TRẦN TRỌNG BIÊN NGHIÊN cứu PHƯƠNG PHÁP LOẠI CAFEIN và làm GIÀU CATECHIN từ CAO lá CHÈ XANH LUẬN văn THẠC sỹ dược học

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

TRẦN TRỌNG BIÊN

NGHIÊN CỨU PHƯƠNG PHÁP LOẠI CAFEIN VÀ
LÀM GIÀU CATECHIN TỪ CAO LÁ CHÈ XANH

LUẬN VĂN THẠC SỸ DƯỢC HỌC

HÀ NỘI 2019


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

TRẦN TRỌNG BIÊN

NGHIÊN CỨU PHƯƠNG PHÁP LOẠI CAFEIN VÀ
LÀM GIÀU CATECHIN TỪ CAO LÁ CHÈ XANH

LUẬN VĂN THẠC SỸ DƯỢC HỌC
CHUYÊN NGÀNH: Công nghệ dược phẩm & bào chế thuốc
MÃ SỐ: 8720202

Người hướng dẫn khoa học: PGS. TS. Nguyễn Văn Hân

HÀ NỘI 2019


Lời cảm ơn
Để hoàn thành luận văn này, người đầu tiên tôi xin trân trọng gửi lời cảm ơn là
thầy của tôi, PGS.TS. Nguyễn Văn Hân, người tôi luôn kính trọng và biết ơn vì đã dìu
dắt tôi trong những ngày đầu về bộ môn và hỗ trợ rất nhiều trong công việc nghiên cứu
và cuộc sống.
Tiếp theo tôi xin cảm ơn TS. Bùi Thị Thúy Luyện và các thầy cô giảng viên, kỹ
thuật viên Bộ môn Công nghiệp Dược đã hỗ trợ trong công việc chung để tôi có thời
gian dành cho nghiên cứu.
Tôi xin cảm ơn chị Nguyễn Thị Phương Thảo (công ty cổ phẩn Anvy) đã hỗ trợ
về chất chuẩn, TS. Hoàng Văn Hoan (Viện Hóa học công nghiệp) đã hỗ trợ nguyên liệu
EGCG, chị Đào Minh (Công ty Clariant Việt Nam) đã hỗ trợ các mẫu MMT, TS. Takashi
Shiono (Công ty Kirin, Nhật Bản) đã tư vấn chuyên môn tận tình, Ths. Đào Anh Hoàng
(Viện Dược liệu) đã hỗ trợ phun sấy sản phẩm, DS. Lê Thị Hà (Công ty BBraun) đã hỗ
trợ về sắc ký HPLC, Ths. Vũ Văn Tuấn (ĐH Đại Nam) đã hỗ trợ nguyên liệu cafein.
Nếu không có các sự hỗ trợ vô tư này, chắc chắn tôi sẽ khó hoàn thành công việc nghiên
cứu.
Tôi xin cảm ơn DS. Lê Thị Bảo Ngọc, sinh viên Nguyễn Thu Hà (K69) đã hỗ trợ
các công việc phần thực nghiệm.
Nhân đây, tôi cũng xin cảm ơn Ban giám hiệu trường ĐH Dược Hà Nội đã tạo
điều kiện, hỗ trợ kinh phí cho khóa học.
Cuối cùng tôi xin cảm ơn gia đình và bạn bè tôi đã đồng hành trong suốt chặng
đường đã qua.
Hà Nội, tháng 4/2019
Học viên

Trần Trọng Biên


MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ
ĐẶT VẤN ĐỀ.................................................................................................................1
Chương 1. TỔNG QUAN..............................................................................................2
1.1. Cây Chè .................................................................................................................2
1.1.1.

Các thành phần quan trọng trong lá Chè .....................................................2

1.1.2.

Các phương pháp loại cafein Chè xanh ......................................................5

1.1.3.

Các phương pháp chiết xuất và làm giàu catechin Chè xanh .....................8

1.1.4.

Một số sản phẩm chiết xuất từ lá Chè .......................................................10

1.1.5.

