tiểu luận CHẤT màu CAROTENOID từ THỰC vật và VI SINH vật, NGUỒN gốc, đặc TÍNH và CHIẾT SUẤT

BỘ CÔNG THƯƠNG
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP TPHCM
VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ THỰC PHẨM

BỘ MÔN:

HÓA SINH THỰC PHẨM 2

TIỂU LUẬN
CHẤT MÀU CAROTENOID TỪ THỰC VẬT
VÀ VI SINH VẬT, NGUỒN GỐC, ĐẶC TÍNH
VÀ CHIẾT SUẤT

GVHD

: NGUYỄN THỊ MAI HƯƠNG

LỚP

: DHTP8B

NHÓM TH

: 19

1. TRẦN THỊ HỒNG

12137821

2. PHẠM THỊ TUYẾT LIÊU

12143771

3. HUỲNH ĐẶNG ÁNH NHỰT

12132561

TP. HCM, THÁNG 06 NĂM 2014
1


BẢNG PHÂN CÔNG CÔNG VIỆC
DANH SÁCH NHÓM

NHIỆM VỤ
Tìm tài liệu, lập dàn ý.

TRẦN THỊ HỒNG

Làm phần nguồn gốc và chiết suất
carotenoid

PHẠM THỊ TUYẾT LIÊU
HUỲNH ĐẶNG ÁNH NHỰT

Tìm tài liệu, làm phần giới thiệu chung và
ứng dụng của carotenoid
Tìm tài liệu, làm phần đặc tính, tính chất
của carotenoid, tông hợp bài.

2

MỤC LỤC

I. PHẦN MỞ ĐẦU
II. PHẦN NỘI DUNG ....................................................................................
1. GIỚI THIỆU CHUNG VỀ CAROTENOID ........................................... 6
1.1. Khái niệm ............................................................................................... 6
1.2. Phân loại ................................................................................................ 6
1.3. Vai trò .................................................................................................... 6
1.4. Một số carotenoid tiêu biểu ................................................................... 7
2. NGUỒN GỐC CỦA CAROTENOID ...................................................... 7
2.1. Từ thực vật........................................................................................... 10
2.2. Từ vi sinh vật ....................................................................................... 10
3. ĐẶC TÍNH, TÍNH CHẤT CỦA CAROTENOID ................................ 11
3.1. Tính chất vật lý .................................................................................... 11
3.2. Tính chất hóa học ................................................................................ 11
3.3. Hoạt tính sinh học................................................................................ 12
3.3.1. Tính chất chống oxy hóa của các carotenoid................................... 12
3.3.2. Hoạt tính phòng chống xơ vữa động mạch...................................... 12
3.3.3. Hoạt tính phòng chống ung thư ....................................................... 12
3.3.4. Hoạt tính bảo vệ mắt ........................................................................ 13
3.3.5. Hoạt tính bảo vệ da ........................................................................... 13
3


3.3.6. Hoạt tính chống viêm khớp .............................................................. 13
4. CHIẾT SUẤT CAROTENOID TỪ THỰC VẬT VÀ VI SINH VẬT.. 14
4.1. Phương pháp sắc kí cột ...................................................................... 14
4.2. Sắc ký bản mỏng ................................................................................. 14

4.3. Sắc ký lỏng hiệu năng cao ................................................................... 15
4.4. Sắc ký cột lọc gel .................................................................................. 15
4.5. Ngâm chiết .......................................................................................... 15
4.6. Phương pháp ly trích carotenoid ........................................................ 15
4.7. Chiết suất carotenoid từ lá trầu .......................................................... 16
4.8. Chiết suất carotenoid từ cà chua. ....................................................... 19
4.9. Sản xuất carotenoid theo quá trình chuyển gen E.coli ...................... 20
5. ỨNG DỤNG CỦA CHẤT MÀU CAROTENOID ................................ 21
5.2. Dùng làm thực phẩm ........................................................................... 22
5.1.Tạo màu cho sản phẩm ........................................................................ 23
KẾT LUẬN
TÀI LIỆU THAM KHẢO

4


I. PHẦN MỞ ĐẦU
Chất lượng của các sản phẩm thực phẩm không những bao hàm giá trị dinh
dưỡng mà còn bao hàm cả giá trị cảm quan. Màu sắc thực phẩm không những có
giá trị về mặt hình thức mà còn có tác dụng sinh lý rất rõ rệt. Màu sắc thích hợp
sẽ giúp cho cơ thể đồng hóa thực phẩm đó dễ dàng. Vì vậy trong kỹ thuật sản
xuất không chỉ bảo vệ màu sắc tự nhiên mà còn thêm chất màu mới tạo ra những
màu sắc thích hợp với tính chất và trạng thái của sản phẩm. Chất màu được sử
dụng rất nhiều loại màu khác nhau như clorofil chất màu xanh lá cây, carotenoid
màu da cam màu vàng và đôi khi màu đỏ, flavonoid màu đỏ xanh và vàng, các
chất màu vô cơ…được chiết suất từ nhiều nguồn gốc khác nhau từ thực vật, vi
sinh vật. Trong đó chất màu carotenoid có nguồn gốc, chiết suất từ thực vật và
vi sinh vật là chất có màu da cam, màu vàng và đôi khi màu đỏ. Là nhóm các
chất màu được biết đến từ rất lâu và được ứng dụng phổ biến trong sản xuất thực
phẩm. Đất nước ta với nhiều loại thực vật phong phú của miền nhiệt đới là

nguồn tài nguyên đa dạng để tìm kiếm thêm các loại carotenoid mới, làm
nguyên liệu đẻ sản xuất các carotenoid cung cấp cho nhu cầu sử dụng làm thuốc,
thực phẩm chức năng, mỹ phẩm, phẩm màu, phụ gia trong thực phẩm… Để
hiểu thêm về chất màu carotenoid nhóm chúng em tìm hiểu đề tài “chất màu
carotenoid từ thực vật và vi sinh vật, nguồn gốc, đặc tính và chiết suất”.

