tại, có
6

ba dự án khác nhau đang độc lập nghiên cứu về hệ gen của A. niger, thể hiện tầm
quan trọng của vi nấm này. Lƣợng dữ liệu phong phú từ nhiều trình tự gen của A.
niger sẽ đƣợc đƣa vào các chƣơng trình nghiên cứu cơ bản và ứng dụng cho phát
triển quy trình lên men, hình thái và bệnh học [11]. Hiện nay, hệ gen của ba chủng
A. niger khác nhau đã đƣợc giải trình tự là NRRL 3, CBS 513.88 và ATCC 1015.
Hai trong số các chủng đƣợc giải trình tự, NRRL 3 và ATCC 1015 là các chủng
hoang dại, trong khi đó chủng CBS 513.88 là chủng đột biến để nâng cao khả năng
sản xuất glucoamylase [192, 194].
1.1.2.2. Vai trò của nấm A. niger
A. niger đóng vai trò quan trọng không thể phủ nhận trong công nghiệp. Sản
phẩm tiêu biểu của A. niger là axit citric đƣợc sử dụng trong công nghiệp thực phẩm
để tạo đồ uống có ga, nƣớc hoa quả, mứt, kẹo và rƣợu. Axit citric do A. niger sản
xuất có lƣợng lớn nhiều hơn hẳn so với những axit hữu cơ khác, ví dụ nhƣ axit
gluconic [151]. Cục Quản lý Thực phẩm và Dƣợc phẩm Hoa Kỳ (FDA) đã xếp A.
niger là một nguồn tạo axit citric tiềm năng [158]. Ngoài ra, A. niger có khả năng
sản xuất nhiều loại enzym quan trọng nhƣ pectinase cho sản xuất nƣớc quả và rƣợu
để làm giảm độ bột và tăng sự thanh mát, glucose oxidase và catalase để phân giải
các thành phần hƣ hại trong thực phẩm. Một số nghiên cứu gần đây khẳng định khả
năng phân giải các cơ chất mạnh mẽ của A. niger có thể đƣợc ứng dụng trong xử lý
môi trƣờng, bao gồm việc tẩy khoáng cho nƣớc với khả năng hấp thu tới 96,61%
lƣợng ion thừa trong nƣớc và phân giải phốt-pho trong đất trồng dạng đá rắn để làm
tăng năng suất cây trồng [5]. Về phƣơng diện nghiên cứu, A. niger là sinh vật mô
hình có khả năng ứng dụng hiệu quả nhƣ một hệ thống biểu hiện protein ngoại lai.
Cải biến di truyền nấm sợi, bắt đầu từ A. nidulans và sau đó là A. niger đã đạt nhiều
thành tựu, đặc biệt là trong việc biểu hiện phytase công nghiệp [5, 126].
1.1.3. Sơ lƣợc về chi nấm Penicillium
Chi Penicillium thuộc họ Trichocomaceae là một trong những chi nấm rất
phổ biến, phân bố rộng rãi ở nhiều môi trƣờng sống khác nhau trên Trái Đất. Tên

Penicillium xuất phát từ những điểm tƣơng đồng của cuống sinh bào tử nấm này với

7


cây chổi cọ - penicillus trong tiếng La tinh. Cho đến nay, có khoảng 200 loài thuộc
chi Penicillium đã đƣợc mô tả, nhiều loài trong đó đóng vai trò quan trọng trong hệ
sinh thái cũng nhƣ trong cuộc sống của con ngƣời [196].
Khuẩn lạc của các loài nấm mốc thuộc chi Penicillium có dải màu sắc rất đa
dạng, có thể là màu trắng pha trộn với đỏ, cam hoặc vàng; tuy nhiên phần lớn là
dạng khuẩn lạc có màu xanh lục, vàng lục, lục xám, xám và xanh dƣơng (Hình 1.3).
Sau khoảng thời gian nhất định, ở một số loài, khuẩn lạc có thể mất hoàn toàn màu
xanh và ngả sang màu sậm hơn nhƣ nâu vàng, nâu đỏ hay xám xanh [146].
A

C

B

Hình 1.3. Hình thái một số nấm mốc thuộc chi Penicillium
(A) P. tulipae [84], (B) P. sclerotigenum [83], (C) P. solitum [85]

