PHẠM VIỆT HÙNG NGHIÊN cứu đặc điểm THỰC vật và THÀNH PHẦN TINH dầu cây RE RỪNG (NEOCINNAMOMUM DELAVAYI (LECOMTE) h LIU) THU hái ở HUYỆN QUẢN bạ, hà GIANG

BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

PHẠM VIỆT HÙNG

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT
VÀ THÀNH PHẦN TINH DẦU CÂY RE
RỪNG (NEOCINNAMOMUM DELAVAYI
(LECOMTE) H. LIU) THU HÁI Ở
HUYỆN QUẢN BẠ, HÀ GIANG
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI - 2019


BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

PHẠM VIỆT HÙNG
Mã sinh viên: 1401321

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT
VÀ THÀNH PHẦN TINH DẦU CÂY RE
RỪNG (NEOCINNAMOMUM DELAVAYI
(LECOMTE) H. LIU) THU HÁI Ở
HUYỆN QUẢN BẠ, HÀ GIANG
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ
Người hướng dẫn:
1. TS. Hoàng Quỳnh Hoa
Nơi thực hiện:
1. Bộ môn Thực Vật – Trường Đại học

Dược Hà Nội

HÀ NỘI – 2019


LỜI CẢM ƠN
Bằng tất cả sự chân thành và lòng biết ơn sâu sắc, em xin gửi lời cảm ơn tới TS.
Hoàng Quỳnh Hoa (Bộ môn Thực vật – Trường Đại học Dược Hà Nội) – người đã tận
tình hướng dẫn, động viên và giúp đỡ em trong suốt quá trình thực hiện và hoàn thành
khóa luận này.
Em xin cảm ơn các thầy cô và các chị kỹ thuật viên trong Bộ môn Thực vật –
Trường Đại học Dược Hà Nội: PGS. TS. Trần Văn Ơn, ThS. Nghiêm Đức Trọng, chị
Phạm Thị Linh Giang, anh Lê Thiên Kim, chị Phạm Mỹ Hạnh, chị Chu Thị Thoa
cùng DS. Nguyễn Thanh Tùng (Bộ môn Dược liệu – Trường Đại học Dược Hà Nội)
đã quan tâm và chỉ bảo cho em nhiều kinh nghiệm quý báu trong thời gian em làm thực
nghiệm tại Bộ môn.
Tiếp theo, tôi muốn gửi lời cảm ơn chân thành tới các bạn Hà Thị Huệ, Lý Tà
Giàng (Hà Giang) đã giúp đỡ rất nhiệt tình trong quá trình thu mẫu nghiên cứu tại Hà
Giang và bạn Phạm Minh Hiền – sinh viên lớp P1K69, các bạn nghiên cứu khoa học tại
Bộ môn Thực vật đã luôn đồng hành, giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện khóa luận
này.
Cuối cùng là lời cảm ơn chân thành nhất, tôi muốn gửi tới gia đình, bạn bè những
người luôn ủng hộ và tạo điều kiện tốt nhất cho tôi trong quá trình học tập và trong cuộc
sống.
Em xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 20 tháng 5 năm 2019
Sinh viên
Hùng
Phạm Việt Hùng

MỤC LỤC
ĐẶT VẤN ĐỀ................................................................................................................. 1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN ......................................................................................... 2
1.1. VỊ TRÍ PHÂN LOẠI, ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT, PHÂN BỐ VÀ KHÓA PHÂN
LOẠI CỦA CHI NEOCINNAMOMUM ...................................................................... 2
1.1.1. Vị trí phân loại chi Neocinnamomum H.Liu................................................... 2
1.1.2. Đặc điểm thực vật và phân bố chi Neocinnamomum H.Liu ........................... 2
1.1.3. Khóa phân loại chi Neocinnamomum H.Liu .................................................. 3
1.2. Đặc điểm một số loài thuộc chi Neocinnamomum H.Liu ở Việt Nam ................. 3
1.2.1. Neocinnamomum caudatum (Nees) Merr. – Re (Rè) mới lá có đuôi ............. 3
1.2.2. Neocinnamomum delavayi (Lecomte) H. Liu – Re (Rè) mới hoa thưa. ......... 4
1.2.3. Neocinnamomum lecomtei H. Liu – Re (Rè) mới Lecomte. .......................... 5
1.3. Thành phần hóa học của chi Neocinnamomum H.Liu .......................................... 5
1.3.1. Thành phần hóa học ngoài tinh dầu ................................................................ 5
1.3.2. Thành phần tinh dầu ....................................................................................... 8
CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ....................... 11
2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ ...................................................................... 11
2.1.1. Nguyên vật liệu nghiên cứu .......................................................................... 11
2.1.2. Thiết bị và hóa chất....................................................................................... 11
2.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU ............................................................................... 12
2.2.1. Nghiên cứu về đặc điểm thực vật ................................................................. 12
2.2.2. Nghiên cứu về thành phần tinh dầu thay đổi theo thời gian ......................... 12
2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU....................................................................... 12
2.3.1. Nghiên cứu về đặc điểm thực vật ................................................................. 12
2.3.2. Nghiên cứu thành phần hóa học ................................................................... 13
2.3.3. Nghiên cứu hàm lượng và thành phần tinh dầu ............................................ 18
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN................................................................. 23

