Luận án tiến sĩ sinh học sàng lọc và nghiên cứu ảnh hưởng của đột biến điểm trên peptide tín hiệu đến khả năng tiết α amylase tái tổ hợp trong bacillus subtilis

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

NGUYỄN THỊ ĐÀ

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

SÀNG LỌC VÀ NGHIÊN CỨU ẢNH HƢỞNG CỦA
ĐỘT BIẾN ĐIỂM TRÊN PEPTIDE TÍN HIỆU ĐẾN KHẢ
NĂNG TIẾT α – AMYLASE TÁI TỔ HỢP TRONG
BACILLUS SUBTILIS

Hà Nội, 2017


VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

NGUYỄN THỊ ĐÀ

SÀNG LỌC VÀ NGHIÊN CỨU ẢNH HƢỞNG CỦA
ĐỘT BIẾN ĐIỂM TRÊN PEPTIDE TÍN HIỆU ĐẾN
KHẢ NĂNG TIẾT α – AMYLASE TÁI TỔ HỢP TRONG
BACILLUS SUBTILIS

Chuyên ngành: Vi sinh vật học
Mã số: 62 42 01 07

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: PGS.TS. Trần Đình Mấn
Viện Công nghệ sinh học

Hà Nội, 2017


i

Lời cảm ơn
Trƣớc tiên, tôi xin gửi lời biết ơn chân thành và sâu sắc nhất tới PGS.TS Trần
Đình Mấn, Phòng Công nghệ vật liệu sinh học, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn
lâm KH&CN Việt Nam đã tận tình hƣớng dẫn và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình
nghiên cứu.
Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới TS.Nguyễn Kim Thoa cùng toàn thể các anh
chị và các bạn đồng nghiệp phòng Công nghệ vật liệu sinh học đã động viên, giúp đỡ
và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình nghiên cứu đề tài này.
Tôi xin trân trọng gửi lời cảm ơn tới Ban lãnh đạo Viện công nghệ sinh học,
các anh chị phòng Vi sinh vật đất, phòng Công nghệ lên men, Trung tâm bảo tàng
giống, phòng Vi sinh phân tử và ThS. Bùi Thị Hải Hà đã giúp đỡ, hợp tác và tạo mọi
điều kiện thuận lợi để tôi hoàn thành luận án này.
Đây là công trình đƣợc thực hiện nhờ sự hỗ trợ kinh phí của đề tài “Nghiên cứu
sản xuất enzyme -amylase bền nhiệt tái tổ hợp ứng dụng trong công nghiệp dệt”
thuộc Đề án Phát triển và Ứng dụng CNSH trong công nghiệp chế biến, Mã số:
CNSHCB/2010-5 và đề tài cán bộ trẻ của Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt
Nam:“Nghiên cứu ảnh hưởng của trình tự peptide tín hiệu lên khả năng tiết  amylaza ngoại bào ở Bacillus”.
Cuối cùng, tôi vô cùng biết ơn gia đình và bạn bè, những ngƣời luôn bên tôi,
quan tâm, động viên, tạo mọi điều kiện và giúp đỡ tôi trong những lúc khó khăn nhất
trong suốt thời gian học tập và nghiên cứu để tôi có thể hoàn thành nhiệm vụ đƣợc
giao.

Hà Nội, ngày 16 tháng 01 năm 2018

NCS. Nguyễn Thị Đà


ii

Lời cam đoan
Tôi xin cam đoan:
Đây là công trình nghiên cứu của tôi và một số kết quả cùng cộng tác với các
cộng sự khác;
Các số liệu và kết quả trình bày trong luận án là trung thực, một phần đã đƣợc
công bố trên các tạp chí khoa học chuyên ngành với sự đồng ý và cho phép của các
đồng tác giả;
Phần còn lại chƣa đƣợc ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác.
Hà Nội, ngày 16 tháng 01 năm 2018
Tác giả

NCS. Nguyễn Thị Đà


iii

MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT ............................................. vii
DANH MỤC BẢNG ................................................................................................... ix
DANH MỤC HÌNH ................................................................................................... xi
MỞ ĐẦU ...................................................................................................................... 1

CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .......................................................... 3

1.1. QUÁ TRÌNH TIẾT PROTEIN Ở TẾ BÀO VI SINH VẬT ................................. 3
1.1.1. Quá trình tiết protein ở tế bào Eucaryotes .......................................................... 3
1.1.2. Quá trình tiết protein ở E. coli ............................................................................ 3
1.1.3. Quá trình tiết protein trong Bacillus ................................................................... 4
1.1.4. Enzyme phân cắt peptide tín hiệu của Sec/P..................................................... 16
1.2. HỆ BIỂU HIỆN PROTEIN TÁI TỔ HỢP Ở VI SINH VẬT .............................. 18
1.2.1. Vai trò của Bacillus trong công nghiệp sản xuất enzyme ................................. 18
1.2.2. Hệ thống biểu hiện ở Bacillus ........................................................................... 20
1.2.3. Đặc điểm di truyền của Bacillus subtilis ........................................................... 20
1.2.4. Hệ biểu hiện ở E. coli và vi sinh vật khác......................................................... 21
1.3. CÁC YẾU TỐ LIÊN QUAN ĐẾN BIỂU HIỆN GEN Ở Bacillus subtilis ......... 22
1.3.1. Lựa chọn promoter ............................................................................................ 23
1.3.2. Các vector biểu hiện ở Bacillus subtilis ............................................................ 24
1.3.3. Chọn trình tự peptide tín hiệu. .......................................................................... 25
1.3.4. Đột biến peptide tín hiệu ................................................................................... 25
1.3.5. Sử dụng chủng chủ đã đƣợc cải biến di truyền ................................................. 28
1.4. α - AMYLASE ..................................................................................................... 29
1.4.1. Cấu trúc của α – amylase .................................................................................. 29
1.4.2. α-Amylase từ Bacillus ....................................................................................... 30
1.4.3. α-Amylase từ các vi sinh vật khác .................................................................... 32
1.4.4. α-Amylase tái tổ hợp trong vi sinh vật .............................................................. 35

CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP .......................................... 38


iv

2.1. CHỦNG VI SINH VẬT VÀ PLASMID ............................................................. 38
2.1.1. Các chủng dại .................................................................................................... 38
2.1.2. Chủng chủ dùng trong nghiên cứu .................................................................... 38

