VÕ NGUYÊN THÀNH SÀNG lọc tìm KIẾM hợp CHẤT tự NHIÊN ức CHẾ ACETYLCHOLINESTERASE có tác DỤNG đa ĐÍCH ỨNG DỤNG TRONG điều TRỊ BỆNH ALZHEIMER

BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI
**********

VÕ NGUYÊN THÀNH

SÀNG LỌC TÌM KIẾM HỢP CHẤT TỰ
NHIÊN ỨC CHẾ
ACETYLCHOLINESTERASE CĨ TÁC
DỤNG ĐA ĐÍCH ỨNG DỤNG TRONG
ĐIỀU TRỊ BỆNH ALZHEIMER

KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI - 2019


BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI
**********

VÕ NGUYÊN THÀNH
Mã sinh viên:
1401555

SÀNG LỌC TÌM KIẾM HỢP CHẤT TỰ
NHIÊN ỨC CHẾ
ACETYLCHOLINESTERASE CĨ TÁC
DỤNG ĐA ĐÍCH ỨNG DỤNG TRONG
ĐIỀU TRỊ BỆNH ALZHEIMER
KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

Người hướng dẫn:
1. TS. Phạm Thế Hải
2. TS. Lê Thị Thu Hường
Nơi thực hiện:
Bộ mơn Hố Dược

HÀ NỘI - 2019


Lời cảm ơn
Để hồn thành khóa luận tốt nghiệp này, lời đầu tiên tôi xin gửi lời cảm ơn
chân thành nhất đến TS. Phạm Thế Hải - Giảng viên bộ mơn Hóa dược, Đại học
Dược Hà Nội, cơ TS. Lê Thị Thu Hường – Giảng viên khoa Y Dược, Đại học Quốc
Gia Hà Nội, những người thầy, cơ đã dìu dắt tơi từ những ngày đầu cịn bỡ ngỡ khi
bước vào con đường nghiên cứu khoa học, luôn ở bên chỉ bảo, động viên giúp tơi
hồn thành đề tài nghiên cứu.
Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới các thầy cơ Bộ mơn Hóa dược, các anh
chị, các bạn và các em trong nhóm nghiên cứu đã tạo điều kiện thuận lợi nhất giúp
cho tơi hồn thành khóa luận này.
Xin được cảm ơn gia đình, bạn bè và người thân đã luôn ở bên, động viên, ủng
hộ giúp em trong suốt quá trình tiến hành nghiên cứu.
Hà Nội, Ngày 20 tháng 5 năm 2019
Sinh Viên
Võ Nguyên Thành


MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VIẾT TẮT ........................................................................... 5
DANH MỤC CÁC BẢNG ................................................................................................... 7
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ .............................................................................................. 8

ĐẶT VẤN ĐỀ ...................................................................................................................... 1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN ................................................................................................ 2
1.1. Tổng quan về bệnh Alzheimer và các thuốc điều trị đa đích .................................. 2
1.1.1. Bệnh Alzheimer ............................................................................................... 2
1.1.2. Thuốc điều trị Alzheimer ................................................................................. 3
1.2. Tổng quan về enzym acetylcholinesterase .............................................................. 4
1.3. Tổng quan về phương pháp nghiên cứu in silico .................................................... 6
1.3.1. Dự đốn ADMET và các thơng số hóa lý ........................................................ 6
1.3.2. Sàng lọc ảo dựa trên docking và thuộc tính giống thuốc (drug-likeness) ........ 7
1.3.3. Mơ phỏng động lực học phân tử ...................................................................... 9
CHƯƠNG 2. NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN
CỨU.................................................................................................................................... 12
2.1. Nguyên liệu, thiết bị .............................................................................................. 12
2.1.1. Nguyên liệu .................................................................................................... 12
2.1.2. Thiết bị ........................................................................................................... 12
2.2. Nội dung nghiên cứu ............................................................................................. 12
2.3. Phương pháp ......................................................................................................... 12
2.3.1. Sàng lọc Drugs likeness ................................................................................. 12
2.3.2. Mô phỏng docking ......................................................................................... 13
2.3.3. Molecular Dynamic ........................................................................................ 15
2.3.4. Dự đoán ADMET và các thơng số hóa lý ...................................................... 17


CHƯƠNG 3. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN .......................................... 18
3.1. Sàng lọc drug-likeness .......................................................................................... 18
3.2. Mô phỏng protein docking .................................................................................... 18
3.2.1. Re-dock galanthamin ..................................................................................... 18
3.2.2. Sàng lọc ảo 810 hợp chất ............................................................................... 20
3.3. Mô phỏng động lực học phân tử ........................................................................... 24
3.3.1. Độ lệch trung bình bình phương gốc (RMSD) .............................................. 24

3.3.2. Kết quả của biến động bình phương trung bình (RMSF) .............................. 26
3.3.3. Phân tích liên kết hydro giữa ligand và protein ............................................. 27
3.4. Dự đoán ADMET và các thơng số hóa lý ............................................................. 28
3.4.1. Thơng số hóa lý .............................................................................................. 28
3.4.2. Dự đốn đặc tính dược động học ................................................................... 29
3.5. Bàn luận ................................................................................................................ 31
3.5.1. Về các hợp chất mang khung lignan .............................................................. 31
3.5.2. Về ưu điểm của phương pháp ........................................................................ 31
3.5.3. Về nhược điểm của phương pháp nghiên cứu................................................ 32
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ............................................................................................ 33
TÀI LIỆU THAM KHẢO .................................................................................................. 34
PHỤ LỤC


DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VIẾT TẮT
Å

Angstrom (Đơn vị đo khoảng cách, chiều dài liên kết)

RMSD

Độ lệch bình phương trung bình gốc

RMSF

Độ biến động bình phương trung bình gốc

His

Histidin

Pro

Prolin

Phe

Phenylalanin

Gly

Glycin

Glu

Glutamic acid

Tyr

Tyrosin

Ser

Serine

Asp

Aspartic Acid

P-gly

Kênh vận chuyển P-glycoprotein

BBB

Hàng rào máu - não

HIA

Hấp thu qua đường ruột ở người

FDA

Food and Drug Administration (Cơ Quan Quản lý Thực phẩm và
Dược phẩm Hoa Kỳ)