3.1. Kết quả thực nghiệm ........................................................................................... 23
3.1.1. Đặc điểm thực vật cây Re rừng .................................................................... 23
3.1.2. Nghiên cứu thành phần hóa học ngoài tinh dầu ........................................... 28
3.1.3. Nghiên cứu hàm lượng và thành phần tinh dầu cây Re rừng ....................... 29
3.2. Bàn luận .............................................................................................................. 36
3.2.1. Nghiên cứu đặc điểm thực vật ...................................................................... 36
3.2.2. Nghiên cứu các thành phần hóa học ngoài tinh dầu ..................................... 36
3.2.3. Nghiên cứu hàm lượng và thành phần tinh dầu ............................................ 37
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ..................................................................................... 42
KẾT LUẬN ................................................................................................................ 42
KIẾN NGHỊ ............................................................................................................... 42
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC


DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
Chữ viết tắt

Viết đầy đủ

EtOH

Ethanol

GC/MS

Gas chromatography/mass spectrometry – Sắc ký khí khối phổ

HPTLC

High-performance thin-layer chromatography – Sắc ký lớp mỏng
hiệu năng cao

NXB

Nhà xuất bản

Rf

Hệ số lưu trữ

SKLM

Sắc ký lớp mỏng

STT

Số thứ tự

TLC

Thin layer chromatography – Sắc ký lớp mỏng

TT

Thuốc thử

TR

Thời gian lưu của chất phân tích (đơn vị: phút)

UV

Ultra Violet – Tử ngoại


DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1 Thành phần hóa học loài Neocinnamomum delavayii (Lecomte) H. Liu ........ 5
Bảng 1.2. Thành phần tinh dầu lá Neocinnamomum delavayii (Lecomte) H. Liu .......... 9
Bảng 2.1. Danh sách các mẫu thu được ........................................................................ 11
Bảng 2.2. Chương trình nhiệt độ GC............................................................................. 22
Bảng 3.1. Kết quả định tính các nhóm chất chính trong lá cây Re rừng ....................... 28
Bảng 3.2. Hàm lượng tinh dầu trong lá Re rừng của các mẫu nghiên cứu ...................29
Bảng 3.3. Kết quả phân tích sắc ký đồ sau khi phun thuốc thử hiện màu bằng phần
mềm VideoScan.............................................................................................................31
Bảng 3.4. Kết quả phân tích thành phần các mẫu tinh dầu lá Re rừng bằng GC/MS ...32
Bảng 3.5. Hàm lượng monoterpen và sesquiterpen trong các mẫu tinh dầu Re rừng ...35
Bảng 3.6. So sánh hàm lượng tinh dầu trong lá cây Re rừng và 1 số loài trong chi
Cinnamomum .................................................................................................................37
Bảng 3.7. Thành phần chính trong các mẫu tinh dầu R1, R4, R7, R10 và tài liệu [13] 39


DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH
Hình 2.1. Bộ dụng cụ định lượng tinh dầu theo Dược điển Mỹ .......................................... 18
Hình 2.2. Bộ dụng cụ xác định độ ẩm của Dược liệu bằng phương pháp dung môi .... 20
Hình 3.1. Đặc điểm sinh dưỡng cây Re rừng ................................................................24
Hình 3.2. Đặc điểm hoa cây Re rừng ............................................................................24
Hình 3.3. Hình vẽ bộ nhị cây Re rừng ...........................................................................25
Hình 3.4. Đặc điểm quả cây Re rừng ............................................................................25

Hình 3.5. Đặc điểm vi phẫu thân cây Re rừng ..............................................................26
Hình 3.6. Đặc điểm vi phẫu lá cây Re rừng ..................................................................27
Hình 3.7. Sắc ký đồ 4 mẫu tinh dầu Re rừng quan sát dưới ánh sáng tử ngoại bước
sóng 254 nm và ánh sáng thường sau khi phun thuốc thử hiện màu.............................30
Hình 3.8. Đồ thị hàm lượng α-citral và β-citral trong các mẫu R10, R1, R4 ................35
Hình 3.9. Hình ảnh chồng phổ sắc ký đồ của các mẫu R7, R10, R1, R4 ......................38
Hình 3.10. Công thức cấu tạo 1 số thành phần chính trong tinh dầu lá Re rừng ..........40


ĐẶT VẤN ĐỀ
Tinh dầu được sử dụng từ rất lâu đời. Dựa theo những văn bản cổ để lại thì từ thế
kỷ thứ 9, tinh dầu đã được thu bằng phương pháp chưng cất: nguyên liệu thực vật được
xử lý với ancol và sau đó được chưng cất với nước để thu được nước thơm. Tinh dầu và
các dược liệu chứa tinh dầu có một phạm vi sử dụng rất rộng lớn trong đời sống hàng
ngày của con người, trong nhiều ngành khác nhau. Trong y dược học, tinh dầu được
dùng làm thuốc với tác dụng kích thích tiêu hóa, lợi mật, thông mật; tác dụng kháng
khuẩn và diệt khuẩn; tác dụng kích thích thần kinh trung ương; tác dụng diệt ký sinh
trùng và rất nhiều tinh dầu có tác dụng chống viêm, làm lành vết thương, sinh cơ khi sử
dụng ngoài da [4]. Tinh dầu được xem là “vàng xanh” và nó sẽ có giá trị hơn nếu con
người biết khai thác và sử dụng một cách hợp lí.
Trong một chuyến đi thực địa tại xã Nghĩa Thuận huyện Quản Bạ tỉnh Hà Giang
vào tháng 5 năm 2018, đoàn nghiên cứu Bộ môn Thực vât trường Đại học Dược Hà Nội
đã phát hiện ra một loài cây gỗ nhỏ, lá có chứa nhiều tinh dầu. Theo phân loại sơ bộ,
loài này thuộc chi Neocinnamomum H. Liu, họ Long não (Lauraceae). Qua khảo sát sơ
bộ về tinh dầu trong lá của cây cho thấy hàm lượng tinh dầu trong lá là khá cao (khoảng
4,0% tính theo dược liệu khô kiệt). Nhận thấy tinh dầu của loài cây này có mùi thơm dễ
chịu và có khả năng đem lại giá trị kinh tế cao, chúng tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu
đặc điểm thực vật và thành phần tinh dầu cây Re rừng (Neocinnamomum sp.)”.
Đề tài được thực hiện với các mục tiêu sau:
−

