VŨ THỊ PHƢƠNG HUẾ xây DỰNG PHƢƠNG PHÁP ĐỊNH LƢỢNG PARACETAMOL và METHIONIN TRONG CHẾ PHẨM PASAFE BẰNG sắc ký LỎNG TƢƠNG tác THÂN nƣớc KHÓA LUẬN tốt NGHIỆP dƣợc sĩ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI

VŨ THỊ PHƢƠNG HUẾ

XÂY DỰNG PHƢƠNG PHÁP ĐỊNH
LƢỢNG PARACETAMOL VÀ
METHIONIN TRONG CHẾ PHẨM
PASAFE BẰNG SẮC KÝ LỎNG
TƢƠNG TÁC THÂN NƢỚC
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ

HÀ NỘI 2019


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI

VŨ THỊ PHƢƠNG HUẾ

XÂY DỰNG PHƢƠNG PHÁP ĐỊNH
LƢỢNG PARACETAMOL VÀ
METHIONIN TRONG CHẾ PHẨM
PASAFE BẰNG SẮC KÝ LỎNG
TƢƠNG TÁC THÂN NƢỚC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ
Người hướng dẫn:
1. PGS. TS. Phạm Thị Thanh Hà
2. Ths. Vũ Ngân Bình
Nơi thực hiện:
Bộ mơn Hóa phân tích – Độc chất

HÀ NỘI 2019


LỜI CẢM ƠN
Khóa luận này được hồn thành tại Bộ mơn Hóa phân tích – Độc chất, Trường Đại
học Dược Hà Nội dưới sự hướng dẫn của PGS.TS. Phạm Thị Thanh Hà và ThS. Vũ Ngân
Bình.
Lời đầu tiên tơi xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất tới PGS.TS. Phạm
Thị Thanh Hà và ThS. Vũ Ngân Bình là người thầy đã trực tiếp hướng dẫn tận tình, chu
đáo, ln động viên khích lệ và tạo mọi điều kiện thuận lợi nhất cho tôi trong suốt thời
gian thực hiện khóa luận.
Tơi xin trân trọng cảm ơn các thầy cơ Bộ mơn Hóa phân tích – Độc chất, Trường
Đại học Dược Hà Nội đã tạo điều kiện, giúp đỡ và động viên tơi hồn thành khóa luận
này.
Tơi cũng xin gửi lời cảm ơn tới bạn bè, người thân trong gia đình ln tạo điều
kiện, quan tâm, giúp đỡ, động viên tơi trong suốt q trình học tập, nghiên cứu.
Cuối cùng xin kính chúc các thầy cơ ln mạnh khỏe, hạnh phúc và thành công
trong công việc cũng như trong cuộc sống.
Hà Nội, ngày 20 tháng 05 năm 2019
Sinh viên

Vũ Thị Phƣơng Huế

MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
ĐẶT VẤN ĐỀ...................................................................................................................... 1
CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN .............................................................................................. 2
1.1. Tổng quan về đối tƣợng nghiên cứu ....................................................................... 2
1.1.1. Đặc điểm về paracetamol và methionin ............................................................. 2
1.1.2. Một số phương pháp phân tích acid amin và paracetamol .............................. 4
1.2. Tổng quan về sắc ký lỏng tƣơng tác thân nƣớc ..................................................... 7
1.2.1. Pha tĩnh ............................................................................................................... 7
1.2.2. Pha động.............................................................................................................. 8
1.2.3. Cơ chế tách .......................................................................................................... 9
1.2.4 Ưu điểm .............................................................................................................. 10
1.2.5 Nhược điểm ........................................................................................................ 11
CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................ 12
2.1. Đối tƣợng nghiên cứu............................................................................................. 12
2.2. Nguyên vật liệu ....................................................................................................... 12
2.2.1. Hóa chất ............................................................................................................ 12
2.2.2. Thiết bị, dụng cụ ............................................................................................... 12
2.3. Nội dung nghiên cứu .............................................................................................. 13
2.4. Phƣơng pháp nghiên cứu....................................................................................... 13
2.4.1. Khảo sát bước sóng phát hiện .......................................................................... 13
2.4.2. Khảo sát pha tĩnh .............................................................................................. 13
2.4.3. Khảo sát pha động ............................................................................................ 14
2.4.4. Khảo sát nồng độ định lượng của paracetamol và methionin........................ 15
2.4.5. Thẩm định quy trình ......................................................................................... 15
CHƢƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ..................................... 19
3.1.Quy trình chuẩn bị mẫu ......................................................................................... 19

3.1.1. Chuẩn bị mẫu thử ............................................................................................. 19


3.1.2. Chuẩn bị nền mẫu tự tạo .................................................................................. 21
3.1.3. Chuẩn bị dung dịch chuẩn ............................................................................... 21
3.1.4. Chuẩn bị các mẫu thử thêm chuẩn.................................................................. 22
3.1.4.1. Các mẫu thử thêm chuẩn methionin ............................................................ 22
3.1.4.2. Các mẫu thử thêm chuẩn paracetamol ......................................................... 23
3.2. Quy trình chuẩn bị dung mơi pha động ............................................................... 24
3.3. Khảo sát diều kiện sắc ký ...................................................................................... 25
3.3.1. Lựa chọn bước sóng phát hiện ........................................................................ 25
3.3.2. Khảo sát pha tĩnh .............................................................................................. 26
3.3.3. Khảo sát pha động ............................................................................................ 29
3.3.3.1. Khảo sát thành phần pha động ..................................................................... 29
3.3.3.2. Khảo sát tốc độ dòng ...................................................................................... 31
3.3.4. Khảo sát nồng độ định lượng của methionin và paracetamol........................ 32
3.4. Phƣơng pháp phân tích methionin và paracetamol ............................................ 33
3.5. Thẩm định phƣơng pháp ....................................................................................... 33
3.5.1. Độ thích hợp hệ thống (system suitability) ...................................................... 33
3.5.2. Độ chọn lọc (selectivity) .................................................................................... 34
3.5.3. Đường chuẩn và khoảng tuyến tính (linearity) ............................................... 35
3.5.4. Độ chính xác của phương pháp (precision) .................................................... 36
3.5.5. Độ đúng (accuracy) .......................................................................................... 37
3.5.6. Độ ổn định của phương pháp (robustness) ..................................................... 37
3.6. Ứng dụng phƣơng pháp phân tích chế phẩm viên nang mềm trên thị trƣờng 42
CHƢƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .................................................................. 45
4.1. Kết luận ................................................................................................................... 45
4.2 Kiến nghị .................................................................................................................. 46
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC

Phụ lục 1: Sắc ký đồ
Phụ lục 2: Kết quả độ ổn định của phƣơng pháp


DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
Ký hiệu

Tên tiếng Anh hoặc tên khoa học

Tiếng Việt

ACN

Acetonitrile

Acetonitril

HPLC

High performance liquid
chromatography

Sắc ký lỏng hiệu năng cao

Hydrophilic Interaction Liquid

Sắc ký lỏng tương tác thân

Chromatography

nước

PAR

Paracetamol

Paracetamol

MET

Methionine

Methionin

NP - LC

Sắc ký lỏng pha thuận

UV

Normal Phase Liquid
Chromatography
Reversed Phase Liquid
Chromatography
Ultraviolet

RSD (%)

Relative standard deviation

Độ lệch chuẩn tương đối

SD

Standard Deviation

Độ lệch chuẩn

HILIC

RP - LC

Sắc ký lỏng pha đảo
Tử ngoại


DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1

Một số phương pháp phân tích acid amin và paracetamol

5

Bảng 2.1

Các điều kiện pha động khảo sát

14

Bảng 3.1

Kết quả độ đồng đều khối lượng của viên nang mềm Pasafe

19

Bảng 3.2

Quy trình pha dãy các dung dịch chuẩn hỗn hợp

22

Bảng 3.3

Quy trình pha các mẫu thêm chuẩn methionin

23

Bảng 3.4

Quy trình pha các mẫu thêm chuẩn paracetamol

24

Bảng 3.5

Quy trình pha các dung dịch formic và formic thêm DEA

25

Bảng 3.6

Kết quả độ ổn định hệ thống

33

Bảng 3.7

Kết quả độ chọn lọc

34

Bảng 3.8

Kết quả khảo sát đường chuẩn

35

Bảng 3.9

Kết quả độ chính xác của phương pháp

36

Bảng 3.10

Kết quả độ đúng của paracetamol

37

Bảng 3.11

Kết quả độ đúng của methionin

37

Bảng 3.12

Kết quả đánh giá độ ổn định của phương pháp

39

Bảng 3.13

Kết quả định lượng paracetamol trong chế phẩm

43

Bảng 3.14

Kết quả định lượng methionin trong chế phẩm

43


DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
Hình 1.1

Cơng thức cấu tạo paracetamol

2

Hình 1.2

Chuyển hóa paracetamol ở gan

3

Hình 1.3

Cơng thức cấu tạo methionin

3

Hình 1.4

Chế phẩm viên nang mềm Pasafe

4

Hình 1.5

Cơ chế tách trong HILIC

10

Hình 3.1

Quy trình chuẩn bị mẫu thử

21

Hình 3.2

Phổ hấp thụ UV của paracetamol và methionin

26

Hình 3.3

Kết quả khảo sát cột Zorbax CN ở bước sóng 210 nm

27

Hình 3.4

Kết quả khảo sát trên các cột silica ở bước sóng 210 nm

28

Hình 3.5

Kết quả khảo sát một số dung mơi thân nước trên cột Zorbax
Rx Silica

29

Hình 3.6

Kết quả khảo sát nồng độ DEA

30

Hình 3.7

Kết quả khảo sát tốc độ dịng

31

Hình 3.8

Mối tương quan giữa diện tích píc và nồng độ của PAR (100
- 300 ppm)

Hình 3.9
Hình 3.10
Hình 3.11

Hình 3.12

33

Đồ thị biểu diễn mối tương quan tuyến tính giữa diện tích
píc và nồng độ của paracetamol và methionin
Ảnh hưởng chung của các yếu tố khảo sát lên các đáp ứng

36
40

Mức độ ảnh hưởng của các yếu tố khảo sát lên hàm lượng
của methionin

40

Mức độ ảnh hưởng của các yếu tố khảo sát lên thời gian lưu
của methionin

41


ĐẶT VẤN ĐỀ
Hiện nay có nhiều chế phẩm đa thành phần có chứa các acid amin và các hoạt chất
thuộc nhóm khác. Trong những chế phầm này, các acid amin có thể được sử dụng với
mục đích làm tăng tác dụng điều trị và giảm tác dụng không mong muốn của các hoạt
chất khác. Một trong những chế phẩm có dạng phối hợp như trên là chế phẩm chứa
paracetamol và methionin. Paracetamol có tác dụng giảm đau, hạ sốt, khi dùng q liều có
thể gây độc tính trên gan. Methionin là acid amin có chưa lưu huỳnh, có tác dụng làm
giảm độc tính của paracetamol trên gan, phịng ngừa tổn thương gan [2]. Có nhiều
phương pháp định lượng riêng paracetamol và methionin, nhưng hiện nay chưa có cơng
bố nào về phương pháp định lượng cả hai hoạt chất trên trong chế phẩm. Về mặt hóa học,
paracetamol và methionin có tính chất rất khác nhau. Paracetamol có độ phân cực trung
bình, có thể định lượng được bằng sắc ký lỏng pha đảo. Tuy nhiên methionin có độ phân
cực mạnh, do đó ít được lưu giữ và không phân tích được bằng sắc ký lỏng pha đảo. Sắc
ký lỏng tương tác thân nước sử dụng pha tĩnh và pha động đều phân cực, có thể phân tích
được các chất phân cực như acid amin, đồng thời cũng có khả năng lưu giữ các chất có độ
phân cực trung bình như paracetamol. Chính vì vậy, tơi tiến hành thực hiện đề tài “Xây
dựng phƣơng pháp định lƣợng acid amin trong chế phẩm đa thành phần bằng sắc
ký lỏng tƣơng tác thân nƣớc” trên đối tượng cụ thể là viên nang mềm Pasafe có chứa 2
thành phần là paracetamol và methionin với các mục tiêu như sau:
- Xây dựng và thẩm định phương pháp phân tích paracetamol và methionin bằng
sắc ký lỏng tương tác thân nước

- Ứng dụng phương pháp trên để định lượng paracetamol và methionin trong chế
phẩm.

