PHẠM THANH HIỀN NGHIÊN cứu CHIẾT XUẤT, PHÂN lập và TINH CHẾ δ⁹ TETRAHYDROCANNABINOL từ cây cần SA làm NGUYÊN LIỆU THIẾT lập CHẤT CHUẨN LUẬN văn THẠC sĩ dƣợc học

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI

PHẠM THANH HIỀN

NGHIÊN CỨU CHIẾT XUẤT, PHÂN LẬP VÀ
TINH CHẾ Δ9-TETRAHYDROCANNABINOL TỪ
CÂY CẦN SA LÀM NGUYÊN LIỆU THIẾT LẬP
CHẤT CHUẨN

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƢỢC HỌC

HÀ NỘI - 2019


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI

PHẠM THANH HIỀN

NGHIÊN CỨU CHIẾT XUẤT, PHÂN LẬP VÀ
TINH CHẾ Δ9-TETRAHYDROCANNABINOL TỪ
CÂY CẦN SA LÀM NGUYÊN LIỆU THIẾT LẬP
CHẤT CHUẨN
LUẬN VĂN THẠC SĨ DƢỢC HỌC

CHUYÊN NGÀNH: KIỂM NGHIỆM THUỐC VÀ ĐỘC CHẤT
MÃ SỐ: 8720210

Ngƣời hƣớng dẫn khoa học:1. TS Trần Nguyên Hà
2. PGS.TS Nguyễn Xuân Trƣờng

HÀ NỘI - 2019


LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành luận văn này, tôi xin tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến PGS.TS.Nguyễn
Xuân Trƣờng – Giám đốc Trung tâm giám định ma túy, Viện Khoa học hình sự và
TS.Trần Nguyên Hà – Trƣởng Bộ môn Kiểm Nghiệm Thuốc và Độc chất – Trƣờng
Đại học Dƣợc Hà Nội, ngƣời đã trực tiếp hƣớng dẫn và tạo điều kiện cho tôi trong suốt
quá trình thực hiện luận văn này.
Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô trong Bộ môn Kiểm nghiệm Thuốc và
Độc chất- Trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội đã tận tình giảng dạy, truyền đạt tri thức giúp
tôi có thể áp dụng vào thực nghiệm để hoàn thành luận văn này.
Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn đến ThS. Nguyễn Đức Trọng và các anh chị ở
Trung tâm Giám định ma túy- Viện Khoa học hình sự đã hỗ trợ, tạo điều kiện thuận lợi
và phối hợp giúp tôi trong quá trình thực hiện đề tài. Những kinh nghiệm và kỹ năng
học hỏi đƣợc đã góp phần giúp tôi thực nghiệm chính xác và thực tế hơn.
Cuối cùng tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè và những
ngƣời thân đã luôn ở bên động viên, cổ vũ và giúp tôi hoàn thành đƣợc khóa học này.
Hà Nội, ngày 06 tháng 04 năm 2019

Dƣợc sĩ Phạm Thanh Hiền

MỤC LỤC
Trang
ĐẶT VẤN ĐỀ .................................................................................................................1
Chƣơng 1 TỔNG QUAN.................................................................................................3
1.1. Tổng quan đối tƣợng nghiên cứu.............................................................................. 3
1.1.1. Tên khoa học và đặc điểm thực vật ................................................................ 3
1.1.2. Thành phần hóa học trong cần sa ................................................................... 4
1.1.3. Sử dụng cần sa ................................................................................................ 8
1.2. Tổng quan về phƣơng pháp chiết xuất, phân lập và tinh chế ................................... 9
1.2.1. Các phƣơng pháp chiết xuất, phân lập và tinh chế ......................................... 9
1.2.2. Các nghiên cứu về chiết xuất, phân lập THC ............................................... 10
1.2.3. Các nghiên cứu tinh chế THC ...................................................................... 15
1.3. Phân tích định tính, định lƣợng cannabinoids trong cây cần sa ............................. 16
1.4. Một số phƣơng pháp hóa lý dùng trong đề tài........................................................ 18
1.4.1. Sắc kí lớp mỏng ............................................................................................ 18
1.4.2. Sắc kí cột ....................................................................................................... 19
1.4.3. Sắc kí lỏng khối phổ ..................................................................................... 19
1.4.4. Sắc kí khí ...................................................................................................... 20
Chƣơng 2 ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..................................22
2.1. Nguyên liệu............................................................................................................. 22
2.2. Phƣơng tiện, dụng cụ .............................................................................................. 22
2.2.1. Thiết bị, dụng cụ ........................................................................................... 22
2.2.2. Chất chuẩn và dung môi hóa chất ................................................................. 22
2.3. Nội dung nghiên cứu .............................................................................................. 23
2.3.1. Chiết xuất, phân lập, tinh chế ....................................................................... 23
2.3.2. Xác định cấu trúc, nhận dạng THC tinh chế đƣợc ....................................... 23


2.3.3. Xây dựng và thẩm định quy trình định lƣợng THC tinh chế bằng
LC-MS/MS ............................................................................................................. 23