5


II. PHẦN NỘI DUNG
1. GIỚI THIỆU CHUNG VỀ CAROTENOID.
1.1. Khái niệm
Carotenoids là nhóm chất màu hòa tan trong chất béo làm cho quả và rau có
màu da cam, màu vàng và màu đỏ. Loại chất màu này không chỉ tìm thấy ở thực
vật mà còn trong những tế bào vi khuẩn, nấm, tảo và động vật. Nhóm này gồm
từ 65 tới 70 chất màu tự nhiên, tiêu biểu là carotene, licopene , xanthophylls ,
capsanthin,… và đến bây giờ người ta đã tìm được hơn 500 loại carotenoid.
Carotenoid là là nhóm tetraterpenoid, được tạo nên bởi 8 đơn vị isoprencce.
Carotenoid không phải là tên riêng của một chất nào mà là tên của một nhóm
các hợp chất có công thức cấu tạo tương tự nhau.
1.2. Phân loại
Theo cấu trúc hóa học: có 2 lớp là: carotenes và xanthophylls.
+ Carotenes : là hidrocarbon ,α-carotene , β-carotene, b-cryptoxanthin.
+ Xanhthophyll : có chứa các nhóm hidroxyl và keto, Lutein, zeaxanthin,
violaxanthin, neoxanthin , fucoxanthin.
Theo chức năng ( functionality ): nhóm carotenoids cơ bản ( primary
carotenoids ) và nhóm carotenoids chuyển hóa ( secondary carotenoids ).
+ Nhóm carotenoid cơ bản beta-carotene, neoxanthin, violaxanthin , zea
xanthin.
+ Nhóm carotenoid chuyển hóa: α-carotene , capsanthin, lycopene, Bixin .

1.3. Vai trò
Carotenoid là có bản chất tự nhiên: ngoài tác dụng tạo màu, carotenoid có
đặc tính sinh học quý giá.
Các –carotene chuyển thành vitamin A khi đi vào cơ thể; lycopen, lutein là
các chất chống oxy hóa rất mạnh, được xem là các yếu tố “vàng” đối với sức
khỏe.
6


Chúng không bị mất màu trong các sản phẩm không chứa acid ascorbic so
với việc sử dụng các hợp chất màu tổng hợp.
Carotenoid tạo ra sự thuận lợi cho việc sản xuất, kinh doanh vì được xem là
an toàn.
Carotenoid phổ biến ở nhiều loại thực vật và có nhiều chức năng.
1.4. Một số carotenoid tiêu biểu
1.4.1 Carotenes:
Carotenes là chất màu thuộc nhóm màu
carotenoid.
Có hoạt tính tiền vitamin A: gồm các hợp
chất carotene mà nổi bật là - carotene, một
hợp chất có tiền vitamin A mạnh nhất.
Không có hoạt tính tiền vitamin A: gồm các
hợp chất lycopene, annatto, extract ( là dịch
chiết từ một loại hạt gọi là achiote, có nhiều ở
châu Mỹ, chứa các hợp chất bixin và dẫn xuất
norbixin), paprika extract ( là dịch chiết từ
một loại ớt đỏ Ấn Độ, chứa các hợp chất tạo
màu thuộc carotenoids).
Carotene có trong cà rốt, mơ, có màu da cam đặc trưng. Caroten thường ở
các

dạng
đồng phân : α – Caroten, , γ – Caroten, β – Caroten.

7


Trong đó, β – Caroten quan trọng nhất và tìm thấy được nhiều trong rau
củ.Có màu vàng, có nhiều trong cà rốt, các trái cây có màu vàng, màu xanh
đậm.Chính màu vàng của β – Caroten làm nền cho màu xanh của diệp lục tố
đậm hơn các loại rau nghèo β – Carotene.
Tác dụng:
β – Carotene là chất chống oxi hóa mạnh, ngăn chặn tế bào ung thư, chống sự
hình thành của các cục máu đông trong thành mạch máu. Khi được hấp thu vào
cơ thể, β – Carotene chuyển hóa thành vitamin A giúp bảo vệ niêm mạc mắt,
tăng cường miễn dịch cơ thể. Trong các thí nghiệm cho rằng 300mg, β –
Carotene mỗi ngày làm tăng tỉ lệ ung thư phổi và ung thư tuyến tiền liệt ở người
hút thuốc và những người có tiền sử với chất gây nghiện.
1.4.2 Licopen
Licopen là một carotene màu
đỏ tươi, có trong quả cà chua và
một số quả khác. Màu đỏ của cà
chua chín chủ yếu do có mặt
licopen mặc dầu trong cà chua
còn có một loạt các Carotenoit
khác
nữa
như:
fitoflutin,
αCaroten, γ – Caroten, β –
Caroten.

Là một hidrocacrbon không
bão hòa, là một tetraterpene lắp
ráp từ tám đơn vị isoprene, hoàn
toàn bao gồm carbon và hydro. Trong quá trình chín, hàm lượng của licopen
tăng lên 10 lần. Tuy nhiên chất này không có hoạt tính vitamin.

