NGUYỄN CHÍNH KHOA xây DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG MAJONOSIDE r2 TRONG CHẾ PHẨM CHỨA sâm NGỌC LINH BẰNG PHƯƠNG PHÁP sắc ký LỎNG KHỐI PHỔ LUẬN văn THẠC sĩ dược học

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN CHÍNH KHOA

XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG
MAJONOSIDE R2 TRONG CHẾ PHẨM CHỨA
SÂM NGỌC LINH BẰNG PHƯƠNG PHÁP
SẮC KÝ LỎNG KHỐI PHỔ

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

HÀ NỘI 2019


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN CHÍNH KHOA

XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG
MAJONOSIDE R2 TRONG CHẾ PHẨM CHỨA
SÂM NGỌC LINH BẰNG PHƯƠNG PHÁP
SẮC KÝ LỎNG KHỐI PHỔ

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC
CHUYÊN NGÀNH: KIỂM NGHIỆM THUỐC VÀ ĐỘC CHẤT
MÃ SỐ: 8720210

Người hướng dẫn khoa học:
PGS.TS. Nguyễn Thị Kiều Anh

HÀ NỘI 2019


LỜI CẢM ƠN
Để có thể hồn thành đề tài Luận văn thạc sĩ một cách hoàn chỉnh, sự hướng dẫn
nhiệt tình của q thầy cơ, sự động viên ủng hộ của gia đình, bạn bè và đồng nghiệp
trong suốt thời gian học tập nghiên cứu luôn là nguồn đồng lực lớn lao và quý báu nhất
đối với tôi.
Đầu tiên, tôi xin chân thành bày tỏ lịng kính trọng và biết ơn sâu sắc nhất đến
PGS. TS. Nguyễn Thị Kiều Anh, là người trực tiếp hướng dẫn, tận tình chỉ bảo và tạo
mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt q trình thực hiện và hồn thành luận văn.
Tơi xin chân thành bày tỏ lịng biết ơn đến tồn thể quý thầy cô trường Đại học
Dược Hà Nội và đặc biệt là q thầy cơ Bộ mơn Hóa phân tích – Độc chất, đã tận tình
truyền đạt những kiến thức quý báu cũng như tạo mọi điều kiện thuận lợi nhất cho tơi
trong suốt q trình học tập và nghiên cứu.
Tôi xin gởi lời cảm ơn đến Ban lãnh đạo và các anh chị cán bộ Viện Công nghệ
Dược phẩm Quốc gia – Trường Đại học Dược Hà Nội và Trung tâm giám định ma túy
– Viện Khoa học hình sự – Bộ Công an đã không ngừng hỗ trợ về thiết bị và tạo mọi
điều kiện tốt nhất cho tôi trong suốt thời gian nghiên cứu và thực hiện luận văn.
Cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn gia đình, các bạn và các anh chị đồng nghiệp
đã động viên, hỗ trợ cho tôi rất nhiều trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài.
Mặc dù đã có nhiều cố gắng trong suốt q trình thực hiện đề tài, song có thể cịn
có những mặt hạn chế, thiếu sót. Tơi rất mong nhận được ý kiến đóng góp và sự chỉ

dẫn của các thầy cơ giáo và các anh chị đồng nghiệp.
Hà Nội, ngày 01 tháng 04 năm 2019

Nguyễn Chính Khoa


MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
ĐẶT VẤN ĐỀ ...................................................................................................... 1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN ............................................................................... 3
1.1. Tổng quan về sâm Ngọc Linh ........................................................................ 3
1.1.1. Đặc điểm của sâm Ngọc Linh .................................................................. 3
1.1.2. Thành phần hóa học ................................................................................. 4
1.1.2.1. Thành phần hóa học của phần dưới mặt đất ...................................... 4
1.1.2.2. Thành phần hóa học của phần trên mặt đất ....................................... 5
1.1.3. Tác dụng của sâm Ngọc Linh .................................................................. 5
1.2. Tổng quan về Majonoside R2 ........................................................................ 8
1.2.1. Công thức cấu tạo và tính chất ................................................................. 8
1.2.2. Tác dụng của Majonoside R2 .................................................................. 8
1.2.3. Phương pháp định tính và định lượng Majonoside R2 ............................ 9
1.2.3.1. Phương pháp sắc ký lớp mỏng ........................................................... 9
1.2.3.2. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao.......................................... 10
1.2.3.3. Phương pháp sắc ký lỏng khối phổ .................................................. 11
1.2.4. Một số chế phẩm chứa sâm Ngọc Linh lưu hành trên thị trường .......... 12
1.3. Tổng quan về phương pháp sắc ký lỏng khối phổ ....................................... 13
1.3.1. Phương pháp sắc ký lỏng ....................................................................... 13
1.3.2. Detector khối phổ cho sắc ký lỏng ......................................................... 13
1.3.2.1. Nguyên tắc ....................................................................................... 13

1.3.2.2. Các nguồn ion hóa trong sắc ký lỏng khối phổ ............................... 14
1.3.2.3. Bộ phận phân tích khối lượng .......................................................... 14
1.3.3. Ứng dụng phương pháp sắc ký lỏng khối phổ trong phân tích.............. 15
1.3.3.1. Ứng dụng trong định tính................................................................. 15
1.3.3.2. Ứng dụng trong định lượng ............................................................. 15