Sợi nấm có vách ngăn, phân nhánh, gần nhƣ không màu, đôi khi quan sát
thấy các sắc tố nhƣ vàng hay đỏ phân bố rải rác trên bề mặt thành tế bào. Mặt khác,
khi nuôi cấy trong môi trƣờng dịch lỏng, sợi nấm có thể mang màu vàng, cam, đỏ,
nâu, tím, xanh hoặc đen [146]. Cơ quan sinh bào tử của các loài thuộc chi
Penicillium là thể bình. Thể bình ở các loài thuộc chi nấm này thƣờng có phần đỉnh
dài hoặc ngắn và thon nhỏ dần phía trên. Các bào tử hình thành chuỗi dài trên đầu
thể bình, hình cầu hoặc gần cầu, trứng hay elip. Khi tồn tại riêng rẽ, các bào tử gần
nhƣ không màu, nhƣng khi tập hợp thành đám, các bào tử mang các màu đặc trƣng

cho loài.
Nhiệt độ sinh trƣởng tối ƣu của các loài thuộc chi nấm này thƣờng trong
khoảng từ 20ºC đến 30ºC. Một số loài nhƣ P. chrysogenum, P. digitatum và P.
italicum sinh trƣởng thích hợp nhất ở nhiệt độ khoảng 25ºC. Trong khi một vài loài
khác có thể tồn tại đƣợc nhiệt độ cao từ 37ºC đến 40ºC hoặc ở nhiệt độ thấp từ 5ºC

8


đến 7ºC. Penicillium có xu hƣớng sinh trƣởng tốt ở môi trƣờng axit hơn so với ở
môi trƣờng kiềm, pH tối ƣu cho sự phát triển của nấm là 5-5,5. Phần lớn các loài
tồn tại đƣợc trong khoảng pH khá rộng từ 3-9. Ngoài ra, một số ít loài nhƣ P.
glabrum vẫn có thể sống sót ở pH nhỏ hơn 2 hay lớn hơn 10 [122].
Penicillium là chi nấm phổ biến và có mặt ở hầu hết các môi trƣờng sống.
Chúng có thể gây ra những ảnh hƣởng nhất định đối với cuộc sống của con ngƣời.
Bên cạnh những tác động tiêu cực nhƣ gây mốc hỏng, thối rữa thực phẩm, sinh độc
tố nấm (mycotoxin), rất nhiều loài thuộc chi này đã đƣợc sử dụng để mang lại
những giá trị to lớn, đặc biệt trong ngành sản xuất thuốc và thực phẩm. Có thể kể
đến, nấm P. roqueforti và P. camemberti đƣợc biết đến rộng rãi nhờ khả năng thủy
phân chất béo và lên men tạo hƣơng vị đặc trƣng cho các loại phô-mát nổi tiếng nhƣ
Camembert, Brie và Roquefort [183]. P. nalgioverse đƣợc sử dụng để làm tăng
hƣơng vị của xúc xích và dăm-bông, đồng thời ngăn chặn sự xâm nhiễm của nấm
mốc và vi khuẩn khác [107]. Bên cạnh đó, cùng với Aspergillus, một vài loài thuộc
chi Penicillium cũng đƣợc coi là nhà máy tế bào sản xuất enzym (pectinase, lipase,
amylase, cellulase…) và các đại phân tử quan trọng (axit gluconic, axit citric, axit
tartaric…). Trong vài năm trở lại đây, Penicillium còn đƣợc chứng minh có tiềm
năng trong xử lý sinh học bởi khả năng phân hủy nhiều dạng hợp chất xenobiotic
[98]. Nhiều loài thuộc chi Penicillium có khả năng sinh tổng hợp kháng sinh. Trong
số đó, P. chrysogenum là loài nổi tiếng nhờ khả năng sinh kháng sinh penicillin, với
nhiều chủng cho hiệu suất sinh tổng hợp cao, góp phần tạo nên tiến bộ mới trong

sản xuất kháng sinh phục vụ y học hiện đại [203].
1.1.4. Nấm Penicillium chrysogenum
1.1.4.1. Phân loại và đặc điểm sinh học của P. chrysogenum
P. chrysogenum là loài nấm mốc thuộc chi Penicillium, họ Trichocomaceae,
phân bố phổ biến ở các vùng ôn đới và cận nhiệt đới. Loài nấm này từng đƣợc mô
tả bởi Dierckx năm 1901 với các tên P. griseoroseum, P. citreoroseum và P.
brunneorubrum [48] và Thom năm 1910 với tên hiện nay là P. chrysogenum [182].
Tuy nhiên sau đó các nghiên cứu về hình thái học, sinh lý học và các sản phẩm trao