8


Là một chất có thể trung hòa các chất hóa học gây lão hóa làn da. Ở thực vật,
tảo và các sinh vật quang hợp khác, lycopen là một chất trung gian quan trọng
trong việc sinh tổng hợp của nhiều carotenoid. Bằng cách tạo thành vòng ở một
đầu hoặc cả hai đầu của phân tử licopen thì sẽ được các đồng phân α, β, γ –
caroten.
Tất cả những carotene tự nhiên khác đều là dẫn xuất của licopen và carotene.
Chúng được tạo thành bằng cách đưa nhóm hydroxyl, cacbonyl hoặc metoxy
vào mạch, nhờ phản ứng hydro hóa hoặc oxy hóa.
1.4.3 Xantofil:
Là các dẫn xuất có chứa oxygen, trong đó có nhóm keto, hydroxyl hoặc
epoxy nên chúng có độ phân cực lớn hơn. Các hợp chất xantofil nổi bật là
zeaxanthin, lutein, canthaxanthin, cryptoxanthin…
Xantifil có công thức C40H56O2 và có được bằng cách gắn thêm hai nhóm
hydroxyl vào phân tử α – caroten, do đó có tên 3,3– dihydroxy - α – caroten.
Xantofil là nhóm sắc tố màu vàng sẫm nhưng màu sáng hơn caroten vì nó
chứa ít một nối đôi hơn. Trong lòng đỏ trứng gà có 2 xantofil là dihydroxyl - α caroten và dihydroxyl – β – caroten với tỷ lệ 2 : 1. Xantofil cùng với caroten
chứa trong rau xanh và cùng với caroten và licopen có trong cà chua, rau dền, củ
dền, cải tím,…

9

1.4.4 Capxantin:
Capxantin có công thức C40H58O3.
Capxantin là chất màu vàng có trong ớt đỏ. Capxantin chiếm 7/8 chất màu
của ớt.

Chất màu này là dẫn xuất của caroten, nhưng có màu mạnh hơn các
carotenoit khác 10 lần. Trong ớt đỏ có các carotenoit nhiều hơn ớt xanh 35
lần….
2. NGUỒN GỐC CỦA CAROTENOID
Nhóm carotenoid rất phong phú về số lượng cũng như màu sắc nên các chất
màu carotenoid được tìm thấy từ nhiều nguồn khác nhau trong thiên nhiên.
2.1. Từ thực vật
Các carotenoid tồn tại ở phần diệp lục của mô xanh, thường bị che lấp bởi
sắc tố chlorophyll và chỉ khi sắc tố chlorophyll bị mất đi thì màu carotenoid mới
hiện ra khi trái cây chín thì màu xanh bị mất dần và hiện ra các màu đỏ, vàng,
cam của carotenoid. Còn khi carotenoid phân bố ở các mô thường (không có
chlorophyll) thì tạo màu vàng, cam hay đỏ cho quả.
2.2. Từ vi sinh vật
Carotenoid là chất nội bào của một số loài vi sinh vật như: vi khuẩn: giống
Brevibacterium tạo canthaxanthin, Flavobacterium tạo zeaxanthin; nấm men:
Rhodotorula; nấm mốc: Neurospora crassa, Penicillium sclerotiorum, Mucorals
choanophoracea,…; tảo: Dunadiella.
Ngày nay với sự phát triển của công nghệ gen, người ta đã phân lậpđược loài
Phycomyces blakesleanus, Blakesleatripora có khả năng tổng hợp được 10


carotene. Dưới tác dụng của tress, áp suất cao, nhiệt độ cao, nồng độ muối,
khoáng cao,… các giống tảo Dunadiella và Haemotococcus chuyển từ màu xanh
sang màu cam vì một lượng lớn carotenoid được tạo ra ở lục lạp và tích lũy trên

thành tế bào hoặc ở dạng những giọt béo: Dunadiella tạo -carotene; còn
Haemotococcus tạo astaxanthin.
3. ĐẶC TÍNH, TÍNH CHẤT CỦA CAROTENOID
3.1. Tính chất vật lý
Kết tinh ở dạng tinh thể, hình kim, hình khối lăng trụ, đa diện, dạng lá hình
thoi.
Nhiệt độ nóng chảy cao: 130- 2200C.
Có độ hòa tan cao,không tan trong nước. Hòa tan trong chất béo, các dung
môi chứa clor và các dung môi không phân cực khác làm cho hoa quả có màu da
cam, màu vàng, màu đỏ.
Màu sắc của carotenoid được tạo ra nhờ sự có mặt của hệ các nối đôi liên
hợp trong phân tử . Phần lớn các nối đôi này có cấu hình dạng trans . Khả năng
hấp thụ sóng mạnh nhất ở những bước sóng khác nhau của hệ nối đôi liên hợp
được sử dụng để phân tích cấu trú , định tính cũng như định lượng carotenoid .
Tính hấp thụ ánh sáng:chuỗi polyne liên hợp đặc trưng cho màu thấy được
của carotenoid. Dựa vào quang phổ hấp thu của nó, người ta thấy khả năng hấp
thụ ánh sáng phụ thuộc vào nối đôi liên hợp, phụ thuộc vào nhóm C9 mạch
thẳng hay mạch vòng, cũng như các nhóm chức gắn trên vòng. Ngoài ra trong
mỗi dung môi hòa tan khác nhau, khả năng hấp thụ ánh sáng tối đa cũng khác
nhau với cùng một loại. Khả năng hấp thụ ánh sáng mạnh,chỉ cần một gam cũng
thấy bằng mắt thường.
3.2. Tính chất hóa học
Carotenoids nhạy cảm với oxi và ánh sáng . Khi các tác nhân này bị loại bỏ,
carotenoid trong thực phẩm rất bền, kể cả ở nhiệt độ cao.
Một trong những đặc điểm của carotenoit là có nhiều nối đôi luân hợp tạo
nên những nhóm mang màu của chúng. Màu của chúng phụ thuộc vào những
nhóm mang màu này.
Dễ bị oxi hóa trong không khí, cần bảo quản trong khí trơ, chân không.Ở
nhiệt độ thấp nên bao kín tránh ánh sáng mặt trời. Carotenoid khi bị oxy hóa:
11