1


CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN
1.1. Tổng quan về đối tƣợng nghiên cứu
1.1.1. Đặc điểm về paracetamol và methionin
Paracetamol (PAR), còn được gọi là acetaminophen, được sản xuất lần đầu tiên
vào năm 1877 [11]. Paracetamol là thuốc giảm đau, hạ sốt, không có hiệu quả điều trị
viêm [2]. Paracetamol tương đối khơng độc với liều điều trị và khi dùng dưới sự hướng
dẫn của thầy thuốc. Liều tối đa được khuyến nghị cho người trưởng thành là từ 3 đến 4
gam một ngày. Tuy nhiên, dùng quá liều paracetamol là nguyên nhân chính gây suy gan
cấp [2].
Paracetamol có cơng thức cấu tạo như hình 1.1:

Hình 1.1. Cơng thức cấu tạo paracetamol
Danh pháp: N-(4-hydroxyphenyl) acetamid. Tên khác: acetaminophen.
Công thức phân tử: C8H9NO2. Phân tử lượng: 151,2 g/mol.
Tính chất vật lý: Bột kết tinh trắng, khơng mùi. Hơi tan trong nước, rất khó tan
trong cloroform, ether, methylen clorid, dễ tan trong dung dịch kiềm, ethanol 96% [1].
Bảo quản: 2ºC - 8ºC, tránh ánh sáng.
Paracetamol được chuyển hóa chủ yếu ở gan (90%), gắn kết với sunfat và
glucuronid, rồi thải ra nước tiểu. Một phần (5%) được thải ra nước tiểu dưới dạng khơng
chuyển hóa, 5% cịn lại được oxy hóa thành N – acetyl – p – benzoquinone imine
(NAPQI) qua cytochrome P450 ở gan. NAPQI là chất độc cho tế bào gan. Với liều
paracetamol thích hợp sẽ chỉ tạo ra lượng nhỏ NAPQI, lượng này nhanh chóng kết hợp
với glutathion của gan, tạo thành các chất không độc thải ra nước tiểu. Tuy nhiên khi sử
dụng paracetamol liều cao, con đường gắn kết với sulfat và glucuronid bị bão hòa, lượng

paracetamol bị chuyển thành NAPQI tăng lên. Đến khi lượng dự trữ glutathion ở gan
giảm xuống khoảng 70%, NAPQI bắt đầu phản ứng với cấu trúc tế bào gan và gây tổn
thương tế bào gan [2]. Hình 1.2 miêu tả q trình chuyển hóa paracetamol ở gan.
2


Hình 1.2. Chuyển hóa paracetamol ở gan
Để giảm độc tính của paracetamol trên gan, người ta hay sử dụng acetylcystein và
methionin. Trong đó, methionin làm tăng cường tổng hợp glutathion, giúp chuyển hóa
NAPQI thành chất khơng độc, được sử dụng để điều trị ngộ độc paracetamol, phòng ngừa
tổn thương gan [2]. Methionin cịn là một acid amin thiết yếu có trong thành phần của chế
độ ăn và trong công thức của các chế phẩm acid amin để nuôi dưỡng. Methionin được
dùng theo đường uống để làm giảm pH nước tiểu [2].
Methionin (MET) có cơng thức cấu tạo như sau:

Hình 1.3. Công thức cấu tạo methionin
Danh pháp: acid 2 – amino – 4 – (methylthio) butanoic.
Công thức phân tử: C5H11NO2S. Phân tử lượng 149,2 g/mol.
Tính chất vật lý: Bột kết tinh trắng hay vẩy trắng. Hơi tan trong nước, rất khó tan
trong ethanol 96%. Tan trong các dung dịch acid và hydroxyd kiềm lỗng [1].
Tính chất hóa học: pK1 = 2,28 và pK2 = 9,21; pI = 5,75 [3].
Bảo quản: Tránh ánh sáng.
3


Trên thị trường có các chế phẩm chứa paracetamol và methionin nhằm mục đích
giảm độc tính của paracetamol trên gan, có thể hạn chế việc quá liều paracetamol, gọi
chung là co – methiamol như Paradote. Ở Việt Nam cũng có chế phẩm viên nang mềm
Pasafe với hàm lượng paracetamol 500 mg (hoặc 325 mg) và methionin 100 mg (hoặc 65
mg).

Hình 1.4. Chế phẩm viên nang mềm Pasafe
1.1.2. Một số phương pháp phân tích acid amin và paracetamol
Methionin là một acid amin, có nhóm acid và base do đó có thể sử dụng phép
chuẩn độ môi trường khan để định lượng như trong chuyên luận nguyên liệu methionin
trong Dược điển Việt Nam V [1]. Ngồi ra methionin chứa S (hóa trị + 2), có thể tham gia
phản ứng oxy hóa khử. Phương pháp chuẩn độ oxy hóa khử bằng iod được sử dụng để
định lượng methionin trong chế phẩm viên nén [1]. Tuy nhiên muốn định lượng
methionin trong hỗn hợp thì các kỹ thuật sắc ký hay được sử dụng. Methionin nói riêng
và acid amin nói chung có thể được phân tách và định lượng bằng nhiều kỹ thuật bao gồm
sắc ký giấy, sắc ký lớp mỏng, sắc ký trao đổi ion áp suất thấp, sắc ký lỏng pha đảo, sắc ký
khí, điện di mao quản, điện di mao quản khối phổ,... [18]. Một trong các kỹ thuật sắc ký
được sử dụng phổ biến nhất hiện nay để phân tích acid amin là sắc ký trao đổi ion sử dụng
dẫn xuất sau cột. Ninhydrin và o-phthaldialdehyd (OPA) là hai thuốc thử tạo dẫn xuất
được sử dụng phổ biến nhất [18]. Phương pháp sắc ký phổ biến khác để tách acid amin là
sắc ký pha đảo kết hợp với dẫn xuất hóa trước cột hoặc sau cộtvới các thuốc thử hay được
sử dụng như phenylisothiocyanate (PITC); 6-aminoquinolyl-N-hydroxysuccinimidyl
carbamat (AQC); o-phthalaldehyd (OPA); 9-fluorenylmethyl cloroformat (FMOC-Cl)
[18]. Dẫn xuất hóa nhằm hai mục tiêu: (1) để làm cho acid amin kỵ nước hơn và (2) để có
thể phát hiện bằng cách sử dụng độ hấp thụ hoặc huỳnh quang [18].