ΔG

Năng lượng tự do Gibbs

Kd

Hằng số liên kết

TPSA

Topological polar surface area – Diện tích bề mặt phân cực

LogS

Hệ số tan

LogP

Hệ số phân bố Octanol – nước

ADMET

Hấp thu, phân bố, chuyển hóa, thải trừ, độc tính

Receptor

Thụ thể

Ligand

Phối tử

MD

Molecular Dynamic

Pdb

Protein data bank

ACh

Acetylcholin

AChE

Enzym Acetylcholinsterase

AChE

Chất ức chế enzyme Acetylcholinsterase

AD

Bệnh Alzheimer

Aβ

amyloid-β

NMDA

N-methyl-D-aspartate

PAF

Yếu tố hoạt hóa tiểu cầu

MAO

Monoamine oxidase

RO5

Quy tắc 5 điểm của Lipiski

MW

Khối lượng phân tử

ID

Kí hiệu nhận dạng

VNPD

Cơ sở dữ liệu các sản phẩm thiên nhiên Việt Nam

ROC

Đường cong đặc tính hoạt động

ns

Nano giây

Residue

Dư lượng acid amin

ps

Pico giây

PAS

Vùng ngoại biên của enzyme acetylcholine esterase

CAS

Vùng xúc tác của enzyme acetylcholine esterase

S

Chất nền

NS

Khơng phải chất nền

I

Có khả năng ức chế

NI

Khơng có khả năng ức chế

TcAChE

Enzym Acetylcholinsterase của loài cá đuối điện

NPT

Điều kiện đẳng nhiệt đẳng áp

NVP

Điều kiện đẳng nhiệt đẳng tích


DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 3.1. Kết quả re-dock galanthamin ............................................................................. 19
Bảng 3.2. 24 ligand tương tác với các residue thuộc bộ ba xúc tác. .................................. 20
Bảng 3.3. Điểm số docking và các tương tác giữa phối tử với đích .................................. 23
Bảng 3.4. Số lượng liên kết hydro trung bình. ................................................................... 27
Bảng 3.5. Tính chất hóa lý của các hợp chất ..................................................................... 29
Bảng 3.6. Đặc tính hấp thu, phân bố và thải trừ ............................................................... 29
Bảng 3.7. Đặc tính chuyển hóa với các enzym gan ........................................................... 30


DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ
Hình 1.1. Trung tâm hoạt động của acetylcholinesterase .................................................... 5
Hình 2.1. Cấu trúc các chất được vẽ bằng ChemDraw ...................................................... 13
Hình 2.2. Xây dựng hộp nước bằng tiện ích mở rộng Add Solvation Box ...................... 15
Hình 3.1. Tương tác của Galanthamin trong tinh thể 1dx6 ............................................... 18
Hình 3.2. Cấu dạng galanthamin re-dock được phân tích bằng phần mềm Discover studio
............................................................................................................................................ 19
Hình 3.3. Kết quả sàng lọc docking ................................................................................... 20
Hình 3.3. Tương tác các của 9 ligand với đích được phân tính bằng MOE ...................... 22
Hình 3.4. RMSD của galanthamin và 9 hợp chất theo thời gian mô phỏng ...................... 25
Hình 3.5. RMSF theo từng residue của galanthamin và 9 hợp chất .................................. 26
Hình 3.6. Số liên kết hydro của galanthamin và 9 hợp chất với đích theo thời gian ......... 28

ĐẶT VẤN ĐỀ
Bệnh Alzheimer (AD) là dạng sa sút trí tuệ phổ biến nhất, đóng góp tới 60-70%
những ca lâm sàng đã ghi nhận. Theo tổ chức quốc tế về bệnh Azheimer, hiện nay ước tính
có khoảng 50 triệu người trên toàn thế giới mắc bệnh, con số này sẽ tăng gấp đôi sau mỗi
20 năm, đạt 75 triệu vào năm 2030 và 131,5 triệu vào năm 2050. Cũng theo đó, tổng chi
phí y tế cho AD ước tính trên tồn thế giới trong năm 2018 là 1 nghìn tỷ đơ la Mỹ. Con số
này sẽ tăng lên 2 nghìn tỷ đô la vào năm 2030 [32].
Cho đến nay các chất ức chế acetylcholinsterase (AChEI) đã trở thành loại thuốc
được kê đơn nhiều nhất để điều trị triệu chứng của AD nhẹ đến trung bình. Các thuốc này
mặc dù có lợi trong việc cải thiện nhận thức và hành vi, song chúng khơng trì hỗn hoặc
ngăn ngừa sự thối hóa thần kinh. Do vậy, hiện nay mơ hình thuốc điều trị Alzheimer đơn
mục tiêu truyền thống đang dần chuyển hướng sang các thuốc hướng đa đích. Sàng lọc các
chất ức chế kép đồng thời khóa cả vị trí xúc tác và ngoại vi AChE là một trong những hướng
đi tiềm năng trong phát triển thuốc đa đích và đồng thời cũng là trọng tâm trong nghiên cứu
“Sàng lọc tìm kiếm hợp chất tự nhiên ức chế acetylcholinsterase có tác dụng đa đích ứng
dụng trong điều trị bệnh Alzheimer”. Cơ sở dữ liệu của nghiên cứu hiện có 1600 hợp chất
có nguồn gốc dược liệu Việt Nam và vẫn đang tiếp tục được cập nhật [1]. Với số lượng lớn
hợp chất như vậy, phương pháp in silico được áp dụng để giảm thiểu thời gian nghiên cứu
và tiết kiệm ngân sách. Phương pháp tiến hành với 3 mục tiêu chính:
1. Sàng lọc docking tìm kiếm các hợp chất tự nhiên tương tác mạnh với 2 vùng xúc tác
và ngoại biên của AChE.
2. Mô phỏng động lực học phân tử để nghiên cứu sự ổn định của phức hợp các ligandProtein thu được từ docking.
3. Nghiên cứu đặc điểm dược động học và hóa lý của các chất nhờ các cơng cụ in silico.

1


CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN

1.1.