9


đổi chất ngoại bào đã chứng minh những loài trên đều là một. Khi đó, tên P.
chrysogenum đang đƣợc sử dụng phổ biến vì vậy đã đƣợc chọn làm tên khoa học
chính thức và đƣợc công nhận bởi Hiệp hội Nấm và Địa y, những tên khác bị xoá
bỏ [112].
Khuẩn lạc nấm P. chrysogenum có kết cấu lì, mịn, mỏng, mang nhiều bào tử,
xuất hiện các rãnh khía sâu và đồng tâm giống hình “bánh xe”. Vùng mép khuẩn lạc
có màu trắng, rộng 1-2 mm. Vùng trung tâm khuẩn lạc có các sợi nấm màu vàng
hoặc vàng kem, bào tử có màu đặc trƣng tùy chủng, thƣờng là xanh vàng, xanh
xám, xanh lục và ngả sang màu sậm hơn sau 2-3 tuần. Ở hầu hết các chủng, các giọt
tiết xuất hiện nhiều, thƣờng có màu vàng và làm biến đổi màu tƣơng ứng ở môi
trƣờng thạch xung quanh khuẩn lạc (Hình 1.4). Cuống bào tử đính có độ dài ngắn
khác nhau, khoảng 150-300 μm với đƣờng kính từ 3,0-3,5 μm, nhẵn, không màu và
phân thành một hoặc nhiều nhánh. Bào tử đính mọc thành chuỗi dài lên tới 200 μm,
phân thành các nhánh dài khoảng 15-25 μm. Bào tử thƣờng có dạng tròn hay elip,
đƣờng kính 2,8-4,0 μm, trơn nhẵn và mang màu đặc trƣng [137].

Hình 1.4. Hình thái khuẩn lạc P. chrysogenum trên các môi trƣờng [208]
A: CYA (Czapek Yeast extract Agar), B: CA (Czapek Agar), C: CYAS (Czapek Yeast

extract Agar Salt), D: PDA (Potato Dextrose Agar) và E: SDA (Sabouraud Dextrose Agar)

P. chrysogenum sinh trƣởng thích hợp nhất ở nhiệt độ 25ºC, độ ẩm cao, hoạt
độ nƣớc khoảng 0,97-0,98, pH 4,5-6,2. Trong đó, độ ẩm hay hoạt độ nƣớc có ảnh
10


hƣởng mạnh mẽ nhất tới sự sinh trƣởng của nấm, sau đó là nhiệt độ. Trái lại, pH
môi trƣờng gần nhƣ không có tác động đáng kể tới sự sinh trƣởng của nấm mốc này
bởi chúng có thể tồn tại trong dải pH khá rộng, khoảng 3-9 [122, 156]. Nhiệt độ
thích hợp cho việc tổng hợp penicillin của nấm P. chrysogenum nằm trong khoảng
23°C-28°C [132].
Đã có nhiều nghiên cứu về nấm P. chrysogenum, tuy nhiên năm 2008 hệ gen
của loài nấm này mới đƣợc giải trình tự toàn bộ và dữ liệu hệ gen đƣợc lƣu trữ tại
Hệ gen nhân có kích
thƣớc 32,19 Mb, gồm 13653 vùng ORF có kích thƣớc tối thiểu 100 axit amin. Hệ
gen ty thể có kích thƣớc 31790 bp với 17 vùng ORF xác định. Các chuỗi mã hóa
protein dự đoán chiếm tỉ lệ 56,6% bộ gen của P. chrysogenum, chiều dài gen trung
bình có kích thƣớc là 1515 bp. Hàm lƣợng GC chiếm 48,9% (52,8% đối với exon,
45,3% đối với intron và 44,4% đối với các vùng liên gen). Trung bình, mỗi gen
chứa 3 exon với 83,5% gen chứa intron, 5329 trong số 12943 protein đƣợc mã hóa
trong nhân đƣợc dự đoán có chức năng [193].
1.1.4.2. Vai trò của nấm P. chrysogenum
Ứng dụng nổi bật nhất của nấm P. chrysogenum là khả năng sinh kháng sinh
penicillin với nhiều chủng cho hiệu suất sinh tổng hợp cao, đặc biệt sau khi đã đƣợc
xử lý đột biến. Kể từ khi phát hiện tình cờ vào năm 1928 của Alexander Fleming về
sự có mặt của một loài nấm màu xanh - đƣợc cho là một chủng thuộc loài
Penicillium notatum có khả năng ức chế sinh trƣởng của tụ cầu khuẩn, P. notatum
trở thành loài vi sinh vật đầu tiên đƣợc sử dụng cho lên men để sản xuất chất kháng
sinh đầu tiên (penicillin), tạo nên bƣớc ngoặt mới trong y học hiện đại. Tuy nhiên