2.4. Phƣơng pháp nghiên cứu ........................................................................................ 23
2.4.1. Phƣơng pháp chiết xuất THC từ nguyên liệu cần sa .................................... 23
2.4.2. Phân lập, tinh chế THC ................................................................................. 24
2.4.3. Định tính, xác định cấu trúc của THC tinh chế đƣợc ................................... 26
2.4.4. Xây dựng và thẩm định phƣơng pháp định lƣợng THC tinh chế bằng
LC-MS/MS. ............................................................................................................ 26
2.4.5. Xử lí kết quả ................................................................................................. 27
Chƣơng 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ...........................................................................29
3.1. Xây dựng phƣơng pháp định lƣợng THC bằng LC-MS/MS .................................. 29
3.1.1. Khảo sát điều kiện khối phổ ......................................................................... 29
3.1.2. Khảo sát và lựa chọn điều kiện sắc kí.......................................................... 31
3.1.3. Kết luận về điều kiện sắc kí .......................................................................... 34
3.2. Khảo sát điều kiện chiết xuất.................................................................................. 34
3.2.1. Khảo sát nhiệt độ sấy .................................................................................... 34
3.2.2. Khảo sát thời gian sấy................................................................................... 38
3.2.3. Khảo sát dung môi chiết ............................................................................... 39
3.2.4. Kết luận về điều kiện chiết xuất ................................................................... 40
3.3. Phân lập THC từ dịch chiết cần sa ......................................................................... 41
3.3.1. Khảo sát lựa chọn hệ dung môi trên sắc kí bản mỏng .................................. 41
3.3.2. Phân lập CBD ra khỏi hỗn hợp THC, CBN.................................................. 43
3.3.3. Phân lập THC ra khỏi hỗn hợp THC, CBN .................................................. 45
3.3.4. Tinh chế THC bằng sắc kí lỏng điều chế (PHPLC) ..................................... 47
3.4. Xác định cấu trúc THC tinh chế bằng NMR, MS, IR ............................................ 49
3.4.1. Kết quả phổ NMR ......................................................................................... 49
3.4.2. Kết quả phổ IR .............................................................................................. 52


3.4.3. Kết quả phổ MS ............................................................................................ 53
3.5. Thẩm định phƣơng pháp định lƣợng THC trong mẫu tinh chế bằng LC-MS/MS.53
3.5.1. Chuẩn bị mẫu ................................................................................................ 53

3.5.2. Độ thích hợp hệ thống .................................................................................. 54
3.5.3. Độ đặc hiệu ................................................................................................... 54
3.5.4. Khoảng tuyến tính......................................................................................... 56
3.5.5. Độ chụm........................................................................................................ 58
3.5.6. Giới hạn định lƣợng ...................................................................................... 60
3.6. Xác định tạp liên quan trong mẫu THC tinh chế .................................................... 61
Chƣơng 4 BÀN LUẬN ..................................................................................................66
4.1. Về qui trình chiết xuất, phân lập và tinh chế THC từ dƣợc liệu ............................ 66
4.2. Xác định cấu trúc, nhận dạng chất tinh chế đƣợc................................................... 67
4.3. Về định tính, định lƣợng THC tinh chế đƣợc bằng LC-MS/MS ............................ 67
4.4. Về xây dựng phƣơng pháp xác định tạp liên quan bằng LC-MS/MS .................... 68
4.5. Ý nghĩa thực tiễn của đề tài .................................................................................... 68
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ....................................................................................... 70


CÁC KÝ HIỆU VIẾT TẮT
Kí hiệu

Tiếng Anh

8

Δ8- Tetrahydrocannabinol

Δ -THC
AOAC

Tiếng Việt/Tên khoa học

Association of Official

Analytical Chemists

Hiệp hội phân tích hóa học

CBC

Cannabichromene

CBCA

Acid cannabichromenic

CBD

Cannabidiol

CBDA

Acid cannabidiolic

CBG

Cannabigerol

CBGA

Acid cannabigerolic

CBN

Cannabiniol

CBNA

Acid cannabinolic

DAD

Diode Array Detector

Đầu dò diod mảng

GC

Gas chromatography

Sắc kí khí

HPLC

High-performance liquid
chromatography

Sắc kí lỏng hiệu năng cao

IR

Infrared Spectroscopy

Quang phổ hồng ngoại

LOQ

Limit of Quantitation

Giới hạn định lƣợng

MS

Mass spectrometry

Khối phổ

LLE

TB

Trung bình
9

THC

Δ -Tetrahydrocannabinol

THCA

Acid tetrahydrocannabinolic A

THCB

Acid tetrahydrocannabinolic B

USP

United States Pharmacopoeia

Dƣợc điển Mỹ

PHPLC

Preparative High Performance
Liquid Chromatography

Sắc kí lỏng điều chế

PA

Pure Analysis

Tinh khiết phân tích

S/N

Signal to noise ratio

Tỷ lệ tín hiệu trên nhiễu

SPE

Solid Phase Extraction

Chiết pha rắn

RSD

Relative Standard Deviation

Độ lệch chuẩn tƣơng đối


DANH MỤC BẢNG
Trang
Bảng 1.1 Các thành phần Cannabinoids có ý nghĩa trong khoa học hình sự ..................5
Bảng 1.2 Điều kiện phân lập bằng sắc kí cột ................................................................12
Bảng 1.3 Điều kiện decarboxyl hóa ..............................................................................14
Bảng 1.4 Điều kiện tinh chế bằng sắc kí lỏng điều chế.................................................16
Bảng 1.5 Một số điều kiện chạy LC/MS .......................................................................17
Bảng 1.6 Một số hệ dung môi chạy sắc kí lớp mỏng ....................................................18
Bảng 3.1. Điều kiện khối phổ của chất phân tích ..........................................................29
Bảng 3.2. Điều kiện khảo sát pha động rửa giải THC ...................................................31
Bảng 3.3 Kết quả hàm lƣợng THC khi khảo sát nhiệt độ sấy .......................................35
Bảng 3.4 Kết quả hàm lƣợng THC khi khảo sát thời gian sấy ......................................38
Bảng 3.5. Kết quả hàm lƣợng THC khi khảo sát dung môi chiết .................................39
Bảng 3.6. Kết quả phân lập CBD giai đoạn 1 ...............................................................44
Bảng 3.7 Kết quả phân lập THC ở giai đoạn 2 .............................................................46
Bảng 3.8. Dữ liệu phổ của THC tinh chế và Δ9-tetrahydrocannabinol .........................50
Bảng 3.9. Kết quả sắc ký thẩm định độ thích hợp hệ thống ..........................................54
Bảng 3.10. Kết quả sắc ký thẩm định khoảng tuyến tính ..............................................56
Bảng 3.11. Kết quả tính độ chệch từng điểm ................................................................57
Bảng 3.12. Kết quả hàm lƣợng mẫu thử khi thẩm định độ lặp lại ................................58