CHƯƠNG 2.ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................... 16
2.1. Đối tượng và phương tiện nghiên cứu ....................................................... 16
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu .......................................................................... 16
2.1.2. Phương tiện và thiết bị nghiên cứu...................................................... 17
2.1.3. Hóa chất và dung mơi .......................................................................... 17
2.2. Phương pháp nghiên cứu ........................................................................... 18
2.2.1. Thu thập mẫu ....................................................................................... 18
2.2.2. Lựa chọn điều kiện sắc ký ................................................................... 18
2.2.3. Lựa chọn phương pháp xử lý mẫu....................................................... 18
2.2.4. Thẩm định phương pháp...................................................................... 19
2.2.5. Áp dụng trên một số chế phẩm chứa sâm Ngọc Linh ......................... 19
2.2.6. Phương pháp xử lý số liệu ................................................................... 19
CHƯƠNG 3.KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ......................................................... 21
3.1. Khảo sát và lựa chọn điều kiện sắc ký....................................................... 21
3.1.1. Chuẩn bị dung dịch chuẩn. .................................................................. 21
3.1.2. Khảo sát điều kiện khối phổ ................................................................ 21
3.1.3. Khảo sát cột sắc ký .............................................................................. 23
3.1.4. Khảo sát thành phần và tỷ lệ pha động................................................ 26
3.1.5. Khảo sát thể tích tiêm .......................................................................... 30
3.2. Khảo sát quy trình xử lý mẫu .................................................................... 31
3.2.1. Khảo sát dung môi chiết ...................................................................... 32
3.2.2. Khảo sát thời gian chiết ....................................................................... 33
3.2.3. Khảo sát số lần chiết ............................................................................ 34

3.3. Quy trình phân tích .................................................................................... 35
3.3.1. Điều kiện sắc ký .................................................................................. 35
3.3.2. Chuẩn bị mẫu chuẩn và mẫu thử ......................................................... 36
3.3.3. Định tính Majonoside R2 .................................................................... 37
3.3.4. Định lượng Majonoside R2 ................................................................. 37
3.4. Thẩm định phương pháp ............................................................................ 38


3.4.1. Độ phù hợp của hệ thống..................................................................... 38
3.4.2. Độ đặc hiệu .......................................................................................... 38
3.4.3. Độ tuyến tính ....................................................................................... 41
3.4.4. Độ chụm .............................................................................................. 42
3.4.5. Độ đúng ............................................................................................... 44
3.4.6. Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) .................. 47
3.5. Áp dụng phương pháp trên một số mẫu chứa sâm Ngọc Linh .................. 48
3.5.1. Định tính .............................................................................................. 49
3.5.2. Định lượng ........................................................................................... 51
CHƯƠNG 4.BÀN LUẬN .................................................................................. 52
4.1. Lựa chọn phương pháp phân tích. ............................................................. 52
4.2. Lựa chọn phương pháp xử lý mẫu ............................................................. 53
4.3. Thẩm định phương pháp ............................................................................ 54
4.4. Áp dụng phương pháp vào nền mẫu thực tế .............................................. 55
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .......................................................................... 57
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC


DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
Ký hiệu và
chữ viết tắt

AOAC

APCI

APPI
ESI
HPLC

IUPAC

LC-MS

Diễn giải tiếng Anh

Việt

Association of Official

Hiệp hội các nhà hố

Agricultural Chemists

phân tích chính thống

Atmospheric pressure chemical Ion hóa hóa học ở áp suất
ionization

khí quyển

Atmospheric pressure

Ion hóa quang học ở áp

photoionization

suất khí quyển

Electrospray ionization

Ion hóa phun điện tử

High performance liquid

Sắc ký lỏng hiệu năng

chromatography

cao

International Union of Pure and
Applied Chemistry
Liquid chromatography–mass
spectrometry
Liquid chromatography–mass

LC-MS/MS

Dịch nghĩa tiếng

spectrometry/ mass

spectrometry

Liên minh Quốc tế về
Hóa học thuần túy và
Hóa học ứng dụng
Sắc ký lỏng khối phổ

Sắc ký lỏng khối phổ hai
lần

Rf

Retention factor

Hệ số lưu giữ

RSD

Relative standard deviation

Độ lệch chuẩn tương đối

TNF-α

tumor necrosis factor α

Yếu tố hoại tử khối u α

TOF

Time of flight

Thời gian bay

UV-VIS

Ultraviolet–visible

Tử ngoại- khả kiến


DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1

Một số chế phẩm chứa sâm Ngọc Linh .......................................... 12

Bảng 2.1

Chế phẩm chứa sâm Ngọc Linh dạng rắn ....................................... 16

Bảng 2.2

Chế phẩm chứa sâm Ngọc Linh dạng dầu ...................................... 16

Bảng 2.3

Danh mục dung mơi và hóa chất .................................................... 17

Bảng 3.1

Các thông số tối ưu của buồng ion hóa........................................... 22

Bảng 3.2

Điều kiện phân mảnh của Majonoside R2 ...................................... 23

Bảng 3.3

Kết quả khảo sát dung môi chiết (n =3).......................................... 32

Bảng 3.4

Kết quả khảo sát thời gian chiết (n=3)............................................ 33

Bảng 3.5

Kết quả khảo sát số lần chiết .......................................................... 35

Bảng 3.6

Chương trình dung mơi ................................................................... 36

Bảng 3.7

Điều kiện khối phổ .......................................................................... 36

Bảng 3.8

Kết quả khảo sát độ phù hợp hệ thống............................................ 38

Bảng 3.9

Kết quả khảo sát độ tuyến tính........................................................ 41

Bảng 3.10 Kết quả khảo sát độ chụm mẫu dạng rắn ........................................ 43
Bảng 3.11 Kết quả khảo sát độ chụm mẫu dạng dầu ....................................... 44
Bảng 3.12 Kết quả khảo sát độ thu hồi mẫu dạng rắn...................................... 45
Bảng 3.13 Kết quả khảo sát độ thu hồi mẫu dạng dầu ..................................... 46
Bảng 3.14 Kết quả khảo sát giới hạn phát hiện ................................................ 47
Bảng 3.15 Kết quả định lượng Majonoside R2 trên một số mẫu ..................... 51


DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
Hình 1.1 Sâm Ngọc Linh....................................................................................... 3
Hình 1.2 Cơng thức cấu tạo của Majonoside R2 .................................................. 8
Hình 1.3 Nguyên lý hoạt động của sắc ký lỏng khối phổ ................................... 13
Hình 1.4 Phạm vi áp dụng của các cơ chế ion hóa ............................................. 14
Hình 3.1 Phổ khối lượng của Majonoside R2 chế độ ion hóa dương ................. 21
Hình 3.2 Phổ khối lượng của Majonoside R2 chế độ ion hóa âm ...................... 22
Hình 3.3 Kết quả khảo sát ion con và năng lượng phân mảnh ........................... 23
Hình 3.4 Kết quả khảo sát cột Inertsustain NH2................................................. 25
Hình 3.5 Kết quả khảo sát cột Inertsustain AQ C18 ........................................... 26
Hình 3.6 Kết quả khảo sát pha động methanol : nước chứa 0,1% acid formic . 27
Hình 3.7 Kết quả khảo sát pha động acetonitril : nước chứa 0,1% acid formic . 28
Hình 3.8 Kết quả khảo sát tỷ lệ pha động. .......................................................... 30
Hình 3.9 Kết quả khảo sát thể tích tiêm mẫu ...................................................... 31
Hình 3.10 Kết quả khảo sát dung mơi chiết ....................................................... 33
Hình 3.11 Kết quả khảo sát thời gian chiết ........................................................ 34
Hình 3.12 Sắc ký đồ khảo sát độ đặc hiệu .......................................................... 40
Hình 3.13 Kết quả định tính mẫu R1 .................................................................. 40

Hình 3.14 Kết quả định tính mẫu N1 .................................................................. 41
Hình 3.15 Đường chuẩn Majonoside R2 ............................................................ 42
Hình 3.16 Kết quả xác định LOD của phương pháp (nồng độ 0,2ng/ml). ......... 48
Hình 3.17 Sắc ký đồ mẫu R2 và N5 .................................................................... 49
Hình 3.18 Kết quả định tính mẫu R2 và N5........................................................ 50


ĐẶT VẤN ĐỀ
Việt Nam là nước có nguồn tài nguyên thực vật đa dạng, cùng với đó là
nguồn dược liệu làm thuốc rất phong phú. Từ hàng ngàn năm trước, các loại
dược liệu đã được sử dụng để phòng, chữa bệnh và có vai trị rất quan trọng
trong việc bảo vệ sức khỏe con người. Sử dụng các loại dược phẩm có nguồn
gốc tự nhiên (đơng dược) đang là xu hướng phát triển chủ yếu không chỉ ở Việt
Nam mà còn rất nhiều nước châu Á. Các thành phần tự nhiên trong dược liệu
thân thiện với sức khỏe con người, ít độc hại và ít gây tác dụng không mong
muốn hơn so với thuốc tân dược.
Sâm Ngọc Linh có tên khoa học là Panax Vietnamensis, là một loài cây
thuộc họ Ngũ gia bì (Araliaceae). Được tìm thấy lần đầu tiên vào năm 1973 tại
núi Ngọc Linh, huyện Đắc Tô, tỉnh Kon Tum [4]. Sâm Ngọc Linh là loại sâm
đặc biệt quý hiếm, chỉ có tại Việt Nam. Trước đây, người dân sử dụng sâm Ngọc
Linh theo các bài thuốc cổ truyền để chữa rất nhiều bệnh. Sau khi được tìm thấy
và xác nhận danh tính, sâm Ngọc Linh được nghiên cữu kỹ hơn, các nhà khoa
học đã phát hiện ra 52 loại saponin trong củ sâm, có những chất chưa từng được
phát hiện trong các loại sâm khác [18], [19], [20]. Các nghiên cứu về tác dụng
của sâm Ngọc Linh cũng được tiến hành và cho thấy nhiều kết quả khả quan.
Chính vì vậy, hiện nay trên thị trường có rất nhiều các sản phẩm từ sâm Ngọc
Linh như sâm tươi, cao sâm và các chế phẩm khác.
Majonoside R2 là saponin chiếm tỷ lệ cao nhất trong sâm Ngọc Linh [1],
[5], đây cũng là hoạt chất đặc trưng chỉ có ở sâm Ngọc Linh mà khơng có ở bất
kỳ loại sâm nào đã được phát hiện trước đó. Do đó, việc định tính và định lượng

Majonoside R2 có ý nghĩa rất quan trọng trong việc kiểm soát chất lượng sâm
Ngọc Linh cũng như các chế phẩm liên quan. Trong Dược điển Việt Nam V đã
có chuyên luận về định lượng Majonoside R2 trong dược liệu sâm Ngọc Linh
theo phương pháp HPLC [3]. Ngồi ra, có nhiều nghiên cứu định lượng
Majonoside R2 trong sâm Ngọc Linh [1], [5], [28]. Tuy nhiên, đối với các chế

1


phẩm trên thị trường ngoài thành phần Sâm Ngọc Linh thì cịn có nhiều dược
liệu khác nên các phương pháp này rất khó có thể tách và định lượng được
Majonoside R2, mà yêu cầu một phương pháp đặc hiệu hơn.
Để góp phần vào cơng tác kiểm tra chất lượng các chế phẩm chứa Sâm
Ngọc Linh chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài “Xây dựng phương pháp định
lượng Majonoside R2 trong chế phẩm chứa sâm Ngọc Linh bằng phương pháp
sắc ký lỏng khối phổ hai lần” với các mục tiêu sau:
Xây dựng được phương pháp định tính, định lượng Majonoside R2 trong
các chế phẩm chứa sâm Ngọc Linh bằng phương pháp sắc ký lỏng khối phổ.
Áp dụng phương pháp để định tính, định lượng Majonoside R2 trong một
số chế phẩm chứa sâm Ngọc Linh lưu hành trên thị trường.