Tổng quan về bệnh Alzheimer và các thuốc điều trị đa đích

1.1.1. Bệnh Alzheimer
Bệnh Alzheimer (AD) được đặc trưng bởi sự suy giảm về khả năng nhận thức. AD
tăng đáng kể ở những người từ 65 tuổi trở lên, với sự suy giảm dần về trí nhớ, suy nghĩ,
ngôn ngữ và khả năng học tập. Bệnh thường bắt đầu với các triệu chứng nhẹ và kết thúc
bằng tổn thương não nghiêm trọng.
Bệnh Alzheimer lần đầu tiên được mô tả bởi bác sĩ Alois Alzheimer vào ngày 3
tháng 11 năm 1906 tại cuộc họp lần thứ 37 của Hội tâm thần học Tây Nam Đức ở Tubingen.
Ơng mơ tả một phụ nữ 50 tuổi ở Tây Nam Đức mắc chứng hoang tưởng, rối loạn trí nhớ,
thường xuyên gây hấn và bối rối cho đến khi bà tử vong. Báo cáo của ông ghi nhận các
mảng đặc biệt và đám xơ rối trong mô não bệnh nhân. Năm 1910, tái bản lần 8 quyển “Tâm
thần học” của Kraepelin được phát hành và trong đó tác giả đề nghị đặt tên căn bệnh mới
được tìm ra là Alzheimer. Tới năm 1909, Alois Alzheimer công bố thêm 3 trường hợp khác
tương tự với tình trạng của Auguste D, và một bệnh nhân mới (Josef F) chỉ có các mảng
bám trong não mà khơng có rối loạn sợi thần kinh. Từ trường hợp của Auguste D và Josef
F, Alzheimer đã chỉ ra mảng bám và đám xơ rối là các giai đoạn khác nhau của một bệnh
lý [16].
Mặc dù đã có nhiều nghiên cứu sâu rộng được tiến hành, tuy nhiên cơ chế gây bệnh
của AD vẫn chưa được làm sáng tỏ. Điều này gây cản trở việc phòng ngừa và điều trị bệnh.
Trong số các giả thuyết về cơ chế bệnh sinh, phải kể đến giả thuyết amyloid-β oligome
(AβO) đã được cơng bố vào năm 1998 [6]. Nó đề xuất rằng tổn thương não dẫn đến bệnh
Alzheimer được kích thích bởi các AβO hịa tan, giống như ligand. Trong khi đó, giả thiết
Amyloid (Amyloid cascade hypothesis) đề xuất rằng sự lắng đọng của Aβ là sự kiện khởi
phát bệnh lý AD dẫn đến sự hình thành các mảng bám và sau đó đến các đám rối thần kinh,
chết tế bào thần kinh và cuối cùng là mất trí nhớ [33]. Sự tích tụ các mảng Aβ cũng khiến
cho nồng độ acetylcholin ở người mắc AD bị suy giảm đáng kể. Mặt khác, acetylcholin là
chất dẫn truyền thần kinh tại khe synapse, có vai trị quan trọng trong hoạt động của hệ thần

kinh và nồng độ acetylcholin được duy trì ổn định bởi enzym acetylcholinsterase. Do vậy,

2


thiết kế các thuốc ức chế acetylcholinsterase đóng vai trị quan trọng trong việc làm chậm
tiến triển của bệnh AD.
1.1.2. Thuốc điều trị Alzheimer
Cho đến nay vẫn chưa có phương pháp nào thực sự điều trị cho bệnh Alzheimer.
Điều trị hỗ trợ và chăm sóc bệnh nhân là những biện pháp chủ yếu. Đối với các bệnh nhân
mắc AD triệu chứng từ nhẹ đến trung bình, các chất ức chế acetylcholinsterase (AChEI)
được kê đơn nhiều nhất. Tuy nhiên, chiến lược sử dụng chất ức chế đơn đích truyền thống
là khơng đủ và không phù hợp để mang lại hiệu quả điều trị mong muốn vì nhiều yếu tố
như sự lắng cặn amyloid-β (Aβ), viêm thần kinh, stress oxy hóa và giảm mức độ
acetylcholin (ACh) đã được cho là đóng vai trị quan trọng trong bệnh học AD [48].
Mơ hình phát triển thuốc AD theo hướng mới giải quyết vấn đề này bằng cách tập
trung vào các chất ức chế đa đích dựa trên AChEI. Có thể kể đến một số ví dụ điển hình
như: Các chất ức chế kép AChEI, các AChEI ức chế NMDA, các AChEI đối kháng thụ thể
PAF, các AChEI ức chế MAO-B [48].
1.1.2.1.

Các chất ức chế kép AChE

Các chất này có khả năng ức chế đồng thời vị trí xúc tác lẫn ngoại vi, vì vậy không
chỉ làm giảm triệu chứng suy giảm nhận thức của bệnh nhân AD bằng cách tăng số lượng
ACh trong khe synap mà cịn đóng vai trị là tác nhân làm chậm tiến trình của bệnh, làm trì
hỗn sự hình thành mảng bám amyloid. Một trong các thuốc điển hình của hướng nghiên
cứu này thiết kế dẫn xuất của galanthamin - hợp chất đã được FDA công nhận sử dụng là
thuốc điều trị Azheimer [42]. I. Doytchinova và các cộng sự đã thiết kế và tổng hợp 15 hợp
chất dựa trên khung galanthamin, kết quả nghiên cứu chỉ ra các hợp chất này đều có IC50

lớn hơn galanthamin từ 10 đến 100 lần và đều có khả năng khóa khu vực xúc tác lẫn ngoại
biên của AChE [10].
1.1.2.2.

Các AChEI ức chế NMDA

Bệnh lý AD biểu hiện tổn thương tế bào thần kinh trên các hệ thống truyền đa thần
kinh, bao gồm cholinergic, glutamatergic, dopaminergic, serotoninergic, v.v. Các hợp chất
nhắm mục tiêu vào các thụ thể tương ứng sẽ làm giảm độc tính synap và có lợi cho điều trị
AD. Trong số các thụ thể này, thụ thể NMDA, liên quan đến tính linh hoạt synap, đã được
chứng minh là có liên quan đến rối loạn chức năng glutamatergic trong bệnh lý AD [8] và
3


trở thành mục tiêu điều trị AD đầy hứa hẹn. Trong 1 báo cáo năm 2010, Yvonne Rook và
cộng sự đã chỉ ra rằng một số β-carbolines hóa trị 2 được phát hiện có khả năng ức chế thụ
thể NMDA cùng hoạt tính ức chế AChE/BuChE [35].
1.1.2.3.

