BẠCH THÚY ANH xây DỰNG và THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP xác ĐỊNH ĐỒNG THỜI HYPOGLYCIN a và (METHYLENCYCLOPROPYL)GLYCIN TRONG QUẢ vải tại CAO BẰNG BẰNG sắc ký LỎNG KHỐI PHỔ HAI lần LUẬN văn THẠC sĩ dược học

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

BẠCH THÚY ANH

XÂY DỰNG VÀ THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP
XÁC ĐỊNH ĐỒNG THỜI HYPOGLYCIN A VÀ
(METHYLENCYCLOPROPYL)GLYCIN
TRONG QUẢ VẢI TẠI CAO BẰNG BẰNG

SẮC KÝ LỎNG KHỐI PHỔ HAI LẦN
LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

HÀ NỘI 2019


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

BẠCH THÚY ANH

XÂY DỰNG VÀ THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP
XÁC ĐỊNH ĐỒNG THỜI HYPOGLYCIN A VÀ
(METHYLENCYCLOPROPYL)GLYCIN
TRONG QUẢ VẢI TẠI CAO BẰNG BẰNG

SẮC KÝ LỎNG KHỐI PHỔ HAI LẦN

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC
CHUYÊN NGÀNH: KIỂM NGHIỆM THUỐC – ĐỘC CHẤT
MÃ SỐ: 8720210

Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS. Lê Thị Hồng Hảo
PGS.TS. Phạm Thị Thanh Hà

HÀ NỘI 2019


LỜI CẢM ƠN
Trong thời gian thực hiện luận văn này, tôi đã rất may mắn khi nhận
được sự giúp đỡ tận tình của các thầy cô giáo, các chuyên gia, các nghiên cứu
viên, các anh chị kỹ thuật viên cùng tình cảm và sự khích lệ mà gia đình và
bạn bè đã dành cho tôi.
Tôi xin được bày tỏ sự kính trọng và lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS.
Lê Thị Hồng Hảo, PGS.TS. Phạm Thị Thanh Hà đã luôn tâm huyết và tận
tình hướng dẫn, chỉ bảo tôi trong suốt thời gian thực hiện và hoàn thành luận
văn.
Tôi xin được gửi lời cảm ơn sâu sắc và chân thành tới TS. Trần Cao
Sơn đã cho tôi những lời khuyên quý báu, dành nhiều thời gian và tạo điều
kiện tối đa giúp đỡ tôi hoàn thành luận văn này.
Tôi xin chân thành cảm ơn các anh chị khoa Độc học & dị nguyên –
Viện kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia đã tạo điều kiện và
nhiệt tình giúp đỡ tôi trong thời gian thực hiện luận văn.
Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới Ban Giám Hiệu, phòng Sau đại
học, bộ môn Hóa phân tích và độc chất – trường Đại học Dược Hà Nội, cùng

các thầy cô đã giảng dạy và giúp đỡ tôi trong quá trình học tập tại trường.
Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn đến gia đình và bạn bè – những người
đồng hành không thể thiếu trong học tập và cuộc sống đã luôn động viên và
khích lệ tôi những ngày qua.
Tôi xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, ngày…tháng 03 năm 2019
Học viên
Bạch Thúy Anh


MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC BẢNG BIỂU
DANH MỤC HÌNH
ĐẶT VẤN ĐỀ .................................................................................................. 1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN ........................................................................... 2
1.1. Tổng quan về cây vải ................................................................................. 2
1.1.1. Đặc điểm thực vật .................................................................................. 2
1.1.2. Phân bố, sinh thái và bộ phận dùng ........................................................ 2
1.1.3. Thành phần hóa học ................................................................................ 3
1.2. Tổng quan về Hypoglycin A và (Methylencyclopropyl)glycin ................. 4
1.2.1 Nguồn gốc của HGA và MCPG từ thực phẩm ........................................ 4
1.2.2. Độc tính của HGA và MCPG ................................................................. 4
1.2.3. Quy định hiện hành về HGA và MCPG ................................................. 6
1.2.4. Cấu tạo và tính chất của Hypoglycin A và (Methylencyclopropyl)glycin
........................................................................................................................... 7
1.3. Phương pháp xác định HGA và MCPG ..................................................... 8
1.3.1. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao ................................................. 9
1.3.2. Phương pháp sắc ký khí khối phổ ......................................................... 10

1.4. Tổng quan về phương pháp sắc ký lỏng khối phổ hai lần ...........................
(LC – MS/MS) ................................................................................................ 15
1.4.1. Nguyên lý hoạt động ............................................................................. 15
1.4.2. Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao ..................................................... 16
1.4.3. Khối phổ (Mass Spectrometry) ............................................................. 18
CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ......... 19
2.1. Đối tượng nghiên cứu............................................................................... 19