2


CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1. Tổng quan về sâm Ngọc Linh
1.1.1. Đặc điểm của sâm Ngọc Linh
 Tên khoa học
Sâm Ngọc Linh có tên khoa học là Panax Vietnamensis Ha & Grushv.1985
thuộc họ Ngũ gia bì (Araliaceae), bộ Hoa tán (Apiales), lớp Mộc lan

(Magnoliopsida), ngành Mộc lan (Magnoliophyta) [4].
 Đặc điểm thực vật

Hình 1.1 Sâm Ngọc Linh
Cây thảo sống nhiều năm, cao 0,3-110 cm. Thân rễ tạo thành các đốt, nằm
ngang, có thể phân nhánh, đường kính từ 1-2cm. Phần mang lá từ 1-5 thân, tùy
theo số đầu nhánh của thân rễ. Lá kép chân vịt, mọc vòng, ở ngọn, mỗi lá kép
gồm 3-5 lá chét, lá chét hình bầu dục thn, nhọn hai đầu, 6-14 x 2,5-4cm, mép
khía răng cưa. Cụm hoa tán đơn hay tán kép (thêm 1-2 tán phụ), mọc ở ngọn,
chiều dài cuống cụm hoa dài hơn cuống lá, nên thường cao vượt tán lá. Hoa có
cuống ngắn, màu trắng xanh, 5 đài nhỏ, 5 cánh hoa, 5 nhị. Bầu 2 ô (nếu thấy 1 ô
là do ơ cịn lại bị chèn ép khó phân biệt), vịi nhụy chẻ 2 ở đầu. Quả mọng, hình
cầu, đường kính 0,5-0,6cm, khi chín có màu đỏ và thường có chấm đen ở đỉnh.

3


Hạt thường 1 hoặc 2, hạt nhỏ gần tròn hoặc giống hình thận, vỏ hạt khơng nhẵn
[2].
 Đặc điểm sinh thái
Mùa hoa vào tháng 4-5, quả tháng 6-9. Gieo giống tự nhiên bằng hạt. Phần
thân rễ bị gãy còn lại có thể tái sinh. Cây thường lụi hàng năm vào mùa đông,
đến đầu mùa xuân năm sau từ thân rễ sẽ mọc lên chồi thân mới. Cây đặc điểm
ưa ẩm và ưa bóng, mọc rải rác dưới tán rừng kín thường xanh ẩm, nhất là dọc
theo hành lang ven suối, ở độ cao từ 1900-2300m [2].
 Phân bố
Trong nước: Quảng Nam (Trà My), Kon Tum (Đăk Tô)[2].
Thế giới: Trung Quốc.
1.1.2. Thành phần hóa học
Thành phần hóa học của phần dưới mặt đất

1.1.2.1.

 Hợp chất saponin
Hợp chất saponin được xem là thành phần hoạt chất chủ yếu của cây Sâm
Ngọc Linh cũng như của các loài sâm khác trên thế giới. Từ phần dưới mặt đất
của sâm Ngọc Linh hoang dại đã phân lập và xác định được cấu trúc 52 hợp chất
saponin, trong đó có 26 saponin đã biết và 26 saponin có cấu trúc mới
[2],[18],[19],[20]. Tổng hàm lượng saponin trong các bộ phận thân rễ, rễ và rễ
con lần lượt là 19,52%; 15,59% và 13,93%, cao hơn nhiều so với các loại sâm
khác [13].
Các saponin trong sâm Ngọc Linh được chia làm 4 nhóm chính [2]:


Các saponin dẫn chất của 20(S)-protopanaxadiol gồm 20 chất, các

chất có hàm lượng lớn là G-Rb1 (2,0%)và G-Rd (0,87%), 2 chất này cũng có
trong các loại sâm khác như Nhân sâm [26].


Các saponin dẫn chất của 20(S)-protopanaxatrol gồm 17 chất, trong

đó G-Rg1 chiếm tỷ lệ cao nhất (1,37%), chất này cũng có trong thành phần của
Nhân sâm.

4




Các saponin có cấu trúc ocotillol gồm 11 chất, trong đó có

Majonoside R2 có hàm lượng cao nhất (5,29%) và là hoạt chất hồn tồn mới,
chưa có ở bất kỳ loài sâm nào khác.


Các saponin dẫn chất của acid oleanolic gồm 2 chất.

 Hợp chất polyacetylen
Có 7 hợp chất đã được phân lập, 5 hợp chất đã được xác định cấu trúc với
panaxynol và heptadeca-1,8(E)-dien-4,6-diyn-3,10-diol là 2 polyacetylen chủ
yếu. Hai hợp chất mới là 10-acetoxyheptadeca-8(E)-en-4,6-diyn-3-ol và
heptadeca-1,8(E),10(E)-trien-4,6-diyn-3,10-diol[3,6,7,11,12,33-35] [2].
 Hợp chất Sterol
β – Sitosterol và daucosterin (β–Sitosteryl–3 – o - β – D – glucopyranosid)
[2].
 Hợp chất Glucid
Đường tự do: 6,19%
Đường toàn phần: 26,77% [2].
 Các thành phần khác:
Thành phần acid béo trong rễ củ sâm Ngọc Linh chiếm 0,55%, gồm 17 loại
acid béo khác nhau. Trong rễ củ cũng chứa 18 loại acid amin thiết yếu và 20
nguyên tố đa lượng và vi lượng [2].
1.1.2.2.