Bảng 3.13. Kết quả thẩm định độ thu hồi ......................................................................60
Bảng 3.14. Điều kiện khối phổ 2 chất CBD, CBN ........................................................61
Bảng 3.15. Các tạp liên quan dung dịch thử..................................................................64


DANH MỤC HÌNH
Trang
Hình 1.1Mối quan hệ các thành phần chính trong cây cần sa ........................................8
Hình 1.2 Hệ thống máy UPLC-MS/MS Brucker ..........................................................20
Hình 3.1 Phổ khối MS/MS với mảnh mẹ 315.2 ............................................................30
Hình 3.2 Phổ khối MS/MS với mảnh ion định lƣợng của THC ....................................30
Hình 3.3 Phổ khối MS/MS với mảnh ion định tính của THC .......................................31
Hình 3.4 Chƣơng trình pha động ...................................................................................33
Hình 3.5 Chƣơng trình ...................................................................................................33
Hình 3.6 Chƣơng trình pha động ...................................................................................33
Hình 3.7 Chƣơng trình pha động ...................................................................................33
Hình 3.8 Chƣơng trình pha động ...................................................................................33
Hình 3.9. Sắc kí đồ của THCA trong các mẫu (tR=5,4) ................................................36
Hình 3.10. Sắc kí đồ của CBN ở các nhiệt độ sấy.........................................................37
Hình 3.11 Sắc ký đồ Thành phần dịch chiết n-hexan ....................................................40
Hình 3.12 Biểu đồ phân lập CBD giai đoạn 1 ...............................................................45
Hình 3.13. Biểu đồ phân lập THC giai đoạn 2 ..............................................................46
Hình 3.14 Thành phần dịch phân lập cuối .....................................................................47
Hình 3.15 Sắc kí đồ tinh chế .........................................................................................48
Hình 3.16. Quy trình chiết xuất, phân lập và tinh chế THC từ cây cần sa ....................49
Hình 3.17. Phổ IR của chất chuẩn THC ........................................................................52
Hình 3.18. Phổ IR của mẫu tinh chế ..............................................................................52
Hình 3.19 Sắc ký đồ LC-MS của mẫu tinh chế bắn phá mức năng lƣợng 10eV ..........53
Hình 3.20. Sắc ký đồ LC-MS của mẫu chuẩn bắn phá mức năng lƣợng 10eV ............53
Hình 3.21. Sắc ký đồ thẩm định độ đặc hiệu .................................................................55

Hình 3.22. Đƣờng chuẩn và phƣơng trình hồi qui khoảng tuyến tính ..........................57
Hình 3.23 Sắc kí đồ thẩm định giới hạn định lƣợng .....................................................61
Hình 3.24. Sắc kí đồ CBN trong dung dịch thử ............................................................62
Hình 3.25. Sắc kí đồ của CBN trong dung dịch đối chiếu ............................................62
Hình 3.26 Sắc kí đồ CBD trong dung dịch thử .............................................................63
Hình 3.27. Sắc kí đồ tạp liên quan của dung dịch thử ...................................................65



ĐẶT VẤN ĐỀ
Tệ nạn ma túy là hiểm họa đối với toàn xã hội, gây tác hại cho sức khỏe, là
nguyên nhân dẫn đến nhiều loại tội phạm khác. Cùng với sự gia tăng của tệ nạn ma
túy thế giới, những năm qua, tệ nạn ma túy nƣớc ta cũng tăng lên. Cần sa và các sản
phẩm của cần sa đƣợc trồng, sản xuất và buôn bán bất hợp pháp tại nhiều quốc gia,
chiếm 65% tổng số vụ bắt giữ ma túy trên thế giới (1.65 triệu vụ) thu giữ 5200 tấn
cây cần sa và 1000 tấn nhựa cần sa năm 2006.Năm 2006, hiện có hơn 160 triệu
ngƣời trên thế giới sử dụng cần sa thƣờng xuyên và hiện vẫn có xu hƣớng gia tăng
[27]. Những năm gần đây ở Việt Nam, theo thống kê của Bộ Công an năm 2015, tỷ
lệ sử dụng cần sa ở nƣớc ta chiếm khoảng 1,6-2% số ngƣời nghiện nhƣng tình hình
sử dụng cần sa trong nhóm thanh thiếu niên ngày càng phổ biến hơn.Thời gian gần
đây, cần sa lại đƣợc buôn bán dƣới nhiều hình thức: buôn bán công khai qua mạng
hay đƣợc trồng trong vƣờn ngay tại các ngôi nhà trong thành phố.
Theo quy định tại Bộ Luật Hình sự Việt Nam 2015, tất cả các mẫu thu giữ
nghi là ma túy đều phải giám định. Trong quy trình giám định, hầu hết các phƣơng
pháp đều cần dùng đến chất chuẩn.
Hoạt chất chính trong cần sa là Δ9-Tetrahydrocannabinol (THC). Chính hoạt
chất đó làm cho ngƣời sử dụng cần sa có cảm giác hƣng phấn, tinh thần lên cao; khi
dùng liều cao sẽ gây ảo giác; sử dụng lâu dài gây ra rối loạn tâm thần [47]. Để xác
định và kết luận giám định là cần sa, ngoài giám định đặc điểm thực vật học, cần
phân tích hàm lƣợng THC trong mẫu vật. Đến nay, Trung tâm giám định ma túy,

Viện Khoa học hình sự đã thiết lập đƣợc một số chất chuẩn nhƣng chuẩn THC vẫn
phải mua ở nƣớc ngoài với giá cao, thủ tục phức tạp và không chủ động trong công
tác giám định tƣ pháp.
Nhƣ vậy, với nhu cầu thực tiễn đòi hỏi có chất chuẩn phục vụ cho công tác
giám định nên chúng tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu chiết xuất, phân lập và
tinh chế Δ9-tetrahydrocannabinol từ cây cần sa làm nguyên liệu thiết lập chất
chuẩn” với các mục tiêu:

1


- Chiết xuất, phân lập, tinh chế Δ9-tetrahydrocannabinol từ cây cần sa có hàm lƣợng
tối thiểu 95% làm nguyên liệu thiết lập chất chuẩn.
- Nhận dạng, xác định cấu trúc và xác định tạp liên quan của Δ9tetrahydrocannabinol tinh chế đƣợc.
- Xây dựng và thẩm định quy trình định lƣợng Δ9-tetrahydrocannabinol trong mẫu
tinh chế.

