Luận án tiến sĩ sinh học nghiên cứu chuyển gen cry8db có tính kháng côn trùng vào cây mía

VIỆ

ỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

PHAN THỊ THU HIỀN

NGHIÊN CỨU CHUYỂN GEN cry8Db
T

TR

V

Y

Chuyên ngành: Di truyền học
Mã số: 62 42 01 21

LUẬN ÁN TIẾ SĨ SI

ỌC

Người hướng dẫn khoa học: 1.TS. PHẠM BÍCH NGỌC
i n C ng ngh sinh họ
2. PGS.TS. CHU HOÀNG HÀ
i n C ng ngh sinh họ

I - 2018

LỜI

Đ

Tôi xin cam đoan:
Đây là công trình nghiên cứu của tôi và một số kết quả cùng cộng tác với các
cộng sự khác;
Các số liệu và kết quả đƣợc trình bày trong luận án là trung thực, một phần đã
đƣợc công bố trên các tạp chí khoa học chuyên ngành với sự đồng ý và cho phép
của các đồng tác giả;
Phần còn lại chƣa đƣợc ai công bố trong bất kì công trình nào khác.
Hà Nội, ngày tháng năm 2018
Tác giả

Phan Thị Thu Hiền

i


LỜI CẢ

Ơ

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS. Phạm Bích Ngọc và PGS.TS Chu
Hoàng Hà đã tận tình hƣớng dẫn, động viên và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực
hiện luận án.
Xin chân thành cảm ơn Ban Lãnh đạo Viện Công nghệ sinh học, các cán bộ
Phòng Quản lý tổng hợp, bộ phận Quản lý đào tạo sau đại học đã tạo mọi điều kiện
thuận lợi để tôi hoàn thành luận án.
Tôi xin cảm ơn Ban giám hiệu, Ban Chủ nhiệm Khoa Sinh-KTNN, Phòng Tổ

chức cán bộ, Phòng khoa học và công nghệ và Hợp tác quốc tế, phòng Sau Đại học,
Phòng tài vụ trƣờng Đại học Sƣ Phạm Hà Nội 2 đã tạo điều kiện giúp đỡ tôi về mọi
mặt trong suốt quá trình thực hiện nghiên cứu này.
Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến GS.TS Lê Trần Bình, TS Đ
Xuân Đồng, ThS Lê Thu Ngọc, ThS Hồ Th Thƣơng, ThS Nguy n Thu

iang

Phòng ông nghệ tế bào thực vật, Viện Công nghệ sinh học đã tạo điều kiện giúp
đỡ và đóng góp những ý kiến quý báu để tôi hoàn thành đề tài này. Trong thời gian
thực hiện đề tài, tôi cũng nhận đƣợc sự giúp đỡ tận tình của tập thể cán bộ Phòng
Công nghệ tế bào thực vật, Phòng ông nghệ ADN ứng dụng và Phòng Th nghiệm
trọng điểm ông nghệ gen, Viện

ông nghệ sinh học Tôi xin chân thành cảm ơn

mọi ngƣời đã tận tình chỉ bảo trong suốt quá trình tôi thực hiện luận án.
Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình, ngƣời thân, các đồng
nghiệp, những ngƣời đã luôn động viên và góp ý cho tôi trong thời gian vừa qua.
Hà Nội, ngày

tháng năm 2018

Nghiên cứu sinh

Phan Thị Thu Hiền

ii

MỤC LỤC

Ở ĐẦU .......................................................................................................... 1
1 T nh cấp thiết của đề tài ................................................................................ 1
2 Mục tiêu nghiên cứu ...................................................................................... 2
3 Nội dung nghiên cứu ..................................................................................... 2
4. Ý nghĩa lý luận và thực ti n .......................................................................... 3
5 Đóng góp mới của luận án ............................................................................ 3
ƯƠ

1: TỔ
YM

1.1.

V

QU

T I IỆU........................................................ 4

N TR N H

M

.................................................. 4

1 1 1 Nguồn gốc và v tr phân loại .......................................................... 4
1 1 2 Đặc điểm hình thái, sinh thái và di truyền ...................................... 5
113

iá tr của cây m a và tình hình sản xuất m a đƣờng ..................... 7

1 1 4 Bọ hung hại m a và biện pháp phòng trừ ..................................... 10
1.2. ỨN

N

M

B NĐ

N N H S NH H

TRON

H NT O

Y

N ............................................................................. 13

1 2 1 Hệ thống nuôi cấy in vitro của cây m a ....................................... 13
122

ác nghiên cứu tạo cây m a chuyển gen ....................................... 21
NH M

1.3. C

N BACILLUS THURINGIENSIS (BT

T

N TR N ........................................................................................ 26
1 3 1 Nguồn gen kháng côn trùng của Bt ............................................... 26
132

ơ chế gây độc của các độc tố Bt lên sâu hại ............................... 27

1.3.3. Nhóm gen cry8 và đặc t nh kháng bọ hung gây hại cây trồng ..... 28
ƯƠ

2: VẬT IỆU V P ƯƠ

P

P

IÊ

ỨU ............. 36

2.1. VẬT L U N H ÊN ỨU ..................................................................... 36
211

ác giống m a ............................................................................... 36

2 1 2 Vector và chủng khuẩn ................................................................. 36

iii


213

ặp mồi sử dụng ........................................................................... 37

2.1.4. Hóa chất và thiết b máy móc ....................................................... 37
2 1 5 Đ a điểm và thời gian nghiên cứu ................................................. 37
2.2. PHƢƠN PH P N H ÊN ỨU............................................................ 38
2 2 1 Biểu hiện protein độc tố

ry8 b trong vi khuẩn E.coli

Rossetta amy- B và thử hoạt t nh kháng ấu trùng L. signata
Fabricius ...................................................................................... 39
2 2 2 Thiết kế vector chuyển gen vào cây m a ....................................... 42
2 2 3 Thiết lập hệ thống tái sinh in vitro ở cây m a ............................... 43
2 2 4 Xây dựng và tối ƣu quy trình chuyển gen vào cây m a thông
qua chuyển gen gus ..................................................................... 45
2.2.5. Phƣơng pháp tạo cây m a mang gen cry8Db thông qua A.
tumefaciens................................................................................... 48
2 2 6 Kiểm tra sự có mặt của gen chuyển trong cây chuyển gen bằng
phản ứng P R .............................................................................. 48
2 2 7 Phân t ch sự t ch lũy protein ry8 b tái tổ hợp trong các dòng
m a mang gen chuyển bằng kĩ thuật L S ............................... 48
2 2 8 Phƣơng pháp Western blot ............................................................ 49
2 2 9 Thử nghiệm sinh học đánh giá khả n ng kháng ấu trùng L.
signata abricius của các dòng m a chuyển gen ........................ 49
CHƯƠ

3:

ẾT QUẢ

3.1. B ỂU H N PROT N

IÊ

ỨU ................................................... 51

ry8Db TRON

V

ROSSETTA GAMY B VÀ THỬ HO T T NH

KHUẨN E.COLI
T ẤU TRÙNG L.