Các AChEI ức chế MAO-B

Các nghiên cứu gần đây đã chỉ ra rằng hoạt động MAO-B được tăng lên ở vỏ não
của bệnh nhân AD [4], [40] và do đó tạo ra sự gia tăng nồng độ các gốc hydroxyl trong não
có liên quan đến sự lắng đọng của các mảng Aβ [4]. Do đó, các chất ức chế MAO-B đã
được đề xuất để điều trị AD. Một trong những AChEIs ức chế MAO-B tiêu biểu phải kể
tới MBA236, chất này được tổng hợp dựa trên ASS234 - chất chống oxy hóa và chất ức
chế tổng hợp AChE và Aβ. MBA236 đã được Bautista-Aguilera và cộng sự xác định là một
chất ức chế kép cholinesterase và MAO mới đầy hứa hẹn [3].
1.1.2.4.

Các AChEI đối kháng thụ thể PAF

Viêm dây thần kinh có mối tương qua với lắng đọng Aβ và rối loạn sợi thần kinh.
Phản ứng viêm thần kinh nghiêm trọng thúc đẩy thêm q trình thối hóa thần kinh [26].
Là một chất trung gian gây viêm mạnh, PAF cho thấy mức độ tăng cao trong não AD. Do
đó, các thuốc ức chế cả PAF và AChE được mong chờ sẽ có hiệu lực điều trị AD tốt hơn.
1.2.

Tổng quan về enzym acetylcholinesterase
Acetylcholinsterase (kí hiệu: EC 3.1.1.7) là một trong hai loại enzym cholinesterase,

nó tập trung tại các khớp thần kinh cholinergic trên khắp hệ thống thần kinh trung ương và
tại các khớp thần kinh cơ. Tại đây, AChE nhanh chóng thủy phân acetylcholin thành cholin
và acetat [9]. Việc thủy phân acetycholine giúp tái lập kích thích thần kinh và cho phép dẫn
truyền xung động thần kinh mới.
Trung tâm hoạt động
Cấu trúc của AChE được mô tả lần đầu tiên vào năm 1991 bởi J. Sussman, người đã
kết tinh thành công enzym từ cơ quan điện của loài cá đuối điện, Torpedo californiaica
(TcAChE) . TcAChE bao gồm 537 acid amin và được bao quanh bởi 14 chuỗi xoắn ốc [44].
Trong cấu trúc AChE, hai vùng gắn kết quan trọng cần được quan tâm là vùng xúc
tác và vùng ngoại biên.

4


Phản ứng thủy phân AChE diễn ra ở vị trí xúc tác là đáy của một khoang tác động
sâu 20 Å, rộng 5 Å. Vị trí này có bộ ba xúc tác là các residue Ser200, His440 và Glu327.
Hoạt tính xúc tác có liên quan đến việc chuyển nhóm acetyl từ acetylcholin sang Ser200.
Ngồi ra, vùng xúc tác cịn có các thành phần khác như: Túi “oxyanion” với các
amino acid Gly118, Gly119 và Ala201, đóng vai trị đây là nơi ổn định phức hợp trung gian

được tạo thành trong phản ứng xúc tác của enzym. Túi acyl với các amino acid Phe288 và
Phe290, có vai trị ổn định nhóm methyl của phần acetate trong quá trình xúc tác và trong
việc chọn lọc cơ chất cho enzym. Một thành phần khác của vùng xúc tác là vị trí anion
AChE, bao gồm Trp84, Tyr130, Phe330 và Phe331, chịu trách nhiệm liên kết nhóm amoni
bậc bốn cơ chất với các tương tác cation-π [2].
Vùng ngoại biên (PAS) nằm ở lối vào của khoang tác động bao gồm các amino acid
Tyr70, Asp72, Tyr121, Trp279 và Tyr334 trong đó Trp279 là thành phần quan trọng nhất.
Vùng này liên quan đến vai trò thúc đẩy sự kết tập các mảng β amyloid đồng thời biến đổi
chức năng synap của các tế bào thần kinh hải mã [2].
Nghiên cứu từ Inestrosa và cộng sự cho thấy sự tương tác của peptide Aβ với PAS
góp phần hình thành các mảng amyloid bằng cách đẩy nhanh quá trình Oligome hóa Aβ
[17]. Các chất ức chế PAS có thể ngăn chặn ACh đi vào vào lõi xúc tác bằng hoạt tính ức
chế khơng cạnh tranh cũng như ức chế sự oligome hóa do PAS gây ra. Do đó, PAS đã nổi
lên như một hướng đi mới đầy triển vọng cho điều trị AD [2].

Hình 1.1. Trung tâm hoạt động của acetylcholinesterase [2]
5


Sự thay đổi sinh hóa đáng chú ý nhất ở bệnh nhân AD là giảm nồng độ acetylcholine
(ACh) ở vùng đồi thị và vỏ não [18]. Do vậy, các thuốc ức chế AChE nhằm duy trì nồng
độ acetylcholine đóng vai trò tăng cường sự dẫn truyền thần kinh, giúp cải thiện tình trạng
suy giảm trí nhớ trong việc ngăn chặn sự tiến triển của bệnh Alzheimer
1.3.

Tổng quan về phương pháp nghiên cứu in silico
Thuật ngữ in silico có nguồn gốc từ tiếng Latin, dùng để diễn đạt các công việc được

thực hiện trên máy tính thơng qua các chương trình giả lập. Vào năm 1989, thuật ngữ này
lần đầu tiên được sử dụng bởi Pedro Miramontes trong hội thảo "Cellular Automata: Theory