4


Về phân tích paracetamol, có nhiều phương pháp định lượng paracetamol trong
chế phẩm đơn thành phần cũng như đa thành phần. Do paracetamol hấp thụ UV tốt nên
phương pháp đo quang hay được sử dụng để định lượng. Ngoài ra, để phân tích
paracetamol trong hỗn hợp cịn sử dụng sắc ký pha đảo với cột C8, C18.
Một một số phương pháp nghiên cứu phân tích acid amin và paracetamol được
trình bày trong bảng 1.1.

Bảng 1.1. Một số phương pháp phân tích acid amin và paracetamol.
STT

Tác giả

Nền mẫu

I. Varzaru và cộng sự

Ngô

Đối tƣợng

[9]

Kỹ thuật

Methionin,

RPLC

Cystein, Lysin

Dẫn xuất trước cột bằng
OPA, FMOC
Pha

1

động:

phosphate,

đệm

acetonitril,

nước, methanol.
Pha tĩnh: cột Hypersil
BDS C18.
D. Fekkes và cộng sự
[7]

Dịch sinh

Trên

học

amin

40

2

acid RPLC
Dẫn xuất trước cột bằng
o-phthaldialdehyd
Pha tĩnh: cột Spherisorb
ODS

Dược điển Việt Nam V Chế phẩm Methionin
viên nén
[1]

Chuẩn độ
Thực hiện phản ứng
methionin

3

với

iod,

chuẩn độ iod dư bằng
natri thiosulfat, chỉ thị
hồ tinh bột.

4

Dược điển Việt Nam V
[1]

Nguyên
liệu

Methionin

Chuẩn độ đo thế trong

môi trường khan
Dung môi: Acid formic,

5


acid acetic khan
Dung dịch chuẩn: Acid
percloric 0,1 N.

5

Dược điển Việt Nam V Chế phẩm Paracetamol

HPLC

[1]

Cột: C18

thuốc tiêm

Pha

truyền

động:

nước

và

methanol
Dược điển Việt Nam V Chế phẩm Paracetamol
6

[1]

Đo quang

viên nang
cứng

Palled

Mahesh Chế phẩm Paracetamol,

Karagane Swapnalee và
7

viên nén

cộng sự [13]

HPLC

cafein,

Cột C8

phenylephrine

Pha động: đệm natri

hydroclorid,

heptan

dextromethophan acetonitril
hydrobromid

sulfonat

và

chế

độ

gradient

Hiện nay, chưa có cơng bố nào phân tích paracetamol và methionin trên cùng một
phương pháp. Các phương pháp phân tích acid amin nói chung và methionin nói riêng đa
phần là tạo dẫn xuất [7], [9], [12] cịn phân tích paracetamol thì sử dụng các phương pháp
khá thông dụng như đo quang, sắc ký pha đảo,… Khi phân tích acid amin cùng với các
chất có độ phân cực trung bình hoặc yếu như paracetamol thông thường phải sử dụng hai
phương pháp khác nhau, một phương pháp RPLC trực tiếp cho chất có độ phân cực trung
bình hoặc yếu và một phương pháp RPLC kết hợp dẫn xuất hóa cho các acid amin. Sắc ký
lỏng tương tác thân nước là kỹ thuật sắc ký có lưu giữ tốt với các chất phân cực như acid
amin, đồng thời cũng có khả năng lưu giữ các chất có độ phân cực trung bình như

paracetamol. Trong cơng thức của methionin có lưu huỳnh nên có khả năng hấp thụ
quang nên tôi tiến hành nghiên cứu bằng HILIC trên detector UV để xây dựng phương
pháp tách và định lượng methionin và paracetamol trong chế phẩm.

6


1.2. Tổng quan về sắc ký lỏng tƣơng tác thân nƣớc
Sắc ký lỏng tương tác thân nước (hydrophilic interaction liquid chromatography –
HILIC) là một biến thể của sắc ký lỏng thơng thường, có hiệu quả trong việc tách các chất
phân cực và không tĩnh điện, như các acid amin [16], kháng sinh nhóm amino glycosid
[14], peptid [10],… HILIC sử dụng pha động phân cực (như sắc ký pha đảo RP - LC) và
pha tĩnh phân cực (như sắc ký pha thuận NP - LC). So với NP - LC, HILIC sử dụng dung
mơi phân cực ít độc hại hơn. Cịn so với RP - LC, HILIC lưu giữ các chất phân cực tốt
hơn. HILIC khắc phục được các nhược điểm của các kỹ thuật sắc ký trước đó nên hiện
nay đang được ứng dụng rộng rãi hơn.
1.2.1. Pha tĩnh
Giống như NP – LC, HILIC sử dụng các pha tĩnh phân cực, khi tiếp xúc với pha
động phân cực sẽ duy trì một lớp chất lỏng thân nước bao trên bề mặt pha tĩnh, lưu giữ
các chất phân tích. Khi tăng nhóm chức phân cực trên pha tĩnh, lớp chất lỏng thân nước
trên bề mặt pha tĩnh tăng lên, làm tăng thời gian lưu giữ chất phân cực.
Pha tĩnh trong HILIC phổ biến nhất là silica và các dẫn xuất của nó như amino, diol
hay cyano,… Ngồi ra, các pha tĩnh polymer cũng có thể được sử dụng trong HILIC [6].
Tuy nhiên, có thể do giá thành đắt và độ phân giải thấp hơn so với các cột silica nên số
lượng cột polyme trên thị trường khơng nhiều cũng như ít nghiên cứu về HILIC trên cột
polyme.
Dựa vào cấu tạo hóa học, pha tĩnh silica lại được chia làm hai loại là: silica khơng
dẫn xuất và silica dẫn xuất hóa.
-