SIGNATA FABRICIUS ............................................................................ 51
3 1 1 Thiết kế vector biểu hiện p T -21a (+) mang gen cry8Db ........... 51
3 1 2 Biểu hiện gen cry8Db trong tế bào E.coli Rossetta Gamy B ....... 52

iv


3 1 3 Tối ƣu sự biểu hiện gen cry8Db trong vi khuẩn E.coli Rossetta
gamy B .......................................................................................... 53
3.1.4. Tinh sạch và kiểm tra bằng Western Blot protein tái tổ hợp

Cry8Db .......................................................................................... 54
3 1 5 Đánh giá tình hình phân bố của L. signata abricius thu đƣợc
ở vùng nguyên liệu m a Sơn Nam, Tuyên Quang ........................ 56
3 1 6 Đánh giá hoạt lực kháng ấu trùng L. signata Fabricius của
protein ry8 b tái tổ hợp ............................................................. 57
3.2 TH T K V

TOR HUYỂN

N cry8Db VÀO CÂY MÍA ........... 59

3 2 1 Thiết kế vector pB 121/35S/cry8 b/NOST ................................. 59
3 2 2 Thiết kế vector p

MB

1300/ aMV35S/cry8 b/NOST ........ 61

3.3. TH T LẬP H THỐN TÁI SINH IN VITRO Ở

YM

............... 63

3 3 1 Sự tái sinh in vitro qua chồi đỉnh .................................................. 63
3 3 2 Sự tái sinh in vitro qua chồi nách .................................................. 65
3 3 3 Sự tái sinh chồi in vitro trực tiếp từ cuộn lá non .......................... 67
3 3 4 Sự tái sinh chồi in vitro thông qua phôi soma cây m a ............. 72
3.4. TỐ ƢU QUY TR NH HUYỂN

NV O

YM

...................... 80

3 4 1 Quy trình chuyển gen gus in vitro vào cây mía ............................ 80
3 4 2 Quy trình chuyển gen gus ex vitro vào cây mía ............................ 86
3.5. Đ NH

KHẢ NĂN
ÒN M

KH N

B ỂU H N

ẤU TR N

B

HUN

Ủ

N cry8Db ........................................ 91

3.5.1. Kết quả chuyển gen cry8Db vào cây m a trong điều kiện in vitro ...... 91
3.5.2. Kết quả chuyển gen cry8Db vào cây m a trong điều kiện ex vitro...... 96
3.5.3. Western blot .................................................................................. 99

3 5 4 Đánh giá khả n ng kháng ấu trùng L. signata abricius của các
dòng m a chuyển gen .................................................................. 100

v


ƯƠ

4: B

UẬ

ẾT QUẢ ....................................................... 104

4.1. B ỂU H N PROT N ĐỘ

TỐ Cry8Db TRONG E.COLI

ROSETTA GAMY B VÀ THỬ HO T T NH KH N

ẤU

TRÙNG L. SIGNATA FABRICIUS .................................................... 104
4.2. X Y ỰN H THỐN T I SINH IN VITRO MÍA......................... 105
4.3. TỐ ƢU H

H

VITRO V O

QUY TR NH HUYỂN
ỐN

M

RO 22 TH N

N IN VITRO VÀ EX
QU

V KHUẨN A.

TUMEFACIENS .................................................................................... 111
4.4 T O

ÒN

M

B ỂU H N PROT N Cry8Db THEO

QUY TR NH HUYỂN

N IN VITRO VÀ EX VITRO Đ ĐƢ

TỐ ƢU HO ....................................................................................... 115
4.5. W ST RN BLOT V
KHẢ NĂN

KH N

ÒN M
ẾT UẬ V

THỬ N H M S NH H

Đ NH

ẤU TR N

BR

HUYỂN

IẾ

L. SIGNATA

US Ở

N cry8Db ......................................... 117

Ị .................................................................... 119

ẾT UẬ .................................................................................................. 119
Ữ
QU
T

TRÌ

Ủ

T

IẢ ĐÃ

BỐ LIÊN

ĐẾ ĐỀ T I ................................................................................... 120
TẮT UẬ

T I IỆU T

BẰ

TIẾ

........................................... 121

Ả .......................................................................... 134

PHỤ LỤC

vi


DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
ghĩa đầy đủ

Ký hiệu, chữ viết tắt
2,4 –D

2,4 – Dichlorophenoxyacetic acid

A. tumefaciens

Agrobacterium tumefaciens

BAP

6 – Benzylaminopurine

bp

base pair

Bt

Bacillus thuringiensis

Cry

Crystal -endotoxin

CTAB

Hexadecyltrimethyl ammonium bromide

Cyt

Cytolysin

dNTP

Deoxyribo nucleotide triphotphate

Đtg, et al.,

Đồng tác giả

E.coli

Escherichia coli

ELISA

Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay

FAO

Food and Agriculture Organization (Tổ chức Liên
Hợp Quốc về lƣơng thực và nông nghiệp)

GM

Genetically Modified

Gus

β –Glucuronidase gene

Ha

Hecta

HPR

Horseradish Peroxidase

IBA

Indol -3- butyric acid

CaMV35S

Cauliflower Mosaic Virus

IgG

Immunoglobulin G

IPTG

sopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside

Kb

Kilo base

KDa

Kilo Dalton

Kinetin

6 – fufuryl amino purin

Mg

Miligam

mg/L; mg/mL; ng/g

Miligam/l t; miligam/mililit; nanogam/gam

vii


Môi trƣờng LB

Môi trƣờng Luria và Bertani

MS

Môi trƣờng theo Murashige và Skoog

NAA

α – Napthyl acetic acid

NOS

Nopaline synthase gene

NST

Nhi m sắc thể

OD

Optical Density

PCR

Polymerase Chain Reaction

PEG

Polyethylene Glycol

Picloram

4 – amino – 3,5,6 tricloro pyridine – 2- carboxylic acid

RNase

Ribonuclease

scFv

single-chain variable fragment

S. barberi

Saccharum barberi

S. edule

Saccharum edule

S. officinarum

Saccharum officinarum

S. robustum

Saccharum robustum

S. sinense

Saccharum sinense

S. spontaneum

Saccharum spontaneum

SDS

Sodium dodecyl sulfate

SDS-PAGE

Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel
electrophoresis

TAE

Tris Acetate EDTA

Taq ADN polymerase

Thermus aquaticus ADN polymerase

TDZ

Thidiazuron

TMB

3,3‟, 5,5‟-Tetramethylbenzidine

Vip

Vegetative Insecticidal Protein

X – gluc

5- bromo-4-chloro-3-indolyl glucuronide

viii


DANH MỤC BẢNG BIỂU
Bảng 1.1:

Đặc điểm di truyền của các loài m a là tổ tiên của các giống m a
thƣơng mại ngày nay ............................................................................. 7

Bảng 1.2:

iện t ch, n ng suất, sản lƣợng của m a trên thế giới n m 2013, 2014 ...... 9

Bảng 1.3:

Tình hình sản xuất m a ở Việt Nam n m 2009 – 2014 ....................... 10

Bảng 1.4:

Một số công trình nghiên cứu tái sinh in vitro ở cây m a (2001 – 2015) ...... 19

Bảng 1.5:

Một số kết quả tạo cây m a chuyển gen (1992 – 2015) ...................... 21

Bảng 2.1:

ác cặp mồi đƣợc sử dụng trong nghiên cứu ...................................... 37

Bảng 3.1:

ác đặc điểm của ấu trùng L. signata Fabricius thu thập đƣợc ở
Sơn ƣơng, Tuyên Quang .................................................................. 57

Bảng 3.2:

iá tr L

50

khi bổ sung protein ry8 b vào thức n của ấu trùng

L. signata Fabricius (sau 14 ngày ...................................................... 58
Bảng 3.3:

Khả n ng tái sinh và số chồi hình thành của các giống m a trên
các môi trƣờng khác nhau từ chồi đỉnh ............................................... 64

Bảng 3.4:

Khả n ng tái sinh và số chồi hình thành của các giống m a trên
các môi trƣờng khác nhau từ chồi nách .............................................. 66

Bảng 3.5:

Khả n ng tái sinh từ cuộn lá non và số chồi hình thành trung bình
của các giống m a trên các môi trƣờng khác nhau .............................. 69

Bảng 3.6:

Tỷ lệ tạo mô sẹo của 3 giống m a trên môi trƣờng MS có bổ
sung 2,4 -D ......................................................................................... 72

Bảng 3.7:

Ảnh hƣởng của nồng độ 2,4– tới sự hình thành phôi soma từ mô
sẹo của các giống m a sau 2 tuần nuôi cấy.......................................... 74

Bảng 3.8:

Ảnh hƣởng của tổ hợp k ch th ch sinh trƣởng B P và kinetin đến
tỷ lệ tái sinh tạo đa chồi từ phôi soma của các giống m a ................... 75

Bảng 3.9:

Ảnh hƣởng của tổ hợp chất k ch th ch sinh trƣởng BAP và kinetin
lên số lƣợng chồi hình thành (số chồi/0,5 g cụm phôi soma ch n
của các giống m a ................................................................................ 76

Bảng 3.10: Ảnh hƣởng của N

đến khả n ng ra r ............................................ 77

ix


Bảng 3.11: Khả n ng tái sinh từ cụm phôi soma giống m a RO 22 trên môi
trƣờng tái sinh bổ sung hygromycin.................................................... 81
Bảng 3.12: Ảnh hƣởng của nồng độ hygromycin đến khả n ng tái sinh exvitro của giống m a RO 22 trong điều kiện tƣới................................ 86
Bảng 3.13: Ảnh hƣởng của nồng độ hygromycin đến khả n ng sống sót của

giống m a RO 22 trong điều kiện phun ex vitro ................................ 87
Bảng 3.14: Hiệu quả chuyển gen trong điều kiện ex vitro thông qua A.
tumefaciens giống m a RO 22 ........................................................... 89
Bảng 3.15: Kết quả chuyển cấu trúc p

MB 1300/ aMV35S/cry8 b/NOST vào

giống m a RO 22 thông qua A. tumefaciens trong điều kiện in vitro ............ 92
Bảng 3.16: Kết quả chuyển cấu trúc p

MB 1300/ aMV35S/cry8 b/NOST vào

giống m a RO 22 thông qua A. tumefaciens trong điều kiện ex vitro............ 96
Bảng 3.17: Đánh giá khả n ng tác động của m a chuyển gen biểu hiện protein
ry8 b đến sự phát triển của ấu trùng (sau 14 ngày khảo sát ở
nhà lƣới ............................................................................................ 103

x


DANH MỤC HÌNH Ả

ĐỒ T Ị

Hình 1.1:

ác loài m a tổ tiên của các giống m a thƣơng mại ngày nay ............ 4

Hình 1.2:

Sơ đồ hệ thống nuôi cấy in vitro ở m a ............................................. 15

Hình 1.3:

Sự tái sinh trực tiếp các cơ quan của cây m a ................................... 16

Hình 1.4:

Quá trình tái sinh in vitro thông qua phôi soma ở cây m a ............... 18

Hình 1.5:

Mô hình phƣơng thức hoạt động của nội độc tố ry ........................ 28

Hình 1.6:

Sơ đồ phát sinh chủng loại của protein ry8 đƣợc phân lập từ Bt
chủng Q52-7 ...................................................................................... 31

Hình 1.7:
nh 1.8:

ấu trúc 3- của protein có ba vùng độc của protein ry8 b ......... 33
Hình thái loài L. signata abricius ở hai giai đoạn thu thập đƣợc
ở vùng m a Sơn Nam, Sơn ƣơng, Tuyên Quang ............................ 35

Hình 2.1:

Sơ đồ tổng quát quá trình nghiên cứu ............................................... 38

Hình 3.1:

Thiết kế vector biểu hiện p T -21a/cry8Db...................................... 51

Hình 3.2:

Biểu hiện protein ry8 b tái tổ hợp ................................................. 52

Hình 3.3:

Kết quả tối ƣu sự biểu hiện của protein ry8 b tái tổ hợp .............. 54

Hình 3.4:

Đánh giá protein ry8 b tinh sạch bằng điện di S S-PAGE và
Western blot ...................................................................................... 55

Hình 3.5:

Khảo sát sơ bộ mức độ phá hại m a của ấu trùng L. signata Fabricius
vùng nguyên liệu m a Sơn Nam, Sơn ƣơng, Tuyên Quang ................ 56

Hình 3.6:

Ấu trùng L. signata Fabricius hại m a............................................... 57

Hình 3.7:

Ấu trùng L. signata Fabricius chết sau 14 ngày cho n thức n
nhân tạo có bổ sung protein ry8 b ................................................ 58

Hình 3.8:

Sơ đồ thiết

kế

vector

chuyển

gen

p

MB

1300/P-

35S/cry8Db/T-35S ............................................................................. 59
Hình 3.9:

Hình ảnh điện di các sản phẩm cắt ghép tạo vector
pBI121/35S/cry8Db/NOST ................................................................. 60

Hình 3.10.

Hình

ảnh

điện

di

kết

quả

thiết

kế

vector

pCAMBIA1300/35S/cry8Db/NOST ................................................. 61

xi


Hình 3.11:

Quá trình tái sinh chồi trực tiếp in vitro từ chồi đỉnh cây m a .......... 64

Hình 3.12:

Quá trình tái sinh chồi in vitro trực tiếp từ chồi nách cây m a ......... 66

Hình 3.13:

Quá trình tái sinh chồi in vitro trực tiếp từ cuộn lá non .................... 70

nh 3.14:

Hiện tƣợng r mọc ƣu thế so với sự tái sinh chồi khi nuôi cấy
mảnh cắt cuộn lá non ở m a ............................................................. 71

Hình 3.15:

ác dạng mô sẹo khác nhau thu đƣợc sau khi nuôi cấy ................... 73

Hình 3.16:

Tái sinh tạo đa chồi từ cụm phôi soma ............................................. 75

Hình 3.17:

Kết quả tạo r cây m a in vitro .......................................................... 77

Hình 3.18:

Tái sinh cây mía in vitro qua các giai đoạn khác nhau ..................... 79

Bảng 3.11:

Khả n ng tái sinh từ cụm phôi soma giống m a RO 22 trên môi
trƣờng tái sinh bổ sung hygromycin ................................................. 81

Hình 3.20:

Biểu đồ phân t ch ảnh hƣởng của mật độ vi khuẩn (O 600 nm ,
nồng độ cetosyringone đến hiệu quả chuyển gen vào giống m a
ROC22............................................................................................... 83

nh 3.21:

Biểu đồ phân t ch ảnh hƣởng thời gian lây nhi m đến hiệu quả
chuyển gen vào giống m a RO 22 ................................................... 84

Hình 3.22:

Quá trình biểu hiện gen gus các giai đoạn tái sinh m a in vitro
khác nhau .......................................................................................... 84

Hình 3.23:

Sơ đồ các bƣớc chuyển gen in vitro vào giống m a RO 22 thông
qua vi khuẩn A. tumefaciens ............................................................. 85

Hình 3.24:

Quá trình chuyển gen gus trong điều kiện ex vitro thông qua A.
tumefaciens ........................................................................................ 88

Hình 3.25:

Kiểm tra cây chuyển gen gus ............................................................ 89

Hình 3.26:

Sơ đồ các bƣớc chuyển gen ex vitro vào giống m a RO 22
thông qua vi khuẩn A. tumefaciens ................................................... 91

Hình 3.27:

Quá trình tái sinh các dòng m a chuyển gen cry8Db thông qua
A. tumefaciens trong điều kiện in vitro ............................................. 92

Hình 3.28:

Hình ảnh điện di kiểm tra một số dòng m a chuyển gen cry8Db
bằng kĩ thuật P R trên gel agarose 0,8%.......................................... 93

xii


Hình 3.29:

Kết quả L S

đ nh lƣợng tƣơng đối sự biểu hiện của protein

ry8 b của các dòng m a chuyển gen trong điều kiện in vitro........ 95
Hình 3.30:

ác dòng m a mang gen chuyển cry8Db trong điều kiện ex vitro
trồng ở nhà lƣới ................................................................................. 96

Hình 3.31:

Kết quả điện di sản phẩm P R kiểm tra sự có mặt của gen
cry8Db các dòng m a chuyển gen trong điều kiện ex vitro............... 97

Hình 3.32:

Kết quả L S

đ nh lƣợng tƣơng đối sự biểu hiện của protein

ry8 b của các dòng m a chuyển gen ex vitro ................................ 98
nh 3.33:

Sự biểu hiện của protein

ry8 b trong một số dòng m a

chuyển gen ........................................................................................ 99
nh 3.34:

Kết quả thử nghiệm sinh học kiểm tra tính kháng ấu trùng L.
signata abricius của các dòng m a trong điều kiện nhà lƣới sau
14 ngày ............................................................................................ 101

nh 3.35:

Biểu đồ đánh giá khả n ng kháng ấu trùng L. signata
abricius của các dòng m a chuyển gen cry8Db (sau 14 ngày
trong điều kiện nhà lƣới ............................................................... 102

xiii

1

MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết của đề tài
Cây mía (Saccharum officinarum L.) là một trong những cây công nghiệp
đƣợc trồng rộng rãi nhất trên thế giới (Dotaniya, Datta, 2014; Choudhary et al., 2017)
đƣợc canh tác ở 109 quốc gia với diện tích 26,9 triệu ha, sản lƣợng đạt 1,91 tỷ tấn
(Factfish, 2015)

ây m a đƣợc sử dụng vào nhiều mục đ ch: cung cấp thực phẩm:

sucrose, fructose, mật m a; làm sợi: cung cấp vật liệu cenlullose, thức n gia súc: lá,
thân đã đƣợc ép đƣờng; tạo n ng lƣợng: n ng lƣợng sinh học tái tạo từ rỉ đƣờng…;
công nghiệp hóa chất: ethanol sinh học, chất mùn (Dotaniya et al., 2016). Việc cải
thiện các đặc t nh nông sinh học ở cây m a đã đƣợc nghiên cứu trong những n m qua
nhằm t ng trữ lƣợng đƣờng, t ng khả n ng chống ch u các điều kiện stress nhƣ: hạn
hán, ngập, mặn, kháng sâu hại, thuốc diệt cỏ, nấm gây bệnh… Tuy nhiên do một số
đặc thù của cây m a nhƣ: k ch thƣớc hệ gen lớn (985 Mbp), bộ nhi m sắc thể phức
tạp (2n

70-140 , và sự tƣơng tác phức tạp của cây mía với các điều kiện môi trƣờng

(Zhang et al., 2012)… khiến cho thời gian để tạo ra một giống mía mới theo phƣơng
pháp truyền thống lên tới 10-12 n m Kỹ thuật chuyển gen có thể xem là phƣơng
pháp tối ƣu nhất để tạo ra giống mía mới trong thời gian ngắn nhất.
ây m a đƣợc biết là vật chủ của hơn 1500 loài côn trùng và 80 bệnh hại,
trong đó đặc biệt gây hại trên diện rộng và khó kiểm soát là các loài bọ cánh cứng
(bọ hung, xén tóc

, sâu đục thân, rệp

nhƣng phần lớn chúng thƣờng b giới hạn

bởi sự phân bố đ a lý. Tuy nhiên, hiện nay sự phát triển của du l ch, thƣơng mại
giữa các nƣớc cùng với thay đổi điều kiện khí hậu làm t ng nguy cơ sâu bệnh hại
xâm nhập và bùng phát trong nhiều hệ thống nông nghiệp, trong đó sâu bệnh gây
hại trên mía ngày càng khó kiểm soát. Khả n ng th ch ứng của một số loài gây hại
và xâm nhập vào các khu vực trồng mía rất nhanh, gây thiệt hại đặc biệt nghiêm
trọng. ôn trùng bọ cánh cứng ảnh hƣởng xấu đến n ng suất cây mía vì chúng phá
hoại m a ở giai đoạn ấu trùng và trƣởng thành
Các nghiên cứu tạo cây chuyển gen biểu hiện protein độc tố diệt côn trùng gây
hại của Bt đã phát triển trên khắp thế giới từ n m 1996. Việc tạo ra cây trồng biến đổi


2
gen là bƣớc đột phá nhằm: (i): giảm thiểu tác hại của thuốc trừ sâu hóa học, (ii): t ng
cƣờng hiệu quả, t nh đặc hiệu trong diệt trừ sâu đ ch; (iii): giảm chi phí, ít ảnh hƣởng
tới môi trƣờng, sức khỏe con ngƣời và các loài sinh vật khác (James, 2014).
Ở Việt Nam, cây m a cũng là một trong số các cây trồng ch u sự phá hoại lớn
từ côn trùng thuộc Bộ cánh cứng trong đó có họ bọ hung Scarabaeidae. Ấu trùng bọ
hung thƣờng đục thân, phá hoại r , còn giai đoạn trƣởng thành chúng n các bộ
phận nhƣ thân, lá cây m a Sự phá hại do bọ hung gây ra có thể làm chết cây hoặc
giảm đáng kể n ng suất cây m a (Shu et al., 2009a). Kết quả nghiên cứu cho thấy,
không có giống mía nào hệ gen tự nhiên mang gen biểu hiện t nh kháng côn trùng
gây hại (James, 2014). Vì vậy, việc tạo giống m a chuyển gen có khả n ng kháng
côn trùng nói chung và bọ hung nói riêng đang là vấn đề cấp thiết hiện nay Nhóm
protein ry8 là một trong những nhóm protein độc tố Bt đƣợc mã hóa bởi các gen
thuộc họ cry8 đã đƣợc chứng minh có độc t nh với ấu trùng của bọ cánh cứng trong