Mô tả đặc điểm thực vật và xác định tên khoa học cây Re rừng.

−

Xác định được hàm lượng và động thái tích luỹ tinh dầu theo mùa của cây Re rừng.

1


CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1. VỊ TRÍ PHÂN LOẠI, ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT, PHÂN BỐ VÀ KHÓA
PHÂN LOẠI CỦA CHI NEOCINNAMOMUM
1.1.1. Vị trí phân loại chi Neocinnamomum H. Liu
Neocinnamomum H. Liu là một chi thực vật nằm trong họ Long não (Lauraceae).
Vị trí của chi Neocinnamomum trong khung phân loại thực vật của Takhtajan 1987 như
sau:
Ngành Ngọc lan Magnoliophyta
Lớp Ngọc lan Magnoliopsida
Phân lớp Ngọc Lan Magnoliidae
Liên bộ Ngọc lan Magnolianae
Bộ Long não Laurales
Họ Long não Lauraceae
Chi Neocinnamomum H. Liu [5].
1.1.2. Đặc điểm thực vật và phân bố chi Neocinnamomum H. Liu
Cây bụi hoặc cây nhỏ. Chồi dày và luôn có lông. Lá mọc so le, mép nguyên, xếp
thành 2 dãy, mỏng hoặc cứng, có gân nổi rõ. Cụm hoa tán, hình cuống hoặc hiếm khi có
cuống, sắp xếp xa nách lá hoặc đầu cuối chùy hoặc đơn độc trong nách lá. Nụ nhỏ, hình
nón. Hoa nhỏ, cuống nhỏ. Bao hoa rất ngắn; bao hoa phân thùy 6, không đều, dài tới 2
mm, dày và hơi nhiều nhựa. Nhị hữu thụ 9, tất cả đều có chỉ nhị; Các chỉ nhị ở vòng thứ

1 và thứ 2 không có tuyến, chỉ nhị ở vòng thứ 3 có mỗi nhị có 2 tuyến; bao phấn 4 tế
bào, 2 tế bào phía trên hướng trong (của vòng thứ 1 và 2) hoặc hướng ngoài (của vòng
thứ 3) hoặc tất cả các tế bào bên, thấp hơn 2 tế bào lớn hơn và bên, nhưng đôi khi các tế
bào bao phấn đều sắp xếp thành một chuỗi gần như ngang. Nhị lép hình cuống, lớn
hơn. Bầu nhụy như ngọc trai, không cuống, dần dần ngắn lại; đầu nhụy hình đĩa. Quả
hạch, giống quả mọng, hình elip hoặc hình cầu; bao hoa hình chén trong quả lớn và
nông, dày, hình miệng núi lửa; thùy ở quả bền và hơi nở ra, thẳng hoặc nằm
ngang; cuống quả thon, dần dần về phía đỉnh [15].

2


Chi Neocinnamomum H. Liu rất gần với chi Cinnamomum. Sự khác nhau cơ bản
ở hai chi này là cụm hoa và cuống quả. Đối với chi Cinnamomum, cụm hoa là chùy; quả
có cuống không phù ra; còn ở Neocinnamomum H. Liu, cụm hoa là tán; quả có cuống
hay không; cuống quả mập [7]
Phân bố: Có khoảng bảy loài: Bhutan, Trung Quốc, Ấn Độ, Indonesia (Sumatra),
Myanmar, Nepal, Thái Lan, Việt Nam; năm loài (ba loài đặc hữu) ở Trung Quốc [15].
1.1.3. Khóa phân loại chi Neocinnamomum H. Liu
1a. Phiến lá ngang nhiều nhánh, gân ngang, nhiều, gần thẳng hoặc gần song song,
nối với nhau bằng các gân nhỏ dọc, tách biệt, hình thành mạng lưới kéo dài theo chiều
ngang; cụm hoa nhiều, tách biệt và sắp xếp ở nách lá hoặc chùm kép, ống trụ với cuống
phát triển…………………………………………………………………1. N. caudatum
1b. Phiến lá hình mắt lưới, gân lá mịn phân bố đều đặn; hoa hình cầu nhỏ đơn
độc và nách lá, có cuống hoặc không có cuống, không sắp xếp thành chùy.
2a. Cành cây không có lông.
3a. Bao hoa phủ lông măng không đáng kể hoặc nhẵn nhụi…..2. N. fargesii
3b. Bao hoa lông mọc dày đặc sát trục……………………4. N.mekongense
2b. Cành nhiều lông khi còn non.
4a. Cành và phiến lá có nhiều lông mọc dày đặc ngoài trục…3. N. lecomtei