Thành phần hóa học của phần trên mặt đất

Lá sâm và thân giả chứa ít saponin hơn các bộ phận dưới mặt đất, cả về số
lượng lẫn hàm lượng. Các saponin phân lập được từ lá sâm gồm 19 saponin,
trong đó có 11 chất đã biết và 8 chất mới [2].

1.1.3. Tác dụng của sâm Ngọc Linh
 Tác dụng trên hệ thần kinh trung ương:
Sâm Ngọc Linh liều thấp có tác dụng kích thích thần kinh, làm tăng hoạt
động và trí nhớ, nhưng liều cao lại ức chế thần kinh [2].

5


 Tác dụng chống trầm cảm:
Sâm Ngọc Linh có tác dụng chống trầm cảm ở liều uống một lần 200mg/kg
hoặc liều 50 – 100 mg/kg dùng luôn 7 ngày ở chuột nhắt trắng, Majonoside R2
tiêm trong màng bụng có tác dụng chống trầm cảm ở cả 3 liều: 3,1; 6,2 và 12,5
mg/kg [2].
 Tác dụng tăng sinh lực:
Sâm Ngọc Linh có tác dụng tăng sinh lực trong thí nghiệm chuột bơi, làm
tăng sinh lực chống lại sự mệt mỏi, giúp phục hồi sức lực [2].
 Tác dụng sinh thích ứng:
Trong stress vật lý, cho chuột nhắt trắng uống sâm Ngọc Linh liều
100mg/kg có tác dụng làm tăng khả năng chịu đựng đối với nước nóng (37–
42oC) và lạnh (-5oC) làm kéo dài thời gian sống thêm của chuột thí nghiệm.
Trong stress cô lập, chuột nhắt trắng được nuôi riêng từng con trong 4 tuần, thời
gian ngủ khi tiêm natri barbital giảm đi 30%. Sâm Ngọc linh liều uống 50 – 100
mg/kg hoặc hoạt chất Majonoside R2 tiêm trong màng bụng liều 3,1; 12,5
mg/kg làm thời gian ngủ trở lại gần bình thường [2].
 Tác dụng chống oxy hóa:
Trên thí nghiệm in vitro dùng dịch nổi của dịch não, gan và phân đoạn vi
thể gan của mô não chuột và phân đoạn vi thể gan của chuột nhắt trắng, saponin
sâm Ngọc Linh ở nơng độ 0,05 – 0,5 mg/kg có tác dụng chống oxy hóa, ức chế
sự hình thành malondialdehyde là sản phẩm của q trình oxy hóa lipid màng
sinh học [2], [23], [34].

 Tác dụng kích thích miễn dịch:
Bột chiết sâm Ngọc Linh liều uống 500mg/kg và Majonoside R2 tiêm trong
màng bụng có tác dụng làm tăng chỉ số thực bào trong thí nghiệm in vitro và in
vivo ở chuột nhắt trắng [2]. Dùng liều Escherichia coli gây chết chuột nhắt
trắng. nếu kết hợp dùng sâm và Majonoside R2 với liều trên sẽ làm tăng tỷ lệ số
chuột sống sót. Có lẽ do thuốc làm tăng tác dụng thực bào với E. coli [2].

6


 Tác dụng phục hồi máu:
Trong thí nghiệm làm giảm hồng cầu và bạch cầu ở động vật thí nghiệm,
sâm Ngọc Linh có tác dụng làm phục hồi số lượng hồng cầu và bạch cầu đã bị
giảm [2].
 Tác dụng khác:
Sâm Ngọc Linh cịn có tác dụng tăng cường nội tiết tố sinh dục, điều hòa
hoạt động của tim, chống tăng cholesterol máu, chống viêm, chống đông máu và
ức chế sự phát triển của Streptococcus gây bệnh viêm họng ở người [2], [10],
[14], [15].
Theo Trần Lê Quân và cộng sự, dịch chiết methanol của sâm Ngọc Linh có
tác dụng bảo vệ gan do tác động lên D-galactosamine/yếu tố hoại tử (TNF-α)
[29], [30].

7


1.2. Tổng quan về Majonoside R2
1.2.1. Công thức cấu tạo và tính chất

Hình 1.2 Cơng thức cấu tạo của Majonoside R2

 Danh pháp IUPAC: (2S,3R,4S,5R)-2-[(2R,3R,4S,5S,6R)-2-[[(5R,6R,8S,
9R,10R,12S,13S,14S,17S)-3,12-dihydroxy-17-[(2S,5S)-5-(2-hydroxypropan-2yl)-2-methyloxolan-2-yl]-4,4,8,10,14-pentamethyl-2,3,5,6,7,9,11,12,13,15,16,17
-dodecahydro-1H-cyclopenta[a]phenanthren-6-yl]oxy]-4,5-dihydroxy-6(hydroxymethyl)oxan-3-yl]oxyoxane-3,4,5-triol
 Công thức phân tử: C41H70O14
 Khối lượng phân tử: 786,997 đvC
 Độ tan: Majonoside R2 tan được trong methanol, nước, butanol, ethanol.
1.2.2. Tác dụng của Majonoside R2
 Tác dụng chống ung thư
Majonoside R2 thể hiện tác dụng chống ung thư trên chuột bị ung thư gan
sử dụng N-nitrosodiethylamine làm chất gây ung thư [11].
Trong nghiên cứu của Takao Konoshima và cộng sự, Majonoside R2 cho
thấy tác dụng ức chế đối với kháng nguyên Epstein-Barr do khối u sinh ra và 12O-tetradecanoylphorbol-13-acetate (chất được sử dụng để sàng lọc hoạt chất
chống ung thư). Thử nghiệm được tiến hành trên chuột bị gây ung thư da bởi
7,12-dimethylbenz[a]anthracene [12]. Kết quả này cũng được Kazuo Yamazaki
đưa ra trong nghiên cứu của mình vào năm 2000 [33].
8