2.2. Phương tiện nghiên cứu ........................................................................... 19
2.2.1. Thiết bị, dụng cụ .................................................................................. 19
2.2.2. Dung môi, hóa chất ............................................................................... 20
2.2.3. Chất chuẩn ............................................................................................. 20
2.2.4. Chuẩn bị dung dịch chuẩn ..................................................................... 20
2.3. Nội dung nghiên cứu ................................................................................ 22
2.3.1. Khảo sát các điều kiện xác định bằng LC-MS/MS ............................... 22
2.3.2. Khảo sát các điều kiện xử lý mẫu ......................................................... 22
2.3.3. Khảo sát ảnh hưởng nền ........................................................................ 23
2.3.4. Xác nhận giá trị sử dụng ....................................................................... 23
2.3.5. Đánh giá hàm lượng HGA và MCPG trong mẫu thực tế...................... 23
2.4. Phương pháp nghiên cứu.......................................................................... 23
2.4.1. Phương pháp lấy mẫu ............................................................................ 23
2.4.2. Phương pháp xử lý mẫu ........................................................................ 24
2.4.3. Phương pháp sắc ký lỏng khối phổ hai lần (LC-MS/MS) .................... 25
2.4.4. Phương pháp thẩm định ........................................................................ 25
2.4.5. Phương pháp xử lý số liệu..................................................................... 27
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU .................................................... 28
3.1. Nghiên cứu phương pháp xác định đồng thời HGA và MCPG trong quả
vải .................................................................................................................... 28
3.1.1.Khảo sát điều kiện LC-MS/MS.............................................................. 28

3.1.2. Khảo sát quy trình xử lý mẫu ................................................................ 33
3.1.3. Khảo sát ảnh hưởng nền ........................................................................ 40
3.2. Thẩm định phương pháp .......................................................................... 41
3.2.1. Độ đặc hiệu............................................................................................ 41
3.2.2. Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) ................... 43
3.2.3. Khoảng làm việc ................................................................................... 44
3.2.4. Độ lặp lại, độ thu hồi ............................................................................. 46


3.2.5. Độ tái lặp nội bộ .................................................................................... 48
3.3. Ứng dụng phương pháp để phân tích mẫu quả vải .................................. 48
CHƯƠNG 4. BÀN LUẬN............................................................................. 50
KẾT LUẬN .................................................................................................... 52
Kết luận ........................................................................................................... 52
Kiến nghị ......................................................................................................... 52
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC


DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

Chữ viết tắt

Nội dung

ACN

Acetonitril

EtOH

Ethanol

ESI

Ion hóa tia điện
(ElectroSpray Ionization)

GC-MS/MS

Sắc ký khí khối phổ hai lần
(Gas chromatography tandem mass spectrometry)

HGA

Hypoglycin A

MCPG

(Methylencyclopropyl)glycin

MeOH

Methanol

FDA

Cục quản lý thực phẩm và dược phẩm Hoa Kỳ
(United States Food and Drug Administration)

LC-MS/MS

Sắc ký lỏng khối phổ hai lần
(Liquid chromatography tandem mass spectrometry)

LOD

Giới hạn phát hiện
(Limit of detection)

LOQ

Giới hạn định lượng
(Limit of quantification)

PhA
SPE

Phenylalanin
Chiết pha rắn
(Solid phase extraction)


DANH MỤC BẢNG BIỂU
Bảng 1.1. Danh sách các trường hợp ngộ độc độc HGA xảy ra trên toàn cầu ..... 5
Bảng 1.2. Một số nghiên cứu về HGA và MCPG .......................................... 12
Bảng 2.1. Pha dung dịch chuẩn trung gian ..................................................... 21
Bảng 2.2. Pha dung dịch chuẩn làm việc ........................................................ 21
Bảng 3.1. Các điều kiện MS dùng để phân tích HGA và MCPG ................... 28
Bảng 3.2. Các thông số tối ưu của MS............................................................ 30

Bảng 3.3. Điều kiện gradient........................................................................... 32
Bảng 3.4. Ảnh hưởng của nền mẫu đối với HGA ........................................... 40
Bảng 3.5. Tỷ lệ ion của HGA và MCPG ........................................................ 42
Bảng 3.6. Độ lặp lại, độ thu hồi của HGA ...................................................... 46
Bảng 3.7 Độ lặp lại, độ thu hồi của MCPG ................................................... 47
Bảng 3.8. Độ tái lặp nội bộ ............................................................................. 48
Bảng 3.9. Kết quả phân tích mẫu thực tế ........................................................ 49


DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Cây vải (Litchi chinensis Sonn) .................................................... 2
Hình 1.2. Quá trình chuyển hóa của Hypoglycin A...................................... 6
Hình 1.3. Công thức cấu tạo của HGA ......................................................... 7
Hình 1.4. Công thức cấu tạo của MCPG....................................................... 7
Hình 1.5. Mô hình hệ thống LC-ESI-MS/MS............................................ 16
Hình 1.6. Sơ đồ cấu trúc của thiết bị khối phổ MS ..................................... 18
Hình 2.1. Công thức cấu tạo của Phenylalanin ........................................... 22
Hình 3.1. Phổ khối của các chất phân tích .................................................. 29
Hình 3.2. Sắc đồ Dns-HGA, Dns-MCPG và Dns-PhA sử dụng cột C18 ... 31
Hình 3.3. Sắc đồ tổng của HGA và MCPG ................................................ 32
Hình 3.4. Sắc đồ MRM của HGA và MCPG .............................................. 33
Hình 3.5. Biểu đồ kết quả khảo sát dung môi chiết .................................... 34
Hình 3.6. Biểu đồ kết quả khảo sát nồng độ dung môi ............................... 35
Hình 3.7. Biểu đồ kết quả khảo sát SPE ..................................................... 36
Hình 3.8. Sắc ký đồ khảo sát dung môi rửa tạp, rửa giải ............................ 37
Hình 3.9. Sắc đồ khảo sát thể tích dung môi rửa giải ................................. 38
Hình 3.10. Quy trình xử lý mẫu tối ưu ........................................................ 39
Hình 3.11. Đường chuẩn trên nền dung môi và nền mẫu thực ................... 40
Hình 3.12. Sắc đồ mẫu trắng, mẫu chuẩn và mẫu trắng thêm chuẩn của
HGA ............................................................................................................ 42

Hình 3.13. Sắc đồ mẫu trắng, mẫu chuẩn và mẫu trắng thêm chuẩn của
MCPG.......................................................................................................... 43
Hình 3.14. Sắc đồ mẫu trắng thêm chuẩn tại mức nồng độ 0,05 mg/kg ..... 44
Hình 3.15. Sắc ký đồ và đường chuẩn phân tích HGA ............................... 45
Hình 3.16. Sắc ký đồ và đường chuẩn phân tích MCPG ............................ 45


ĐẶT VẤN ĐỀ
Việt Nam là quốc gia nằm trong khu vực nhiệt đới gió mùa, có hệ thực
vật vô cùng phong phú và đa dạng. Do đó nước ta rất có thế mạnh về các loài
cây ăn quả, nhiều loài đặc sản nổi tiếng được thế giới biết đến như bưởi, thanh
long, vú sữa, xoài,… Trong đó, vải cũng là loại trái cây được nhiều người ưu
thích và được xuất khẩu ngày càng nhiều sang các thị trường quốc tế.
Tuy nhiên, một số trường hợp ngộ độc sau khi ăn quả vải chưa chín đã
xảy ra ở nhiều quốc gia như Ấn Độ, Bangladesh, Jamaica,…[8]. Năm 2017 ở
Việt Nam đã xảy ra vụ ngộ độc với 4 cháu nhỏ, nghi do ăn quả vải rừng ở tỉnh
Cao Bằng. Theo các nghiên cứu, trong thịt quả và hạt quả vải nói riêng và một
số loại quả thuộc họ Bồ hòn nói chung (chôm chôm, ackee…) có thể chứa độc
chất Hypoglycin A (HGA) và (Methylencyclopropyl)glycin (MCPG) [6], [9].
Do đó các nghiên cứu về hai độc chất HGA và MCPG cũng được quan tâm
đến. Hiện nay, trên thế giới đã có một số nghiên cứu về các phương pháp xác
định HGA và MCPG trong quả vải. Tuy nhiên, tại Việt Nam cho đến nay
chưa có một phương pháp tiêu chuẩn nào đã và đang được áp dụng. Do đó, đề
tài “Xây dựng và thẩm định phương pháp xác định đồng thời Hypoglycin A
và( Methylencyclopropyl)glycin trong quả vải tại Cao Bằng bằng sắc ký
lỏng khối phổ hai lần” được thực hiện không chỉ có ý nghĩa về mặt khoa học
mà còn có ý nghĩa thực tiễn trong việc tìm hiểu, ngăn ngừa và hỗ trợ điều trị
các ca nhiễm độc liên quan đến các chất này. Mục tiêu của đề tài bao gồm:
1. Xây dựng và thẩm định phương pháp xác định đồng thời HGA và
MCPG trong quả vải bằng sắc ký lỏng khối phổ hai lần.

2. Ứng dụng phương pháp để xác định hàm lượng HGA và MCPG trong
một số mẫu quả vải tại tỉnh Cao Bằng.

1


Chương 1. TỔNG QUAN
1.1. Tổng quan về cây vải
1.1.1. Đặc điểm thực vật
Cây vải có tên khoa học là Litchi chinensis Sonn., họ Bồ hòn
(Sapindaceae). Tên khác là Nephelium litchi Cambess [3], [4].
Cây gỗ cao 8 - 15m. Cành tròn, màu gụ. Tán lá rộng. Lá kép lông chim,
2 - 4 đôi lá chét cứng dai, đầu nhọn, gốc hơi tù, mặt trên sáng, mặt dưới thẫm.
Hoa xếp thành hình chùy ở ngọn cành, có lông nâu, cuống hoa có đốt. Đài
hình đầu phân thùy nhẵn, có lông cả 2 mặt. Không có tràng. Đĩa vòng, phân
thùy, nhẵn. Nhị 7 - 10. Bầu 2 ô, có lông. Quả hình trứng, vỏ sù xì, áo hạt dày
bao gần hoàn toàn hạt, hạt màu nâu. Hoa tháng 2 - 3, quả chín từ tháng 5 - 7
[3], [4].