đó có bọ hung (Zhang et al., 2013).
ho đến nay, cây mía chuyển gen chủ yếu đƣợc tạo ra nhờ sử dụng hai
phƣơng pháp ch nh là súng bắn gen và chuyển gen đ ch thông qua A. tumefaciens.
Với điều kiện thực tế ở Việt Nam, sử dụng A. tumefaciens để chuyển gen thực vật là
phƣơng pháp đơn giản và mang lại hiệu quả cao Xuất phát từ cơ sở khoa học và
thực ti n, chúng tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu hu n g n r D
kháng

n tr ng v o

t nh

m ”.

2. Mục tiêu nghiên cứu
Tạo đƣợc các dòng m a chuyển gen cry8Db có hoạt t nh kháng ấu trùng bọ
hung hại m a
3. Nội dung nghiên cứu
1. Đánh giá thiệt hại bọ hung gây ra trên mía và thử hoạt tính kháng ấu trùng loài
bọ hung điển hình của Cry8Db tái tổ hợp.
2. Thiết kế vector chuyển gen thực vật pCAMBIA1300 chứa gen chuyển cry8Db.
3. Xây dựng hệ thống tái sinh in vitro hiệu quả ở cây m a
4. Tối ƣu hóa quy trình chuyển gen in vitro và ex vitro thông qua A. tumefaciens.
5. Đánh giá khả n ng kháng ấu trùng bọ hung của các dòng mía biểu hiện
gen cry8Db.


3
4. Ý nghĩa lý luận và thực tiễn
Kết quả đạt đƣợc của luận án có giá tr khoa học và thực ti n trong tiếp cận

nghiên cứu t ng cƣờng khả n ng kháng bọ hung hại m a bằng kỹ thuật chuyển gen
thông qua A. tumefaciens.
4.1.Ý nghĩ lý luận
Kết quả nghiên cứu của đề tài cung cấp cơ sở khoa học cho việc nghiên cứu
và thực nghiệm tạo giống mía kháng bọ hung bằng chuyển gen Bt.
4.2. Ý nghĩ thực tiễn
1. Tạo đƣợc protein tái tổ hợp Cry8Db quy mô phòng thí nghiệm thông qua
vi khuẩn E.coli Rosetta -

amy B, chứng minh đƣợc protein tinh sạch có khả n ng

kháng ấu trùng Lepidiota signata abricius – một loài thuộc họ bọ hung hại m a thu
đƣợc ở Sơn Nam, Sơn ƣơng, Tuyên Quang.
2. Tạo đƣợc các dòng mía chuyển gen cry8Db có khả n ng biểu hiện độc tố có
tính kháng ấu trùng bọ hung thu thập đƣợc ở Sơn Nam, Sơn ƣơng, Tuyên Quang
Kết quả này là cơ sở khoa học vững chắc cho hƣớng nghiên cứu ứng dụng kỹ
thuật chuyển gen nhằm nâng cao khả n ng kháng côn trùng gây hại ở cây m a, mở
ra triển vọng ứng dụng mới trong thực ti n tạo giống m a kháng côn trùng hại m a
5. Đóng góp mới của luận án
1. Đã chứng minh đƣợc protein ry8 b k ch thƣớc phân tử khoảng 73 K a
có khả n ng diệt ấu trùng Lepidiota signata Fabricius ở các giai đoạn khác nhau.
Đối với ấu trùng tuổi 1, nồng độ gây chết 50% số cá thể là LC50 = 183,5 ng/g, ấu
trùng tuổi 2 LC50 = 270,8 ng/g và ấu trùng tuổi 3 nồng độ này ở ngƣỡng cao nhất
với giá tr LC50 = 345,4 ng/g.
2. Đây là công trình đầu tiên sử dụng song song 2 quy trình chuyển gen vào
cây m a (trong điều kiện in vitro và ex vitro để tạo ra các dòng mía chuyển gen
cry8Db. ông trình đã tạo đƣợc 13 dòng m a chuyển gen cry8Db. Protein Cry8Db ở
các dòng mía chuyển gen đã đƣợc kiểm tra bằng phản ứng ELISA cho thấy nồng độ
protein tái tổ hợp ở các dòng mía chuyển gen dao động từ 1.62 - 21,73 ng/µg
protein tổng số. Thử nghiệm sinh học cho thấy dòng m a chuyển gen S3 có khả

n ng kháng ấu trùng Lepidiota signata abricius tốt nhất với tỷ lệ b phá hại thấp
(12,91% , khối lƣợng ấu trùng b giảm 2,85 lần sau 14 ngày.


4

ƯƠ

1

TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1.

Y

V

TR

ẠI

1.1.1. guồn gốc và vị trí phân loại
Cây mía (Saccharum officinarum Linn.) trồng hiện nay thuộc chi Saccharum,
họ Gramineae, lớp một lá mầm (Monocotyledoneae), ngành thực vật hạt kín
(Magnoliophyta) (Đ N ng V nh, 2006).
Việc phân loại cây mía gặp rất nhiều vấn đề phức tạp, vì ngoài chi
Saccharum còn có các chi khác thuộc cùng một nhóm giao phấn gọi là „„phức hợp
Saccharum” bao gồm: Erianthus, Ripidium, Miscanthus, Diandra, Narenga và
Sclerostachya (Office of Gene Technology Regulator, 2011).
Chi Saccharum gồm có sáu loài khác nhau: S. barberi L., S. edule L., S.

officinarum L., S. robustum L., S. sinense L., và S. spontaneum L. Trong số này, S.
officinarum L. (loài đƣợc thuần hóa để canh tác và cung cấp đƣờng) và S. spontaneum
L. (loài hoang dại với bộ NST thể d bội đƣợc cho là tổ tiên của mía trồng ngày nay
(Sandhu et al., 2012). Các giống m a thƣơng mại ngày nay là con lai giữa S.
officinarum L. (chiếm 80 – 90% hệ gen) và S. spontaneum L. (chiếm 10–20% hệ gen)
(Hoarau et al., 2002) (Hình 1.1).