 Tác dụng chống oxy hóa
Majonoside R2 có tác dụng điều chỉnh nồng độ nito oxyd và glutathion
trong máu, đồng thời làm tăng nồng độ gama – aminobutyric acid từ đó bảo vệ
lớp màng lipid ở não trước tác động của các chất oxy hóa [8], [22].
Một nghiên cứu khác của Nguyễn Thị Thu Hương và cộng sự cũng cho
thấy Majonoside R2 có tác dụng chống oxy hóa tương tự vitamin E [21].
 Tác dụng bảo vệ gan
Majonoside R2 có tác dụng bảo vệ gan khỏi q trình apoptosis thơng qua
ức chế sản xuất yếu tố hoại tử khối u alpha (TNF-α) bằng các đại thực bào hoạt
hóa và ức chế trực tiếp tác dụng apoptosis gây ra bởi TNF-α [29].
 Tác dụng khác
Một số nghiên cứu chỉ ra rằng Majonoside R2 có tác dụng chống trầm cảm

[23], chống viêm [27] và giảm phản ứng khó chịu gây ra bởi opioid [24].
1.2.3. Phương pháp định tính và định lượng Majonoside R2
1.2.3.1.

Phương pháp sắc ký lớp mỏng

Tác giả Hoàng Hải Anh và cộng sự đã sử dụng phương pháp sắc ký lớp
mỏng để định tính 6 saponin chính của sâm Ngọc Linh trong đó có Majonoside
R2. Dịch chiết methanol của rễ củ sâm được phân tích trên bản mỏng silicagel
GF254 được hoạt hóa. Hệ dung mơi khai triển là hỗn hợp cloroform-methanolnước với tỷ lệ lần lượt là 65-35-10. Bản mỏng sau khi khai triển được phun
thuốc thử hiện màu là dung dịch acid sulfuric 20% trong ethanol 50% và sấy ở
105oC đến khi hiện màu. Mẫu thử được phân tích cùng mẫu chuẩn, kết quả sắc
ký đồ của dịch chiết sâm Ngọc Linh xuất hiện vết Majonoside R2 với Rf = 0,48
[1].
Lian-Wen Qi và cộng sự của mình cũng định tính và định lượng một số
saponin trong sâm Ngọc Linh như Ginsenoside Rh5, Vina-ginsenoside R25 và
đưa đến kết luận phương pháp sắc ký lớp mỏng rất hữu dụng cho việc định

9


lượng saponin trong sâm. Tuy nhiên, nhược điểm chính của phương pháp là độ
chính xác thấp và độ lặp lại kém [25].
1.2.3.2.

Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao

Shu Zhu và cộng sự công bố nghiên cứu năm 2004, tiến hành định lương
Majonoside R2 cùng nhiều saponin khác bằng phương pháp HPLC. Sử dụng cột
C18 (5µm; 250 x4,6mm) với pha động là dung dịch đệm phosphat 10mM pH

5,8 (A), acetonitril (B) và nước (C). Chương trình gradient dài 85 phút. Detector
quang phổ tử ngoại ở bước sóng 196nm. Mẫu bột rễ củ sâm được chiết với cồn
70o. Dung dịch chuẩn được pha với nồng độ 1mg/ml. Kết quả hàm lượng
Majonoside R2 trong sâm Ngọc Linh là 5,78% ±0,054% tính theo dược liệu khơ
kiệt. Phương pháp có độ thu hồi 97,5% và giới hạn phát hiện là 3µg/ml [28].
Năm 2011, Hồng Hải Anh và cộng sự tiến hành định lượng Majonoside
R2 bằng phương pháp HPLC. Bột dược liệu sau khi được chiết với methanol sẽ
được làm sạch bằng cột diaion HP-20 (2,5 x30cm) và rửa giải lần lượt bằng
nước, methanol và cloroform. Dịch methanol được tiêm vào hệ thống HPLC để
phân tích. Tác giả sử dụng cột Supelcosil C18 (150 x 4,6mm; 5,0µm). Pha động
là acetonitril và nước tỷ lệ 24 : 76. Detector mảng diod ở bước sóng 203 nm.
Đường chuẩn được xây dựng từ 0,8mg/ml đến 3,2mg/ml. Kết quả hàm lượng
Majonoside R2 trong rễ củ sâm Ngọc Linh là 5,97% [1]. Phương pháp tương tự
cũng được đề cập đến trong nghiên cứu của Nguyễn Đức Hạnh và cộng sự, tuy
nhiên khoảng tuyến tính được xây dựng từ 1,88mg/ml – 7,06mg/ml, hàm lượng
Majonoside R2 trong rễ củ sâm là 5,31% [17].
Dược điển Việt Nam V có chuyên luận về định lượng saponin trong sâm
Ngọc Linh. Theo đó, bột dược liệu sau khi được nghiền nhỏ và đồng nhất được
chiết với methanol 70% ở 30oC trong 40 phút. Dịch chiết được phân tích cùng
với dung dịch chuẩn Majonoside R2 với nồng độ 0,5mg/ml bằng hệ thống
HPLC. Cột được sử dụng là cột nhồi pha tĩnh C18 (5µm) với kích thước 15cm x
4,6mm. Hệ dung môi gồm acetonitril (A) và nước (B) với chế độ gradient: 0-11