2.1.3. Plasmid .............................................................................................................. 39
2.2. MÔI TRƢỜNG NUÔI CẤY VÀ CÁC CHẤT BỔ SUNG ................................. 40
2.2.1. Môi trƣờng nuôi cấy.......................................................................................... 40
2.2.2. Chất bổ sung ...................................................................................................... 40
2.3. HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ ................................................................................. 41
2.3.1. Thiết bị .............................................................................................................. 41
2.3.2. Hóa chất và Kit.................................................................................................. 41
2.4. CÁC PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .............................................................. 42
2.4.1. Phân lập chủng .................................................................................................. 42
2.4.2. Phƣơng pháp xác định hoạt tính α – amylase ................................................... 42
2.4.3. Phƣơng pháp xác định hàm lƣợng protein hòa tan theo Lowry ........................ 43
2.4.4. Phƣơng pháp thu amylase trong tế bào ............................................................. 43
2.4.5. Phƣơng pháp phân loại chủng chọn lọc ............................................................ 44
2.4.6. Phƣơng pháp tách chiết DNA ........................................................................... 44
2.4.7. Biến nạp DNA plasmid vào chủng chủ ............................................................. 46
2.4.8. Kỹ thuật PCR .................................................................................................... 46
2.4.9. Cắt enzyme giới hạn và ligation DNA .............................................................. 49
2.4.10. Phản ứng loại đầu 5’ - Phosphat (Dephosphorylation) ................................... 50
2.4.11. Phân lập đoạn gen mã hóa peptide tín hiệu..................................................... 50
2.4.12. Phƣơng pháp megaprimer ............................................................................... 50
2.4.13. Phƣơng pháp tinh sạch DNA từ gel agarose ................................................... 52
2.4.14. Phƣơng pháp điện di DNA .............................................................................. 52
2.4.15. Nghiên cứu điều kiện thu nhận α-amylase của chủng tái tổ hợp .................... 53
2.4.16. Điện di SDS – PAGE ...................................................................................... 54
2.4.17. Xác định hoạt tính α – amylase trên gel polyacrylamid ................................. 55
2.4.18. Xử lý số liệu .................................................................................................... 55


v

CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ...................................................... 56
3.1. PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG BACILLUS CÓ KHẢ
NĂNG TIẾT ALPHA AMYLASE MẠNH RA MÔI TRƢỜNG ..................... 56
3.1.1. Phân lập và tuyển chọn sơ bộ các chủng Bacillus có hoạt tính amylase ........ 56
3.1.2. Sàng lọc bộ chủng phân lập thu các chủng thuộc chi Bacillus có hoạt tính
amylase cao ........................................................................................................ 57
3.1.3. Nghiên cứu đặc điểm phân loại của các chủng ................................................. 59
3.2. PHÂN LẬP CÁC ĐOẠN GEN MÃ HÓA CHO TRÌNH TỰ PEPTIDE TÍN
HIỆU CỦA ALPHA AMYLASE TỪ CÁC CHỦNG CHỌN LỌC .................. 62
3.3. SÀNG LỌC THU PEPTIDE TÍN HIỆU MẠNH CỦA GEN α - AMYLASE ... 67
3.3.1. Tách các peptide tín hiệu và tạo tổ hợp với gen đích........................................ 70
3.3.2. Tạo vector mang tổ hợp gen đích ...................................................................... 72
3.3.3. Đánh giá khả năng tiết của các tổ hợp gen đích trong chủng chủ B. subtilis
168M................................................................................................................... 75
3.4. ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG TIẾT AMYLASE CỦA CÁC CHỦNG TÁI TỔ
HỢP MANG VECTOR BIỂU HIỆN CÓ CÁC PEPTIDE TÍN HIỆU ĐỘT
BIẾN ĐƢỢC THIẾT KẾ ................................................................................... 83
3.5. NGHIÊN CỨU ĐIỀU KIỆN BIỂU HIỆN ALPHA AMYLASE CỦA
CHỦNG TÁI TỔ HỢP ....................................................................................... 91
3.5.1. Xác định động thái sinh trƣởng và sinh tổng hợp α - amylase của chủng
168MpHVC1 ...................................................................................................... 91
3.5.2. Ảnh hƣởng của nhiệt độ nuôi cấy lên khả năng sinh trƣởng và sinh amylase
của chủng 168MpHVC1 ..................................................................................... 92
3.5.3. Ảnh hƣởng của nồng độ IPTG lên khả năng tiết amylase của chủng
168MpHVC1 ...................................................................................................... 93
3.5.4. Ảnh hƣởng của nguồn N, C lên khả năng sinh trƣởng và sinh amylase của
chủng 168MpHVC1 ........................................................................................... 95

CHƢƠNG 4. BÀN LUẬN KẾT QUẢ ........................................................... 97

vi

4.1. QUÁ TRÌNH TIẾT PROTEIN ............................................................................ 97
4.1.1. Phân lập và thu các chủng tuyển chọn có hoạt tính α – amylase ...................... 97
4.1.2. Protein ngoại bào và hoạt tính α – amylase của các chủng tuyển chọn ............ 98
4.1.3. Tách dòng các peptide tín hiệu ở Bacillus và đánh giá vai trò của các axit
amin trong trình tự này với quá trình tiết protein ............................................. 101
4.2. KHẢ NĂNG BIỂU HIỆN α–AMYLASE VỚI CÁC PROMOTER KHÁC
NHAU............................................................................................................... 105
4.3. SÀNG LỌC CÁC PEPTIDE TÍN HIỆU VÀ ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG
BIỂU HIỆN TRONG B. subtilis 168M ............................................................ 107
4.4. NGHIÊN CỨU TẠO MỘT SỐ ĐỘT BIẾN TRÊN PEPTIDE TÍN HIỆU VÀ
ĐÁNH GIÁ ẢNH HƢỞNG ĐẾN KHẢ NĂNG TIẾT PROTEIN ĐÍCH
CỦA CHÚNG .................................................................................................. 113
4.5. NGHIÊN CỨU ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY TĂNG TIẾT ENZYME.................. 119
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ............................................................................... 123
NHỮNG CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ TRONG THỜI GIAN THỰC HIỆN
LUẬN ÁN ................................................................................................................ 125
TÓM TẮT LUẬN ÁN BẰNG TIẾNG ANH ....................................................... 126
TÀI LIỆU THAM KHẢO ..................................................................................... 132
PHỤ LỤC