Hình 1.1: C c loài mía tổ ti n của c c giống mía th

ng mại ngày nay

A: Loài S. officinarum L.; B: loài S. spontaneum L.
(Nguồn: Aditya, Jitendra, 2014)


5
Loài S. spontaneum L. đƣợc phân bố rộng rãi ở các vùng nhiệt đới đến cận
nhiệt đới ở châu

và châu Phi, có môi trƣờng sống đa dạng Đây là một loài trong

tự nhiên có hình thái biến đổi, có thể rậm ngắn hoặc cao lớn (có thể cao tới 5 m
Hầu hết loài S. spontaneum L có lá và cuống lá mỏng, hàm lƣợng đƣờng thấp, và tỷ
lệ xơ cao (Aditya, Jitendra, 2014)

ác ngành công nghiệp m a đƣờng trên thế giới

đã thuần hóa và phát triển các giống m a thuộc loài S. officinarum L , đặc trƣng của
loài này là hàm lƣợng đƣờng cao, lƣợng xơ thấp, dày cuống và lá rộng và có nguồn
gốc từ New uinea hoặc Melanesian (Grivet et al., 1996).

1.1.2. Đặc điểm h nh th i sinh th i và di truyền
Đặc điểm hình thái
M a là cây một lá mầm, thân thảo Thân m a là nguyên liệu chế biến đƣờng
và làm giống cho vụ sau Trên biểu bì thân m a có chứa nhiều chlorophin và
xantophin hợp thành màu sắc đặc trƣng của từng giống m a

iữa các dóng thân là

các đốt m a chứa bốn bộ phận gồm đai sinh trƣởng, r , chồi bên và sẹo lá
Trên thân có các bẹ lá bao bọc, lá mọc thành hai hàng so le, đối nhau hoặc
theo đƣờng vòng trên thân m a Là thực vật thuộc nhóm 4, lá m a dài 1-2 m, rộng
5 -7 cm (Taparia et al., 2012) Lá m a có hai bộ phận ch nh: phiến lá và bẹ lá

h

tiếp giáp giữa bẹ lá và phiến lá gọi là cổ lá, thƣờng thì khi cây phát triển đến lá thật
thứ 12 -15, mới đạt đến độ to và chiều dài tiêu chuẩn tƣơng ứng với m i giống
Ngoài ra, còn có lớp phấn và lông nơi bẹ lá
M a thuộc loại r chùm R m a nói chung đƣợc chia thành hai loại: r sơ cấp
và r thứ cấp R sơ cấp còn gọi là r tạm thời, là loại r mọc từ hom giống hoặc hạt
giống, đây là loại r đƣờng k nh bé, phân nhánh nhiều, t n sâu, chỉ đảm bảo nuôi
cây đến khoảng 4-7 tuần đầu R thứ cấp còn gọi là r vĩnh cửu, xuất hiện khi cây
con có từ 3-5 lá thật Loại này tồn tại lâu hơn và n sâu hơn trong đất và có ba dạng
(r hấp thu, r

n sâu và r chống đổ , m i dạng có vai trò khác nhau trong việc

cung cấp chất dinh dƣỡng và đảm bảo sự sinh tồn của cây m a khi có điều kiện bất
lợi về thời tiết xảy ra (Trần V n Sỏi, 2003)
Khi kết thúc thời kỳ sinh trƣởng, cây m a sẽ chuyển sang giai đoạn sinh thực

(ra hoa Mầm hoa đƣợc hình thành từ đỉnh sinh trƣởng và đƣợc bao bọc bởi chiếc


6
lá cuối cùng của bộ lá (lá đòng Bông hoa m a gồm trục ch nh và các nhánh cấp 1,
cấp 2, có chứa nhiều hoa nhỏ Hoa m a lƣỡng t nh, có ba nh đực và một bầu noãn,
quá trình thụ tinh đƣợc tiến hành nhƣ cây thuộc họ Hòa thảo khác (lúa, ngô… Hạt
m a rất bé, k ch thƣớc khoảng 1-1,25 mm, chỉ nặng 0,15 – 0,25 mg, hình thoi, bên
trong có chứa albumin, tinh bột và phôi mầm Trong công tác cải tạo giống m a, lai
hữu t nh là một phƣơng pháp truyền thống đã đƣợc áp dụng (Trần V n Sỏi, 2003 .
Đặc điểm sinh thái
M a thuộc nhóm thực vật

4 th ch nghi với kh hậu vùng nhiệt đới và cận

nhiệt đới Nhiệt độ tối th ch cho phát triển của m a là từ 30-34o

Nếu trên 38oC thì

sự sinh trƣởng của m a b đình trệ vì quá trình đồng hóa cao hơn d hóa

òn nhiệt

độ thấp dƣới 0o kéo dài, cây m a sẽ b chết và đông nhựa Tuy nhiên, nhiệt độ tối
th ch cho việc phát triển cây m a còn tùy thuộc vào từng giai đoạn phát triển và bản
chất giống Trong thân cây m a, nƣớc chiếm tỷ lệ 70% Tùy từng thời kỳ sinh
trƣởng, cây m a th ch nghi với độ ẩm nhất đ nh Thời kì đẻ nhánh, m a tiêu hao
nƣớc nhiều hơn, độ ẩm th ch hợp tối đa trong đất là 55–70% Thời kì vƣơn lóng,
cây m a đòi hỏi tiêu hao nƣớc nhiều nhất (60-80% Đến thời kỳ t ch lũy đƣờng, yêu
cầu nƣớc giảm xuống và độ ẩm tối th ch trong đất chỉ còn 50-60%. Đất phù hợp để

trồng m a là đất cát pha, đất th t nhẹ và trung bình, trong đất có chất hữu cơ, chất mùn
Độ pH

5,5-7,5, không b nhi m mặn (Trần V n Sỏi, 2003 .
Đặc điểm di truyền
Bộ gen của cây m a hiện nay đƣợc cho là phức tạp nhất trong tất cả các loài

cây trồng và đƣợc hình thành từ những loài đa bội thuộc chi m a Số lƣợng nhi m
sắc thể của các loài m a hiện nay biến đổi từ 36 đến 200 (Office of Gene
Technology Regulator, 2011) Trong khi đó, Zhang và đtg (2012 cho rằng hai loài
S. officinarum L có số lƣợng NST 2n
NST 2n

70–140 và S. spontaneum L có số lƣợng

40–128 (Bảng 1 1 . Bộ nhi m sắc thể của các loài thuộc chi Saccharum

không chỉ đa bội cùng loài autopolyploid (mang hơn hai bộ nhi m sắc thể đồng hợp từ
một loài mà còn đa bội khác loài allopolyploid (mang hai hoặc hơn hai bộ nhi m sắc
thể từ các loài khác nhau, vì vậy hệ gen m a rất phức tạp

ây m a có bộ nhi m sắc thể


7
cơ bản là x

6; x

8 hoặc x

10 Sự biến động số lƣợng nhi m sắc thể ở m a do các

nguyên nhân sau: (i lai giữa các loài; (ii một số dòng có tần số biến d số lƣợng
nhi m sắc thể lớn trong quá trình phân bào giảm nhi m; (iii biến d tế bào soma
xảy ra trong quá trình nhân giống vô t nh hoặc do sự xâm nhi m của gen từ loài này
sang loài khác (Đ N ng V nh, 2006 . Hai loài S. officinarum L. và S. spontaneum L
có số lƣợng nhi m sắc thể khác nhau, lai với nhau để tạo nên các giống m a thƣơng
mại ngày nay Trong đó loài S. officinarum L. có k ch thƣớc bộ gen lớn hơn (985
Mbp (Bảng 1 1
Bảng 1.1: Đặc điểm di truyền của các loài mía là tổ tiên
của các giống mía th
Chi/ Loài

ng mại ngày nay

Số lượng
Nồng độ
Đặ đi m ph n loại
nhiễm sắ
đường
th (2n)