10


phút: 21% A; 11-25 phút: 21-32% A; 25-35 phút: 32-40% A; 35-40 phút: 4095% A; 460-60 phút: 95% A; 60-61 phút: 95-21% A; 61-71 phút: 21% A.
Detector quang phổ tử ngoại ở bước sóng 196 nm. Hàm lượng Majonoside R2
khơng được thấp hơn 0,4% tính theo dược liệu khơ kiệt [3].
Các phương pháp định lượng bằng HPLC nêu trên đều có độ chính xác cao

và dễ thực hiện do sự phổ biến của thiết bị HPLC. Tuy nhiên, một số điểm
chung khác là thời gian phân tích dài (85 phút trong phương pháp của Shu Zhu,
71 phút trong chuyên luận Dược Điển Việt Nam V), nồng độ chất cần phân tích
lớn cỡ mg/ml và qui trình xử lý mẫu rất phức tạp, qua nhiều giai đoạn nên có thể
ảnh hưởng tới độ chính xác của kết quả định lượng.
1.2.3.3.

Phương pháp sắc ký lỏng khối phổ

Các nghiên cứu hiện tại chủ yếu sử dụng khối phổ như một công cụ để định
tính Majonoside R2 và các saponin khác như nghiên cứu của Hong-Ping Wang
và cộng sự năm 2015 [32], Juan Luu và cộng sự năm 2017 [16].
Một bài báo được công bố năm 2015 của tác giả Võ Hoàng Tùng và cộng
sự đã sử dụng phương pháp sắc ký lỏng khối phổ để định lượng Majonoside R2.
Mẫu dược liệu được nghiền nhỏ và đồng nhất, sau đó chiết bằng methanol 80%
trong 5 giờ. Quá trình sắc ký được tiến hành trên thiết bị Shimadzu, với cột tách
C18 (4µm; 150 x 4,6mm). Pha động gồm Acetonitril chứa 0,1% acid formic (A)
và nước (B). Gradient như sau: 0-2 phút: 0-5%A; 2-7 phút: 5-50%A; 7-15 phút:
50-80%A; 15-17 phút: 80-5%A; 17-20 phút; 5%A. Thiết bị sử dụng detector
khối phổ 3 tứ cực với chế độ ion hóa phun điện tử (ESI) và dải quét từ 50-2000
dalton. Kết quả hàm lượng Majonoside R2 trong sâm Ngọc Linh 5 năm tuổi là
8,088±0,05% [31].
Một ưu điểm dễ nhận thấy nhất của phương pháp sắc ký lỏng khối phổ là
thời gian phân tích nhanh. Tuy nhiên, phương pháp của tác giả chỉ dừng lại ở
nền mẫu dược liệu và detector khối phổ với chế độ quét toàn dải dễ bị ảnh
hưởng bởi nền mẫu.

11

Từ tổng quan tài liệu chưa có nghiên cứu nào tiến hành trên các chế phẩm
làm từ sâm Ngọc Linh.
1.2.4. Một số chế phẩm chứa sâm Ngọc Linh lưu hành trên thị trường
Bảng 1.1 Một số chế phẩm chứa sâm Ngọc Linh
STT

Tên sản phẩm

Nguồn gốc

1

Sâm Ngọc Linh gói bột

Cơng ty CPDP Boston Việt Nam

TPBVSK chiết xuất sinh khối

Công ty cổ phần đầu tư sâm Ngọc

sâm Ngọc Linh (Lọ)

Linh Việt Nam

TPBVSK chiết xuất sinh khối

Công ty cổ phần đầu tư sâm Ngọc

sâm Ngọc Linh (Vỉ)

Linh Việt Nam

2

3

Công ty cổ phần sâm Ngọc Linh Tu

4

Trà sâm Ngọc Linh hòa tan

5

TPCN Anti-U100

6

Viên ngậm sâm Việt Nam

7

Sâm Ngọc Linh viên nang mềm

8

Mơ Rông Kon Tum
Công ty CP Thọ Xuân Đường
Viện dược liệu - Trung tâm sâm và
dược liệu TP. Hồ Chí Minh

Cơng ty CPDP Boston Việt Nam

Sâm Ngọc Linh Đông Trùng Hạ Trung tâm nghiên cứu ứng dụng sản
Thảo

xuất TPCN Học viện Quân Y
Trung tâm nghiên cứu ứng dụng sản

9

Tỏi đen sâm Ngọc Linh

10

Tỏi đen cô đơn sâm Ngọc Linh

11

Kem Skginseng

xuất TPCN Học viện Quân Y
Công ty CPSPQT Canada Việt Nam
Trung tâm nghiên cứu ứng dụng sản
xuất TPCN Học viện Quân Y

12


1.3. Tổng quan về phương pháp sắc ký lỏng khối phổ
1.3.1. Phương pháp sắc ký lỏng

Sắc ký lỏng là quá trình tách xảy ra trên cột tách với pha tĩnh là chất rắn và
pha động là chất lỏng (sắc ký lỏng - rắn). Mẫu phân tích được chuyển lên cột
tách dưới dạng dung dịch. Cơ chế của quá trình sắc ký lỏng là hấp phụ, phân bố,
trao đổi ion hay loại trừ theo kích cỡ.
1.3.2. Detector khối phổ cho sắc ký lỏng
1.3.2.1.

Nguyên tắc

Khối phổ là kỹ thuật phân tích đo phổ về khối lượng của các phân tử tích
điện khi chúng di chuyển trong điện trường. Mẫu được ion hóa trở thành các
phân tử tích điện khác nhau và được phân tách dựa vào sự sai khác về giá trị m/z.
Hệ thống khối phổ thường gồm ba phần chính là nguồn ion, bộ phân tích
khối lượng và detector thu nhận tín hiệu.