vii

DANH MỤC CÁC THUẬT NGỮ VÀ KÝ HIỆU VIẾT TẮT
APS

Ammonium persulphate

BLAST

Basic local alignment search tool

Bp

Base pair – cặp bazơ

BSA

Bovine serum albumin

CM

Cell membrane

Cs

Cộng sự

CTAB

hexadecyltrimethyl ammonium bromide

DNA

Deoxyribonucleic acid

DTT

Dithiothreitol

ER

Mạng lƣới nội chất/ endoplasmic reticulum

G-

Vi khuẩn Gram âm

G+

Vi khuẩn Gram dƣơng

GRAS

Generally recognized as safe – đƣợc coi là an toàn

HAc

Axit axetic

Kb

kilobase

mg

Milligram

mg/ml

Milligram/millilitre

mM

Milli (10-3) Molar

NCBI

National Centre for Biotechnology Information

PAGE

Polyacrylamide gel electrophoresis

PCR

Polymerase chain reaction

PMSF

Phenylmethylsulfonyl fluoride

rDNA

Ribosomal deoxynucleic acid

SDS

Sodiumdodecylsulfat

Sec/P

Sec pathway/ Secretion pathway – con đƣờng tiết

SP

Peptide tín hiệu (SP)

SPase

SPase


viii

SRP

Signal recognition particle

STT

Số thứ tự

TAE

Tris-acetic acid-EDTA

TAT/P

Twin-arginine translocation pathway

TEMED

Tetramethylethylenediamine

TIM

Triose phosphate Isomerase

Tm

Melting temperature

U

Unit

VSV

Vi sinh vật

MeOH

Methanol

TRAM

Translocating chain-associating membrane protein


ix

DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1 So sánh sự khác biệt của các peptide tín hiệu ở G+ và G- theo
Sec/P ............................................................................................... 9
Bảng 1.2 Các nhân tố tham gia vận chuyển protein theo Sec/P .................... 10
Bảng 1.3 Một số enzyme có nguồn gốc vi khuẩn và ứng dụng của chúng ... 19
Bảng 2.1 Các mẫu đất và ký hiệu sử dụng khi nghiên cứu ........................... 38
Bảng 2.2 Các chủng chủ trong nghiên cứu .................................................... 38
Bảng 2.3 Các plasmid đặt theo hãng sử dụng trong nghiên cứu ................... 40
Bảng 2.4 Các chất bổ sung sử dụng cho môi trƣờng chọn lọc ...................... 41
Bảng 2.5 Các primer sử dụng trong nghiên cứu ............................................ 47
Bảng 3.1 Số lƣợng khuẩn lạc phân lập trên môi trƣờng LB tinh bột ............ 56
Bảng 3.2 Hoạt tính và hàm lƣợng α- amylase của một số chủng chọn lọc ... 60
Bảng 3.3 Đặc điểm của các peptide tín hiệu chọn lọc ................................... 66
Bảng 3.4 Các thành phần của tổ hợp Megaprimer ........................................ 68
Bảng 3.5 Hoạt tính tiết enzyme của các chủng tái tổ hợp ............................. 77
Bảng 3.6 Các plasmid thiết kế ....................................................................... 80
Bảng 3.7 Ảnh hƣởng của các peptide tín hiệu khác nhau lên khả năng
biểu hiện và tiết protein của α-amylase B. licheniformis 3BT2 ..... 81
Bảng 3.8 Đặc điểm của các peptide tín hiệu đột biến.................................... 84
Bảng 3.9 Thành phần của plasmid mang tổ hợp gen đột biến....................... 85
Bảng 3.10 Khả năng tiết α - amylase và protein tổng số của các chủng tái
tổ hợp .............................................................................................. 87
Bảng 3.11 Ảnh hƣởng của nồng độ IPTG lên khả năng tiết amylase của

94

chủng 168MpHVC1 ....................................................................... 94
Bảng 3.12 Ảnh hƣởng của nguồn C lên khả năng sinh trƣởng và sinh
amylase của chủng 168MpHVC1 .................................................. 95
Bảng 3.13 Ảnh hƣởng của nguồn N lên khả năng sinh trƣởng và sinh
amylase của chủng 168MpHVC1 .................................................. 96


x

DANH MỤC HÌNH VÀ ĐỒ THỊ

Hình 1.1

Các con đƣờng tiết protein của vi khuẩn .......................................... 5

Hình 1.2

Sơ đồ cơ chế tiết protein ngoại bào theo Sec/P ở B. subtilis ............ 6

Hình 1.3

Các yếu tố liên quan đến biểu hiện gen ở B. subtilis ........................ 22

Hình 2.1

Các vector sử dụng trong nghiên cứu……………………………..

Hình 2.2

Sơ đồ phƣơng pháp Megaprimer tạo tổ hợp gen giữa peptide tín

39

hiệu quan tâm và đoạn gen đích ....................................................... 51
Hình 2.3

Sơ đồ thí nghiệm tạo tổ hợp promoter - signal – mature 3BT2
amylase gen bằng T4-lygase từ Pgrac và tổ hợp gen đích đã phân
lập ..................................................................................................... 52

Hình 3.1

Hoạt tính amylase của một số chủng sàng lọc.................................. 58

Hình 3.2

Hình thái tế bào và hình ảnh một số khuẩn lạc Bacillus phân lập.... 58

Hình 3.3

Điện di đồ sản phẩm PCR gen 16S rRNA của một số chủng
nghiên cứu ........................................................................................ 60

Hình 3.4

Cây phát sinh loài của các chủng chọn lọc ....................................... 61

Hình 3.5

Điện di đồ sản phẩm gen mang peptide tín hiệu của các chủng
nghiên cứu ........................................................................................ 63

Hình 3.6

Điểm phân cắt trong peptide tín hiệu gen α-amylase của chủng
DA23 ................................................................................................ 64

Hình 3.7

Điểm phân cắt trong peptide tín hiệu gen α-amylase của chủng
D5-2 .................................................................................................. 64

Hình 3.8

Điểm phân cắt trong peptide tín hiệu gen α-amylase của chủng
CN1-5 ............................................................................................... 64