4b. Cành và phiến lá lông mọc dày đặc ngoài trục hoặc lông màu trắng sát
trục…………………………………………………5. N. delavayi [15]
1.2. Đặc điểm một số loài thuộc chi Neocinnamomum H. Liu ở Việt Nam
1.2.1. Neocinnamomum caudatum (Nees) Merr. – Re (Rè) mới lá có đuôi
Mô tả: Cây gỗ nhỏ, có thể cao đến 12m và đường kính 20cm, nhánh hình trụ
mảnh, có lông bóng, đen nhạt. Lá mọc so le, phiến hình trứng hay trứng rộng dài 8 –
13cm, rộng 4 – 7cm, nhọn dần thành đuôi ở đầu, tù ở gốc, nhẵn cả 2 mặt; gân gốc 3, gân
bên lõm ở mặt trên lồi ở mặt dưới, gân con thành mạng; cuống lá dài 0.8 – 1cm, gần như
không lông. Cụm hoa xim phủ lông màu trắng. Hoa đơn tính, dài 5 – 10mm. Bao hoa
có 6 thùy, bằng nhau. Nhị sinh sản 3. Quả hình trứng, dài 1 – 1,5cm; rộng 0,6 – 0,8cm,
có cuống hình chén có lông, thùy của bao hoa tồn tại, hơi trải ra ở dưới quả [6], [7], [10].
3


Sinh thái: Cây mọc trong rừng nguyên sinh thường xanh hay thứ sinh, ở độ cao
500-1000m. Cây ưa sáng, lúc non chiu bóng một phần. Mọc tốt trên đất sâu, ẩm, nhiều
mùn và thoát nước. Ra hoa tháng 2, có quả tháng 11 [6], [7].
Phân bố: Việt Nam, Nepan và Nam Trung Quốc. Ở nước ta, có gặp từ Nghệ An
vào Phú Yên, Khánh Hòa và Ninh Thuận [6], [7].
Bộ phận dùng: Lá và vỏ - Folium et Cortex Neocinnamomi Caudati [6].
Công dụng: Lá và vỏ cây dùng hãm nước uống trị đau bụng. Dân gian dùng lá
cây sắc nước gội đầu cho thơm và sạch gầu [6], [7], [10].
1.2.2. Neocinnamomum delavayi (Lecomte) H. Liu – Re (Rè) mới hoa thưa.
Tên gọi khác: Tiểu hoa tân chương, Tam cô câu [6].
Mô tả: Cây bụi hay cây gỗ nhỏ, cao 2-4,5m; nhánh mảnh có lông lúc non. Lá
mọc so le, phiến hình trái xoan thon, dài 5-8cm, rộng 2-4cm; đầu nhọn thành đuôi, gốc
tù, có lông tơ ở mặt dưới; gân từ gốc 3; gân bên không rõ, cuống dài 5-8mm. Hoa đơn
tính mọc chụm ở nách, trên cuống 6-9mm. Hoa nhỏ màu vàng nhạt, cánh hoa dài 0,2cm
không lông hay có ít lông; bầu nhẵn. Quả hình trái xoan, dài cỡ 1cm, trên cuống mập,
khi chín màu hồng [6], [7], [10].

Sinh thái: Cây mọc rải rác trong rừng rậm ẩm thường xanh nhiệt đới vùng núi
cao. Ở độ cao 1700m. Lúc non chịu bóng. Tái sinh hạt trung bình. Ra hoa vào tháng 13 và có quả tháng 6-7 [6], [7], [10].
Phân bố: Nam Trung Quốc và Bắc Việt Nam [6], [7].
Bộ phận dùng: Lá – Folium Neocinnamomi Delavayi [6].
Tính vị, tác dụng: Vị cay, chát, tính nóng; có tác dụng khư phong thấp, thư cân
lạc, cầm máu [6].
Công dụng: Lá được sử dụng làm thuốc trị phong thấp tê liệt, đòn ngã tổn
thương, ngoại thương xuất huyết. Liều dùng 4-12g, ngâm rượu uống, dùng ngoài tán
nhỏ rắc [6], [7], [10].

4


1.2.3. Neocinnamomum lecomtei H. Liu – Re (Rè) mới Lecomte.
Mô tả: Cây gỗ nhỏ, cao 3-4m; nhánh mảnh, có lông mềm màu nâu. Lá mọc so
le, phiến hình trái xoan rộng, dài 8-10cm, rộng 4-7cm, có lông mềm màu nâu ở mặt
dưới; gân gốc 3, cuống lá dài 1-1,5cm. Cụm hoa tán có cuống ngắn. Hoa đơn tính, hoa
đực có 9 nhị, bao phấn 4 ô. Quả hình trái xoan, cao 2,5-3,5cm, trên cuống to và đài tồn
tại [6], [7], [10].
Sinh thái: Cây mọc rải rác trong rừng rậm thường xanh vùng núi trung du đến
vùng cao, ở độ cao dưới 500m. Ra hoa tháng 2-3, có quả tháng 8-10 [6], [7].
Phân bố: Nam Trung Quốc và Việt Nam. Ở nước ta, có gặp từ Lạng Sơn, Hà
Tây tới Ninh Bình [6], [7].
Bộ phận dùng: Vỏ thân – Cortex Neocinnamomi Lecomtei [6].
Công dụng: Ở Quảng Tây (Trung Quốc), vỏ được dùng trị đau dạ dày, trị lỵ và
ỉa chảy [6], [7], [10].
1.3. Thành phần hóa học của chi Neocinnamomum H. Liu
Nghiên cứu về thành phần hóa học của chi Neocinnamomum mới chỉ được thực
hiện ở loài Neocinnamomum delavayi (Lecomte) H. Liu.
1.3.1. Thành phần hóa học ngoài tinh dầu