+ Làm giảm chất lượng thực phẩm.
+ Làm thay đổi màu sắc của thực phẩm.
Tạo ra nhiều chất mùi. (hợp chất có mùi thơm như aldehide không no
hoặc ketone đóng vai trò tạo hương thơm cho trà).
Rất nhạy đối với acid và chất oxi hóa, bền vững với kiềm.Do có hệ thống nối
đôi liên hợp nên nó dễ bị oxy hóa mất màu hoặc đồng phân hóa, hydro hóa tạo
màu khác.
3.3. Hoạt tính sinh học
3.3.1. Tính chất chống oxy hóa của các carotenoid
Carotenoid là chất chống oxy hóa tự nhiên có khả năng bắt giữ oxy đơn phân
tử (oxy singlet) và các gốc tự do. Có khả năng bảo vệ quang hóa.
Carotenoid có khả năng hạn chế tác hại của các gốc oxy tự do. β – Carotene
cóa khả năng bảo vệ tế bào nhờ khả năng ức chế quá trình oxy hóa chất béo do
các gốc tự do gây ra.
3.3.2. Hoạt tính chống xơ vữa động mạch
Nguyên nhân của chứng xơ vữa động mạch là do sự tạo thành các cholesterol
LDL oxy hóa.
Carotenoid có khả năng ngăn chặn sự tạo thành LDL oxy hóa và các
peroxide của chất béo.
3.3.3. Hoạt tính chống ung thư
Carotenoid có khả năng ngăn chặn sự khởi phát, sự tăng sinh của tế bào ung
thư cũng như sự tiến triển của căn bệnh này.
Cơ chế có thể là nhờ khả năng làm tăng sự điều hòa trao đổi thông tin giữa
các tế bào do làm tăng biểu hiện của gen kết nối p53, bảo vệ AND khỏi sự tấn
công của các gốc tự do và tăng sự điều hòa chức năng miễn dịch.
β – Carotene có khả năng tiêu diệt các chất bạch sản (leukoplakia), là chất
gây tổn thương tiền ác tính của ung thư vòm họng, đồng thời việc bổ sung β –
Carotene có thể làm tăng lượng nhân tố tiêu diệt khối u TNF – α trong huyết

tương.

12


Lycopene cũng là một carotenoid có tác dụng phòng chống nhiều căn bệnh
ung thư, đặc biệt là đối với ung thư tuyến tiền liệt, ung thư phổi và ung thư dạ
dày.
Lycopene còn có khả năng ngăn chặn sự phát triển u ngực, có tác dụng ức
chế sự tăng sinh tế bào ung thư màng trong dạ con.
Giúp phòng chống một số bệnh: ngăn ngừa ung thư tiền liệt tuyến, ung thư
phổi. Giải độc, bảo vệ gan, đặc biệt là chống ung thư gan, ung thư vú, ung thư
cổ tử cung có nguy cơ cao ở phụ nữ độ tuổi 30- 45; giúp chống đột quỵ; chống
oxy hoá, có tác dụng chống các bệnh tim mạch ở những người không hút thuốc
(Nghiên cứu của Manfed Engger do Folr (chương trình nghiên cứu về dinh
dưỡng DSM )); giảm chứng viêm khớp. Bảo vệ da. Có tác dụng tăng sức đề
kháng cho cơ thể cải thiện trí nhớ, tác động đến bộ não.
3.3.4. Hoạt tính bảo vệ mắt
β – Carotene là tiền chất của vitamin A.
Carotenoid đóng vai trò như là các chất bảo vệ quang hóa, bảo vệ các protein
của mắt khỏi sự oxy hóa.
Có chức năng bảo vệ mắt. Lutein và zeaxanthin hấp phụ những phổ ánh sáng
có năng lượng cao và có hại nhất của ánh sáng mặt trời, kìm hãm việc hoạt hóa
các gốc tự do, ngăn chặn phản ứng kích hoạt của ánh sáng, bảo vệ thị giác.
3.3.5. Hoạt tính bảo vệ da
Carotenoid, đặt biệt là lycopene, do tính chất bảo vệ quang hóa, là tác nhân
rất hữu hiệu trong các phản ứng nhạy quang, nên có tác dụng bảo vệ, phòng
cống ung thư da.
Carotenoid thiên nhiên có tác dụng kích thích sự hình thành sắc tố melanin
và chống lại các gốc tự do.

Vitamin A còn giúp tạo lập tế bào lympho làm tăng khả năng đề kháng của
cơ thể, do đó hạn chế các bệnh nhiễm trùng đặc biệt là nhiễm trùng da.
Lycopen có tác dụng cực kỳ quan trọng đối với sắc đẹp. Giúp quá trình
chuyển hoá chất trong tế bào làm đẹp da, tóc, tăng sức đề kháng cho da,
chống lão hoá da.
3.3.6. Hoạt tính chống viêm khớp
13


Nhiều nghiên cứu đã khẳng định khả năng giảm viêm sưng của nhóm chất
carotenoid. Các điều tra về dịch tễ học đã cho thấy mức tiêu thụ trung bình β –
cryptoxanthin và zeaxanthin ở những bệnh nhân viêm khớp thấp hơn từ 20-40%
so với người khỏe mạnh. Những người tiêu thụ β – cryptoxanthin và zeaxanthin
nhiều nhất có nguy cơ mắc bệnh viêm đa khớp chỉ bằng một nửa so với nhóm
tiêu thụ ít nhất. Lutein và ly copene lại không có hoạt tính này.
4. CHIẾT SUẤT CAROTENOID TỪ THỰC VẬT VÀ VI SINH VẬT
Một số phương pháp chiết xuất và tinh chế các carotenoid:
4.1. Phương pháp sắc kí cột
Sắc ký cột là phương pháp mà chất nhồi (là pha tĩnh: hấp phụ, trao đổi ion,
phân gen) được nhồi vào cột, dùng để phân chia các chất trong hỗn hợp và tinh
chế các chất. Phương pháp sắc ký dựa vào sự phân bố khác nhau của các chất
giữa hai pha động và tĩnh.
Cách tiến hành:
 Nút kín bình ở bên dưới của cột sắc kí 600 × 40–mm bằng len thủy tinh.
 Đặt cột sắc kí trên một hệ thống lọc chân không, dung bình lọc 1 lit để làm
bình thu nhận.
 Đặt một lớp chất hấp phụ dài khoảng 20cm bên trong cột.
 San bằng lớp chất hấp phụ và rải lên trên một lớp Na2SO4 khan dày
khoảng 2cm.
 Rót chất rửa giải carotene vào trong cột cho tới khi chất rửa giải thấm ướt