Hình 1.1. Cây vải (Litchi chinensis Sonn.)
1.1.2. Phân bố, sinh thái và bộ phận dùng
Chi Litchi Sonn. chỉ có một loài trên thế giới là Litchi chinensis Sonn.
với 3 loài phụ là:
 Litchi chinensis subsp. chinensis: Loài phụ này có nguồn gốc ở Bắc Việt
Nam, và có thể tìm thấy dạng gốc của nó mọc hoang dại ở Bắc Việt Nam
và Campuchia. Hiện nay cây được trồng nhiều ở Việt Nam và Nam

2

Trung Quốc. Vải trồng ở Việt Nam có nhiều giống, song đáng lưu ý nhất
là loại vải quả to, hình trứng, vỏ quả khi chín màu đỏ nâu, gai hơi nhọn.
Loại vải khác là loại có dáng cây nhỏ hơn, quả trong nhỏ, gần như không
rõ gai, khi chín vỏ quả màu vàng nâu, tên thường gọi là “vải thiều” [3].
 Litchi chinensis subsp. philippinensis (Radlk.) Leenth.: Loài này mọc
hoang dại ở Philippin, đôi khi cũng thấy trồng [3].
 Litchi chinensis subsp. javensis Leenth: Loài phụ thứ ba này mới chỉ
thấy trồng ở phía tây đảo Java (Indonesia) và Nam Đông Dương
(Campuchia và Nam Việt Nam) [3].
Nhìn chung tất cả những loài phụ vải đều là cây nhiệt đới hoặc cận
nhiệt đới. Chúng thích nghi với điều kiện khí hậu nóng và ẩm; nhiệt độ trung
bình 20 - 25oC. Đối với 2 giống vải chính trồng ở các tỉnh phía bắc, giống vải
quả hình trứng, to có khả năng chịu lạnh cao hơn giống vải thiều. Vải ưa sống
trên nhiều loại đất có thành phần sét cao và thoát nước nhanh [3].
Đặc biệt ở Cao Bằng cũng có một giống vải mọc tự nhiên, ưa những
nơi ẩm ướt trong rừng hoặc ven suối. Cây có quả nhỏ, hạt to hình bầu dục, khi
chín có màu đỏ tươi và vị chua.
Bộ phận dùng là hạt, thường gọi là Lệ chi hạch. Còn áo hạt của quả vải
(cùi vải), thường gọi là Lệ chi nhục [3], [4].
1.1.3. Thành phần hóa học
Quả vải gồm 8 - 15% vỏ, 70 - 86% cùi và 4 - 18% hạt [3].
Cùi vải chứa đường (chủ yếu là glucose và sacharose), đường khử, acid
citric, acid ascorbic, protein, chất béo, acid nicotic riboflavin, caroten, acid
amin và các nguyên tố đa vi lượng như calci, phosphor, sắt [3], [4].
Vỏ quả chứa cyanidin diglycosid và một số anthoxanthin vàng [3].
Hạt vải có chứa α-(methylenecyclopropylglycin), saponosid, tannin [3], [4].

3

1.2. Tổng quan về Hypoglycin A và (Methylencyclopropyl)glycin
1.2.1 Nguồn gốc của HGA và MCPG từ thực phẩm
HGA và MCPG là các độc tố tự nhiên được tìm thấy chủ yếu trong các
loại quả chưa chín của họ Bồ hòn (Sapindaceae), họ này ở Việt Nam phổ biến
có trong vải, chôm chôm, dâu da đất, … Nồng độ của HGA trong phần thịt
quả dao động từ 1000 ppm trong quả non đến dưới 0,1 ppm trong quả chín
[6]. Đối với MCPG, trong phần hạt vải là 1,8 µg/g, cùi vải chưa chín là 0,57
µg/g và cùi vải chín là 0,18 µg/g [10]. Do đó các độc tố này chỉ gây độc khi
quả còn non.
1.2.2. Độc tính của HGA và MCPG
Các độc tố HGA và MCPG chính là nguyên nhân dẫn đến hội chứng hạ
đường huyết (THS) với các triệu chứng là buồn nôn, nôn mửa, hôn mê, động
kinh, nặng nhất là hạ đường huyết sâu dẫn tới tổn thương não bộ [15]. Ảnh
hưởng tiêu cực của THS sẽ càng lớn nếu cơ thể đang có mức glucose thấp,
điển hình là lúc đói, cơ thể suy nhược, ăn phải quá nhiều thực phẩm có chứa
HGA và MCPG, hay có những bệnh lý khác, hoặc có thể trạng yếu như ở trẻ
em, đặc biệt trẻ suy dinh dưỡng.
Đã có những báo cáo về hàng loạt ca ngộ độc xảy ra sau khi ăn trái cây
thuộc họ Sapindaceae, xảy ra tại nhiều quốc gia như Ấn Độ, Bangladesh,
Jamaica,…. Và tại Việt Nam, cũng đã đã xảy ra vụ ngộ độc với 4 cháu nhỏ,
nghi do ăn quả vải rừng ở tỉnh Cao Bằng năm 2017. Danh sách những trường
hợp ngộ độc HGA sau khi ăn quả trong họ Bồ hòn được chỉ ra trong bảng 1.1