Theo tài liệu đã được công bố, thành phần hóa học trong loài Neocinnamomum
delavayi H. Liu. có 17 hợp chất được phân lập từ dịch chiết trong 80% EtOH, bao gồm
4 glucoside phenolic, 3 lignans, 6 sesquiterpenoids, 3 flavonoid và 1 sterol [16]. Các
hợp chất được xác định như bảng sau:
Bảng 1.1. Thành phần hóa học loài Neocinnamomum delavayi (Lecomte) H. Liu
STT

Danh pháp

1

6-O-syringoyl-1-O-vanilloyl-

Công thức cấu tạo

β-D-glucopyranoside

5


STT
2

Danh pháp
6-O-acetyl-1-Otrimethoxyphenyl)

Công thức cấu tạo
(3,4,5-β-D-

glucopyranoside

3

1,6-di-O-syringoyl-Dglucopyranoside

4

3,4,5-trimethoxyphenyl-6-Osyringoyl-D-glucopyranoside

5

Lirioresinol B dimethylether

6

Sesartemin

7

(+) - 9′-O- (E) -feruloyl-5,5′dimethoxylariciresinol

6


STT

Danh pháp

8

Oplodiol

9

Cryptomeridiol

10

4-epicryptomeridiol

11

7α,

Công thức cấu tạo

11-dihydroxy-cadin-

10(14)-ene

12

(-) - clovane-2,9-diol

13

Axit phaseic

14

Catechin

7


STT

Danh pháp

15

Epicatechin

16

Trans-dihydroquercetin

17

(24S) -24-ethylcholsta-3β, 5α,

Công thức cấu tạo

6β-triol

1.3.2. Thành phần tinh dầu
Lá của loài Neocinnamomum delavayi (Lecomte) H. Liu được thu thập từ Vườn
thực vật, Viện thực vật học Côn Minh, Côn Minh (tháng 7 năm 1988). Lá cây được cất
trong 2 giờ. Lớp dung dịch sau khi chiết được lắc với diethyl ether. Lớp ether thu được
được loại nước bằng Na2SO4 khan. Dung môi ether được thu hồi dưới áp suất giảm,

phần tinh dầu hòa tan được làm khô bằng Na2SO4 khan qua đêm [13].
Tinh dầu được phân tích bằng phương pháp sắc ký khí kết hợp khối phổ GC/MS
được thực hiện bằng máy quang phổ khối Finnigan 4510 với chương trình như sau [13]:
-

Sử dụng cột mao quản SE-54 (30m x 0,25 mm).

-

Nhiệt độ ban đầu ở 80°C trong 1 phút.

-

Sau đó gia nhiệt với tốc độ 3oC/phút đến 200°C với Heli là khí mang.

-

Detector MS hoạt động với điện áp ion hóa 70eV.
8


Phổ được so sánh với các phổ chuẩn của thư viện NBS để đưa ra kết quả.
Tinh dầu thu được với hàm lượng 0,80% tính theo dược liệu tươi. Các
monoterpene (92,91%) trong đó a-phellandrene (47,55%) và a-pinene (17,35%) được
tìm thấy với hàm lượng lớn nhất, cùng với β-pinene (9,77%) và camphene (8,56%).
Ngoài ra, còn có chứa các thành phần đặc trưng khác như: linalool (4,93%), β-elemene
(2,89%), limonene (2,38%), p-cymene (1,45%) và elemol (1,23%) có mặt với lượng lớn
hơn 1,00% [16]. Các hợp chất xác định được trong tinh dầu lá loài này được trình bày
trong bảng 1.2.
Bảng 1.2. Thành phần tinh dầu lá Neocinnamomum delavayi (Lecomte) H. Liu

STT

Thành phần

Tỷ lệ (%)

1

α-pinene

17,35

2

Camphene

8,56

3

β-pinene

9,77

4

α-phellandrene

47,55

5

α-terpinene

0,06

6

β-cymene

1,45

7

Limonene

2,38

8

1,8-cineole

0,12

9

(Z)-β-ocinene

0,16

10

δ-3-carene

0,05

11

Trans-linalool oxide*

0,01

12

Terpinolene

0,41

13

Linalool

4,93

14

Borneol

0,02

15

Terpinen-4-ol

0,04

16

α-terpineol

0,03

17

Sabinol*

0,02

18

δ-elemene

0,01

19

β-elemene

2,89

20

β-caryophyllene

0,86
9

Ghi chú

Chưa xác dịnh dạng đồng phân

Chưa xác dịnh dạng đồng phân


21

α- humulene

0,04

22

γ-muurolene

0,30

23

β-selinene

0,19

24

δ-cadinene

0,03

25

Elemicin

0,09

26

Elemol

1,23

27

Nerolidol*

0,68

28

α-guaiol

0,08

29

β-eudesmol

0,33

30

Chưa xác định

0,43

10

Chưa xác dịnh dạng đồng phân


CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ
2.1.1. Nguyên vật liệu nghiên cứu
Nguyên liệu nghiên cứu là lá và cành non của cây Re rừng thu hái tại xã Nghĩa
Thuận, huyện Quản Bạ, tỉnh Hà Giang. Các mẫu thu được ký hiệu trong bảng 2.1.
Bảng 2.1. Danh sách các mẫu thu được
Địa điểm