hoàn toàn chất hấp phụ.
 Thay bình thu nhận bằng một cái bình sạch và rót phần dịch chiết vào
trong cột.
 Tất cả các chất sẽ được thấm vào lớp chất hấp phụ sau đó tiến hành rửa giải
carotene cho tới khi các carotenoid tách biệt thành từng dải riêng biệt thì thu
nhận vào bình.
4.2. Sắc ký bản mỏng
Lượng 0,1gr cao khô các mẫu thực vật chứa carotenoid được hòa tan lại với
1ml hệ dung môi sắc ký bản rồi đem ly tâm ở 40C để loại bỏ cặn không tan, thu
14


lại cao bằng bốc hơi cách thủy. Cao được hòa tan lại với 1ml dung môi sắc ký để
chấm lên bản sắc ký silicagel tráng sẵn.
4.3. Sắc ký lỏng hiệu năng cao
Pha động: acetonitrine:methanol:chloroform = 55:23:22 (v/v/v).
Tốc độ dòng 0,85 ml/phút, thời gian chạy 20 phút.
Nhiệt độ 300C, pH 2-8.
Pha tĩnh: cột silical gep C18, trên máy HPLC-10Av, Shimazu.
4.4. Sắc ký cột lọc gel
Cột lọc gel Pharmacia Biotech chiều dài 40 cm, đường kính 1.5 cm. Pha tĩnh
là hạt silicagel (Merck) có kích thước 0.063 x 0.2 mm. Pha động là hệ dung môi
rửa giải ether dầu hoả : acetone được pha theo tỷ lệ tương ứng 90:10. Nhiệt độ:
300C.
Cân 20 g silicagel ngâm trong hệ dung môi rửa giải trong 24 giờ, sử dụng để
nhồi cột. Mẫu chứa carotenoid đưa lên cột được chuẩn bị như sau: cân 2 gr mẫu
thực vật, hoà tan với 10 ml ether dầu hoả : acetone (95/5, v/v), để lắng, sau 1 giờ
lọc bỏ cặn thu phần dịch phía trên khoảng 8 ml. Tốc độ dòng chạy của bơm nhu
động là 20 ml/giờ, thu mỗi phân đoạn là 2ml cho đến khi các chất trên cột được
đẩy ra hết. Các phân đoạn được đo mật độ quang phổ với các bước sóng hấp phụ

cực đại tương ứng với từng chất. Các phân đoạn có cùng độ hấp phụ quang học
giống nhau, giống với chất chuẩn được gộp lại thu được dịch chứa carotenoid
tinh sạch. Dung dịch được đem bốc hơi cách thủy để thu carotenoid ở dạng tinh
khiết, khô, có màu đặc trưng.
4.5. Ngâm chiết
Lượng 10gr bột khô mẫu thực vật chứa carotenoid được trộn đều với 100ml
dung môi ether dầu hỏa (acetone), ngâm trong bình kín, tối màu, qua đêm (2448h). Dung dịch ngâm được lọc qua phễu có giấy lọc để thu dịch trong, đem cô
bằng hệ thống cô quay thu hồi dung môi để thu cao chiết.
4.6. Phương pháp ly trích carotenoid
Ly trích (chiết) là phương pháp dùng một dung môi (đơn hay hỗn hợp) để
tách lấy một chất hay một nhóm các chất từ hỗn hợp cần nghiên cứu. Trường
hợp thường gặp nhất là sự chiết hoạt chất từ dung dịch nước vào dung môi hữu
15


cơ. Dung môi có tỷ trọng nhỏ hơn sẽ ở lớp trên như: eter, benzene, các
hyđrocacbua,… dung môi có tỷ trọng lớp hơn sẽ ở lớp dưới như: chloroform,
tetracloriccacbon, dicloetan,… khi trộn lẫn 2 pha nước và dung môi hữu cơ với
nhau pha này có thể khuếch tán một ít sang pha kia nhưng về cơ bản một pha
vẫn là nước và pha kia vẫn là dung môi hữu cơ.
Chúng ta dùng dung môi hexane (hoặc hexane/acetone) để ly trích các sắc tố
carotenoid.
Cách tiến hành:
 Nguyên liệu được khử nước tại bình trích ly 500 ml.
 Thêm vào ba lần thể tích dung dịch trích ly (hexane/acetone 1:1(v/v) hoặc
hexane) sau đó trộn đều trong vòng 15 phút bằng “máy trộn trục chống nổ” để
huyền phù dung dịch. Không được gia nhiệt.
 Kết hợp hệ thống lọc chân không với giấy lọc Whatman để lọc dung dịch
và thu hồi dịch lọc
 Phần dịch được lọc này loại các chất bẩn bằng giấy lọc. có thể trích ly thêm

lần nữa bằng cách thêm vào 2 lần thể tích chất chất ly vào bã vừa được lọc, tiến
hành lọc cho đến khi quan sát không thấy rõ được màu của phần dịch chiết.
 Phần dịch chiết được cô đặc khoảng 40ml bằng Thiết bị bốc hơi quay đi
kèm máy bơm chân không tại nhiệt độ ≤ 55°C.
 Thêm vào 3ml dung dịch xà phòng hóa và khuấy đều khoảng 45 phút tại
56°C.
 Chuyển phần dịch chiết đã được xà phòng hóa sang phễu chiết 125ml và
thêm vào đó một lượng dung dich khử muối bằng thể tích của dịch chiết.
 Phần đáy còn lại được rửa sạch bằng nước để lấy được một cách tối đa dịch
chiết.
 Thêm vào 3 g Na2SO4 sau đó tiến hành lọc bằng giấy lọc whatman và cất
giữ phần dịch lọc.
4.7. Chiết suất carotenoid từ lá trầu