Hình 3.9

Hình ảnh logo trình tự peptide tín hiệu của các chủng nghiên cứu .. 65


xi

Hình 3.10 So sánh trình tự nucleotide của ba peptide tín hiệu chọn lọc ........... 65
Hình 3.11 So sánh trình tự protein mã hóa cho SP của cả ba chủng nghiên
cứu .................................................................................................... 65
Hình 3.12 Sơ đồ thí nghiệm tăng khả năng tiết α-amylase trong Bacillus
subtilis............................................................................................... 68

Hình 3.13 Sơ đồ điểm cắt enzyme giới hạn của các peptide tín hiệu chọn
lọc ..................................................................................................... 69
Hình 3.14 Điện di đồ sản phẩm PCR đoạn mature gen α amylase của chủng
3BT2, các đoạn peptide tín hiệu quan tâm, sản phẩm megaprimer
giữa peptide tín hiệu quan tâm và đoạn gen trƣởng thành của α –
amylase 3BT2 ................................................................................... 71
Hình 3.15 Sản phẩm tách DNA plasmid và cắt kiểm tra bằng BamHI và
XbaI của các dòng mang đoạn sản phẩm megaprimer
DASsub3BT2Mature trong pTZ57R/T .............................................. 71
Hình 3.16 Điện di đồ sản phẩm PCR khuếch đại các gen quan tâm ................. 71
Hình 3.17 Sơ đồ thí nghiệm tạo vector pHVgracAmy mới từ vector pHV33
gốc .................................................................................................... 74
Hình 3.18 Điện di đồ DNA plasmid pHVSusig5.2 tách dòng và xử lý EcoRI . 75
Hình 3.19 Ảnh hƣởng của thời gian nuôi cấy lên hoạt tính cũng nhƣ khả
năng sinh tổng hợp enzym của chủng B. subtilis 168M mang
vector pHV33-promoter Pgrac - α-amylase 3BT2 .......................... 78
Hình 3.20 Ảnh hƣởng của promoter lên khả năng tiết enzym của chủng tái
tổ hợp ................................................................................................ 78
Hình 3.21 So sánh biểu hiện tiết α-amylase các peptide tín hiệu khác nhau .... 82
Hình 3.22 Ảnh hƣởng của thời gian nuôi cấy lên sinh trƣởng và sinh tổng

82


xii

hợp amylase của chủng 168MSusigD52 ..........................................
Hình 3.23 Sơ đồ cấu trúc và trình tự axit amin 3 vùng trên SP gen α amylase chủng D5-2 ......................................................................... 84
Hình 3.24 So sánh trình tự axit amin của các peptide đột biến ......................... 85
Hình 3.25 Điện di đồ sản phẩm PCR khuếch đại đoạn peptide tín hiệu mang

trình tự đột biến…………………………………………………...

86

Hình 3.26 Điện di đồ sản phẩm PCR các cụm tổ hợp và cắt kiểm tra
plasmid ............................................................................................. 89
Hình 3.27 Sàng lọc các dòng mang vector thiết kế thu các chủng có hoạt
tính amylase ...................................................................................... 89
Hình 3.28 Khả năng tiết amylase ngoại bào của các peptide tín hiệu đột
biến ................................................................................................... 89
Hình 3.29 Động thái sinh trƣởng và sinh tổng hợp α - amylase của chủng
168MpHVC1 .................................................................................... 91
Hình 3.30 Ảnh hƣởng của nhiệt độ nuôi cấy lên khả năng sinh trƣởng và
sinh amylase của chủng 168MpHVC1 ............................................. 93
Hình 3.31 Ảnh hƣởng của nồng độ IPTG lên khả năng tiết α - amylase của
chủng tái tổ hợp B. subtilis 168MpHVC1 ........................................ 94


1

MỞ ĐẦU
Protein là sản phẩm của gene, đƣợc sử dụng trong nhiều lĩnh vực của đời
sống đặc biệt là trong công nghiệp dƣợc phẩm, công nghiệp enzyme, công nghiệp
chế biến các sản phẩm nông nghiệp… Protein đƣợc tế bào sinh vật sinh ra tồn tại ở
hai dạng chính là protein nội bào (intracellular) và protein ngoại bào (extracellular)
tùy theo chức năng của chúng. Protein là một trong những sản phẩm quan trọng
trong công nghệ DNA tái tổ hợp, đƣợc biểu hiện trong tế bào chủng chủ cả ở
Eucaryote và Procaryote. Ở chủng tái tổ hợp mục tiêu cần đạt là tăng cƣờng quá
trình biểu hiện protein đƣợc ở mức độ cao. Tuy nhiên, khi protein ở trong tế bào
quá lớn sẽ tạo ra áp lực cho tế bào dẫn đến tế bào bị phá vỡ. Tăng quá trình tiết

protein ngoại bào sẽ giúp giảm áp lực cho tế bào làm tăng khả năng biểu hiện của
protein tái tổ hợp. Các protein ngoại bào đƣợc vi sinh vật tiết ra môi tƣờng theo
nhiều cơ chế khác nhau và phụ thuộc vào nhiều yếu tố trong đó có vai trò của trình
tự peptide tín hiệu. Xây dựng một hệ thống biểu hiện tốt và tăng cƣờng khả năng
tiết protein nhằm cải thiện đáng kể hiệu quả sản xuất, các sản phẩm đƣợc tạo ra
nhiều hơn, giảm giá thành để có thể ứng dụng trong sản xuất và đời sống đã đƣợc
quan tâm nghiên cứu.
Amylase là một trong những protein - enzyme tái tổ hợp đầu tiên đƣợc thu
nhận. Thị trƣờng tiêu thụ enzyme thế giới ƣớc tính đạt 1.6 tỷ USD cho các ngành:
công nghiệp thực phẩm (29%), thức ăn gia súc (15%) và các ngành công nghiệp
khác (56%). Trong đó, amylase chiếm khoảng 30% sản phẩm enzyme trên toàn thế
giới. Vai trò ứng dụng của amylase đặc biệt là α-amylase đƣợc biết đến trong rất
nhiều ngành công nghiệp nhƣ: thực phẩm, rƣợu - bia, lên men, dệt, tẩy, giấy, dƣợc
phẩm và công nghiệp hóa học, lâm sàng, y học và phân tích hóa học… vì vậy nhu
cầu về amylase nói chung và α-amylase nói riêng không ngừng tăng lên. Ở vi sinh
vật, α-amylase có mặt ở rất nhiều nhóm nhƣ trong vi khuẩn cổ, nấm men, nấm mốc,
vi khuẩn…Trong đó, đƣợc quan tâm nhiều nhất là các chủng thuộc nhóm Bacillus
vì chúng có khả năng tiết protein trong đó có α-amylase ra ngoài môi trƣờng và có