4


Bảng 1.1. Danh sách các trường hợp ngộ độc HGA xảy ra trên toàn cầu
Tài liệu tham

Quốc gia

Số ca tử vong

Năm

Jamaica

271

1980-1991

[8]

Bờ Biển Ngà

>100

1984

[5], [11]

Togo

132

1988-1989

[30]

Jamaica

6

1989-1991

[18]

Haiti

>10

1991

[31]

Jamaica

28

1992

[29]

USA

1

1994

[22]

Benin

24,40

1996,1997

[5]

Burkina Faso

29

1998

[5], [18]

Haiti

>50

2008

[31]

khảo

Hiện nay, cơ chế gây hạ đường huyết của HGA chưa được xác định
chính xác. Có nghiên cứu chỉ ra rằng tác nhân gây bệnh thực tế là một chất
chuyển hóa của Hypoglycin A là Methylencyclopropan acetyl CoA (MCPACoA). Hypoglycin A được chuyển sang Methylencyclopropyl-alanin (MCPA)

và sau đó trải qua quá trình oxy hóa decarboxyl hóa thành MCPA-CoA [25]
(theo sơ đồ hình 1.3). MCPA-CoA ức chế một số coenzym A dehydrogenase
cần thiết cho quá trình tạo glucose [8], [26]. Sự suy giảm trữ lượng glucose và
sự bất lực của các tế bào để tái tạo glucose dẫn đến hạ đường huyết. Ngoài ra,
HGA tham gia ức chế không hồi phục quá trình tạo glucose bằng cách hạn
chế các cơ chất tự do là CoA và carnitin – các chất cần thiết cho quá trình oxy
hóa các acid béo chuỗi dài [19].

5


Hypoglycin A

Pyridoxalphosphat
Mg, Pyruvat

Methylencyclopropanpyruvic Acid

Thiaminpyrophosphat,
Mg, CoASH

MethylencyclopropanacetylCoenzym A

Hình 1.2. Quá trình chuyển hóa của Hypoglycin A
Theo nghiên cứu của Klaus Melde và các cộng sự, MCPG có độc tính
tương tự với HGA nhưng nhẹ hơn. Khi thử invivo trên chuột, HGA và MCPG
đều có sự phụ thuộc liều lượng và thời gian làm giảm glucose huyết tương [16].
1.2.3. Quy định hiện hành về HGA và MCPG
Hiện nay Cục quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Hoa Kỳ (FDA) đã
công bố giới hạn của hàm lượng HGA trong quả ackee khô, ackee đóng hộp

nhập khẩu vào nước này là 100 mg/kg [23] [24]. Tuy nhiên tại Việt Nam vẫn
chưa có quy định về hàm lượng HGA và MCPG trong thực phẩm. Do đó đề
tài nghiên cứu về HGA và MCPG vừa có tính khoa học, vừa có giá trị thực
tiễn cao góp phần bảo vệ sức khỏe cho người tiêu dùng, đặc biệt là trẻ em.

6


1.2.4. Cấu tạo, tính chất của Hypoglycin A và (Methylencyclopropyl)glycin
Hypoglycin A và (Methylencyclopropyl)glycin là acid amin, có công
thức phân tử và các tính chất sau:

Hình 1.3. Công thức cấu tạo của HGA

Hình 1.4. Công thức cấu tạo của MCPG
1.2.4.1. Tính chất vật lý
 Hypoglycin A
 Phân tử gam: 141,17 g/mol
 Công thức phân tử: C7H11NO2
 Tên

IUPAC:

(2S)-2-amino-3-[(1R)-2-

methylidenecyclopropyl]propanoic acid
 Điểm nóng chảy: 282oC [17]
 HGA tan trong methanol và nước, độ tan trong nước ở 25ºC là 8,9
g/mL, dung dịch HGA trong nước hoặc methanol có màu vàng [20].