16


Nguyên liệu :
Trầu còn gọi là trầu không có tên khoa học là Piper betle L, thuộc họ hồ tiêu
(Piperaceae) chỉ được trồng rải rác để thu hoạch lá.
Phương pháp:
Lá trầu tươi đem chưng cất theo hơi nước tách tinh dầu. Bã đen xà phòng hóa
với dung dịch NaOH trong cồn. Trích carotenoid trong dịch cồn bằng ete dầu.
Dịch ete dầu đem tinh chế bằng cách rửa tuần tự với hỗn hợp CH3OH 85% bão
hòa KOH, rửa nước, rửa bằng CH3OH 80%. Cô cạn dịch ete dầu sản phẩm là
các tinh thể carotenoid hình kim màu vàng.
Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tách chiết carotenoid được khảo sát là:
thời gian, lượng kiềm, thể tích cồn sử dụng để xà phòng hóa bột lá, lượng ete
dầu để trích carotenoid. Bằng cách đo độ hấp thu A của dịch ete tại λ = 475nm.
A càng lớn lượng carotenoid trích được nhiều.

Quy trình thực nghiệm:

17


Thuyết minh qui trình:
Cân 200g lá trầu xay nhuyễn. Ngâm trong 500ml dung dịch NaCl 10%
khoảng ½ giờ.Tiến hành chưng cất theo hơi nước có hồi lưu. Tách tinh dầu. Lọc
hỗn hợp. Phần bã đem xà phòng hóa trong dung dịch NaOH /cồn (15g NaOH,
500ml cồn trong 2giờ ở 50oC). Lọc hỗn hợp. Dịch cồn thu được đem cô cạn
khoảng 50% thể tích dưới áp suất thấp. Tách chiết carotenoid với ete dầu hỏa
(nhiệt độ sôi 45 – 65oC) khoảng 3 lần, mỗi lần 200ml có khuấy trộn khoảng 30
phút ở nhiệt độ thường. Thêm nước vào hỗn hợp để sự phân lớp rõ. Tách dịch
ete dầu , rửa sạch kiềm. Rửa dịch ete tuần tự trong hỗn hợp CH3OH 85% bão
hòa KOH rồi rửa nước và rửa lần nữa với CH3OH 80%. Các lần rửa cần khuấy
trộn, để lắng tách lớp rõ. Dịch ete qua tinh chế được cô cạn trong chân không.
Chất rắn thu được hòa tan trong ete etylic để bốc hơi dung môi tự nhiên có các
tinh thể hình kim tạo thành.

18


4.8. Chiết suất carotenoid từ cà chua.

Chuẩn bị nguyên liệu: Nên chiết suất carotenoid từ nguyên liệu tươi.
Đồng nhất mẫu chiết: bằng phương pháp nghiền hoặc kết hợp với giã.
Các dung môi và hệ dung môi thường sử dụng là: acetone, acetone : nhexane (4:6), n-hexane : isopropanol (3:2), người ta thường dùng n-hexane và
diethyl ether làm dung môi đẻ tách chiết các carotenoid từ cà chua.
Có thể bổ sung MgCO3 và các tác nhân trung hòa khác để trung hòa các acid
hữu cơ có trong mẫu để tránh sự phân hủy và đồng phân hóa.

Lọc dịnh chiết bằng phễu lọc thủy tinh hoặc dùng phễu Buchner.
Tiến hành tách nước và dung môi ra khỏi dịch chiết bằng cách bổ sung ete
dầu hỏa, dietyl ete, diclorometan hoặc hỗn hợp của chúng.
Xà phòng hóa bằng KOH, có bổ sung chất chống oxy hóa BHT, để loại
chlorophyl và các chất béo khác, thu carotenoid tổng.
Để tách carotenoid tinh khiết người ta thường sử dụng phương pháp sắc ký
cột, HPLC điều chế.

19


4.9. Sản xuất carotenoid theo quá trình chuyển gen E.coli

 Escherichia coli là vật chủ đầu tiên thể hiện chức năng biểu hiện gen của
các gen sinh tổng hợp carotene để phân tích chức năng của các enzyme tương
ứng. Thêm vào đó, vi khuẩn này có thể biểu hiện gen khác loài của các enzym
sinh tổng hợp carotene riêng biệt giống như là các protein chức năng cho sự
thanh lọc và truyền lại các đặc tính sinh hóa của chúng. Escherichia coli là một
vật chủ rất thuận tiện trong việc sản xuất carotenoid từ vi sinh vật khác loại. Nhờ
sự sinh sôi nhanh chóng và dễ dàng với số lượng đáng kểmột plasmid có thể
mang các gen cần thiết để có thể thu được carotenoid trung gian nhất định và
mang những gen khác để thay đổi hệ thống cấu trúc. Có thể nói rằng E. coli làm
tăng sự linh hoạt để xây dựng một con đường sinh tổng hợp carotenoid như
mong muốn. Một số plasmid khác có thể biểu hiện các gen nhất định nhằm tăng
cường khả năng trao đổi chất của E. coli để cung cấp tiền chất carotenoid.
 Phần lớn các vi khuẩn, bao gồm cả E. coli, hình thành các pyrophosphates
prenyl, mà đó là tiền thân của carotenoids, được hình thành thông qua một chuỗi
phản ứng khác với chu trình mevalonate (đường trao đổi chất trong các sinh vật
nhân chuẩn và một vài loài vi khuẩn). Nó được gọi là chu trình 1deoxyxylulose-5-phosphate, bởi vì đây là sản phẩm trung gian đầu tiên, hoặc là
chu trình 2-C-methyl-D-Erythritol-4-phosphate, bởi vì đây là sản phẩm đầu tiên