2

thể đạt đến tới nồng độ cao nên thuận tiện cho việc thu hồi sau lên men. Hoạt tính
của enzyme tiết ra ngoài môi trƣờng nuôi cấy, phụ thuộc vào thời gian cảm ứng,
loại peptide tín hiệu và khối lƣợng phân tử của enzyme. Sử dụng kỹ thuật gen để đi
sâu nghiên cứu về cấu trúc và cơ chế tiết enzyme ra ngoài môi trƣờng cũng nhƣ tạo
đột biến trong trình tự peptide tín hiệu đã tạo đƣợc chủng tái tổ hợp có khả năng
tăng cƣờng biểu hiện hoạt tính α–amylase.
Với mong muốn xây dựng đƣợc hệ biểu hiện enzyme có hiệu quả ở Bacillus
dựa trên sàng lọc các peptide tín hiệu của gen α-amylase từ các chủng thuộc chi

Bacillus hoang dại phân lập ở Việt Nam, chúng tôi lựa chọn đề tài: “Sàng lọc và
nghiên cứu ảnh hưởng của đột biến điểm trên peptide tín hiệu đến khả năng tiết
α-amylase tái tổ hợp trong Bacillus subtilis”
Mục tiêu nghiên cứu:
- Có đƣợc cơ sở dự liệu về trình tự peptide tín hiệu của gene α–amylase từ các
chủng thuộc chi Bacillus.
- Tạo đƣợc hệ biểu hiện mang trình tự peptide tín hiệu đột biến làm tăng khả năng
tiết α-amylase ngoại bào ở chủng Bacillus tái tổ hợp.
1. Nội dung luận án:
- Phân lập tuyển chọn các chủng Bacillus có khả năng sinh α-amylase ngoại bào

cao.
- Tách các trình tự peptide tín hiệu của gen α-amylase từ chủng chọn lọc
- Gây đột biến hoặc thay thế các peptide tín hiệu đã đƣợc đột biến định hƣớng
- Tạo các chủng tái tổ hợp với các peptide tín hiệu đột biến và sàng lọc các chủng

có khả năng tiết α-amylase cao.
- Nghiên cứu điều kiện biểu hiện α-amylase của chủng tái tổ hợp thu đƣợc.

2. Những đóng góp mới của luận án
- Đã xác định đƣợc dữ liệu khoa học về peptide tín hiệu của gen α --amylase từ 3
chủng điển hình trong số 130 chủng Bacillus phân lập tại Việt Nam.
- Tạo đƣợc các đột biến điểm và xác định đƣợc đột biến A31V giúp tăng cƣờng tiết
α - amylase trong Bacillus subtilis.


3

CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. QUÁ TRÌNH TIẾT PROTEIN Ở TẾ BÀO VI SINH VẬT

1.1.1. Quá trình tiết protein ở tế bào Eucaryotes
Các preprotein hình thành trong nấm men ít nhất có hai con đƣờng vận chuyển
một đƣờng qua SRP trung gian và một con đƣờng độc lập khác. Vận chuyển protein
qua SRP trung gian vẫn chƣa đƣợc mô tả rõ ràng nhƣng phức hợp vận chuyển
protein của S. cerevisiae xuất hiện 5 polypeptide khác nhau: Sec61, Sec62, Sec63,
và 2 protein phát hiện thêm gần đây. Protein Sec61 có một số trình tự kỵ nƣớc liên
kết với ER và liên kết trực tiếp với protein tiết trong quá trình vận chuyển, tƣơng tự
nhƣ TRAM trong tế bào động vật có vú nhƣng trình tự của Sec61 không có bất kỳ
điểm tƣơng đồng nào với TRAM mà chúng lại có một số điểm tƣơng đồng với
protein SecY ở E. coli (Simonen & Palva, 1993).
Trong suốt hoặc ngay sau khi vận chuyển protein trong tế bào động vật có vú
và trong S. cerevisiae, các peptide tín hiệu đƣợc loại bởi SPase. Hai phức hợp chuỗi
các enzyme phân cắt tín hiệu (SPase) của động vật có vú và nấm men có tƣơng
đồng với Sec11 (YaDeau et al., 1991). Trong khoang lƣới nội chất của ER của cả tế
bào nấm men và động vật có vú đều có BiP (Binding immunoglobulin protein), một
loại protein đóng vai trò quan trọng trong quá trình gấp cuộn của các protein tiết.
BiP của S. cerevisiae (Kar2) tƣơng tác với protein trong bƣớc sớm quá trình vận
chuyển protein qua màng. BiP rất cần thiết cho sự sinh trƣởng của tế bào nấm men
(Simonen & Palva, 1993)
1.1.2. Quá trình tiết protein ở E. coli
Trong E. coli, khoảng 50% protein của tế bào đƣợc tiết ra ngoài môi trƣờng
với hơn 90% protein đƣợc vận chuyển thông qua Sec/P (Low et al., 2013). Các SP
đƣợc cho là hỗ trợ liên kết với các nhân tố tham gia quá trình tiết nhƣ: SecB,
GroEL, DnaK và DnaJ và trong đó SecB đóng vai trò là nhân tố chính. Liên kết của
SecB ngăn preprotein gấp cuộn khi chƣa thể hiện chức năng. GroEL, DnaK, và