7


 (Methylencyclopropyl)glycin
 Phân tử gam: 127,14 g/mol
 Công thức phân tử: C6H9NO2
 Tên IUPAC: 2-(cyclopropylamino)prop-2-enoic acid
 MCPG là đồng đẳng của HGA, do đó có các tính chất tương tự như
HGA.
1.2.4.2. Tính chất hóa học
Do có cấu trúc α-amino acid, nên HGA và MCPG mang các tính chất
cơ bản của một α-amino acid, có các tính chất gây ra bởi nhóm –NH2, nhóm –
COOH, trong đó có một số phản ứng quan trọng như:
 Phản ứng với tác nhân acyl hóa: phản ứng với các tác nhân acyl hóa
như acetyl clorid, phthalic anhydrid.
 Phản ứng với dansyl clorid (dns-Cl): phản ứng thế ái nhân tạo nên dẫn
xuất dansyl, trong môi trường pH > 9,51.
 Phản ứng với thuốc thử Sanger (1-floro-2,4-dinitrobenzen): trong pH
kiềm nhẹ cho phản ứng với thuốc thử Sanger tạo dẫn xuất màu vàng.
 Phản ứng với thuốc thử phenyl isothiocyanat (PITC).
1.3. Phương pháp xác định HGA và MCPG
Có nhiều nghiên cứu xác định HGA và MCPG trong mẫu thịt quả họ
Bồ hòn đã được công bố. Về nguyên tắc, đầu tiên chất phân tích được tách ra
khỏi nền mẫu vào một dịch chiết thích hợp. Sau đó, một kỹ thuật phân tích
phù hợp được sử dụng để xác định hàm lượng HGA và MCPG trong dịch
chiết từ đó tính được hàm lượng trong mẫu ban đầu.
HGA và MCPG có bản chất là acid amin đồng thời hàm lượng trong
mẫu vải thường rất thấp (cỡ ppm) nên sắc ký là phương pháp được sử dụng
phổ biến để xác định hàm lượng 2 độc tố này do ưu điểm về độ nhạy và tính
chọn lọc. Ngoài ra khi phân tích thường được tạo dẫn xuất để tăng hiệu quả

8


phân tách khi qua cột sắc ký cũng như tăng khả năng xác định của dectector.
Thường các dẫn xuất được sử dụng phải đảm bảo về tính ổn định, điều kiện
phản ứng nhẹ nhàng, đơn giản. Các thuốc thử hay được sử dụng là:
fluorenylmethyloxycarbonyl clorid (Fmoc-Cl), dansyl clorid (Dns-Cl), phenyl
isothiocyanat (PITC), ortho-phthalaldehyd (OPA)…
1.3.1. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao
Sắc ký lỏng là quá trình tách xảy ra trên cột tách với pha tĩnh là chất
rắn và pha động là chất lỏng. Mẫu phân tích được chuyển lên cột tách dưới
dạng dung dịch. Khi tiến hành phân tích sắc ký, các chất phân tích được phân
bố liên tục giữa pha động và pha tĩnh. Trong hỗn hợp các chất phân tích, do
cấu trúc phân tử và tính chất lí hoá của các chất khác nhau, nên khả năng
tương tác của chúng với pha tĩnh và pha động khác nhau. Do vậy, chúng di
chuyển với tốc độ khác nhau và tách ra khỏi nhau. Trong HPLC, pha tĩnh
chính là chất nhồi cột làm nhiệm vụ tách hỗn hợp chất phân tích, đó là những
chất rắn, xốp và kích thước hạt rất nhỏ, từ 3 – 7 µm. Tuỳ theo bản chất của
pha tĩnh, trong phương pháp sắc ký lỏng thường chia làm 2 loại: sắc ký pha
thường (NP-HPLC) và sắc ký pha đảo (RP-HPLC) [1].
Ware JM đã sử dụng phương pháp HPLC để xác định hàm lượng HGA
trong quả ackee. HGA được chiết ra khỏi nền mẫu bằng hỗn hợp dung môi
ethanol 80%

trong

nước.

Dịch

chiết

được

tạo

dẫn

xuất

với

phenylisothiocyanat và được phân tích bằng detector UV ở bước sóng 254nm.
Giới hạn phát hiện của phương pháp là 50μg/g [27].
Isenberg S. L. và các cộng sự đã sử dụng phương pháp sắc ký lỏng LCMS/MS để xác định HGA và MCPG trong thịt quả họ Sapindaceae. Mẫu
được chiết bằng dung môi ethanol 80% trong nước. Dịch chiết thu được tạo
dẫn chất với dansyl clorid, sau đó làm sạch qua cột HLB với dung môi rửa tạp
và dung môi rửa giải là nước/acetonitril 98:2 và nước/acetonitril 2:98. Dịch

9


rửa được thổi khô, hòa tan lại trong acid formic 1% và được phân tích bằng
LC-MS/MS. Giới hạn phát hiện của phương pháp là 1 µg/g [14].
Ziegler và cộng sự đưa ra phương pháp phân tích các acid amin trong
mẫu thực vật bằng cách chiết trong dung môi methanol 20% trong nước và
tạo dẫn xuất với FMOC-Cl. Dịch chiết được phân tích bằng LC-MS/MS với
giới hạn phát hiện đạt được của hầu hết các acid amin là 1nM [28].
Theo nghiên cứu của Carlier, mẫu máu toàn phần sau khi ngộ độc HGA