được chuyển đổi thành prenyl pyrophosphate.
 Sản phẩm này có thể là điểm phân nhánh để tạo thành isopentenyl
pyrophosphate(IPP) và pyrophosphate dimethylallyl (DMAPP) bằng con đường
riêng biệt.. Sự cung cấp tiền thân của các gen sinh caroten có thể tăng lên trong
E. coli bằng sự biểu hiện gen của các enzyme giới hạn trong chu trình
deoxyxylulose-5-phosphate và các phản ứng tiếp theo. Pyrophosphates prenyl và
các gen sinh carotene tiếp theo được cung cấp bởi các biến đổi của các enzyme
20


1-deoxy-D-xylulose-5-phosphate synthase, 1-deoxy-D-xylulose-5-phosphate
reductoisomerase và IPP isomerase được mã hóa gen dưới một promoter mạnh.
Vì geranylgeranyl pyrophosphate là cơ chất trực tiếp để hình thành carotenoid
đầu tiên trong quá trình và mức độ của nó tương đối thấp trong E. coli, mức độ
biểu hiện gen cao của enzyme synthase pyrophosphate geranyl rất quan trọng
đối với các gen sinh tổng hợp carotene . Một lối đi hẹp cho việc sinh tổng hợp
chất carotenoid trong E. coli đã được giải quyết bằng sự biểu hiện gen enzyme
synthase phosphoenolpyruvate được mã hóa (một enzyme phân hủy pyruvat).
Bằng sự biểu hiện gen của các tổ hợp gen khác nhau đã được nêu ở trên, sẽ cho
một sản lượng carotenoid cuối cùng là 1,5 mg / g trọng lượng khô có thể đạt
được.
Kết quả
- Escherichia coli là vi sinh vật đầu tiên được đưa vào quá trình sinh tổng
hợp carotenoid. Các tế bào sinh caroten thu được khi tổ hợp gen từ loài Erwinia
được phân tích các chức năng. Sự biểu hiện của các gen riêng rẽ dẫn đến sự tích
lũy sản phẩm cuối cùng là zeaxanthin diglucoside và những sản phẩm trung gian
như phytoene, lycopene, _-carotene, and zeaxanthin. Những carotenoid khác
được hình thành từ đó bằng cách tổ hợp gen của những vi sinh vật khác nhau.
Dựa vào cấu trúc và lượng carotenoid tạo thành có thể thấy đựơc sự thay đổi rất
rõ các sắc tố của E.coli từ màu vàng đến màu cam và màu đỏ.

- Các gen được dùng để sản xuất carotenoid trong E.coli không chỉ có ở vi
khuẩn mà còn có ở nấm, tảo và các thực vật bậc cao. Ban đầu ba enzyme được
mã hóa bởi các gen của vi khuẩn (crtE, crtB, and crtI) xúc tác hình thành
lycopene. Sau đó, một enzyme monocyclase từ nấm Al-2 được thay thế, hình
thành _- carotene. Trong phân tử này, enzyme hydroxylase từ thực vật (Bhy)
làm xuất hiện nhóm 3-hydroxy.Do chức năng của tất cả các enzym này trong vi
sinh vật khác E.coli, hình thành nên sản phẩm cuối cùng là 3-hydroxy-carotene.
Sự tổng hợp các carotenoid mới lạ bằng quá trình chuyển gen từ những sinh vật
khác nhau chỉ hoạt động dựa trên cơ chất đặc trưng của enzyme, như vậy
enzyme không cần phải nhận ra toàn bộ phân tử cơ chất, mà chỉ cần nhận ra
những khu vực phân tử cơ chất phù hợp cho việc chuyển đổi. Phương pháp tổ
hợp gen này có thể sản xuất đựơc carotenoid một cách hoàn toàn mới.
5. ỨNG DỤNG CỦA CHẤT MÀU CAROTENOID
- Ngoài nguốn carotenoid từ những thực phẩm, hoa quả; các nha khoa học, còn
khuyên dùng các sản phẩm bổ sung (Thực phẩm chức năng,..) trong một số
trường hợp thiếu hụt.
21


- Từ khả năng chống oxy hóa của lutein cũng như β-caotene, lycopene cho nên
hiện nay các nhà nghiên cứu đã tọ ra một sô sản phẩm chức năng với mục đích
đưa ra một sản phẩm có tác dung bổ sung dinh dưỡng cho mắt, bảo vệ mắt khỏi
tia UV ánh sáng mặt trời, tăng cường hoạt động của điểm vàng. Đây là hướng
thu hút nhiều sự quan tâm của các nhà nghiên cứu trên thế giới, đặt biệt là ở Việt
Nam, là nước đang phát triển với tài nguyên dồi dào.
- Tổ chức Food Additives and Contaminants Committee (FACC) đã chấp nhận
cho sử dụng các chất màu vào thực phẩm,kèm theo danh mục các chất màu được
sử dụng.
- Các loại carotenoid và ly trích chứa carotenoid đã được sử dụng để làm chất
tạo màu cho sản phẩm . Carotenoid cũng có nhiều ứng dụng trong lĩnh vực dược

phẩm, trị liệu.
5.1.Tạo màu cho sản phẩm:

Bằng cách gián tiếp hoặc trực tiếp
- Gián tiếp:
Carotenioid còn trong nguyên liệu hay đã ly trích được trộn với thức ăn gia
súc làm đậm thêm màu vàng, đỏ của lông, da, trứng, thịt gia súc, gia cầm.
Ví dụ: lúc trước người ta trộn cỏ linh lăng và bắp có chứa zeaxanthin và
lutein vào thức ăn của gà con và lòng đỏ trứng sẽ đậm hơn. Sau này người ta cho
22


chất màu đã chiết hoặc chất màu tổng hợp vào thức ăn súc vật sẽ mang lại hiệu
quả cao hơn, quy trình đơn giản hơn.
- Trực tiếp:
Nếu bổ sung gián tiếp sẽ không mang lại lợi ích nhiều về kinh tế, sự lợi
nhuận và tính đồng đều của sản phẩm, vậy nên người ta tiềm ra biện pháp mới là
bổ sung trực tiếp.
Người ta tạo ra dạng bột màu sấy phun, có thể phân tán tốt trong cả nước
nóng và lạnh, rất bền màu. Canthaxthin ở dạng bột sấy kho giữ được khoảng 93100% cường độ màu trong 1 năm. Các dạng thương phẩm thông dụng là dạng
nhũ tương (beta – carotene), dạng bột tang trong nước (beta – carotene và
canthaxanthin).
5.2. Dùng làm thực phẩm:
- Các carotenoid có vòng beta – ionone ở đầu phân tử có thể chuyển hóa
thành các Vitamin A nên được gọi là Provitamin A. Beta – carotene có hoạt tính
Provitamin A cao nhất vì có cả 2 nhóm beta – ionone ở 2 đầu. Trong 600 loại
carotenoid chỉ có khoảng 38 loại có hoạt tính vitamin. Khi bổ sung chúng vào cơ
thể, chúng sẽ tích lũy ở các tế bào gan, khi cần thiết chúng sẽ chuyển hóa thành
Vitamin A (C20).
- Vitamin A giữ vai trò quan trọng trong cơ thể con người. Nó bảo vệ biểu bì

mô, tham gia tạo rhodopsin duy trì tính nhạy ánh sáng của mắt, vận chuyển oxy
nhờ hệ nối đôi liên hợp, tham gia trao đổi protein, glucid, lipid, muối khoáng…
Ngoài tác dụng cung cấp Provitamin A, sự bổ sung các loại carotenoid
(lycopene, beta – carotene, astaxanthin, phyotene, phyoteofluence) vào thức ăn
còn có tác dụng ức chế sự tăng sinh của các tế bào ung thư vú và nội mạc tử
cung. Cơ chế chống tác nhân gây ung thư là chống oxy hóa của các hợp chất
caotenoid.
Beta – carotene dùng để trị liệu làm giảm các biến chứng của bệnh nhạy với
ánh sáng. Tác dụng chống oxy hóa của beta – carotene sẽ bảo vệ da, giảm đau
đớn.
Chất màu carotenoid còn sử dụng trong dược phẩm đơn giản giản chỉ để tạo
màu cho các loại thuốc viên nén, con nhộng, thuốc nước…

23


Dùng để sản xuất các chế phẩm làm giảm nồng độ LDL toàn phần, giảm kích
thước mảng lắng đọng cholesterol và độ dày thành mạch máu; cải thiện các bệnh
lý về tim mạch.
Tia cực tím trong ánh nắng mặt trời tạo ra nhiều gốc tự do gây tổn hại các tế
bào da. Các vitamin và dưỡng chất có khả năng chống oxy hóa thường tập trung
rất nhiều ở da, như β – Caroten , vitamin E và C. Sử dụng chế phẩm β – Caroten
làm tăng đáng kể nguồn dự trữ β – Caroten ở da, giúp bảo vệ làn da.
Chế phẩm β – Caroten làm tăng hoạt động của tế bào tiêu diệt tự nhiên, thúc
đẩy hoạt động của các tế bào hệ miễn dịch.

24


KẾT LUẬN

Qua đề tài này chúng em đã hiểu rõ thêm về chất màu carotenoid có vai trò
quan trọng trong thực phẩm. Cũng như trong các bữa ăn hằng ngày thì nhờ có
các chất màu góp phần tạo nên màu sắc sặc sỡ, bách mắt cho người dùng cảm
thấy ngon miệng hơn, làm tăng giá trị cảm quan thực phẩm. Qua đó, chúng ta
nhận biết được nguồn gốc tự nhiên của các chất màu là như thế nào, đươc lấy từ
tự nhiên thì sẽ không gây hại đến sức khỏe, giúp chúng ta chọn lựa các chất màu
được thu hồi từ tự nhiên sẽ làm thực phẩm trở nên ngon hơn. Và những ứng
dụng của chất màu nói chung, carotenoid nói riêng đã góp phần cho ngành công
nghệ thực phẩm ngày càng phong phú và đặc sắc hơn. Tuy nhiên, nếu chúng ta
sử dung quá liều lượng và không đúng quy định sẽ gây ngộ độc và các bệnh như
gan, suy thận, rối loạn chuyển hóa, uung thư….. Như vậy, chất màu, ngoài việc
làm tăng cảm quan thực phẩm thì còn có thể là nguyên nhân của những vấn đề
sức khỏe nghiêm trọng. Vì vậy chúng ta cần sử dụng đúng liều lượng cho phép
và chon lựa những chất có sẵn trong tự nhiên một cách hợp lí để sử dụng an toàn
cho sức khỏe.

25