2


Chƣơng 1 TỔNG QUAN
1.1. Tổng quan đối tƣợng nghiên cứu
1.1.1. Tên khoa học và đặc điểm thực vật
Cây cần sa có tên khoa học là: Canabis sativa, Họ Cần sa (Cannabaceae) [15]
❖ Phân loại theo thực vật học [15]
Ngành -Tracheophyta
Phân ngành-Pteropsida
Lớp-Angiospermae
Phân lớp-Vrticales
Bộ-Dicotyledoneae

Họ -Cannabaceae
Chi - Cannabis
❖ Đặc điểm thực vật học
Cần sa là một loài cây thân thảo, thân mọc thẳng đứng có thể cao tới 0.2 –
6m nhƣng phổ biến nhất cây cao từ 1 – 3 m [2],[15], [34], . Chiều cao cây, độ phân
nhánh phụ thuộc yếu tố môi trƣờng, di truyền và phƣơng pháp canh tác [12].
Lá cây màu xanh đậm, có răng cƣa, thô ráp cả hai mặt. Cặp lá đầu tiên chỉ có
một lá chét, số lƣợng lá chét tăng dần, tối đa là 13 lá chét trên mỗi lá, phụ thuộc vào
giống và điều kiện sinh trƣởng.Cặp lá bên dƣới thƣờng mọc đối trong khi cặp lá
phía trên mọc so le [41].
Cần sa là loài cây lƣỡng tính hoặc hoa đơn tính khác gốc [3]. Các hoa cái mọc
theo chùm gồm một trục chính là hoa lớn và nhánh là các hoa nhỏ. Các hoa đực
mọc thành các chùy hoa lỏng lẻo [15]. Cây đực thƣờng cao hơn nhƣng không sum
suê bằng cây cái [34].
Hạt cần sa có hình dạng bầu dục và hơi dẹt, màu xanh lục hoặc xám. Khi chín
hạt đổi màu thành nâu nhạt hoặc nâu [34]. Hạt không có nội nhũ, chứa nhiều dầu
[3]. Quả có chứa một hạt giống gồm hai lá mầm, phần lớn là chứa các chất dự trữ
[12].

3


❖ Trồng và thu hoạch cần sa
Nếu ngƣời trồng không loại bỏ những cây đực và cây lƣỡng tính (bao gồm cả
hoa đực và hoa cái) thì khi hoa đực trƣởng thành sẽ bung túi phấn ra. Phấn hoa
trong tự nhiên theo gió đến với hoa của cây cái. Hoa cái sau khi nhận đƣợc phấn sẽ
thụ phấn và tạo hạt đến cuối vụ ngƣời trồng sẽ thu hoạch đƣợc hạt cần sa và những
bông hoa nhỏ do hoa tập trung vào thụ phấn mà không phát triển hoa.
Trên thế giới hiện nay, cần sa đƣợc trồng theo hai phƣơng thức chính: ngoài
trời hoặc trong nhà. Để tăng hàm lƣợng THC trong cây:đối với cần sa trồng ngoài

trời thƣờng đƣợc áp dụng kỹ thuật ngăn không cho hoa cái thụ phấn để không tạo
hạt; nếu trồng cần sa trong nhà thì kiểm soát các yếu tố: nhiệt độ, pH đất, môi
trƣờng (ánh sáng, khí) và kết hợp dùng kỹ thuật nhân giống[43] .
Phần lớn những giống cần sa hiện nay có thời điểm thu hoạch vào khoảng
tháng 5 hoặc tháng 10 hàng năm. Trên cây cần sa, lá hoa và quả là những phần
chính chứa hoạt chất tác dụng lên hệ thần kinh đƣợc gọi là “những phần chứa ma
túy”. Khi những bông hoa chuyển thành màu lốm đốm, cánh hoa quăn dần rồi
chuyển màu nâu là dấu hiệu báo hiệu đã đến lúc thu hoạch cần sa.
1.1.2. Thành phần hóa học trong cần sa
Có khoảng 20 nhóm hợp chất trong cây cần sa, trong đó có 3 nhóm hợp chất
chính là: Cannabinoids, Flavonoids, Terpenoid [15]. Thành phần Terpenoids và
Flavonoids có ảnh hƣởng đến hoạt tính sinh học của nhóm Cannabinoids trong cây
cần sa [34].
 Tổng quan về nhóm hợp chất Cannabinoids
Mechoulam và Gaoni (1967) định nghĩa Cannabinoids là: nhóm các hợp chất
21C có ở hầu hết ở các loài Canabis, bao gồm các dạng: trung tính, acid carboxylic
(dạng A, B), các đồng phân và các sản phẩm chuyển hóa của chúng[11], [12].
Cannabinoids là thành phần hoạt tính sinh học chính của cây cần sa [26].
Hầu hết các bộ phận trong cây đều chứa Cannabinoids có nhiều trong lá và hoa
nhƣng hạt không có thành phần này [11], [12].