Mẫu

Thời gian

Kí hiệu

1

17/01/2019

R1

2

05/04/2019

R4

Xã Nghĩa Thuận, Huyện Quản Bạ,

3

16/07/2018

R7

Tỉnh Hà Giang

4

09/10/2018

R10

Xử lí dược liệu: Dược liệu sau khi thu hái được hong khô trong bóng râm. Khi
bóp lá giòn vụn (khô tương đối) dược liệu được bảo quản trong túi nilon kín, để nơi khô
ráo, thoáng mát.
2.1.2. Thiết bị và hóa chất
2.1.2.1. Thiết bị máy móc và dụng cụ thí nghiệm
− Chụp ảnh mẫu nghiên cứu bằng máy ảnh kỹ thuật số Canon 60D.
− Kính hiển vi soi nổi Nikon SMZ 745T kết nối camera Nikon DS-Fi2 và máy tính.
− Kính hiển vi Nikon Eclipse Ci-L kết nối camera Nikon DS-Fi2 và máy tính.
− Cân kỹ thuật Sartorius.
− Cân phân tích hiện số Shimadzu AY 220.
− Bể siêu âm Daihan Scientific.
− Cặp ép, tủ sấy mẫu tiêu bản cây khô.
− Bộ dụng cụ xác định độ ẩm bằng phương pháp dung môi.
− Bộ định lượng tinh dầu nhẹ hơn nước.
− Sắc ký lớp mỏng sử dụng bản mỏng tráng sẵn silica gel 60 F254.
− Hệ thống sắc ký bản mỏng hiệu năng cao HPTLC: thiết bị phun mẫu Linomat V
CAMAG, bình khai triển sắc ký ADC, buồng chụp ảnh TLC Visualizer CAMAG.
11


− Hệ thống GC-MS: Máy sắc ký khí kết hợp khối phổ (GC-MS) GCMS-QP2020
Shimadzu.
2.1.2.2. Hóa chất
Các thuốc thử, dung môi, hóa chất đạt tiêu chuẩn phân tích theo quy định của
Dược điển Việt Nam V [3].
2.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
2.2.1. Nghiên cứu về đặc điểm thực vật
− Nghiên cứu về đặc điểm hình thái và đặc điểm vi học của cây Re rừng.
− Xác định tên khoa học của cây Re rừng.

2.2.2. Nghiên cứu về thành phần tinh dầu thay đổi theo thời gian
− Định tính thành phần hoá học của lá cây Re rừng.
− Nghiên cứu sự khác nhau về hàm lượng và thành phần tinh dầu lá của mẫu Re rừng
tại cùng một địa điểm thu hái theo thời gian vào các tháng 7, 10 năm 2018 và tháng
1, 4 năm 2019.
2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3.1. Nghiên cứu về đặc điểm thực vật
2.3.1.1. Nghiên cứu đặc điểm hình thái
Quan sát bằng mắt thường, kính lúp soi nổi và mô tả theo phương pháp mô tả
phân tích [2].
2.3.1.2. Nghiên cứu đặc điểm vi học
− Đặc điểm vi phẫu: Tiêu bản vi phẫu được thực hiện bằng phương pháp nhuộm kép.
Các đặc điểm vi phẫu của cành và lá được mô tả phân tích theo nguyên tắc nghiên
cứu tiêu bản vi phẫu. Tiêu bản được soi và chụp ảnh qua kính hiển vi kết nối
camera [2].
− Từ các đặc điểm thực vật này so sánh với các tài liệu mô tả và khóa phân loại thực
vật để xác định tên khoa học của cây.

12


2.3.2. Nghiên cứu thành phần hóa học
Định tính sơ bộ các nhóm chất hữu cơ có mặt trong dược liệu theo phương pháp
thường quy ghi trong tài liệu “Thực tập Dược liệu” và “Phương pháp nghiên cứu hóa
học cây thuốc” [1], [8].
2.3.2.1. Định tính đường khử tự do, acid amin, acid hữu cơ
Cho 5 g bột dược liệu vào cốc có mỏ, thêm 30 ml nước cất, đun sôi trong 7 phút.
Để nguội, lọc lấy dịch lọc đem làm phản ứng định tính.
− Định tính acid amin:
Cho 2 ml dịch lọc vào ống nghiệm nhỏ. Nhỏ vài giọt TT Ninhydrin 3% vào, sau

đó đun cách thủy vài phút. Phản ứng dương tính khi xuât hiện màu tím.
− Định tính acid hữu cơ:
Cho 2 ml dịch lọc vào ống nghiệm nhỏ, thêm ít tinh thể Na2CO3. Phản ứng dương
tính khi xuất hiện bọt khí.
− Định tính đường khử tự do:
Cho 2 ml dịch lọc vào ống nghiệm nhỏ. Thêm 0,5 ml TT Fehling A và 0,5 ml TT
Fehling B. Đun sôi cách thủy vài phút. Phản ứng dương tính khi xuất hiện kết tủa
màu đỏ gạch.
2.3.2.2. Định tính alcaloid
Cân khoảng 3 g bột dược liệu cho vào bình cầu 500ml. Thêm 15 ml dung dịch
acid sulfuric 1N. Chiết hồi lưu trong 1 giờ, để nguội. Lọc dịch lọc vào bình gạn dung
tích 60 ml. Kiềm hóa dịch lọc bằng amoniac đến pH 9 – 10. Chiết alcaloid base bằng
cloroform 3 lần, mỗi lần 5 ml. Gộp các dịch chiết chloroform, loại nước bằng natri sulfat
khan. Lấy dịch chiết cloroform bên trên lắc với dung dịch acid sulfuric 1N 3 lần, mỗi
lần 5 ml. Gộp các dịch chiết nước có màu vàng, chia đều vào các ống nghiệm nhỏ, mỗi
ống 1 ml. Tiến hành làm cùng lúc các ống chứng (không chứa dịch chiết) với các ống
thử.
− Ống 1: Thêm 2 – 3 giọt TT Bouchardat. Phản ứng dương tính khi xuất hiện tủa
nâu đến đỏ nâu.
13