Silica khơng dẫn xuất:

Chất phân tích được lưu giữ lại mạnh mẽ bởi liên kết hydro và tương tác trao đổi với
nhóm silanol (-SiOH). Trong đó nhóm –SiOH đóng vai trị thiết yếu tạo nên bề mặt phân
cực của silica.
Ưu điểm của pha tĩnh silica không dẫn xuất là không bị pha động pH thấp thủy
phân, cắt các liên kết, rửa trôi như các pha tĩnh pha liên kết. Về độ nhạy, cột silica cải
thiện độ nhạy từ 2 đến 10 lần so với các cột pha đảo khi tách các hợp chất phân cực[8].
Tuy nhiên, nhược điểm của pha tĩnh này là có thể xảy ra sự quá tải cột. Pha tĩnh silica

7


khơng dẫn xuất cịn khơng ổn định về mặt hóa học ở pH lớn hơn 8 do có sự hịa tan của
silica.
-

Silica dẫn xuất hóa:

Các pha tĩnh dẫn xuất hóa thu được thơng qua việc biến đổi hóa học bề mặt silica và
được chia thành các nhóm theo trạng thái tích điện của chúng, bao gồm: trung tính (amid,
diol, cyanopropyl, cyclodextrin,…), lưỡng cực (sulfoalkyl betain,…), tích điện dương
(amino silica,…), tích điện âm (poly aspartic, poly sulfoethyl A, poly succinimid
silica…).
 Amino silica: Cột amino silica có chứa các aminopropyl liên kết với silica. Các
chất phân tích được lưu giữ bởi liên kết hydro và tương tác trao đổi ion với các nhóm SiOH. Các hợp chất có tính acid có ái lực mạnh hơn với các cột amino silica, đôi khi dẫn
đến sự hấp phụ không thuận nghịch. Mặt khác, cột amino silica cịn kém ổn định khi dung
mơi rửa giải là nước, dẫn đến lưu giữ chất kém và hình dáng píc xấu đi [8].
 Cyanopropyl silica: Ít tìm thấy các ứng dụng của nó trong HILIC. Mặc dù được
xem là pha phân cực nhưng do khơng có liên kết hydro nên sự lưu giữ chất phân tích trên

cột này rất kém. Và pha tĩnh nãy cũng kém ổn định cơ học khi hoạt động trong điều kiện
dung môi phân cực và rất phân cực.
 Poly succinimid silica: Một số pha tĩnh silica liên kết phân cực được tạo thành dựa
trên phản ứng cộng hóa trị của poly succinimid với aminopropyl silica. Phản ứng tạo ra
một lớp bề mặt polyamide/imid liên kết ở nhiều vị trí. Nhiều pha tĩnh poly succinimid đã
được ứng dụng trong phân tách HILIC nhưng ngày càng ít được sử dụng do hiệu quả tách
thấp hơn nhiều so với các pha tĩnh HILIC gần đây [8].
1.2.2. Pha động
HILIC thường sử dụng pha động là lượng lớn dung môi hữu cơ đồng tan với nước,
kết hợp với một dung môi thân nước [4]. Dung môi hữu cơ thường được sử dụng nhất cho
pha động là acetonitril (ACN). Ngồi ra cịn sử dụng các dung mơi hữu cơ khác như
tetrahydrofuran, dioxin, các rượu nồng độ cao [5]. Lượng dung môi hữu cơ chiếm tỷ lệ từ
60% – 98% lượng pha động. Dung mơi thân nước có thể là nước, muối, hoặc đệm,…, cần
phải duy trì tỷ lệ thấp nhất là 2 - 3% để hydrat hóa hồn tồn các hạt pha tĩnh [17]. Khi
đó, chất phân tích sẽ phân bố vào cả hai pha.
8


Các dung môi được sắp xếp theo chiều lực rửa giải chất phân tích tăng dần như sau:
aceton < isopropanol ~ propanol < acetonitril < ethanol < dioxin < dimethyl formamid ~
methanol < nước [6]. Theo đó, các chất kém phân cực sẽ được rửa giải nhanh hơn các
chất phân cực, khi giảm độ phân cực của pha động sẽ làm tăng thời gian lưu của chất
phân tích.
pH của pha động ảnh hưởng rất lớn đến quá trình tách và thời gian lưu do thay đổi
sự phân cực của chất phân tích và pha động, cũng như trạng thái tồn tại của bề mặt pha
tĩnh, dẫn đến những thay đổi khác biệt trong việc lưu giữ, do vậy làm thay đổi thời gian
lưu của chất phân tích. Dung mơi thân nước hay được sử dụng là các đệm nhằm ổn định
pH pha động. Loại đệm được dùng phổ biến là amoni acetat, amoni format, phosphat (ứng
với vùng acid), đệm triethylamin, amoni (ứng với vùng base)… với nồng độ thường sử
dụng là 2 – 20 mM (nồng độ 20 mM chỉ sử dụng trong trường hợp tỷ lệ dung môi hữa cơ

trong pha động nhỏ hơn 90%) [19]. Đối với các chất phân tích có nhiều dạng ion hóa, pH
thường được điều chỉnh để đảm bảo rằng các chất phân tích chỉ tồn tại một dạng ion duy
nhất và cũng được dùng để điều chỉnh trạng thái tồn tại của chất phân tích và kiểm sốt
thời gian lưu [6]. Đối với các chất phân tích trung tính hoặc trạng thái tồn tại không thay
đổi trong khoảng pH 2 - 8, không cần sử dụng đệm trong pha động. Ngoài ra nồng độ chất
tan trong pha động cũng ảnh hưởng đến việc lưu giữ. Thông thường, nồng độ tăng làm
giảm thời gian lưu.
HILIC có thể được thực hiện ở chế độ đẳng dịng với nồng độ dung mơi hữu cơ cao;
hoặc chế độ gradient với tỷ lệ cao dung môi hữu cơ cao khi bắt đầu và kết thúc với tỷ lệ
thấp dung mơi hữu cơ.
1.2.3. Cơ chế tách
Về cơ bản có ba cách để mô phỏng về cơ chế tách của HILIC. Cách thứ nhất là sự
phân bố chất phân tích giữa pha động và pha tĩnh; thứ hai là sự hấp phụ của chất phân tích
lên bề mặt của pha tĩnh, thứ ba là pha động hấp phụ lên bề mặt pha tĩnh, sau đó các chất
phân tích phân bố lên lớp hấp phụ này [6]. Hiện nay, mô phỏng thứ ba được thừa nhận
rộng rãi. Hình 1.4 minh họa cơ chế tách này:

9


Hình 1.5. Cơ chế tách trong HILIC
Theo cơ chế này, khi pha động di chuyển qua pha tĩnh phân cực, một phần pha động
tương tác với pha tĩnh, tạo thành một phần của pha tĩnh, đó là một lớp chất lỏng chứa
nước bao trên bề mặt pha tĩnh. Chất phân tích khi qua cột sắc ký sẽ được phân bố giữa
pha động và lớp chất lỏng thân nước bao xung quanh pha tĩnh này. Như vậy, chất phân
tích càng phân cực sẽ được lưu giữ càng lâu trong lớp nước trên bề mặt pha tĩnh. Nói cách
khác, q trình phân tách dựa trên độ phân cực của hợp chất và lớp solvate hóa trên bề
mặt pha tĩnh. Trong trường hợp pha tĩnh có mang điện tích, chất phân tích có thể thêm các
tương tác tĩnh điện với pha tĩnh.
1.2.4 Ưu điểm

Tương tự các kỹ thuật sắc ký khác, HILIC cho phép phân tích đồng thời nhiều hợp
chất, hiệu quả khi phân tích các mẫu có thành phần phức tạp hay hỗn hợp nhiều chất.
Kỹ thuật HILIC tiến hành thuận lợi, thu được kết quả tương đối nhanh, có độ chính
xác và độ nhạy tốt.
HILIC sử dụng pha động có nồng độ dung mơi hữu cơ cao giúp pha động có độ nhớt
thấp, do đó tiến hành được ở áp suất thấp hơn và cho phép cột có khả năng làm việc ở tốc
độ dòng cao , giảm thời gian phân tích. Pha động giàu dung mơi hữu cơ cũng làm tăng tốc
độ khuếch tán chất tan trong pha động, tăng khối lượng chất tan được vận chuyển.
HILIC cịn có nhiều ưu điểm so với kỹ thuật RPLC hay NPLC. Trong phân tích các
hợp chất rất phân cực, HILIC có khả năng lưu giữ tốt các chất này, khắc phục được nhược
điểm của RP – LC. Còn đối với NP – LC, tuy có thể lưu giữ các chất phân cực với thời
gian phù hợp nhưng lại sử dụng các dung môi pha động đắt tiền, độc hại và không thân

10


thiện với mơi trường, hịa tan kém các chất phân cực. Vì vậy, HILIC là lựa chọn tối ưu
hơn trong trường hợp này.
Đối với các chất phân cực hấp thụ UV kém, HILIC có thể giúp đơn giản hóa q
trình chuẩn bị mẫu (không tạo dẫn xuất) sơ với RPLC nhờ khả năng định tính các chất tại
bước sóng thấp.
HILIC có khả năng áp dụng sắc ký lỏng khối phổ LC-MS [8] nhờ pha động có chứa
lượng lớn dung mơi hữu cơ đồng tan với nước, thích hợp với LC-MS. Trong khi RPLC có
chưa tỷ lệ nước cao trong pha động nên khơng phù hợp với bề mặt LC-MS, cịn NPLC có
pha động khơng những độc hại mà cịn rất khó hịa tan các hợp chất phân cực, giảm tỷ lệ
ion hóa của chất phân tích, có thể gây nhiễu nền hoặc tín hiệu kém [9] khi phân tích bằng
LC-MS.
1.2.5 Nhược điểm
Bên cạnh những ưu điểm kể trên, kỹ thuật HILIC cịn có các nhược điểm như: thời
gian đtạ cân bằng lâu hơn RPLC; pha tĩnh silica kém lưu giữ các anion; tương tác phức

tạp, nhiều lớp, khó kiểm sốt hơn RPLC và NPLC; phụ thuộc quá nhiều vào dung mơi
acetonitril, khó tìm dung mơi thay thế.

11


CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tƣợng nghiên cứu
Đối tượng nghiên cứu là viên nang mềm Pasafe. Công thức của mỗi viên Pasafe
như sau:
+Paracetamol: 500 mg
+Methionin: 100 mg
+Tá dược: PEG 400, gelatin, glycerin, dung dịch sorbitol 70%, methyl
paraben, propyl paraben, ethyl vanillin, titan dioxyd, tartrazin yellow, brilliant blue,
allura red AC, nước tinh khiết.
2.2. Nguyên vật liệu
2.2.1. Hóa chất

- Chuẩn đối chiếu methionin: Sigma (Độ tinh khiết 98%, số lô M9625)
- Chuẩn đối chiếu paracetamol: Viện kiểm nghiệm thuốc Trung ương (Độ tinh khiết
100,04%, số lô 0415019.04)

- Viên nang mềm Pasafe: Nhà sản xuất Công ty liên doanh dược phẩm Mebiphar Austrapharm; số lô sản xuất: 0080818; số đăng ký: VD-8283-09; hạn dùng:
08/8/2020.

- Tá dược: PEG 400, gelatin, glycerin, dung dịch sorbitol 70%, methyl paraben,
propyl paraben, ethyl vanillin.

- Acetonitril dùng cho sắc ký lỏng hiệu năng cao (Merck – Đức).
- Acid formic, acid acetic, amoni acetat, natri hydroxyd, diethylamin (Merck – Đức).