and Application" ở Los Alamos, New Mexico [28].
Ban đầu in silico dùng để chỉ các mơ phỏng máy tính dùng để mơ hình hóa các q
trình tự nhiên và khơng đề cập đến các tính tốn được thực hiện bởi máy tính nói chung.
Sau đó, các nhà khoa học đã nhanh chóng mở rộng và ứng dụng phương pháp này để dự
đoán khả năng phát triển một hợp chất cho mục đích y học cũng như tác dụng phụ của
chúng trên con người [36]. Theo tính tốn của PricewaterhouseCooper, việc ứng dụng in
silico được kì vọng giúp đẩy nhanh tốc độ nghiên cứu phát triển thuốc và cắt giảm tới một
nửa chi phí [49].
Nghiên cứu in silico trong y học được cho là có khả năng tăng tốc độ tìm kiếm các
hợp chất làm thuốc. Một trong những cách để đạt được mục tiêu này là sàng lọc tìm kiếm
các chất ứng cử viên làm thuốc có tiềm năng. Năm 2007, các nhà nghiên cứu đã sử dụng
phương pháp in silico để hỗ trợ phát hiện thuốc điều trị lao, phương pháp này cho phép các
thí nghiệm chỉ mất vài phút thay vì thực nghiệm tiêu tốn thời gian vài tháng [43]. Năm
2010, bằng cách sử dụng thuật toán lắp ghép protein, các nhà nghiên cứu đã tìm thấy các
chất ức chế tiềm năng đối với một loại enzym liên quan đến hoạt động ung thư. Một nửa
trong số các phân tử sau đó đã được chứng minh là có hoạt tính ức chế in vitro [34].
1.3.1. Dự đốn ADMET và các thơng số hóa lý
1.3.1.1.

Dự đốn ADMET

Các đặc tính liên quan đến sự hấp thụ, phân phối, trao đổi chất, bài tiết và độc tính
(ADMET) đã trở thành một trong những vấn đề quan trọng nhất để đánh giá khả năng trở
thành thuốc của một chất. Phát triển một thuốc mới địi hỏi rất nhiều chi phí và công sức.
Tuy nhiên, số lượng thuốc được đưa ra thị trường chiếm tỷ lệ rất nhỏ so với các thuốc đưa
6


vào thử nghiệm lâm sàng. Hai nguyên nhân chính cho sự thất bại này là do hiệu quả tác
dụng của các hợp chất kém và độc tính của chúng quá cao. Kể từ khi việc đánh giá thông

số ADMET được chú ý, chỉ còn 8% các thuốc thất bại do khơng đáp ứng được các thuộc
tính ADMET, một con số nhỏ hơn nhiều so với trước [5].
Giám sát và tối ưu hóa các thơng số ADMET cần được quan tâm từ giai đoạn đầu
thử nghiệm thuốc. Tuy nhiên, việc đánh giá thông số dược động học của hàng triệu hợp
chất ứng cử viên là q trình khơng đơn giản. Vì vậy, cùng với sự ra đời của kĩ thuật in
silico, các cơng cụ đến tính tốn ADMET đã ra đời.
AdmetSAR là một trong số những cơng cụ dự đốn ADMET mạnh mẽ. Cơng cụ này
tích hợp hơn 210.000 dữ liệu lưu trữ thuộc tính hấp thu, phân bố, chuyển hóa, thải trừ của
96.000 hợp chất. Cùng với đó là 22 mơ hình dự đốn định tính với đầu ra xác suất và 5 mơ
hình hồi quy định lượng với đầu ra số thực tế đã được phát triển và triển khai để dự đốn
các thuộc tính ADMET [5].
1.3.1.2.

Dự đốn thơng số hóa lý

Các thơng số hóa lý là yếu tố vô cùng quan trọng trong việc cân nhắc một chất có
thể trở thành thuốc được hay khơng. Cùng với sự ra đời của các nguồn dữ liệu khổng lồ
như PubChem việc tính tốn các thơng số hóa lý khơng cịn là việc đơn giản. Vì vậy, các
cơng cụ hóa tin học đã ra đời để hỗ trợ q trình tính tốn.
Một trong số các cơng cụ tiêu biểu có thể kể đến là phần mềm Datawarrior, phần
mềm được phát triển bởi tiến sĩ Thomas Sander và các cộng sự nhằm mục đích giảm bớt
gánh nặng trong cơng việc tính tốn. Sử dụng Datawarrior cho phép tính tốn được các
thơng số từ cấc trúc hóa học như TPSA (Topological polar surface area – Diện tích bề mặt
phân cực), logP (hệ số phân bố Octanol – nước), logS (hệ số tan) [38]….
1.3.2. Sàng lọc ảo dựa trên docking và thuộc tính giống thuốc (drug-likeness)
1.3.2.1.

Sàng lọc drug-likeness dựa theo quy tắc của Lipinski

Lipinski chỉ định các hợp chất giống thuốc là những chất có các đặc tính ADMET

(hấp thu, phân phối, chuyển hóa, thải trừ) đủ để vượt qua các thử nghiệm lâm sàng pha I
[25]. Ông cũng đưa ra bộ quy tắc 5 điểm (RO5) cung cấp một hướng dẫn để xác định đặc
điểm giống thuốc. Các thuộc tính như sinh khả dụng đường uống hoặc tính thấm của màng
thường có mối tương quan với log P, trọng lượng phân tử (MW), số lượng liên kết hydro
7


cho và số lương liên kết hydro nhận trong một phân tử. Quy tắc RO5 nói rằng các phân tử
thể hiện sự hấp thụ hoặc thẩm thấu tốt khi logP < 5, MW < 500, số liên kết hydro cho (n
OHNH) ≤ 5, số liên kết hydro nhận (n ON) ≤ 10. Nếu một hợp chất không vượt qua quy
tắc RO5, nó sẽ có nguy cơ gặp vấn đề khi sử dụng đường uống. Tuy nhiên một chất đáp
ứng RO5 khơng đảm bảo nó sẽ trở thành thuốc, vì RO5 khơng bàn về đặc điểm cấu trúc
hóa học.
1.3.2.2.

Mơ phỏng docking

Docking là phương pháp dựa đốn chế độ liên kết thích hợp của một phân tử với
phân tử thứ hai sao cho sau khi liên kết chúng tạo thành phức hợp ổn định [23]. Docking
phân tử là một trong những phương pháp được sử dụng thường xuyên nhất trong thiết kế
thuốc dựa trên cấu trúc, do khả năng dự đoán cấu trúc liên kết của các phối tử phân tử nhỏ
đến vị trí gắn kết đích thích hợp.
Để hồn thành mục tiêu tìm cấu dạng phù hợp nhất, kết quả docking cần liên hệ cấu
hình khơng gian với các trị số đánh giá được khả năng gắn kết của cơ chất (ligand) lên
protein [19]. Các trị số đánh giá khả năng gắn kết được định lượng thơng qua hàm tính
điểm, nhờ đó xếp hạng khả năng liên kết mạnh hay yếu của ligand với receptor.
Thực chất, quá trình docking tìm kiếm vị trí và cấu hình phù hợp nhất mà ligand có
thể gắn với protein và dự đốn chính xác hoạt động của phối tử để năng lượng tự do của
phức hợp mục tiêu phân tử - phối tử là nhỏ nhất [22].
Năng lượng này được cho bởi hằng số liên kết (Kd) và năng lượng tự do Gibbs (ΔG).