4


Phân loại dựa theo cấu trúc hóa học có thể chia ra thành 10 nhóm:
Cannabigerol,

Cannabichromene,

Delta-8-tetracannabinol,

Cannabidiol,

Cannabicycol,

Delta-9-tetrahydrocannabinol,

Cannabielsoin,

Cannabinol

và

cannabinodiol, Cannabitrol và nhóm khác.
Trong đó, hợp chất ∆9-Tetrahydrocannabinol (THC) thuộc nhóm Delta-9tetrahydrocannabiol,có hoạt tính chính trên thần kinh trung ƣơng. Hàm lƣợng THC
có trong cây phụ thuộc vào tính di truyền, điều kiện nuôi trồng, khí hậu, đất và số
năm trồng [34].
Các bộ phận khác nhau thì hàm lƣợng ∆9-Tetrahydrocannabinol (THC) cũng
có sự khác nhau, giảm theo thứ tự: nhựa, hoa, lá và ít có trong rễ, thân. Trong hoa
cái có 10-12% THC, lá có 1-2% THC và thân 0,1-0,3%.
THC trong cây có hai dạng chính: dạng acid và dạng trung tính. THCA có
thể chuyển hóa thành THC dƣới tác động của nhiệt độ.
Trong ngành khoa học hình sự một số thành phần Cannabinoids đƣợc coi là
đối tƣợng trong giám định đƣợc trình bày ở bảng 1.1
Bảng 1.1 Các thành phần Cannabinoids có ý nghĩa trong khoa học hình sự
Tên hợp chất và công thức

∆9-Tetrahydrocannabinol
THC

Đặc điểm và tính chất
Công thức phân tử: C21H30O2
Khối lƣợng phân tử: 314,46 g/mol
Tên khoa học:
(6aR)-6,6,9-trimethyl-3-pentyl-6a,7,8,10atetrahydrobenzo[c] chromen-1-ol
Thuộc nhóm Delta-9- tetrahydrocannabiol
Là chất bán rắn màu nâu, chất lỏng
nhớt, hoặc là chất rắn màu vàng.
Không tan trong nƣớc (2,8 g/l ở 230C),
Tan tốt trong Ethanol, Chloroform,
Hexan. logP = 3.78 – 7.6 [10].
Nhiệt độ nóng chảy: 155-157°C ở áp
suất 0.05 mmHg.
Khối lƣợng phân tử: 314.469 g/mol
pka= 10.6
Năng suất quay cực: [α]=-150,5 (dung
5


dịch trong Ethanol) .
Phổ hấp thụ UV có 2 cực đại ở 282 nm
và 276 nm .
Dƣợc lý: giảm đau kháng viêm, chống
nôn.
∆9-acid tetrahydrocannabinolic
THCA

Công thức phân tử: C22H30O4
Khối lƣợng phân tử: 358 g/mol
Thuộc nhóm Delta-9- tetrahydrocannabiol

Gần nhƣ không tan trong nƣớc, tan tốt
trong dung môi ethanol, chloroform, hexan
Dƣợc lý: Kháng khuẩn, kháng sinh

Cannabinol, CBN
Công thức phân tử: C21H26O2
Khối lƣợng phân tử: 310,43 g/mol
Thuộc nhóm Cannabinol và
cannabinodiol
Gần nhƣ không tan trong nƣớc, tan tốt
trong dung môi ethanol, chloroform, hexan

Cannabidiol, CBD

Công thức phân tử: C21H30O2
Khối lƣợng phân tử: 314,46 g/mol
Thuộc nhóm Cannabinol và
cannabinodiol
Gần nhƣ không tan trong nƣớc, tan tốt
trong dung môi ethanol, clorofrom, hexan.

Cannabigerol, CBG
-

Công thức: C21H32O2
Khối lƣợng phân tử: 316,48 g/mol
Thuộc nhóm Cannabicycol

6

Các hợp chất trên có mối quan hệ với nhau thông qua 3 quá trình (hình 1.1) [27]:
 Quá trình sinh tổng hợp.
 Quá trình dercarboxyl hóa.
 Quá trình thoái hóa nhƣ: oxy hóa, đồng phân hóa hay tác động của ánh sáng.
CBGA nhờ các enzyme synthase (THCA, CBDA synthase) tạo thành dạng
acid phổ biến trong cây là THCA, CBDA. Các dạng acid này có thể bị decarboxyl
hóa thành dạng trung tính dƣới tác động của nhiệt độ, ánh sáng và các yếu tố khác
tạo các sản phẩm THC, CBDtƣơng ứng. THC sẽ bị oxy hóa tạo CBN, đồng phân
hóa tạo Δ8-Tetrahydrocannabinol (Δ8-THC).
Dựa vào thành phần hóa học đặc trƣng trên chia thành hai loại cần sa sợi và
cần sa ma túy [19], [24], [40]. Ngƣời ta phân biệt hai loại cần sa trên dựa vào tỉ lệ
hàm lƣợng THC và CBD. Bởi vì THC bị oxy hóa một phần thành CBN, nên tổng
diện tích píc của THC và CBN đƣợc sử dụng và đƣợc chia cho diện tích của CBD .
[

]
[

[

]
]

[THC]: diện tích pic của THC trên sắc kí đồ
[CBN]: diện tích pic của CBN trên sắc kí đồ
[CBD]: diện tích pic của CBD trên sắc kí đồ
Hệ thống phân loại của Grlic:
+ X ≥ 1: Cần sa ma túy: hàm lƣợng THC cao, CBD thấp.
+ X ≤ 1: Cần sa lấy sợi (hay đƣợc gọi là cây gai dầu): hàm lƣợng THC thấp, CBD

cao.
Hiện nay, châu Âu quy định đối với cần sa lấy sợi thì hàm lƣợng THC ≤
0,2% còn ở Châu Âu và Canada ≤ 0,3%.