- Nước cất hai lần.
2.2.2. Thiết bị, dụng cụ

- Hệ thống máy HPLC Agilent 1200 series và phần mềm Chemstation.
- Cột sắc ký: Cột Supelco Ascentis Silica (250 x 4,6 mm, 5µm) (Sigma Aldrich); cột
Hypersil Silica (200 x 4,6 mm, 5 µm) (Agilent); cột Zorbax CN (150 x 4,6 mm,
5µm) (Agilent); cột Zorbax Rx Silica (150 x 4,6 mm, 5µm) (Agilent); cột Apollo
Silica Alltech (150 x 4,6 nm, 5µm) (Hichrom).

- Máy siêu âm Ultrasonic LC 60H (Hà Lan).
12


- Máy lắc xoáy Labinco L46 (Đài Loan).
- Máy ly tâm Kubota 6500.
- Phễu lọc Bunchner, màng lọc cellulose 0,45 µm.
- Màng lọc mẫu cellulose 0,45 µm.
- Cân phân tích Sartorius TE214S (Đức).
- Micropipet 10 – 100 µL ABMATE pro, 100 -1000 µL Nichipet EX.
- Ống ly tâm 2 mL.
- Pipet chính xác 0,5 mL; 1 mL; 1,5 mL; 2 mL.
- Bình định mức 5 mL; 10 mL; 20 mL; 25 mL; 50 mL.
- Các dụng cụ khác: pipet Pasteur, cốc có mỏ, ống đong, vial.
2.3. Nội dung nghiên cứu

- Khảo sát điều kiện sắc ký phân tích paracetamol và methionin trong chế phẩm viên
nang mềm bằng sắc ký lỏng tương tác thân nước (HILIC).

- Thẩm định phương pháp trên các tiêu chí: độ phù hợp hệ thống, độ chọn lọc,
đường chuẩn và khoảng tuyến tính, độ chính xác, độ đúng, độ ổn định hệ thống theo

hướng dẫn của ICH Q2B và mơ hình Plackett Burman - linear.

- Ứng dụng phương pháp trên xác định hàm lượng paracetamol và methionin trong
chế phẩm viên nang mềm Pasafe trên thị trường.
2.4. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.4.1. Khảo sát bước sóng phát hiện
Tiến hành quét phổ trên píc sắc ký của hai chất chuẩn trong khoảng bước sóng từ
210 đến 400 nm. Lựa chọn bước sóng thích hợp của mỗi chất.
2.4.2. Khảo sát pha tĩnh
Tiến hành khảo sát các cột sau:
+ Cột Zorbax CN kích thước 150 x 4,6 mm, 5µm (Agilent).
+ Cột Supelco Ascentis Silica kích thước 250 x 4,6 mm, 5 µm (Sigma Aldrich).
+ Cột Hypersil Silica kích thước 200 x 4,6 mm, 5 µm (Agilent).
+ Cột Zorbax Rx Silica kích thước 150 x 4,6 mm, 5µm (Agilent).

13


Đánh giá kết quả dựa trên độ chọn lọc, độ phân giải, độ cân xứng píc sắc ký và
thời gian phân tích để lựa chọn cột sắc ký phù hợp.
2.4.3. Khảo sát pha động
Tiến hành khảo sát thành phần, tỷ lệ (v/v), nồng độ, và tốc độ dòng (f) của pha
động như bảng 2.1. Dựa vào khả năng tách các chất, mức độ ổn định của đường nền, hình
dáng píc và thời gian lưu của chất phân tích để lựa chọn pha động.
Bảng 2.1. Các điều kiện pha động khảo sát
Pha tĩnh

Pha động

Tỷ lệ

f (mL/phút)

ACN : CH3COONH4 15 mM

60:40

0,8

ACN : CH3COOH 15 mM

60:40

0,8

ACN : HCOOH 10 mM

60:40

0,8

ACN : (HCOOH 10 mM + DEA 5 mM)

60:40

0,6

ACN : (HCOOH 10 mM + DEA 7,5 mM)

60:40

0,6

ACN : (HCOOH 10 mM + DEA 10 mM)

60:40

0,6

60:40

0,6

55:45

0,6

50:50

0,6

ACN : (HCOOH 2 mM + DEA 1,25 mM)

60:40

0,6

ACN : (HCOOH 10 mM + TEA 0,5 mM)

60:40

0,6

Cột Supelco ACN : CH3COONH4 15 mM
Ascentis Silica ACN : CH3COOH 15 mM

70:30

0,8

75:25

0,8

Hypersil ACN : CH3COONH4 15 mM

75:25

0,8

ACN : CH3COOH 15 mM

70:30

0,8

ACN : CH3COONH4 15 mM

70:30

0,8

ACN : CH3COOH 15 mM

75:25

0,8

60:40

0,6

60:40

0,6

60:40

0,5

60:40

0,6

60:40

0,7

Cột
CN

Zorbax

ACN : (HCOOH 2 mM + DEA 1 mM)

Cột
Silica

ACN : HCOOH 10 mM
Cột Zorbax Rx
ACN : (HCOOH 10 mM + DEA 10 mM)
Silica
ACN : (HCOOH 10mM + DEA 5 mM)

(Ghi chú: ACN: acetonitril, DEA: diethylamin, TEA: triethanolamin)

14


2.4.4. Khảo sát nồng độ định lượng của paracetamol và methionin
Khảo sát hỗn hợp chuẩn hỗn hợp paracetamol và methionin ở 2 ngưỡng nồng độ
cùng tỷ lệ PAR : MET = 5:1 (như tỷ lệ trong công thức chế phẩm) là PAR là 200 ppm –
MET 40 ppm và PAR 100 ppm - MET 20 ppm.
Đánh giá kết quả dựa trên diện tích píc và sự đáp ứng tuyến tính giữa diện tích píc
và nồng độ.
2.4.5. Thẩm định quy trình
Sau khi lựa chọn được điều kiện sắc ký, tiến hành thẩm định phương pháp định
lượng methionin và paracetamol bằng HILIC theo hướng dẫn của ICH Q2B trên các tiêu
chí sau: Độ ổn định hệ thống, độ chọn lọc, đường chuẩn và khoảng tuyến tính, độ chính
xác của phương pháp, độ đúng, độ ổn định của phương pháp.