được làm sạch bằng cột chiết pha rắn HILIC. Sau đó tạo dẫn xuất với dansyl
clorid và định lượng bằng UHPLC-HRMS/MS [7].
Gray N. và cộng sự đã chiết các acid amin ra khỏi nền mẫu nước tiểu
của các loài động vật có vú bằng dung môi methanol và acid formic 1%. Dịch
chiết được phân tích bằng LC-MS/MS [13].
Nhóm nghiên cứu của Sander J. sử dụng dung môi methanol để chiết
chất phân tích ra khỏi nền mẫu huyết thanh và nước tiểu. Dịch chiết được tạo
dẫn xuất butyl ester và phân tích bằng LC-MS/MS [21].
1.3.2. Phương pháp sắc ký khí khối phổ
Sắc ký khí có pha động là chất khí, pha tĩnh là rắn hoặc lỏng. Phương
pháp có hiệu quả tách rất cao và thời gian phân tích nhanh, hơn nữa với
những detector phù hợp, giới hạn phát hiện của phương pháp đạt tới cỡ
ng/mL. Tuy nhiên phương pháp có hạn chế là đối tượng phân tích hẹp, chỉ
phù hợp với các chất dễ bay hơi. Ngày nay, sắc ký khí là một phương pháp đã
phát triển đầy đủ, đóng góp nhiều vào phân tích môi trường.
Y. Gaillard và các cộng sự đã sử dụng sắc ký khí kết nối khối phổ để
xác định hàm lượng HGA trong quả ackee. Phương pháp sử dụng chất chuẩn
nội

là

phenylalanin.

Chất

phân

tích

được dẫn

xuất

với

N,O-

bis(trimethylsilyl)trifluoroacetamid có chứa 1% trimethyl chlorosilan

10


(BSTFA) trước khi phân tích. Giới hạn phát hiện của phương pháp là 0,1
mg/g [12].

11


Bảng 1.2 thể hiện một số phương pháp đã được sử dụng để phân tích HGA và MCPG trên các nền mẫu khác nhau:
Bảng 1.2. Một số nghiên cứu về HGA và MCPG
Thiết
bị sử
dụng
HPLC

Tài
liệu
tham
khảo
[27]

LC[14]
MS/MS

Chất
phân
tích

Đối tượng
thử

Điều kiện sắc ký

Phương pháp xử lý mẫu

Kết quả

HGA

Quả ackee

Detector UV, bước sóng Dung môi chiết ethanol
254nm
80% trong nước.
Tạo
dẫn
xuất
với
phenylisothiocyanat

Thời gian lưu là ~
6,2 phút
Giới hạn định lượng
là 50 μg/g
Khoảng tuyến tính
của HGA là 50 đến
400 μg/g

HGA
và
MCPG

Thịt quả của
họ
Sapindaceae
(vải, chôm
chôm, nhãn,
ackee)

Cột sắc ký (2,1 x 50mm,
1,8µm)
Thể tích tiêm 2,5 µL
Pha động: acid formic
0,1% trong nước và ACN
Tốc độ dòng 0,5 mL/phút

Thời gian lưu của
HGA và MCPG là
2,58 và 2,75 phút
Khoảng tuyến tính

từ 1 đến 200ng/mL
Giới hạn phát hiện

12

Sử dụng chất chuẩn nội là
đồng vị của HGA và
MCPG
Dung môi chiết ethanol
80% trong nước. Tạo dẫn
xuất với dansyl clorid.


Chế độ ESI dương

Làm sạch qua cột HLB. là 1µg/g
Dung môi rửa tạp và rửa
giải là nước/ACN 98:2 và
2:98. Dịch được thổi khô
và hòa lại bằng acid
formic 1%.

[21]

HGA

Mẫu huyết Cột C18 (2,1mm x 50 Sử dụng chất chuẩn nội là Giới hạn định lượng
thanh
và mm, 1,7µm)
d3-leucine

là 0,01µmol/L
nước tiểu
Thể tích tiêm 5µL
Dung môi chiết methanol.
Chế độ ESI dương
Thổi khô dịch chiết và tạo
dẫn xuất với butanolic
HCl. Dịch thu được hòa
trong
hỗn
hợp
methanol:nước (80:20)

[28]

Amino
acid

Mẫu
vật

thực Cột Nucleoshell RP 18
(50 x3mm; 2,7 µm)
Pha động: ammonium
format 10mM, pH 4,5 và
ACN

13

Dung môi chiết methanol

20% trong nước
Sử dụng nội chuẩn là
norvalin
Tạo dẫn xuất với Fmoc-Cl.