7


Hình 1.1 Mối quan hệ các thành phần chính trong cây cần sa [36]
1.1.3. Sử dụng cần sa [43]
Theo Nghị định 73/2018/NĐ-CP quy định các danh mục chất ma túy và tiền
chất thì cần sa và các chế phẩm trong cần sa đều thuộc danh mục các chất ma túy
cấm sử dụng dƣới mọi hình thức.Các sản phẩm buôn bán trái phép bao gồm: nhựa
cần sa, cây cần sa.
8


Cây cần sa
Các bộ phận nụ hoa và các lá gần nụ hoa chứa một lƣợng đáng kể THC và
chúng đƣợc gọi là “những bộ phận chứa ma túy”. Chế phẩm sẽ đƣợc sàng tách bỏ
hết tất cả các phần thân, chỉ giữ lại các hạt hoa và nụ hoa cần sa là những phần chứa
khá giàu hàm lƣợng THC. Chế phẩm có thể ở dạng bột hoặc bánh .
Nhựa cần sa (Hashish)
Nhựa cần sa đƣợc tiết ra trong các tuyến túm lông mọc theo hàng ở hoa hay
bề mặt trên của lá, chứa một hàm lƣợng lớn THC so với phần khác của cây cần sa.
Có nhiều cách để lấy nhựa từ cây cần sa: đập, ép, hay từ máy li tâm “pollinator”
1.2. Tổng quan về phƣơng pháp chiết xuất, phân lập và tinh chế
1.2.1. Các phƣơng pháp chiết xuất, phân lập và tinh chế
Chiết xuất [8]
Chiết xuất có vai trò quan trọng trƣớc hết để lấy các chất cần thiết có trong
dƣợc liệu dƣới dạng toàn phần hoặc đơn chất cho mục đích nghiên cứu cụ thể.

Phƣơng pháp chiết xuất hoạt chất trong dƣợc liệu bao gồm cả việc chọn dung
môi chiết, dụng cụ chiết và phƣơng pháp chiết.
Có nhiều cách phân loại phƣơng pháp chiết xuất dựa vào các yếu tố khác nhau:
- Căn cứ vào nhiệt độ: Chiết nóng; Chiết nguội
- Căn cứ chế độ làm việc: Phƣơng pháp chiết gián đoạn; Phƣơng pháp chiết bán liên
tục; Phƣơng pháp chiết liên tục
- Căn cứ vào chuyển động tƣơng hỗ giữa hai pha: Phƣơng pháp chiết ngƣợc dòng;
Phƣơng pháp chiết xuôi dòng; Phƣơng pháp chiết chéo dòng.
- Căn cứ vào áp suất làm việc: Phƣơng pháp chiết ở áp suất thƣờng (áp suất khí
quyển); Phƣơng pháp chiết ở áp suất giảm (áp suất chân không); Phƣơng pháp chiết
ở áp suất cao (chế độ làm việc có áp lực).
- Căn cứ vào trạng thái làm việc của hai pha: Phƣơng pháp ngâm; Phƣơng pháp
ngấm kiệt.

9


- Dựa vào biện pháp kỹ thuật đặc biệt: Phƣơng pháp dùng siêu âm; Phƣơng pháp
khí hóa lỏng; Phƣơng pháp tạo lốc xoáy.
Phân lập và tinh chế [45]
Để phân lập và tinh chế các hợp chất thiên nhiên, các quy trình sau thƣờng
đƣợc sử dụng:
- Tách các phân đoạn bằng hệ dung môi có độ phân cực khác nhau, không hòa lẫn
vào nhau chia thành hai phân đoạn: nhóm tan trong nƣớc và không tan trong nƣớc.
- Tách các phân đoạn bằng sắc kí cột: silicagel hoặc sắc kí cột nhiều lần với chất
hấp phụ nhƣ: sephalex LH-20, silicagel, polyamid…
- Tách bằng sắc kí lỏng điều chế: MPLC, HPLC.
Sắc kí lỏng điều chế có khả năng tách các chất có cấu trúc tƣơng tự nhau,
những hợp chất khó tách bằng sắc kí cột thƣờng. Nhƣng có một nhƣợc điểm của
phƣơng pháp sắc kí lỏng là không tách đƣợc lƣợng mẫu lớn, lƣợng mẫu hàng

miligam đến vài gam tùy thuộc vào thiết bị và đối tƣợng mẫu.
1.2.2. Các nghiên cứu về chiết xuất, phân lập THC
Cannabioids tồn tại trong cây có hai dạng chính là dạng acid và trung tính.
THCA phân cực và dễ bị decarboxyl thành THC. Hiện có hai hƣớng để phân lập
đƣợc THC tinh khiết:
-

Phương pháp A: Phân lập THC từ cây cần sa.

-

Phương pháp B: Phân lập THCA rồi decarboxyl hóa thành THC.

1.2.2.1. Chiết xuất và phân lập THC từ cây cần sa (Phƣơng pháp A)
 Các nghiên cứu về chiết xuất cần sa
Hai kỹ thuật chiết xuất phổ biến đối với cần sa là: chiết pha rắn (SPE) và chiết
lỏng – lỏng (LLE). Đây là những kĩ thuật thông dụng đƣợc sử dụng xử lí mẫu cần sa
để định lƣợng. Trong phân lập, các tác giả hay dùng kĩ thuật chiết xuất đơn giản là
ngâm ở nhiệt độ phòng.
Dung môi đƣợc sử dụng phổ biến bao gồm các dung môi phân cực nhƣ
methanol [13], [37], ethanol [13], [37], chloroform [28], [30], [37], [38] ; các dung

10


môi ít phân cực hơn nhƣ benzen [22], [37], ether dầu hỏa [14], [37], và n-hexane
[14], [20], [22], [37], [46], hỗn hợp dung môi MeOH/CHCL3 (9:1) [12], [13], [19]
và các dung môi khác: aceton, toluene, methyllen clorua [40]. Dung môi không
phân cực thích hợp cho quá trình chiết xuất là các alkan thẳng và phân nhánh, cụ thể
là pentane, hexan, heptan, octan và nonan .