Trong đó xét đến các tương tác như Van der Waals, liên kết kị nước, liên kết Hydro, liên
kết cộng hóa trị, liên kết tĩnh điện [30].
Phân loại docking [12]
(a) Docking cứng nhắc, trong đó cả thụ thể và phân tử nhỏ được coi là cứng nhắc,
chỉ quan tâm đến chuyển động tự do và chuyển động tịnh tiến của phối tử.
(b) Doking phối tử linh hoạt/thụ thể cứng, đây là phương pháp được ứng dụng nhiều
nhất trong thiết kế thuốc do tính chính xác cao vào tốc độ nhanh.
(c) Docking linh hoạt hồn tồn, trong đó cả thụ thể và phối tử đều có tính linh hoạt.
Tuy nhiên khi thực hiện phải lưu ý giới hạn tính linh động ở những chuỗi bên đặc trưng của
8


điểm gắn kết. Phương pháp này tính tốn rất phức tạp, đòi hỏi phải so sánh với các phương
pháp khác.
Quy trình docking
Q trình docking được thực hiện thơng qua ba bước: chuẩn bị cấu tử, chuẩn bị
protein, mô phỏng docking.
Chuẩn bị cấu tử
Dữ liệu cấu trúc phối tử sau khi được thu thập sẽ dung để xây dựng cấu trúc 3D trong
các phần mềm chuyên dụng. Sau đó cấu tử cần chỉnh sửa điện tích, gắn trường lực và tối
ưu hóa năng lượng để chuẩn bị cho docking
Chuẩn bị protein
Cấu trúc 3D của protein có thể tìm thấy trong ngân hàng dữ liệu protein. Có thể tự
xây dựng cấu trúc protein theo phương pháp mơ hình hóa tương đồng (Homology
modeling) nếu cấu trúc protein khơng có sẵn. Tiếp theo, tiến hành tách các thành phần
không cần thiết ra khỏi cấu trúc protein, gắn hydro, áp đặt trường lực và phân tích vùng
tương tác.
Mơ phỏng docking
Trước khi tiến hành mơ phỏng docking cần khoanh vùng tìm kiếm cho thuật tốn.
Vùng tìm kiếm tùy thuộc vào tưng nghiên cứu, tuy nhiên không nên quá nên tránh gây mất

thời gian, cũng không nên quá nhỏ vì số cấu hình thu được sẽ giảm. Khi tiến hành docking,
phần mềm sẽ tự động tìm kiếm trả về những cấu hình phù hợp chất của phối tử cùng với
điểm số docking đi kèm. Việc phân tích tương tác của các cấu hình thu được có thể thực
hiện trên phần mềm như MOE, Discovery studio.
1.3.3. Mô phỏng động lực học phân tử
Tính linh hoạt của vị trí liên kết mục tiêu là một khía cạnh thiết yếu nhưng thường
bị bỏ qua để được xem xét trong lắp ghép phân tử. Phối tử và thụ thể có thể trải qua những
thay đổi về hình dạng trong quá trình nhận dạng phân tử [24]. Trong một số trường hợp, sự
sắp xếp lại cấu trúc này là nhỏ và phối tử phù hợp với một vị trí gắn kết với ít sự di động.
Mặt khác, một số protein thực hiện các thay đổi về hình dạng đáng kể, có thể liên quan đến
các yếu tố cấu trúc bậc hai và bậc ba. Các vấn đề linh hoạt như vậy có thể được xử lý bằng
cách sử dụng các kỹ thuật như mô phỏng động lực học phân tử (MD) [37].
9


MD dự đoán sự di chuyển của các nguyên tử, phân tử trong một theo thời gian dựa
trên các phương trình động học như định luật chuyển động của Newton [21]. Những mơ
phỏng này cho biết các q trình phân tử sinh học quan trọng, bao gồm sự thay đổi về hình
dạng, liên kết phối tử và protein, cho biết vị trí của tất cả các nguyên tử ở cấp độ
femtosecond. Nhờ đó, MD có thể dự đốn các phân tử sinh học sẽ phản ứng thế nào ở mức
độ ngun tử.
Mơ phỏng MD cịn được sử dụng để kiểm tra độ chính xác của cấu trúc mơ hình
nhiễu xạ tia X hoặc thậm chí để tinh chỉnh nó. Đơi khi người ta loại bỏ ligand ràng buộc
khỏi cấu trúc protein và sau đó mơ phỏng MD để xem việc loại bỏ phối tử ảnh hưởng đến
cấu trúc protein như thế nào [11]. Trong một số trường hợp, một hay nhiều acid amin trong
protein sẽ bị đột biến rồi sau đó sử dụng MD để giải thích, dự đốn ảnh hưởng của đột biến
đến hệ [7]. Mô phỏng MD đặc biệt có giá trị trong thiết kế thuốc, sau khi sàng lọc ảo, các
phức hợp của các ligand tiềm năng với protein được mô phỏng MD để nghiên cứu sự ổn
định của hệ [46].
Trường lực trong mô phỏng động lực học phân tử

Trường lực là một biểu thức toán học mô tả sự phụ thuộc năng lượng của một hệ vào
tọa độ của các hạt của nó. Nó là một dạng phân tích của năng lượng tiềm năng của các
tương tác và một tập hợp các tham số tham chiếu. Một trường lực lý tưởng phải đủ đơn
giản để được đánh giá nhanh chóng, nhưng đủ chi tiết để tái tạo các thuộc tính quan trọng
của hệ thống được nghiên cứu [14]. Trong động lực phân tử, trường lực là một tập hợp các
phương trình và hằng số liên quan được thiết kế để tái tạo hình học phân tử và các thuộc
tính được chọn của các cấu trúc được thử nghiệm. Nó dùng để mơ tả sự biến đổi theo thời
gian của độ dài liên kết, góc và độ xoắn của liên kết, cũng tương tác van der Waals, tương
tác tĩnh điện…
4 bước trong mô phỏng MD [14]
Bước 1: Thiết lập hệ thống. Giai đoạn này phải tạo ra một cấu hình hợp lý của hệ
thống cần mơ phỏng, chọn trường lực hợp lệ cho hệ thống này, chọn phương pháp xử lý
các tương tác tĩnh điện nếu hệ thống chứa mang điện tích, chọn điều kiện định biên định kì
(thiết lập hộp mơ phỏng).
10