− Ống 2: Thêm 2 – 3 giọt TT Dragendorff. Phản ứng dương tính khi xuất hiện tủa
vàng cam dến đỏ.
− Ống 3: Thêm 2 – 3 giọt TT Mayer. Phản ứng dương tính khi xuất hiện tủa trắng
đến vàng.
2.3.2.3. Định tính anthranoid
− Phản ứng Borntrager: Định tính anthranoid toàn phần
Lấy 1 g bột dược liệu cho vào cốc có mỏ. Thêm 5 ml dung dịch H2SO4 1N, đun
trực tiếp cho đến sôi. Lọc dịch chiết còn nóng qua giấy lọc vào bình gạn 60 ml. Để nguội

dịch lọc. Thêm 5 ml cloroform, lắc nhẹ. Gạn bỏ lớp nước, giữ lớp cloroform để làm
phản ứng.
+ Lấy 1 ml dịch chiết cloroform cho vào ống nghiệm nhỏ. Thêm 1 ml dung dịch
NH3. Lắc nhẹ.
+ Lấy 1 ml dịch chiết cloroform cho vào ống nghiệm nhỏ khác. Thêm 1 ml dung
dịch NaOH 10%. Lắc nhẹ.
Phản ứng dương tính nếu lớp nước xuất hiện màu đỏ sim.
2.3.2.4. Định tính chất béo, carotene, sterol
Cho 3 g dược liệu vào bình nón 100 ml. Sau đó đổ ngập ether dầu hỏa, ngâm qua
đêm 24 giờ, lọc qua giấy lọc. Dịch lọc được đưa làm các phản ứng.
− Định tính caroten:
Cho 2 ml dịch lọc vào một ống nghiệm nhỏ, bốc hơi cách thủy đến cắn. Thêm 4
giọt acid sulfuric đặc. Phản ứng dương tính khi xuất hiện màu xanh ve.
− Định tính chất béo:
Nhỏ một giọt dịch lọc lên tờ giấy lọc, để bay hơi hết dung môi. Quan sát thấy vết
dịch lọc sau khi bay hơi. Phản ứng dương tính khi trên giấy lọc còn vết mờ.
− Định tính sterol: Phản ứng Liebermann:
Cho 2 ml dịch lọc vào ống nghiệm nhỏ, bốc hơi cách thủy đến cắn. Thêm 1 ml
anhydrid acetic, lắc kỹ cho tan hết cắn. Đặt nghiêng ống nghiệm 45o. Thêm từ từ
14


0,5 ml acid sulfuric đặc theo thành ống. Phản ứng dương tính khi mặt phân cách
2 lớp chất lỏng có màu.
2.3.2.5. Định tính coumarin
Cân 5 g bột dược liệu cho vào bình cầu 500 ml. Thêm 30 ml EtOH 90%. Chiết
hồi lưu trong 30 phút. Để nguội, lọc lấy dịch lọc. Dịch lọc thu được đem thực hiện các
phản ứng định tính.
− Phản ứng mở đóng vòng lacton:
Cho vào 2 ống nghiệm mỗi ống 1 ml dịch lọc. Ống 1 thêm 0,5 ml NaOH

10%, ống 2 để nguyên. Đun 2 ống đến sôi, để nguội và quan sát: nếu có chứa
coumarin ống 1 có màu vàng hoặc tủa đục màu vàng, ống 2 trong. Thêm vào
2 ống 2 ml nước cất, lắc đều và quan sát: ống 1 trong suốt, ống 2 có tủa đục.
Acid hóa ống 1 bằng HCl đặc, ống 1 sẽ trở lại đục như ống 2. Dựa vào độ tan
trong cồn và nước của coumarin để giải thích quá trình đóng mở vòng lacton.
− Phản ứng huỳnh quang chuyển dạng đồng phân cis sang trans dưới ánh sáng tử
ngoại:
Nhỏ vài giọt dịch chiết lên giấy thấm. Nhỏ tiếp vài giọt dung dịch NaOH 5%.
Sấy nhẹ. Che một phần diện tích dịch chiết trên giấy lọc bằng một miếng kim
loại (đồng xu) rồi chiếu tia tử ngoại trong một vài phút. Bỏ miếng kim loại ra,
quan sát dưới đèn tử ngoại. Tiếp tục chiếu tia tử ngoại và quan sát.
− Phản ứng vi thăng hoa:
Cho một ít bột dược liệu vào nắp bằng nhôm. Đặt lên bếp điện có lưới amian,
cho bay hơi hết nước trong dược liệu. Đặt trên miệng nắp nhôm 1 phiến kính trên
đó có đặt ít bông thấm nước lạnh. Đun nhẹ dưới nắp nhôm, sau 5 phút lấy phiến
kính ra, để nguội, quan sát dưới kính hiển vi thấy tinh thể hình kim. Nhỏ thêm 1
giọt dung dịch KI 10% lên phiến kính, quan sát dưới kính hiển vi thấy tinh thể
hình kim màu nâu sẫm hoặc tím thì kết luận phản ứng dương tính.
2.3.2.6. Định tính flavonoid