Dung môi ethanol (EtOH) có hiệu suất chiết cao do EtOH có ái lực cao với cấu
trúc phân tử cannabinoid. Chiết xuất bằng EtOH 96% (v/v) đã đƣợc đề xuất trong
một dự thảo chuyên đề Cannabis Flos của Dƣợc điển Đức [17].
Các dung môi chiết không phân cực nhƣ n-hexan hoặc ether dầu hỏa có thể chiết
đƣợc chủ yếu các dạng trung tính còn các dung môi khác có thể chiết đƣợc cả dạng
acid và trung tính [16], [40].
 Các nghiên cứu về phân lập THC
Năm 1964, Gaoni và Mechoulam đã phân lập THC tinh khiết đầu tiên.Từ dịch
chiết hexan bằng sắc ký cột lặp lại trên florisil và alumina, tiếp tục phản ứng tạo
tinh thể 3,5-dinitrophenylurethane với THC rồi thủy phân bởi kiềm nhẹ để có đƣợc
THC tinh khiết. Độ tinh khiết của THC đƣợc kiểm tra bằng sắc ký lớp mỏng (TLC)
và phân tích phổ (IR và NMR).
Năm 1965, Korte và cộng sự đã phân lập THC từ dịch chiết xuất của hoa cái của
Cannabis Sativa indica và Cannibis Sativa non-indica. Dịch chiết đã đƣợc chạy trên
cột alumina để loại các tạp chất.Sau đó, tinh chế bởi phƣơng pháp lƣu động ngƣợc
dòng.
Các nghiên cứu trên mới là bƣớc đầu, chủ yếu dùng cột silicagel và alumina để
phân lập THC và đƣợc áp dụng để tinh chế lấy một lƣợng nhỏ THC.Để thu đƣợc
nhiều lƣợng THC và có độ tinh khiết cao hơn, nhiều phƣơng pháp khác cải tiến nhƣ:
phân lập bằng sắc kí cột, phân đoạn chứa THC sẽ đƣợc chƣng cất phân đoạn ở áp
suất giảm sẽ thu đƣợc THC; thực hiện thêm tinh chế bằng sắc kí cột hoặc sắc kí
điều chế pha thƣờng hoặc pha đảo để thu đƣợc THC trên 95%.
Quá trình phân lập thực hiện trên sắc kí cột silicagel hoặc alumina. Đối với sắc
kí pha thƣờng, sử dụng dung môi rửa giải có độ phân cực tăng dần. Các dung môi

11


không phân cực hay sử dụng là các alkan mạch thẳng ví dụ nhƣ heptan, hexan,
isoctan, ether dầu hỏa. Các dung môi phân cực bao gồm ether hữu cơ, rƣợu và các

acid hữu cơ nhƣ: ethyl acetat, aceton, diethyl ether, isopropyl alcohol. Tỷ lệ dung
môi không phân cực: dung môi phân cực có thể thay đổi 100:0 đến 80:20.
Bảng 1.2 Điều kiện phân lập bằng sắc kí cột

STT

Pha tĩnh

1

Silicagel 100-120
mesh+ AgNO3+
CaSO4 (3:1:0.5)

Tỉ lệ
nguyên
liệu:
silicagel

Kích thƣớc cột:
4,8×60 cm
Silicagel 60
2

Kích thƣớc cột:
10×60 cm

Kích thƣớc cột:
10×60 cm

1:15

4

6

Kích thƣớc cột:
10×50 cm
Silicagel 60
Kích thƣớc cột:

[46]

THC
55,87% từ
dịch chiết
hexan
THC 40%

[21]
Ví dụ
1

THC
58,98% từ
dịch chiết
hexan 29%

[21]
Ví dụ

2

THC
54,74% từ
dịch chiết
hexan
THC 41%

[21]
Ví dụ
3

THC 98%
từ THC
96%

[21]
Ví dụ
5

THC 98%
từ THC

[21]
Ví dụ
6

Ether dầu hỏa -ether
1:30

(độ phân cực tăng
dần)
Hexan – Ether

1:10

(độ phân cực tăng
dần)
Hexan – Ether

Silicagel 60
5

Chloroform hoặc
benzen

1,2 g THC
độ tinh
khiết 99%,
hiệu suất
55%

(độ phân cực tăng
dần)

Silicagel 60
Kích thƣớc hạt:
0,04-0,063 mm

Kết quả

Ether dầu hỏa -ether

Silicagel 60
3

Pha động

Tài
liệu
tham
khảo

1: 15

1:13

(độ phân cực tăng
dần)
Hexan – Ether
(độ phân cực tăng

12


dần)

10×50 cm

92%

Silicagel
Kích thƣớc hạt:
7

0,04 mm

1:4

Methyl-t-butyl ether
(phân đoạn 1)
Methanol
(phân đoạn 2)

Kích thƣớc cột:

THC
55,56%

[21]
Ví dụ
7

10×60 cm
1.2.2.2. Phân lập từ THCA trong cây cần sa (Phƣơng pháp B)
 Các nghiên cứu về chiết xuất, phân lập THCA
Chiết xuất phân đoạn THCA cần chú ý đến nhiệt độ chiết để tránh bị decarboxyl
hóa và pH của môi trƣờng chiết để đảm bảo chuyển THCA sang dạng muối [17].
Dung môi chiết cũng giống nhƣ đã đề cập ở phần trên. Dịch chiết acid thu đƣợc
thêm một base mạnh nhƣ natri hydroxyd (NaOH) 0,1M để tạo thành muối rồi tách