S. officinarum L. Loài lai

Cao

70–140

S. spontaneum L. Loài hoang dã

Thấp

40–128

h
thướ
Tá giả
h g n
(Mbp)
985 Zhang et al., 2012
843

Zhang et al., 2012

Các loài mía trồng và mía hoang dại nói chung đều có khả n ng nhân giống
hữu tính bằng hạt và nhân giống vô t nh

ác đặc tính này ở mía có liên quan mật

thiết với di truyền nhi m sắc thể. Nhân giống hữu tính cho phép lai chéo giữa các
loài, tạo ra con lai, sau đó tiến hành nhân giống vô tính bảo tồn các đặc tính sau lai
(Đ N ng V nh, 2006).
1.1.3.

i trị của cây mía và t nh h nh sản xuất mía đ ờng
Giá trị kinh tế
Cây mía hiện nay là nguyên liệu để sản xuất ra 80% sản lƣợng đƣờng

sucrose trên thế giới (Dotaniya et al.,2016). Lƣợng đƣờng bình quân đầu ngƣời sử

dụng đƣờng từ 10 – 12 kg/n m và dự kiến sẽ t ng trong những n m tới.
Cây mía với thành phần sinh hóa phong phú nên ngày càng đƣợc các ngành
công nghiệp quan tâm khai thác, chủ yếu là sản xuất đƣờng sucrose

ây m a còn cung

cấp nguyên liệu để sản xuất ethanol sinh học, góp phần phát triển n ng lƣợng sinh học
thay thế cho nguồn n ng lƣợng hóa thạch đang ngày càng cạn kiệt. Xenlulose trong bã


8
mía là nguyên liệu rẻ đƣợc ứng dụng để sản xuất bột giấy, g ép, có thể làm sợi nhân
tạo trong công nghiệp dệt. Công nghiệp hóa chất sử dụng đƣờng thông qua các phản
ứng hóa học để tạo ra các chất nhƣ: sobitol, manitol, glixerol, phenol
formandehit…Mật rỉ qua quá trình lên men, chƣng cất đã tạo nên rƣợu, cồn công
nghiệp, acid lactic, acid xitric, men thực phẩm, men thức n gia súc Nhƣ vậy, cây m a
là cây trồng có giá tr cao Hơn nữa, mía là một trong những cây cao sản, chỉ số diện
tích lá của mía rất lớn, gấp 6 -7 lần diện t ch đất M a có hiệu quả quang hợp cao, nếu
ch m bón tốt có thể cung cấp 200 – 250 tấn sinh khối/ha/n m – n ng suất kỉ lục mà cây
trồng khác không đạt đƣợc Vì vậy, nếu tận dụng hết đƣợc các nguồn lợi mà cây mía
đem lại, thì sẽ mang lợi ích gấp 2 – 3 lần so với cây trồng khác (Pippo, Luengo, 2013).
Tình hình sản xuất mía đường trên thế giới và Việt Nam
Mía là cây công nghiệp phân bố khá rộng, thích nghi tốt ở các vùng nhiệt
đới và cận nhiệt đới, đƣợc thu hoạch sản lƣợng lớn nhất so với các cây trồng khác
trên toàn cầu ( Hơn 100 quốc gia đang trồng và phát triển
các giống m a thƣơng mại có n ng suất cao, đứng đầu thế giới về sản xuất mía có
ba nƣớc: Brazil, Ấn Độ và Trung Quốc. M i n m có hơn 1,5 tỷ tấn m a đƣợc thu
hoạch và chế biến. Việc mở rộng sản xuất mía ở Brazil đã làm cho sản lƣợng mía
toàn thế giới t ng gấp đôi trong 25 n m qua Sự mở rộng này đã tạo ra một xu thế
t ng lƣợng đƣờng tiêu thụ toàn cầu m i n m 2% một cách bền vững. Theo thống

kê của

O n m 2013, tổng sản lƣợng thu hoạch toàn cầu đạt lần lƣợt 1,9 tỷ tấn.

Trong đó, tổng sản lƣợng m a đƣờng chủ yếu tập trung ở châu Mỹ với xấp xỉ 1,04
tỷ tấn/n m, trong đó, Brazil là nƣớc có sản lƣợng m a đƣờng cao nhất thế giới đạt
xấp xỉ 768,1 triệu tấn/n m và n ng suất là 75,34 tấn/ ha. Châu Á đứng thứ hai trên
thế giới về tổng sản lƣợng m a, ƣớc t nh đạt xấp xỉ 747,1 triệu tấn (Bảng 1 2 trong đó
có hai nƣớc là Ấn Độ và Trung Quốc đại lục là các nƣớc sản xuất m a đƣờng mạnh thứ
hai, thứ ba thế giới, sản lƣợng lần lƣợt đạt 341,2 triệu tấn/n m và 128,2 triệu tấn/n m
hâu Phi và hâu Đại dƣơng đạt mức sản lƣợng khá cao (97,4 và 29,1 triệu tấn/n m
N ng suất m a đƣờng ở các châu lục tƣơng đối đồng đều. Ở châu Âu, diện tích canh tác
mía chỉ 64 ha, sản lƣợng đạt xấp xỉ 5,5 nghìn tấn/n m, tuy không mở rộng diện tích


9
nhƣng n m suất đạt cao nhất trong tất cả các châu lục (85,16 tấn/ha , cao hơn với mức
trung bình chung của n ng suất toàn thế giới (Bảng 1.2).
Bảng 1.2: Diện tích năng suất, sản l ợng của mía trên thế giới năm 2013, 2014
hu vự

Năm Di n t h (h )

Năng suất (tấn/h ) Sản lượng (tấn/năm)

2013

26 942 686

70,94

1 911 179 776

2014

27 124 723

69,50

1 884 246 253

2013

1 559 132

62,49

97 423 114

2014

1 483 157

64,41

95 531 379

2013

13 968 445

74,28

1 037 591 125

2014

14 182 849

71,05

1 007 714 796

2013

11 033 670

67,71

747 075 443

2014

11 032 298

67,84

748 405 113

2013

64

85,16

5 450

2014

73

81,04

5 885

hâu Đại

2013

381 375

76,26

29 084 644

dƣơng

2014

426 346

76,44

32 589 079

Toàn thế giới

Châu Phi

hâu Mỹ
Châu Á

Châu Âu

(Nguồn: faostat.fao.org, c p nh t 08 2017)
N m 2014, diện t ch, n ng suất và sản lƣợng của m a trên thế giới có thay đổi
ụ thể diện t ch canh tác toàn thế giới t ng so với 2013, đạt xấp xỉ 27,12 triệu ha, tuy
nhiên do n ng suất chỉ đạt 69,50 tấn/ha nên sản lƣợng toàn thế giới đạt xấp xỉ 1,88 tỷ
tấn, thấp hơn so với sản lƣợng n m 2013