4

DnaJ còn có một số chức năng khác trong tế bào E. coli ngoài vai trò trong quá trình
tiết protein. Phức hợp preprotein với các nhân tố tiết đƣợc vận chuyển đến màng tế
bào bởi ái lực của SecA với SP và SecB. SecA là protein màng ngoại vi và có ái lực
đối với với phần protein trƣởng thành của preprotein (Simonen & Palva, 1993).
Ngoài chức năng vận chuyển, SecA còn tham gia liên kết và thủy phân ATP nhằm
cung cấp năng lƣợng cho quá trình chuyển vận qua màng. Một số protein trên màng
SecY, SecE cùng với SecA hình thành nên hệ vận chuyển ở E. coli. Chuỗi
polypeptide có thể trƣợt qua màng tế bào trên bề mặt của phức hợp SecY/E. Phần
xúc tác của các enzyme phân cắt peptide tín hiệu nằm ở phía bào chất và quá trình
phân cắt SP có thể xảy ra trong hoặc ngay sau quá trình vận chuyển. Chức năng của
2 protein SecD và SecF trên màng chƣa đƣợc biết rõ, tuy nhiên chúng có thể đóng
vai trò trong việc hỗ trợ quá trình gấp cuộn của protein khi mới đƣợc vận chuyển
lên periplasmic tƣơng tự với protein BiP của động vật có vú và của tế bào nấm men
(Simonen & Palva, 1993).
1.1.3. Quá trình tiết protein trong Bacillus
1.1.3.1. Các con đường vận chuyển protein trong Bacillus
Quá trình tiết protein ở Bacillus là hệ thống tiết protein của vi khuẩn đầu tiên
đƣợc nghiên cứu. Bacillus là vi khuẩn G+ nên có cơ chế tiết điển hình đƣợc biết đến
là khác so với E. coli, S. cerevisiae và động vật có vú. Tế bào của Bacillus đƣợc bao
quanh bởi màng tế bào chất, đƣợc bao phủ bởi một thành tế bào dày (10 đến 50 nm)
bao gồm chủ yếu là các chuỗi peptidoglycan và teichoic hoặc teichuronic acid (Chu
H.H., 2001). Theo Tjalsma et al., 2004; Fu et al., 2007, bốn con đƣờng tiết protein
đƣợc biết có mặt trong vi khuẩn Gram âm và Gram dƣơng đó là: Sec-SRP, Tat, qua
nhân tố vận chuyển ATP binding cassette (ABC- transporter) và con đƣờng
Pseudopillin (Com pathway). Các SP của Bacillus đã có rất nhiều công trình công
bố (Kolkman et al., 2008; Igarashi et al., 1998; Borchert & Nagarajan, 1991a; Heng
et al., 2005b; Low et al., 2012; Tjalsma et al., 2000a; Jonet et al., 2012; Sakakibara
et al., 1993). Các con đƣờng tiết protein trong Bacillus cũng nhƣ các enzym phân

5

cắt tín hiệu tham gia trong các con đƣờng này đƣợc thể hiện trên Hình 1.1, Cơ chế
tiết đƣợc thể hiện trên hình 1.2.

Hình 1.1. Các con đƣờng tiết protein của vi khuẩn
(Nguồn: Tjalsma et al., 2000a, 2004)

Trong Sec/P, ribosome liên kết với đầu N của SP nhờ Ffh protein. Protein
Ffh, Hbsu và scRNA là các hợp phần trong phức hợp SRP (signal recognition
particle) tham gia trong quá trình vận chuyển, sau đó phức hợp SRP-precusor sẽ
tƣơng tác với SecA nhờ các liên kết với SP. Cụm liên kết SRP – Precusor – SecA
đƣợc đƣa tới vị trí màng tế bào và tƣơng tác với các yếu tố protein vận chuyển trên
màng SecYEG, SecE, SecG và các protein hỗ trợ SecDF, SpoIIIJ và YqjG. Sau đó,
SP sẽ đƣợc phân cắt bởi một enzyme trên màng là SPase I (SipS-W), Precusor
protein đƣợc đƣa ra qua các Sec-pore bởi SecA chủ yếu nhờ vào nguồn năng lƣợng


6

ATP và các điện tử trên kênh dẫn truyền. Đoạn SP bị phân cắt bởi 2 SPase là SppA
và TepA, các exoprotein sẽ đƣợc vận chuyển qua màng tế bào do đó nó đƣợc điều
khiển bởi WprA, một protease trên màng tế bào và đƣợc tăng cƣờng tạo ra nhờ xúc
tác của PrsA, một lipoprotein trên màng tế bào. BdbB và BdbC là các protein tham
gia giúp cho việc hình thành các cầu nối disulfide (prophage-derived disulfide bond
formation protein) trong quá trình hình thành cấu trúc protein. Một số protease ở
thành tế bào tích điện âm chính vì vậy các ion Ca2+ và Fe3+ rất cần thiết cho việc ổn
định hoạt tính của một số exoprotein.

Hình 1.2.Sơ đồ cơ chế tiết protein ngoại bào theo Sec/P ở B. subtilis

(Nguồn: Brockmeier, 2006)
1.1.3.2. Đích vận chuyển protein trong Bacillus
Cấu trúc của lớp màng tế bào của Bacilli không có lớp màng ngoài (OM Outer membrane) cho nên sau khi tổng hợp các protein có thể đƣợc giữ lại trong tế


7

bào chất hoặc vận chuyển vào CM hoặc chúng sẽ đƣợc vận chuyển qua CM vào
thành tế bào, sau đó protein có thể vẫn giữ trên thành hoặc tiết ra môi trƣờng nuôi
cấy (Tjalsma et al., 2000a). Thông qua các con đƣờng tiết khác nhau sản phẩm
protein có thể đƣợc tiết ra ngoài môi trƣờng nuôi cấy (nhƣ trong: Sec/P, Tat/P, ABC
transporter), có thể là tồn tại ở mặt bên của màng tế bào (Sec/P, Com) và cũng có
thể nằm trên thành tế bào (Sec/P) (Tjalsma et al., 2000a, 2004; Brockmeier, 2006).
Đối với chi Bacillus, các protein chủ yếu đƣợc tiết theo Sec/P-SRP.
Trong quá trình vận chuyển, các protein thiếu các tín hiệu vận chuyển sẽ
đƣợc giữ lại trong tế bào chất và đƣợc gấp cuộn cần hoặc không cần sự có mặt của
các chaperone và đại diện cho nhóm này nhƣ các protein: GroEL-GroES và DnaKDnaJ-GrpE (Tjalsma et al., 2000; Chu., 2001).
Thành tế bào của B. subtilis tƣơng tự nhƣ periplasm ở vi khuẩn Gram âm và
nó chiếm khoảng 9% tổng khối lƣợng của protein tế bào và các protein đƣợc giữ lại
trong thành tế bào bao gồm các enzyme nhƣ: DNases, Rnases (Merchante, et al.,
1995), protease (Margot & Karamata, 1996, Msadek, et. al., 1998), enzyme tham
gia vào quá trình tổng hợp peptidoglycan (penicillin-binding protein) và các
hydrolases có liên quan đến quá trình tăng trƣởng tế bào, phân chia tế bào, sự hình
thành bào tử, và sự nảy mầm (Tjalsma, et. al., 2000). Hầu hết các protein đƣợc vận
chuyển qua màng tế bào chất đều đƣợc tổng hợp với một SP. Giống nhƣ các vi
khuẩn Gram dƣơng khác, B. subtilis thiếu lớp màng ngoài nên nhiều protein đƣợc
tiết trực tiếp ra môi trƣờng nuôi cấy trong quá trình sinh trƣởng trong đó chủ yếu là
các enzyme nhƣ: proteases, lipase, carbohydrase, DNases và Rnases nhằm thực hiện
vai trò giúp vsv có thể thích ứng với điều kiện môi trƣờng bằng việc sử dụng nguồn