lấy pha nƣớc [37].
Lehmann và Brenneisen (1992) chiết xuất bằng ether dầu hỏa; dịch chiết thu
đƣợc tiếp tục đƣợc chiết ba lần với 200ml hỗn hợp dung môi NaOH và NaHSO3.
Sau đó, acid hóa dịch chiết trên đến pH=3 và chiết lại bằng diethyl ether. Phân lập,
tinh chế dịch chiết cuối bằng sắc kí lỏng áp suất trung bình (MPL) thu đƣợc THCA
[14]. Cũng theo phƣơng pháp chiết xuất Lehmann và Brenneisen (1992), một tác
giả khác phân lập THCA bằng silicagel (63-200µm), hỗn hợp dung môi hexantoluen-aceton-acid acetic [20].
Goodwin [25] sử dụng dung môi chiết xuất bột cần sa là dung môi không phân
cực hoặc hỗn hợp dung môi không phân cực nhóm alkan mạch thẳng và phân
nhánh: pentan, hexan, heptan, octan và nonan. Dịch chiết đƣợc kiềm hóa đến
pH=12.7-13.2 tao dạng muối. Pha nƣớc (chứa dạng muối natri của THCA) đƣợc
chiết với dung môi isopropyl ether vì nó hòa tan trong isopropyl ether nhiều hơn là
so với pha nƣớc, kết quả thu đƣợc là thành phần của dịch chiết isopropyl ether:
96,4% dạng muối, 0,5% CBD, 0,8% CBN .

13


 Các nghiên cứu về decarboxyl hóa THCA
Mục đích của quá trình decarboxyl hóa này là chuyển THCA phân lập đƣợc
(THCA trong dịch chiết) thành THC thô để làm nguyên liệu cho bƣớc tinh chế tiếp
theo. Bảng 1.3 tổng hợp một số điều kiện decarboxyl hóa đã đƣợc sử dụng.
Bảng 1.3 Điều kiện decarboxyl hóa
STT
1

Nhiệt độ (0C)
300

Thời gian (phút)

2
3
4
5

200
100
210
68

2
40
15
600

6
7

145
150

7
3

Thiết bị
Bình chứa cát, THCA
dung môi ether
Lọ thủy tinh kín
Lọ thủy tinh kín

Bình thủy tinh kín,
THCA trong dung môi
IPE+NaOH.22%
[31]

TLTK
[21]
[40]
[44]
[25]

Phƣơng pháp B thực hiện phức tạp hơn so với phƣơng pháp A: hai quá trình
thực hiện (phân lập THCA rồi decarboxyl hóa); kiểm soát quá trình chiết xuất và
decarboxyl hóa nhƣng lƣợng THC thu đƣợc nhiều hơn không thì chƣa có tài liệu
nào so sánh. Cụ thể là:
Thứ nhất, chiết lấy phân đoạn THCA: Cần chú ý đến pH môi trƣờng chiết vì
nếu pH quá kiềm, khi chiết có thể tạo 3 phân lớp (lớp muối ở giữa lớp nƣớc và lớp
dung môi hữu cơ) sẽ gây khó khăn cho bƣớc tiếp theo. Đồng thời với môi trƣờng
pH đó, có thể tăng sự biến đổi và decarboxyl hóa của THCA dẫn đến ảnh hƣởng
đến hiệu suất phân lập THC .
Thứ hai, quá trình decarboxyl hóa: Việc khảo sát quá trình decarboxyl cần
đƣợc kiểm soát chặt chẽ về nhiệt độ, thời gian gia nhiệt vì có thể xảy ra các phản
ứng phụ tạo CBN, CBNA. Kiểm soát thời gian gia nhiệt: hàm lƣợng THC cao nhất
ở 145°C trong 7 phút, sau 40 phút tổng THC giảm đi một nửa; hàm lƣợng THC cao
nhất ở 150°C sau 3 phút, giảm nhanh về 0% sau 7 phút [31]. Một trong những điều

14


kiện khi thực hiện decarboxyl hóa cần thực hiện trong một lọ thủy tinh kín [40] và

bơm khí N2 vào trong bình phản ứng để giảm thiểu các phản ứng phụ có thể xảy ra
[42].
Để nhằm tối ƣu lƣợng THC thu đƣợc theo phƣơng pháp A, ta có thể thực
hiện quá trình decarboxyl hóa nhằm chuyển THCA trong dịch chiết hay trong cây
thành THC. Trong luận văn này, chúng tôi có thể khảo sát decarboxyl hóa ở 2 giai
đoạn: chuẩn bị nguyên liệu, xử lí dịch chiết (đã đề cập ở trên).
Trong giai đoạn chuẩn bị nguyên liệu trƣớc khi chiết xuất, Taschwer M,
Schmid MG đã có nghiên cứu về ảnh hƣởng của nhiệt độ đến quá trình chuyển hóa
THCA thành THC. Tác giả đã khảo sát ở 3 nhiệt độ 50, 100, 150°C trong 24h rồi
phân tích kết quả bằng HPLC/DAD. Ở nhiệt độ 100, 150°C xảy ra quá trình
decarboxyl hóa trong thời gian1-2h [41].
Một số điều kiện decarboxyl hóa khác là: sấy ở 105°C trong 15 phút rồi sấy
ở145°C trong 55 phút [32] hoặc sấy 110°C trong 1 giờ .
1.2.3. Các nghiên cứu tinh chế THC
Khi tinh chế bằng sắc kí lỏng điều chế, sử dụng dung môi rửa giải có độ phân
cực giảm dần. Dung môi phân cực là nƣớc hoặc đệm acid và nhóm ít phân cực hơn
là alcol carbon ít nhƣ methanol, ethanol, isopropanol hoặc acetonitrile với tỉ lệ
50:50 đến 0:100 .
Phân đoạn thu đƣợc ở trên chiết với MBTE (Metyl tert butyl ether) rồi rửa
dịch lọc với H2O, loại tạp bằng than hoạt tính, đem bay hơi một phần dung môi rồi
lọc và đem chƣng cất ở áp suất giảm nhiệt độ<45°C, sau đó duy trì ở nhiệt độ 5055°C trong 4-4,5 h [23].
Một phƣơng pháp tinh chế khác: tinh chế bằng cột silicagel, kích thƣớc hạt
40µm, một số hệ dung môi khai triển: isooctane: aceton; isooctane: ethyl acetat;
isooctane: isopropyl alcohol .

15