15


Lấy 10 g bột dược liệu cho vào túi giấy lọc, đặt túi vào bình Soxhlet, chiết bằng
cloroform cho đến khi hết màu xanh. Loại bỏ dịch chiết cloroform, dược liệu được lấy
ra làm khô rồi cho vào cốc có mỏ và thêm 30 ml EtOH 70%. Đun cách thủy trong 10
phút, lọc nóng thu dịch chiết cồn đem làm các phản ứng định tính
− Phản ứng Cyanidin:
Cho 2 ml dịch chiết vào ống nghiệm nhỏ. Thêm một ít bột Mg kim loại. Sau đó
cho thêm vài giọt HCl đậm đặc. Để yên vài phút, phản ứng dương tính nếu dung

dịch chuyển từ màu vàng sang màu đỏ.
− Phản ứng với kiềm với hơi amoniac:
Nhỏ 1 giọt dịch chiết lên tờ giấy lọc. Hơ khô rồi để trên miệng lọ có chứa amoniac
đặc. Quan sát màu vết chấm. Phản ứng dương tính nếu màu vàng của vết đậm
lên.
− Phản ứng tạo phức với muối kim loại FeCl3:
Cho vào ống nghiệm nhỏ 1 ml dịch chiết. Thêm vài giọt FeCl3 5%. Phản ứng
dương tính khi thấy dịch chiết chuyển sang màu xanh đen.
− Phản ứng diazo hóa:
Cho vào ống nghiệm 1 ml dịch chiết. Kiềm hóa bằng dung dịch NaOH 10%.
Thêm vài giọt TT Diazo mới pha, lắc đều, đun cách thủy vài phút, phản ứng
dương tính khi dung dịch xuất hiện màu đỏ.
2.3.2.7. Định tính glycosid tim
Cân 5 g bột dược liệu cho vào bình cầu 500 ml. Thêm 30 ml EtOH 25%. Chiết
hồi lưu 1 giờ, để nguội, lọc lấy dịch. Loại các tạp chất bằng dung dịch chì acetat 30%.
Lọc loại tủa lấy phần dung dịch, kiểm tra lại bằng dung dịch chì acetat 30%. Nếu còn
tủa thì tiếp tục thêm chì acetat đến khi kiểm tra dịch lọc không tạo tủa nữa thì dừng.
Chuyển toàn bộ dịch lọc vào bình gạn 60 ml. Chiết glycosid tim bằng cách lắc dịch lọc
với CHCl3 2 lần, mỗi lần 8 ml. Gạn lấy lớp CHCl3. Chia đều dịch chiết vào 3 ống nghiệm
nhỏ đã được sấy khô. Cô cách thủy các ống nghiệm đến cắn. Cắn thu được đem đi làm
các phản ứng định tính.
16


− Xác định khung steroid: Phản ứng Liebermann – Burchardt:
Cho vào ống nghiệm có chứa cắn 1 ml CHCl3 1 ml anhydrid acetic, lắc đều cho
tan hết. Nghiêng ống 45o. Cho từ từ theo thành ống 0,5 ml H2SO4 đặc, tránh xáo
trộn chất lỏng trong ống. Quan sát mặt phân cách 2 lớp chất lỏng, nếu xuất hiện
một vòng màu tím đỏ, lớp chất lỏng ở phía trên có màu xanh lá, lớp phía dưới
có màu hồng thì kết luận phản ứng dương tính.

− Định tính vòng lacton: Phản ứng Legal:
Hòa tan cắn trong 1ml EtOH 90%. Lắc đều cho tan hết cắn. Nhỏ 1 giọt TT natri
nitroprussiat 0,5% và 2 giọt dung dịch NaOH 10%. Lắc đề nếu thấy xuât hiện
màu đỏ cam thì kết luận phản ứng dương tính.
− Định tính phần đường 2,6 – desoxy: Phản ứng Keller – Kiliani:
Hòa tan cắn glycosid tim trong 0,5 ml EtOH 90%. Lắc đều cho tan hết cắn. Thêm
vài giọt FeCl3 5% pha trong acid acetic đậm đặc. Lắc đều. Nghiêng ống nghiệm
45o, cho từ từ theo thành ống 0,5 ml H2SO4 đặc. Quan sát mặt phân cách 2 lớp
chất lỏng. Phản ứng dương tính khi mặt tiếp xúc giữa 2 lớp chất lỏng xuất hiện
một vòng màu tím đỏ.
2.3.2.8. Định tính polysaccharid
Cho 2 g bột dược liệu vào cốc có mỏ. Thêm 10 ml nước cất, đun sôi 5 phút, lọc
nóng. Cho vào 2 ống nghiệm:
− Ống 1: 4 ml dịch lọc và 5 giọt TT Lugol.
− Ống 2: 4 ml nước cất và 5 gọt TT Lugol.
Quan sát màu 2 ống nghiệm. Phản ứng dương tính khi ống 1 có màu xanh đen
đậm hơn ống 2.
2.3.2.9. Định tính saponin
− Hiện tượng tạo bọt:
17