dinh dƣỡng sẵn có. Ngoài các enzyme ra, một nhóm protein thứ hai đƣợc tiết là
thành viên của nhóm phosphatase (PhrA và PhrK) đóng vai trò nhận biết mật độ tế
bào, điều chỉnh sự phát triển và sự hình thành bào tử (Tjalsma, et.al., 2000; Chu H.
H., 2001). Ngƣợc lại với các enzyme phân hủy cơ chất và các Phr protein, hầu hết
các protein không đƣợc tiết, bao gồm cả các protein tham gia quá trình giống nhƣ
tạo thành tế bào, liên kết cơ chất, hoặc tiết protein, đều phải đƣợc giữ lại trên màng


8

tế bào với đầy đủ chức năng và nhằm để ngăn việc mất hoạt tính của các protein này
khi ở dạng tự do trong tế bào chất. Chúng chứa các SP tƣơng tác với màng hoặc với
thành tế bào nhƣng không bị phân cắt bởi các enzyme tham gia vào quá trình tiết
protein. Ngoài ra, một số protein tiết còn có thể hình thành lên các cấu trúc like –
pilin ở trên bề mặt tế bào (Tjalsma, et. al., 2000; Chu , 2001)
1.1.3.3. Vai trò của peptide tín hiệu
Các SP đƣợc biết đến gồm 5 loại và phân biệt dựa trên điểm nhận biết phân
cắt bao gồm: peptide tín hiệu của con đƣờng tiết chung (Sec/P), peptide tín hiệu
Twin-arginine, peptide tín hiệu Lipoprotein, peptide tín hiệu pilin-like protein và
cuối cùng là các peptide tín hiệu tham gia trong quá trình tiết bacteriocin và
pheromones (Tjalsma, et al., 2000; Tjalsma, et al., 2004). Peptide tín hiệu đƣợc biết
đến có ít nhất 3 chức năng chính (van Roosmalen et al., 2004): Đầu tiên, nhận biết
thụ thể trong bộ máy tiết và chuyển tới bộ máy xúc tác vận chuyển protein qua
màng; Thứ hai, các SP nhƣ một yếu tố quyết định cho xác định preprotein trên
màng và bắt đầu di chuyển đến các vùng ƣa nƣớc ở đầu cuối C của các preprotein
trong khi phần N vẫn đƣợc định vị ở phía cis của tế bào; Thứ ba, các SP có thể ức
chế quá trình gấp cuộn của các protein mới hình thành vì vậy tránh đƣợc việc kích
hoạt các enzyme có hại cho bộ máy tiết của enzyme bên trong tế bào và giúp cho
quá trình tiết đƣợc xảy ra hoàn toàn.
1.1.3.4. Peptide tín hiệu Sec/P

Quá trình vận chuyển ra bên ngoài tế bào của khoảng 300 protein thuộc chi
Bacillus chủ yếu đƣợc tiết qua Sec/P (secretory pathway) vì thế Sec/P đƣợc coi là
con đƣờng tiết chung cho chi này (Tjalsma, et. al., 2000a). Các peptide tín hiệu của
con đƣờng này luôn gồm ba vùng với chức năng riêng: vùng N (tích điện dƣơng),
vùng kỵ nƣớc H và vùng đầu cuối C (Leite, 2011; Brockmeier et al., 2006b; Low et
al., 2013). Sự khác biệt của SP ở vi khuẩn G(+) và G(-) đƣợc so sánh trong Bảng
1.1 (Dalbey&Heijne, 2002). Sec/P đƣợc xem nhƣ con đƣờng tiết chung cho hầu hết
protein của Bacillus với bộ máy tiết tham gia gồm 5 thành phần chính: (1) Các


9

chaperon của tế bào chất (cytosolic chaperones); (2) Bộ máy vận chuyển (SecA,
SecY, SecE, SecG, và SecDF-YajC); (3) Các enzyme phân cắt peptide tín hiệu
(SPase) phân cắt SP của preprotein tạo thành đoạn trƣởng thành; (4) Các enzyme
phân cắt (hay còn gọi là SPase) cắt SP khỏi preprotein trên màng; (5) Các nhân tố
gấp cuộn (folding factors). Trung bình SP loại I của Bacillus dài hơn SP trong E.
coli từ 5 – 7 axit amin. Trong vi khuẩn Gram dƣơng, vị trí phân cắt của SPase
khoảng 7 - 9 axit amin trong khi ở E. coli vị trí phân cắt xảy ra tại vị trí 3 - 7 (Leite,
2011). Vị trí +1 sau điểm phân cắt của SPase thƣờng là Ala (27%) còn lại là các axit
amin khác ngoại trừ proline và cysteine (Tjalsma et al., 2000). Các nhân tố tham gia
vận chuyển protein theo Sec/P đƣợc trình bày trong bảng 1.2 (Tjalsma et al., 2000).
Bảng 1.1.So sánh sự khác biệt của các peptide tín hiệu ở G+ và G- theo Sec/P
STT

Chỉ tiêu so sánh

Gram dƣơng

Gram âm

1

Độ dài SP trung
bình(axit amin)

32

25

2

Vùng N

Tích điện dƣơng cao, giàu
Lys/Arg

Tích điện dƣơng (thấp),
giàu Lys/Arg

3

Vùng H

Kỵ nƣớc, có cấu trúc xoắn
α dài

Kỵ nƣớc, có cấu trúc xoắn α
ngắn hơn

4

Vùng C

5

Vị trí -1 & -3 theo
trình tự Ala – X Ala

Phân cực/trung tính, kéo dài Phân cực/trung tính, kéo dài
hình thành cấu trúc β, dài
hình thành cấu trúc β, ngắn
hơn, giàu Pro/Thr
hơn, giàu Ser/Ala
Chủ yếu Ala, đôi khi đƣợc
thay bằng Ser/Gly