a. Độ ổn định hệ thống (system suitability)
Tính thích hợp hệ thống là phép thử nhằm đánh giá độ ổn định của toàn hệ thống
phân tích bởi các yếu tố như máy móc, thiết bị.
Tiến hành tiêm lặp lại 6 lần dung dịch chuẩn hỗn hợp chứa paracetamol và
methionin (chuẩn bị ở phần sau). Ghi lại các giá trị thời gian lưu, diện tích píc. Tính
tương thích hệ thống được biểu thị qua độ lệch chuẩn tương đối RSD của các đáp ứng
phân tích. Yêu cầu các giá trị thời gian lưu có RSD%

2,0%, diện tích píc có RSD%

2%.
b. Độ chọn lọc (selectivity)
- Tính chọn lọc của phương pháp: Là khả năng đánh giá một cách rõ ràng chất cần
phân tích khi có mặt các thành phần khác như tạp chất hoặc các chất cản trở khác. Trong
sắc ký lỏng hiệu năng cao, tính chọn lọc thể hiện trên sắc ký đồ thu được từ mẫu chuẩn,
mẫu thử và mẫu trắng, píc của chất cần phân tích tách hồn tồn với các píc tạp. Trên sắc
ký đồ mẫu trắng phải khơng xuất hiện píc có thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu
của mẫu chuẩn.
- Tiến hành chạy sắc ký dung dịch chuẩn hỗn hợp paracetamol và methionin, dung
dịch thử và nền mẫu tự tạo, dung môi pha mẫu từ các thành phần của chế phẩm với
chương trình đã lựa chọn. Ghi lại các thơng số thời gian lưu và diện tích píc.

15


- Thời gian lưu píc paracetamol và methion của dung dịch chuẩn hỗn hợp, dung
dịch thử phải tương đương nhau. Píc trong mẫu thử phải tách hồn tồn với các píc khác
trong nền mẫu. Nền mẫu tự tạo và dung mơi pha mẫu khơng xuất hiện píc ở trong khoảng
thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu của píc paracetamol và methionin trên sắc ký đồ
của các dung dịch chuẩn. Nếu có, đáp ứng của píc tạp phải

1,0% so với đáp ứng píc của

mẫu chuẩn. Hệ số tinh khiết píc methionin và paracetamol trong sắc ký đồ dung dịch
chuẩn và dung dịch thử xấp xỉ 1,0. Hệ số chồng phổ UV của píc methionin và
paracetamol thu được trong sắc ký đồ dung dịch thử và phổ UV của píc tương ứng trong
sắc ký đồ dung dịch chuẩn xấp xỉ 1,0.
c. Đường chuẩn và khoảng tuyến tính (linearity)
- Khoảng tuyến tính của một phương pháp phân tích: là khoảng nồng độ ở đó có sự
phụ thuộc tuyến tính giữa tín hiệu đo được và nồng độ chất phân tích.
- Đường chuẩn: là đường biểu diễn sự phụ thuộc tuyến tính giữa đại lượng đo được
và nồng độ các chất phân tích.
Tiến hành sắc ký dung dịch chuẩn hỗn hợp, có nồng độ paracetamol và methionin
lần lượt bằng 50%, 75%, 100%, 125%, và 150% nồng độ định lượng và khảo sát sự phụ
thuộc của tín hiệu đo được và nồng độ. Vẽ đồ thị phụ thuộc giữa tín hiệu và nồng độ.
Đánh giá đường chuẩn dựa vào giá trị và độ chệch các điểm nồng độ dùng xây
dựng đường chuẩn (Δ).
Yêu cầu: r ≥ 0,995.
Hệ số chắn tại nồng độ 100%: Y% =
-2,0%

Y%

2,0%

d. Độ chính xác của phương pháp (precision)
Độ chính xác thể hiện mức độ phân tán kết quả giữa một loạt phép đo từ nhiều lần
tiến hành phân tích trên cùng một mẫu thử đồng nhất dưới những điều kiện xác định.
+ Độ lặp lại của phương pháp (repeatability): Độ lặp lại diễn tả độ chính xác của
một quy trình phân tích trong cùng điều kiện thí nghiệm trong khoảng thời gian ngắn.

Tiến hành thí nghiệm 6 lần với cùng một nồng độ mẫu thử, xác định độ lệch tương đối
RSD (%) của hàm lượng.

16


+ Độ chính xác trung gian (intermediate precision): Bố trí thí nghiệm tương tự
phần độ lặp lại của phương pháp nhưng tiến hành vào thời gian khác, đổi kiểm nghiệm
viên và phân tích trên hệ sắc ký lỏng khác.
Tiến hành:
- Tiến hành định lượng 6 lần riêng biệt trên một mẫu thử và tính tốn độ lệch
chuẩn tương đối.
⃐
√
Trong đó:

∑
̅

xi: Nồng độ tính được của lần thử nghiệm thứ i.
̅ : Nồng độ trung bình tính được của N lần thử nghiệm.
N: Số lần thử nghiệm.

Yêu cầu:
+Độ lặp lại: Chênh lệch kết quả giữa 6 lần thử, biểu thị bằng độ lệch chuẩn tương
đối RSD (%) của hàm lượng paracetamol và methionin khơng q 2%.
+ Độ chính xác trung gian: Chênh lệch kết quả giữa 6 lần thử trong cùng một ngày
và 12 lần thử trong hai ngày khác nhau, biểu thị bằng độ lệch chuẩn tương đối RSD (%)
của hàm lượng paracetamol và methionin không quá 2%.
e. Độ đúng (accuracy)

Độ đúng của phương pháp: là khái niệm chỉ mức độ gần nhau giữa các giá trị
trung bình của kết quả thử nghiệm và giá trị thực hoặc giá trị được chấp nhận là đúng.
Độ thu hồi (đánh giá độ đúng): là tỷ lệ phần trăm giữa giá trị thu được so với giá trị
lý thuyết.
Thêm vào mẫu thử đã được xác định hàm lượng hoạt chất một lượng chính xác chất
chuẩn ở 03 mức 75%, 100% và 125% so với hàm lượng paracetamol và methionin có
trong mẫu khảo sát. Độ thu hồi được tính theo cơng thức

R: độ thu hồi (%).
17