phải đến năm 1941, P. chrysogenum mới đƣợc đặc biệt chú ý bởi phát hiện loài nấm
này cũng cho khả năng sinh penicillin nhƣng với hiệu suất cao hơn nhiều lần so với
loài nấm sinh penicillin do Fleming tìm ra năm 1928 [145]. Từ đó đến nay, P.
chrysogenum đã đƣợc khảo sát tỉ mỉ, nghiên cứu tạo đột biến và sàng lọc để tìm ra
các chủng có khả năng lên men và sinh kháng sinh với sản lƣợng cao. Từ những

11


chủng đầu tiên với năng suất chỉ 60 μg/ml thì đến nay đã đạt tới 85000 μg/ml ở các
chủng đang đƣợc sử dụng trong công nghiệp [178].
Ngoài khả năng sinh kháng sinh penicillin ƣu việt, P. chrysogenum còn đƣợc
biết đến bởi khả năng sinh tổng hợp các sản phẩm trao đổi chất có giá trị nhƣ αamylase [50], lipase [13], polyamine oxidase [144], glucose oxidase [89] và
xanthocillin X [44]. Gần đây, chiết xuất từ sợi nấm P. chrysogenum khô đƣợc
chứng minh có thể hỗ trợ một số cây trồng nhƣ táo, nho, cà chua và hành tây chống
lại các tác nhân gây hƣ hỏng bằng việc kích thích cơ chế phòng vệ của cây, từ đó
giúp cây tránh khỏi các bệnh rụng lá và nấm mốc thông thƣờng [184].
1.1.5. Nấm Penicillium digitatum
1.1.5.1. Phân loại và đặc điểm sinh học của nấm P. digitatum
Nấm P. digitatum gây bệnh mốc xanh trên quả có múi, đƣợc miêu tả và phân
loại bởi Saccardo năm 1881 [153]. Loài này đƣợc xếp vào ngành ascomycota (nấm
túi), ngành phụ Pezizomycotina, lớp Eurotiomycetes, lớp phụ Eurotiomycetidae, bộ
Eurotiales, họ Trichocomaceae và chi Penicillium.

Hình 1.5. Hình thái nấm P. digitatum [15]
A: Nấm P. digitatum gây hỏng cam; B: Nấm P. digitatum sinh trƣởng trên môi trƣờng
PDA; C: Cấu trúc sinh bào tử và bào tử nấm P. digitatum

Nấm P. digitatum phát triển nhanh trên môi trƣờng MEA (malt extract agar)
và PDA, nhƣng lại phát triển chậm trên môi trƣờng CD. Bề mặt khuẩn lạc có màu

xanh ôliu và mặt sau của khuẩn lạc có màu vàng kem hoặc màu nâu nhạt. Mặt trên
khuẩn lạc khá mƣợt mà không có các giọt tiết. P. digitatum có khả năng sinh trƣởng
ở phổ nhiệt độ khá rộng từ 4-30°C, tối ƣu ở nhiệt độ 25-30°C, không sinh trƣởng

12