Chủ yếu Ala, đôi khi đƣợc
thay bằng Ser/Gly

(Nguồn: Dalbey & Heijne, 2002).
Vùng N (N – region) mang điện tích dƣơng của chuỗi preprotein trong SP theo
Sec/P có chứa trung bình khoảng 1 – 5 axit amin, trong đó chứa 2 axit amin Lysine
và Arginine (Low et al., 2013; Leite, 2011). Một preprotein không mang điện tích
dƣơng vẫn đƣợc nhận biết bởi bộ máy vận chuyển tuy nhiên chúng sẽ đƣợc tiết rất
chậm. Vùng N sẽ tƣơng tác với các ATPase, SecA và với các phospholipid tích điện
âm (Dalbey & Von Heijne, 2002).


10

Bảng 1.2. Các nhân tố tham gia vận chuyển protein theo Sec/P
Thành phần

B. subtilis

E. coli

S. cerevisiae

Chaperone riêng

Ffh, FtsY,
scRNA
CsaA (?)

Ffh, FtsY, 4.5S
RNA, SecB
YgjH (?)

Phức hợp SRP (gồm
scR1 RNA, Srp72p,
Srp68p, Srp54p,
Sec65p, Srp21p,
Srp14p, và
Srp7p), DPα/β

Chaperone chung

GroEL, GroES

DnaK, DnaJ,
GrpE, yếu tố
kích hoạt

GroEL, GroES
DnaK, DnaJ,
GrpE, yếu tố kích
hoạt

Hsp70, Ydj1

Nhân tố vận chuyển

SecA

SecA

Ribosome, Kar2 (Bip)

Kênh chuyển vị

SecY, SecG,
SecE, SecDF,
YrbF

SecY, SecG,
SecE, SecD/F,
YajC

Sec61, Ssh1

(Sec61α),Sbh1, Sbh2
(Sec61β), Sss1
(Sec61γ)
Sec62/63, Sec66/67

SPases

SipS/T/U/V/P,
SipW, LspA

LepB, LspA

Sec11

SPPases

SppA, TepA

SppA, OpdA

PrsA, BdbA/B/C

SurA, PpiD,
RotA, FkpA,
DsbA/B/C/D/E/G

Foldases

CPR2, CPR4, CPR5,
CPR8, FPR2, PDI,

Ero1, Eug1. Kar2
(BiP),Lhs1, (Hsp70)

(Nguồn: Tjalsma et al., 2000)
Vùng H (hydrophobic H- region) là vùng tâm kị nƣớc có chứa khoảng 19 axit
amin và có cấu trúc xoắn α đƣợc hình thành do tƣơng tác của vùng N tích điện
dƣơng với các phospholipid tích điện âm. Thông thƣờng hai axit amin Glycine và
Proline sẽ đƣợc tìm thấy nằm giữa vùng này với khoảng 60% vùng H của SP ở
Bacillus chứa Glycine ở giữa và 50% chứa Prolin hoặc Glycine ở điểm bẻ gãy cấu
trúc xoắn -7 và -4 (Tjalsma, et. al., 2000., Leite, 2011). Hai axit amin này đƣợc xem
là vị trí bẻ gãy các liên kết của xoắn α và hình thành nên cấu trúc kẹp tóc tại vị trí


11

chèn của các SP trên màng hay trên kênh vận chuyển. Vùng N và vùng H đều cần
cho quá trình nhận biết SP bởi SecA (Leite, 2011).
Vùng C (carboxyl – terminal) có chứa từ 3 – 7 axit amin và phải có cấu trúc
chuỗi β có chứa vị trí phân cắt bởi SPase (van Roosmalen et al., 2004). Vị trí này
thƣờng nằm ở -3 ÷ -1 (Dalbey & Von Heijne, 2002; Nielsen et al., 1997a; von
Heijne & Abrahmsèn, 1989) và thông thƣờng đặc trƣng bằng các axit amin Ala-XAla với X là axit amin bất kỳ. Vị trí -3 có thể đƣợc thay thế bằng các axit amin nhƣ:
Valine, Threonine, Leucin và Isoleucin. Trong các nghiên cứu về điểm nhận biết
phân cắt của SPase trên các SP trong Sec/P ở Bacillus có tới 71% là A-X-A, 18% là
V–X–A còn lại là một số axit amin khác. Đặc biệt vị trí -1 của điểm phân cắt của
SPase loại I đặc trƣng cho điểm phân cắt SP của preprotein trong B. subtilis (van
Roosmalen et al., 2004).
Các SP loại II giống với SP loại I nhƣng chứa một vùng đƣợc gọi là
“lipoprotein box” với trình tự bảo thủ Leu-Ala-Gly-Cys. Trong màng tế bào chất,
cystein trong trình tự này liên kết cộng hóa trị với lipid. Quá trình phân cắt các
lipoprotein diễn ra khi SP đƣợc phân cắt bởi SPase loại II. Sau đó, nhóm acyl (

)

sẽ đƣợc liên kết với cystein.
1.1.3.5. Peptide tín hiệu Tat/P (Twin Arginine Translocation pathway).
Vận chuyển protein theo Tat/P có sự tham gia của các cofactor là các ion kim
loại đóng vai trò trong các phản ứng oxi hóa khử và các SP cũng đƣợc phân cắt bởi
SPase I. TAT/P đƣợc phát hiện trong Thylakoit và sau đó đƣợc phát hiện có mặt
trong tất cả các vi khuẩn, vi khuẩn cổ (Berks et al., 2003; Kolkman et al., 2008).
Ngày nay, số lƣợng lớn các vi khuẩn đƣợc biết có trình tự Tat mang dạng motif Z –
R - R - X– Φ - Φ, trong đó, Z có thể thay thế bằng axit amin phân cực bất kỳ và Φ
đại diện cho các axit amin kỵ nƣớc và motif này cũng phù hợp với cơ chất cắt của
hệ thống Tat trong hầu hết các Thylakoid ở thực vật (Tjalsma et al., 2004; van Dijl
et al., 2002; Tjalsma et al., 2000b).