Bước 2: Cực tiểu hóa. Thơng thường cấu hình ban đầu của hệ sẽ không đại diện cho
các điều kiện chúng ta muốn mơ phỏng. Ví dụ: nếu xuất phát từ mơ phỏng MD trước đó,
chúng ta có thể muốn mô phỏng hệ thống ở nhiệt độ khác. Nếu các vị trí ban đầu được xác
định ngẫu nhiên, chúng ta có thể có một số nguyên tử quá gần gây ra xung đột cho cấu trúc
hệ. Quá trình cân bằng sẽ tìm kiếm một trạng thái có năng lượng thấp nhất và loại bỏ năng
lượng dư thừa khỏi hệ thống để ngăn chặn mô phỏng thất bại do xuất hiện một lực quá lớn
Bước 3: Mô phỏng. Sau khi cực tiểu hóa ở nhiệt độ và áp suất mong muốn, chúng
ta có thể thực hiện q trình mơ phỏng, trong điều kiện NVP hoặc NPT. Một điều cần lưu
ý là thời gian mô phỏng phải đủ dài để cho phép các đại phân tử khám phá tất cả các cấu
hình có thể.
Bước 4: Phân tích. Sau khi kết thúc q trình mơ phỏng, quỹ đạo mơ phỏng phải
được phân tích để trích xuất các thơng tin mong muốn. Chúng ta có quyền truy cập vào các
vị trí ngun tử, vận tốc và thậm chí các lực như là một hàm của thời gian. Do đó, bất kỳ

tính chất cơ học thống kê nào có thể được biểu thị theo các biến đó đều có thể được tính
tốn.

11


CHƯƠNG 2. NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU
2.1.

Nguyên liệu, thiết bị

2.1.1. Nguyên liệu
Cơ sở dữ liệu VNPD gồm cấu trúc của 1424 hợp chất có nguồn gốc dược liệu Việt
Nam và các thông tin như nguồn dược liệu, tác dụng dược lý đã nghiên cứu được lưu trữ
trong file excel.
Cấu trúc tinh thể tia X của Acetylcholin esterase (1dx6) được tải về từ ngân hàng dữ
liệu protein (Protein data bank).
2.1.2. Thiết bị
Phần mềm: Danh sách các phần mềm sử dụng bao gồm:
MOE 2009

DruLiTo 1

UCSF Chimera 1.10.2

NAMD2

ICM-Pro 3.8-6

Discovery Studio 2016

Chemdraw Professional 15.0

Microsoft Excell 2016

VMD 1.9.3

Công cụ admetSAR online

DataWarrior 5.0

Công cụ charm-gui online

2.2.

Nội dung nghiên cứu

1. Sàng lọc các hợp chất tự nhiên và xác định cấu dạng khi chúng ức chế enzym
Acetylcholin Esterase thông qua mô phỏng docking và phương pháp drug-likeness.
2. Xác định độ ổn định của hệ protein-ligand thông qua mô phỏng động lực học phân
tử.
3. Dự đốn thơng số hóa lý và đặc điểm dược động học của các chất tiềm năng.
2.3.

Phương pháp

2.3.1. Sàng lọc Drugs likeness
Dữ liệu cấu trúc của 1424 hợp chất ban đầu ở dạng smile, cần vẽ lại cấu trúc liên
kết của tất cả hợp chất cần sàng lọc thành định 1 file .sdf duy nhất, file này là dữ liệu

đầu vào của DruLiTo. Việc vẽ cấu trúc được thực hiện trong công cụ Chemdraw thuộc
bộ công cụ ChemOffice2015. Sau khi nạp dữ liệu đầu vào, DruLiTo sẽ dự đoán các
12


thông số dược động học. Cuối cùng, áp dụng bộ lọc Lipinski để sàng lọc các hợp chất
giống thuốc.

Hình 2.1. Cấu trúc các chất được vẽ bằng ChemDraw
2.3.2. Mô phỏng docking
2.3.2.1. Re-dock galantamine
Trong phức hợp TcAChE (pdb: 1DX6) chứa sẵn ligand đồng kết tinh là galantamine.
Do đó, Re-dock Galathamin là cách để thẩm định quy trình dock. Nếu sự sai lệch của
Galathamin trong tinh thể và sau khi Re-dock là khơng đáng kể thì có thể kết luận quy trình
dock là phù hợp. Các bước Re-dock gồm;
Chuẩn bị ligand: Quá trình này được tiến hành với 3 cấu dạng ligand
(1) Tách ligand đồng kết tinh TcAChE trong tinh thể 1dx6
(2) Tách ligand đồng kết tinh và chuẩn bị lại trong phần mềm ICM-Pro
(3) Vẽ ligand hoàn toàn mới bằng Chemdraw và chuẩn bị lại trong ICM-Pro 3.8-6
Chuẩn bị protein: Cấu trúc tinh thể của TcAChE đồng kết tinh với Galanthmin (PDB:
1dx6, độ phân giải 2,3Å) được lấy từ ngân hàng dữ liệu protein (Protein data bank), loại
nước, các cấu tử (ligand) ra khỏi cấu trúc của protein, thêm hydro, tối ưu hóa các hydro
phân cực và gắn trường lực MMFF. Tất cả các bước này đều được tiến hành trong phần
mềm ICM-Pro

13


Mô phỏng docking: Tiến hành docking bằng phần mềm ICM với các tùy chọn. Nỗ
lực (effort = 1,0); số cấu hình (N comformation = 30); Score version 2005; kích thước hộp

tìm kiếm 22x22x33 Å. Phân tích các kết quả bằng phần mềm Discovery studio và MOE
Đánh giá kết quả:
Kết quả docking được đánh giá thơng qua 3 tiêu chí là RMSD (Root mean square
deviation),khả năng tương tác và điểm số docking.
RMSD: đo độ lệch trung bình của các nguyên tử giữa 2 cấu dạng. Cơng thức tính
RMSD cho 2 cấu dạng a, b như sau:
RMSD( a ,b ) =