hâu Mỹ và châu

vẫn tiếp tục là các châu

lục dẫn đầu về sản xuất m a trên thế giới, sản lƣợng đạt lần lƣợt xấp xỉ 1 tỷ tấn, 0,75 tỷ
tấn, không chênh lệch nhiều so với sản lƣợng n m 2013
châu Phi b sụt giảm đáng kể so với 2013

iện t ch và sản lƣợng m a ở

hâu u và châu Đại ƣơng đều t ng diện

t ch canh tác và n ng suất m a, tuy vậy hai châu lục này vẫn chƣa phát triển đƣợc cây
m a thành cây công nghiệp chủ lực, cụ thể diện t ch canh tác m a còn rất thấp, châu u:
73 ha, châu Đại ƣơng: 426,35 nghìn ha (Bảng 1 2
M a là cây trồng phù hợp với điều kiện sinh thái ở nƣớc ta nên thích nghi đƣợc với
nhiều vùng, miền. Chính phủ Việt Nam đã ban hành quyết đ nh số 26/2007/QĐTTg về


10
“Quy hoạch phát triển mía đường đến năm 2010 và định hướng đến năm 2020” đã có
quan điểm rõ ràng nhằm khuyến khích các thành phần kinh tế đầu tƣ phát triển m a đƣờng,
gắn lợi ích giữa nhà chế biến và ngƣời sản xuất nguyên liệu, thúc đẩy xây dựng nông thôn
mới Đây ch nh là tiền đề để các vùng miền trong nƣớc đẩy mạnh sản xuất nhằm t ng n ng
suất và sản lƣợng cây mía, cải thiện kinh tế.
Bảng 1.3: Tình hình sản xuất mía ở Việt Nam năm 2009 – 2014
Năm

Di n t h (ha)

Năng suất (tấn/h ) Sản lượng (tấn/năm)

2009

265 600

58,77

15 608 300

2010

269 100

60,06

16 161 700

2011

282 254

62,14

17 539 572

2012

297 500

64,03

19 040 799

2013

310 264

64,88

20 131 089

2014

304 969

64,99

19 822 851

(Nguồn: faostat.fao.org, c p nh t 08 2017)
Theo số liệu chính thức của FAO, trong những n m gần đây Việt Nam đã
phát triển diện t ch canh tác m a Đặc biệt, diện tích canh tác n m 2013, 2014 đã
t ng lên rất nhiều so với n m n m trƣớc đây đạt 310,2 nghìn ha. Sản lƣợng m a n m
2009 chỉ đạt 15,6 nghìn tấn, chỉ sau 05 n m, đã đạt xấp xỉ 20,1 nghìn tấn N ng suất
n m 2009 chỉ đạt 58,77 tấn/ha. Nhờ các biện pháp cải tiến giống, cải tiến kỹ thuật,
chống sâu bệnh, n ng suất n m 2013, 2014 đã đạt lần lƣợt xấp xỉ 64,88 tấn/ha;
64,99 tấn/ha (Bảng 1.3). Dự kiến trong các niên vụ tiếp theo, Việt Nam sẽ đẩy mạnh
sản xuất loại cây trồng cao sản này.
1.1.4. Bọ hung hại mía và biện ph p phòng trừ
Tình hình nghiên cứu về bọ hung
Trên toàn thế giới, bọ hung là một trong những côn trùng phá hoại mạnh nhất
trong nông nghiệp và lâm nghiệp đặc biệt là châu u và châu , ấu trùng của chúng
phá hại thực vật và làm giảm n ng suất đáng kể (Liu et al., 2010). Ở Trung Quốc,
Holotrichia parallela và Anomala corpulenta là hai loài thuộc họ bọ hung gây hại
nghiêm trọng cho sản xuất nông nghiệp trên các đối tƣợng cây trồng nhƣ lạc, đậu


11
tƣơng, khoai tây, cỏ ch n nuôi và m a (Luo et al., 2008), làm giảm 15 – 20% n ng

suất trung bình m i n m Bọ hung hại m a đã làm giảm 39% n ng suất mía ở USA
(faostat.fao.org).
Trên thế giới đã phát hiện đƣợc hơn 300 000 loài thuộc Bộ cánh cứng Coleoptera,
chiếm tới 40% các loài côn trùng và khoảng 30% các loài động vật đã biết. Họ bọ hung
Scarabaeidae có khoảng 27.800 loài thuộc 600 giống và chia thành 13 phân họ đã đƣợc
phát hiện ( Ở vùng Đông phƣơng và
lân cận, có nhiều công trình nghiên cứu về họ bọ hung (Arrow, 1931; Ttot, 2003;
Chandra, Gupta, 2013).
Ở nƣớc ta, số liệu thu đƣợc hầu hết chỉ ghi nhận ở các đ a danh các miền
hoặc là chỉ đến các tỉnh

ựa trên các tài liệu của Sakai và Nagai (1998 đã thống kê

đƣợc ở Việt Nam đã có 423 loài thuộc họ bọ hung Scarabaeidae đƣợc công bố và
theo đánh giá thì số loài chƣa đƣợc phát hiện còn rất nhiều
Theo Phạm Th Vƣợng và đtg (2011 , thành phần sâu hại m a đƣợc ghi nhận
gồm 26 loài thuộc 8 bộ côn trùng Trong đó có bộ cánh cứng (Coleoptera có số loài
nhiều nhất là 13 loài, chiếm 50% tổng số loài gây hại m a Về tần suất xuất hiện và
gây hại ngoài hiện trƣờng sản xuất, bọ hung là một trong những đối tƣợng gây hại
nghiêm trọng trong đất, làm giảm n ng suất tại nhiều vùng m a trọng điểm Bọ hung
gây hại nặng trên các nhóm thuộc giống m a RO

đƣợc trồng trên đất có thành

phần cơ giới nhẹ và m a trồng lƣu gốc lâu n m.
Lê Quang Khải và đtg (2017 đã sử dụng ba biện pháp ch nh để diệt trừ loài
bọ hung hại m a Lepidiota signata Fabricius: thuốc Regent 0,3 ; thuốc

iazan

10H, chế phẩm nấm Metarhizium anisopliae. Kết quả cho thấy hiệu quả diệt trừ
Lepidiota signata Fabricius hại m a bằng thuốc Regent 0,3 đạt cao nhất 38,4% sau
một tháng xử lý, thời gian hiệu lực nhanh Tuy vậy, nhƣợc điểm của thuốc hoá học
là sau 6 tháng không còn hiệu lực trừ sâu

hế phẩm sinh học từ nấm Metarhizium

anisopliae kéo dài hiệu lực diệt ấu trùng này nhƣng hiệu quả thấp hơn sử dụng
thuốc hóa học, chỉ đạt 26,7%
Bọ hung hại mía thuộc họ bọ hung (Scarabaeidae), bộ Cánh cứng (Coleoptera).
Ở Việt Nam, đã xác nhận có khoảng 10 loài bọ hung gây hại bao gồm bọ hung đen