Phân tích đồng thời
21 acid amin
Giới hạn phát hiện
của hầu hết các acid
amin là 1nM


Tốc độ dòng 0,9mL/phút
Chế độ ESI âm
[13]

Acid
amin

Mẫu nước Cột Acquity UPLC HSS
tiểu
của T3 (150 x 2,1 mm; 1,8
động vật có µm)
vú
Thể tích tiêm 2 µL
Tốc độ dòng 0,6mL/phút
Pha động là acid formic
0,1% trong nước và acid
formic 0,1% trong ACN
Chế độ ESI dương

Dung môi chiết methanol
và acid formic 1%.
Tạo dẫn xuất với 6aminoquinolyl-Nhydroxy-succinimidyl
carbamat

Phân tích đồng thời
20 acid amin
Thời gian phân tích
là 7,5 phút
Khoảng tuyến tính
từ 0,2 – 200 µM

GC-MS [12]

HGA

Quả ackee

Sử dụng phenylalanin làm
nội chuẩn.
Tạo dẫn xuất với N,Obis(trimethylsilyl)trifluoroacetamid có chứa
1% trimethyl chlorosilan
(BSTFA)

Thời gian phân tích
là 25 phút
Giới hạn phát hiện
là 0,1 mg/g
Khoảng tuyến tính

từ 1 - 20 mg/g

Khí mang Helium
Tốc độ khí mang 1
mL/phút
Nhiệt độ interface 280oC,
nhiệt độ source 200oC

14


Như vậy, các nghiên cứu chủ yếu sử dụng sắc ký lỏng khối phổ 2 lần để
phân tích HGA và MCPG, do đây là phương pháp có độ nhạy cao, đáp ứng
chọn lọc. Các loại dẫn xuất thường được sử dụng như Fmoc-Cl, dansyl clorid,
PITC… cũng khá phổ biến, điều kiện tạo dẫn xuất đơn giản. Trong nghiên
cứu này, chúng tôi lựa chọn phương pháp phân tích bằng sắc ký lỏng kết nối
khối phổ hai lần để xác định HGA và MCPG trong nền mẫu thịt quả vải, có
sử dụng chuẩn nội, lựa chọn chiết bằng dung môi và làm sạch qua SPE.
1.4. Tổng quan về phương pháp sắc ký lỏng khối phổ hai lần
(LC – MS/MS)
1.4.1. Nguyên lý hoạt động
Về cơ bản, sắc ký lỏng khối phổ là phương pháp sắc ký lỏng sử dụng
bộ phận phát hiện là detector khối phổ.
Sắc ký lỏng là quá trình tách xảy ra trên cột tách với pha tĩnh là chất
rắn và pha động là chất lỏng (sắc ký lỏng - rắn) [1].
Khối phổ là thiết bị phân tích dựa trên cơ sở xác định khối lượng phân
tử của các hợp chất hóa học bằng việc phân tách các ion phân tử theo tỉ số
giữa khối lượng và điện tích (m/z) của chúng. Các ion có thể tạo ra bằng cách
thêm hay bớt điện tích của chúng như loại bỏ electron, proton hóa,... Các ion
tạo thành này được tách theo tỉ số m/z và phát hiện, từ đó có thể cho thông tin

về khối lượng hoặc cấu trúc phân tử của hợp chất [1].
Một sơ đồ tóm tắt mô hình hệ thống LC-MS/MS được trình bày ở hình 1.5

15


Mẫu

Mảnh mẹ được sàng lọc bị
phân mảnh ở Q2

Cột LC

Q1

Q2

Mảnh mẹ được
sàng lọc ở Q1

Q3

Mảnh con được
sàng lọc ở Q3

Sắc ký đồ

Hình 1.5. Mô hình hệ thống LC-ESI-MS/MS
1.4.2. Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao
1.4.2.1. Pha động

Pha động trong HPLC đóng góp một phần rất quan trọng trong việc
tách các chất phân tích trong quá trình sắc ký nhất định. Mỗi loại sắc ký đều
có pha động rửa giải riêng cho nó để có được hiệu quả tách tốt. Pha động là
chất lỏng, có thể chia thành 2 loại:
 Pha động có độ phân cực cao: có thành phần chủ yếu là nước, tuy nhiên
để phân tích các chất hữu cơ, cần thêm các dung môi khác để giảm độ
phân cực như MeOH, ACN. Pha động loại này được dùng trong sắc ký
pha liên kết ngược [1].
 Pha động có độ phân cực thấp: bao gồm các dung môi ít phân cực như
cyclopentan,

n-pentan,

n-heptan,

n-hexan,

2-chloropropan,

cacbondisulfua (CS2), chlorobutan, CCl4, toluen...[1].
Tuy nhiên pha động một thành phần đôi khi không đáp ứng được khả
năng rửa giải, người ta thường phối hợp 2 hay 3 dung môi để có được dung
môi có độ phân cực từ thấp đến cao phù hợp với phép phân tích. Sự thay đổi
thành phần pha động theo thời gian gọi là rửa giải gradient nồng độ [1].

16