1 n
 (aix − bix ) 2 + (aiy − biy ) 2 + (aiz − biz ) 2
n i =1



Trong đó n là tổng số nguyên tử; ix, iy, iz là toạ độ không gian của nguyên tử thứ i.
RMSD càng lớn thì mức độ sai lệch của hai cấu dạng càng lớn. Thơng thường RMSD ≤
1,5Å thì có thể xem sự sai lệch là không đáng kể [15].
Khả năng tương tác: sử dụng phần mềm MOE để phân tích các tương tác (hydro, , ion, tương tác cation-, Van der Waals) giữa galanthamin re-dock với protein, các tương
tác này được so sánh với tương tác của galanthamin ban đầu.
Điểm số docking (score): Trong mô phỏng docking, năng lượng liên kết thấp hơn
được cho là gần với trạng thái tự nhiên của phức hợp. Hàm tính điểm của thuật tốn docking
là phương trình là tập hợp giá trị các tham số đi kèm với hệ số theo một lý thuyết áp đặt
nhất định. Mỗi loại tương tác, đều được gán cho 1 miền giá trị, kết quả cuối phản ánh khả
năng tương tác mạnh hay yếu của phối tử với receptor.
2.3.2.2. Sàng lọc ảo 1424 hợp chất
Sau khi được thẩm định bởi kết quả re-dock, quy trình docking này được dùng để
sàng lọc ảo cơ sở dữ liệu VNPD 1424 chất. Các hợp chất tiềm năng được đưa vào ICM
dưới dạng công thức cấu tạo trong file .sdf. ICM sẽ áp dụng trường lực MMFF, cực tiểu

hóa năng lượng, điều chỉnh điện tích ở pH7 cho các hợp chất.
Kết quả protein docking sẽ chọn ra với 3 tiêu chí:
1) Điểm số docking tốt hơn galanthamin re-dock
2) Tạo liên kết với bộ ba xúc tác trong vùng thủy phân cơ chất
3) Tạo liên kết với vùng ngoại biên
14


2.3.3. Molecular Dynamic
2.3.3.1. Thiết lập hệ thống
Thu thập tọa độ Protein
Để bắt đầu mô phỏng MD trước tiên cần file tọa độ cấu trúc của cả đích (protein) và
phối tử (ligand) ở dạng file PDB. Với protein sử dụng định dạng PDB được tải xuống từ
ngân hàng dữ liệu cấu trúc của protein (địa chỉ domain: ). File PDB của
ligand được lấy từ kết quả docking. Sau đó sử dụng công cụ online Charmmgui
() để áp dụng trường lực Charm36 cho cả protein và ligand.
Thiết lập điều kiện định biên (thiết lập hộp nước)
Điều kiện biên định biên được áp dụng cho mô phỏng động lực học phân tử để theo
dõi chuyển động của tất cả các hạt và để tránh / giảm thiểu hiệu ứng cạnh trên các nguyên
tử bề mặt. Hộp nước được thiết lập bởi phần mềm VMD sao cho khoảng cách từ bề mặt
protein tới cạnh hộp là 10 Å. Sau đó thực hiện solvat hóa hệ thống bằng nước nhờ tiện ích
mở rộng Add Solvation Box (hình 2.2) trong VMD để bắt chước mơi trường sinh lý của
một protein. Đây là bước cần thiết để mơ phỏng MD với điều kiện định biên.

Hình 2.2. Xây dựng hộp nước bằng tiện ích mở rộng Add Solvation Box
15

3

Làm trung hòa hệ thống
Các ion cần được đặt thêm vào hộp nước để bắt chước môi trường sinh lý. Các ion
này sẽ che chắn các vùng của protein mang điện tích và làm cho tồn bộ hệ thống ổn định
hơn. Sử dụng tiện ích mở rộng VMD Autoionize để thêm ion Na+ và Cl- ở các vị trí ngẫu
nhiên, nồng độ NaCl được thiết lập là 0,15 mol/L.
2.3.3.2. Cực tiểu hóa năng lượng
Việc cực tiểu hóa năng lượng được thực hiện bởi NAMD2 và hoàn thành sau 1000
timesteps, sau đó tốc độ của các hạt được xác định bởi phân phối ngẫu nhiên Boltzmann ở
nhiệt độ 310K.
2.3.3.3. Mô phỏng động lực học phân tử (run MD)
Mô phỏng được thực hiện với NAMD2 với các thông số: Hộp nước với kích thước
85x82x79 Å, trung tâm hộp nước có tọa độ (1,71; 1,17; 2.16). Sử dụng động lực học
Langevin cho toàn hệ (ngoại trừ nguyên tử hydro) với langevin Damping là 0,1;
langevinTemp 310. Bước thời gian (timesteps) được thiết lập là 2fs, nhiệt độ 310K và áp
suất 1 atm, thời gian mơ phỏng 500.000 timesteps (1ns). Tham số hóa trường lực cho hệ sử
dụng Charm36. Langevin áp dụng để kiểm soát động năng của hệ thống, từ đó kiểm sốt
nhiệt độ và áp suất.
2.3.3.4. Phân tích kết quả
Phân tích quỹ đạo MD dùng để phát hiện vấn đề bất thường với tính ổn định của hệ
thống qua các chỉ số. Một trong những vấn đề quan trọng nhất cần lưu ý là xu hướng biến
dạng của phân tử được đo lường bằng RMSD [41].
Phân tích biến động bình phương trung bình gốc (RMSF) của từng dư lượng để phát
hiện các thay đổi cục bộ xảy ra trong chuỗi protein do tính linh động của các residue [29].
RMSF cho residue của protein được tính theo phương trình:
2

1

RMSF= √ ∑𝑇𝑡=1 [𝑟 ′ 𝑖 (𝑡 ) − 𝑟𝑖 (𝑡𝑟𝑒𝑓 )]
𝑇

Trong đó, T là độ dài bước thời gian (timestep), tref là thời gian tham chiếu, ri là vị
trí của residue, r’ là là vị trí của residue i ở thời điểm t.
Phân tích liên kết hydro (H-bond) là một yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến sự ổn
định protein. Ở đây, nghiên cứu thiết lập ngưỡng khoảng cách 3,5Å và góc liên kết 30° [27]
16