Hình 1.3 Ngun lý hoạt động của sắc ký lỏng khối phổ
Trong sắc ký lỏng khối phổ, dòng mẫu sau khi ra khỏi cột được chuyển
sang dạng hơi qua kim phun nhờ khí N2, dưới tác dụng của điện trường, các
phân tử chuyển sang dạng ion âm hoặc dương và được đưa vào bộ phận phân
tách khối.

13


1.3.2.2.

Các nguồn ion hóa trong sắc ký lỏng khối phổ

Một số nguồn ion cho sắc ký lỏng khối phổ hiện nay là ion hóa phun điện
tử (ESI), ion hóa hóa học tại áp suất khí quyển (APCI), ion hóa quang học tại áp

suất khí quyển (APPI) và bắn phá nguyên tử nhanh (FAB). ESI hiện là phương
pháp được lựa chọn phổ biến cho các nghiên cứu do khả năng ion hóa mềm tạo
và chủ yếu tạo ra các ion phân tử. Nguồn ion APCI và APPI cũng ít tạo ra ion
phân mảnh và được sử dụng thay cho ESI trong phân tích các chất kém phân cực
và có độ ổn định cao như chất béo. Phạm vi áp dụng của của các nguồn ion được
tóm tắt trong hình [7].

Hình 1.4 Phạm vi áp dụng của các cơ chế ion hóa
1.3.2.3.

Bộ phận phân tích khối lượng

 Bẫy ion (Ion trap): Dựa vào sự kết hợp của điện trường và từ trường để
phân tách các ion có số khối khác nhau. Các bẫy ion có thể kết hợp với nhau tạo
ra khối phổ nhiều lần.
 Bộ phân tích từ (Magnetic sector): gồm thiết bị hội tụ đơn và hội tụ kép.
Thiết bị hội tụ kép có thể cho độ phân giải rất cao.

14


 Thời gian bay (TOF): Dựa trên thời gian bay khác nhau của các ion có số
khối khác nhau trong từ trường để phân tách các ion. Có 2 kiểu TOF là LinearTOF và Reflection-TOF, trong đó, Reflection-TOF có độ phân giải cao.
 Tứ cực (Quadrupole): là hệ thống gồm 4 điện cực, trong đó cứ 2 điện cực
đối nhau được tích điện giống nhau gồm một điện tích một chiều và một điện
tích xoay chiều. Sự thay đổi điện tích ở các tứ cực sẽ loại bỏ các ion khác và chỉ
để lại ion cần phân tích với số khối nhất định di chuyển qua tứ cực. Hiện nay có
hai loại tứ cực là: đơn tứ cực (single quadrupole) và ba tứ cực (triple
quadrupole). Hệ thống ba tứ cực có thể tạo ra phổ khối lượng hai lần. Ngồi ra,
tứ cực cịn có thể ghép nối với một bẫy ion hoặc bộ phân tích thời gian bay để

tạo ra phổ khối hai lần.
1.3.3. Ứng dụng phương pháp sắc ký lỏng khối phổ trong phân tích
1.3.3.1.

Ứng dụng trong định tính

Một số ứng dụng của phổ khối trong định tính hợp chất hữu cơ như:
 Định danh một chất bằng cách so phổ khối của chất đó với phổ khối của
chất chuẩn hoặc so với phổ trong ngân hàng phổ chuẩn.
 Xác định công thức nguyên của hợp chất hữu cơ từ giá trị m/z của ion
phân tử (phổi khối lượng độ phân giải cao).
 Xác định công thức cấu tạo của hợp chất nhờ việc bắn phá ion mẹ và phân
tích các ion con thu được.
1.3.3.2.

Ứng dụng trong định lượng

Ứng dụng của sắc ký lỏng khối phổ trong phân tích định lượng tương tự
như các phương pháp sắc ký lỏng khác. Có thể dùng một số phương pháp như:
So sánh, đường chuẩn, phương pháp thêm.

15


CHƯƠNG 2.

ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Đối tượng và phương tiện nghiên cứu
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu

 Chất chuẩn: Majonoside R2 (Viện kiểm nghiệm thuốc thành phố Hồ Chí
Minh; số kiểm sốt: Majo.Ref.012012; Hàm lượng: 98.86%)
 Chế phẩm:
Bảng 2.1 Chế phẩm chứa sâm Ngọc Linh dạng rắn
STT

Tên mẫu

Số lơ

R1

Sâm Ngọc Linh gói bột

020517

R2

Bột sâm Ngọc Linh

R3

R4

TPBVSK chiết xuất sinh
khối sâm Ngọc Linh (Lọ)
TPBVSK chiết xuất sinh
khối sâm Ngọc Linh (Vỉ)

Nguồn gốc

Công ty CPDP Boston Việt
Nam
Công ty Sao Thái Dương

050917

011216

R5

Trà sâm Ngọc Linh hịa tan

010517

R6

TPCN Anti-U100

181016

Cơng ty cổ phần đầu tư sâm
Ngọc Linh Việt Nam
Công ty cổ phần đầu tư sâm
Ngọc Linh Việt Nam
Công ty cổ phần sâm Ngọc
Linh Tu Mơ Rông Kon Tum
Công ty CP Thọ Xuân
Đường
Viện dược liệu - Trung tâm

R7

Viên ngậm sâm Việt Nam

0010418

sâm và dược liệu TP. Hồ Chí
Minh

Bảng 2.2 Chế phẩm chứa sâm Ngọc Linh dạng dầu
STT
N1

Tên mẫu
Sâm Ngọc Linh viên nang
mềm

Số lô
020517

16

Nguồn gốc
Công ty CPDP Boston Việt
Nam