Một số phương pháp định lượng cafein và các catechin trong lá Chè ......11

1.2. Thông tin về một số chất hấp phụ sử dụng trong nghiên cứu .............................14
1.2.1. Nhựa macroporous.....................................................................................14
1.2.2. Montmorillonit ...........................................................................................16
Chương 2. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..............19
2.1. Nguyên vật liệu ...................................................................................................19
2.1.1. Mẫu nghiên cứu .........................................................................................19
2.1.2. Chất chuẩn và hóa chất ..............................................................................19
2.1.3. Thiết bị thí nghiệm.....................................................................................20
2.2. Nội dung nghiên cứu ...........................................................................................21
2.3. Phương pháp nghiên cứu.....................................................................................21
2.3.1. Chiết xuất và điều chế cao thô ...................................................................21
2.3.2.

Cơ chế quá trình chiết xuất .......................................................................21

2.3.3.

Quá trình hấp phụ, giải hấp phụ ở điều kiện tĩnh ......................................22

2.3.4.

Quá trình hấp phụ, giải hấp phụ ở điều kiện động ....................................23

2.3.5.

Phương pháp định lượng cafein và EGCG ...............................................25

2.3.6. Xử lý thống kê ...........................................................................................26
Chương 3. THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ ............................................................27
3.1. Thẩm định phương pháp định lượng cafein và EGCG bằng HPLC ...................27

3.1.2. Độ đặc hiệu ................................................................................................27
3.1.3. Độ thích hợp hệ thống ...............................................................................28


3.1.4. Khoảng tuyến tính......................................................................................28
3.1.5. Độ lặp lại....................................................................................................29
3.1.6. Độ đúng .....................................................................................................30
3.1.7. Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng ................................................31
3.2. Nghiên cứu điều chế dịch chiết và cơ chế quá trình chiết xuất ..........................31
3.2.1. Khảo sát điều kiện chiết xuất catechin ......................................................31
3.2.2. Cơ chế quá trình chiết xuất ........................................................................33
3.3. Nghiên cứu sàng lọc các chất hấp phụ ................................................................34
3.3.1. Tính chọn lọc của các chất hấp phụ ...........................................................34
3.3.2. So sánh các chất hấp phụ ...........................................................................35
3.4. Nghiên cứu loại cafein bằng MMT .....................................................................36
3.4.1. Động học hấp phụ cafein trên MMT .........................................................36
3.4.2. Đường hấp phụ đẳng nhiệt.........................................................................37
3.4.3. Ảnh hưởng của pH dịch chiết ....................................................................38
3.4.4. Ảnh hưởng của nhiệt độ.............................................................................39
3.4.5. Ảnh hưởng của nồng độ ethanol ................................................................39
3.5. Nghiên cứu làm giàu catechin bằng nhựa macroporous .....................................40
3.5.1. Sàng lọc nhựa macroporous.......................................................................40
3.5.2. Quá trình hấp phụ, giải hấp phụ ở điều kiện tĩnh ......................................41
3.5.3. Quá trình hấp phụ, giải hấp phụ ở điều kiện động.....................................45
3.5.4. Nghiên cứu tái sử dụng nhựa macroporous ...............................................48
3.6. Quy trình chiết xuất, loại cafein và làm giàu catechin từ lá Chè xanh ...............48
Chương 4. BÀN LUẬN ...............................................................................................53
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT .........................................................................................62
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
ACN

Acetonitril

AOAC Hiệp hội các nhà hóa phân tích chính thức (Association of Official Analytical
Chemists)
BV

Thể tích khối hạt (bed volume)

DĐVN Dược điển Việt Nam
EDTA

Ethylenediaminetetraacetic acid

EGCG Epigallocatechin gallat
FDA

Cơ quan quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Hoa Kỳ (Food and Drug
Administration)

HPLC

Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid Chromatography)

id

Đường kính trong (internal diameter)

kl/tt

khối lượng/thể tích

LOD

Giới hạn phát hiện (Limit of Detection)

LOQ

Giới hạn định lượng (Litmit of Quantifitation)

MMT

Montmorillonit

PE

Polyethylen

RSD

Độ lệch chuẩn tương đối (Relative Standard Deviation)

SDVB

Styrendivinylbenzen

STT

Số thứ tự

tt/tt

thể tích/thể tích

USP

Dược điển Mỹ (United State Pharmacopoeia)

UV

Tử ngoại (Ultraviolet)

VIS

Khả kiến (Visible)


DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1. Một số chương trình HPLC định lượng cafein và các catechin Chè xanh ...12
Bảng 1.2. Phân loại nhựa macroporous ........................................................................15
Bảng 2.1. Các đặc tính lý hóa của nhựa macroporous ..................................................19
Bảng 2.2. Các đặc tính lý hóa của các khoáng sét tự nhiên ..........................................20
Bảng 2.3. Danh mục hóa chất sử dụng .........................................................................20
Bảng 3.1. Kết quả thời gian lưu và diện tích píc của dung dịch chuẩn hỗn hợp ..........28
Bảng 3.2. Mối tương quan giữa diện tích píc và nồng độ cafein và EGCG .................28
Bảng 3.3. Kết quả khảo sát độ lặp lại của phương pháp định lượng ............................29

Bảng 3.4. Kết quả khảo sát độ đúng của cafein ............................................................30
Bảng 3.5. Kết quả khảo sát độ đúng của EGCG ...........................................................30
Bảng 3.6. Độ tan (mg/g) của EGCG và cafein trong các loại dung môi ở 25°C ..........34
Bảng 3.7. Phương trình động học hấp phụ cafein trên MMT 4 ở 25°C .......................36
Bảng 3.8. Các thông số mô hình hấp phụ cafein trên MMT ở 25°C ............................38
Bảng 3.9. Ảnh hưởng của pH dịch chiết đến quá trình loại cafein ...............................39
Bảng 3.10. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình loại cafein .....................................39
Bảng 3.11. Ảnh hưởng của nồng độ ethanol đến quá trình loại cafein .........................40
Bảng 3.12. Phương trình động học hấp phụ EGCG trên nhựa HPD826 ở 25°C ..........42
Bảng 3.13. Các thông số mô hình hấp phụ EGCG trên nhựa HPD826 ở 25°C ............43
Bảng 3.14. Ảnh hưởng của tốc độ nạp dịch chiết đến quá trình hấp phụ .....................45
Bảng 3.15. Ảnh hưởng của tốc độ dòng đến hiệu suất giải hấp phụ EGGC trên cột
HPD826 .........................................................................................................................46
Bảng 3.16. Kết quả khảo sát thể tích dung môi ethanol 30% giải hấp phụ EGCG trên
cột HPD826 ...................................................................................................................47
Bảng 3.17. Kết quả khảo sát độ lặp lại của quy trình chiết xuất và tinh chế ................51


DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ
Hình 1.1. Cấu trúc một số catechin trong lá Chè ............................................................3
Hình 1.2. Công thức cấu tạo của cafein ..........................................................................4
Hình 1.3. Một phần mạng lưới polyme polystyren liên kết chéo .................................14
Hình 1.4. Cấu trúc phân tử montmorillonit [59] ...........................................................16
Hình 1.5. Các vị trí tương tác của montmorillonit [37] ................................................17
Hình 3.1. Sắc ký đồ HPLC thẩm định độ đặc hiệu .......................................................27
Hình 3.2. Đường chuẩn mối tương quan giữa diện tích píc và nồng độ.......................29
Hình 3.3. Ảnh hưởng của kích thước nguyên liệu đến hiệu suất chiết EGCG .............32
Hình 3.4. Ảnh hưởng của nồng độ ethanol đến hiệu suất chiết EGCG ........................32
Hình 3.5. Ảnh hưởng của số lần chiết đến hiệu suất chiết EGCG................................33
Hình 3.6. Tỷ lệ trương nở của nguyên liệu trong các dung môi khác nhau .................33

Hình 3.7. Ảnh hưởng của loại chất hấp phụ đến dung lượng hấp phụ cafein, EGCG và
hệ số chọn lọc ................................................................................................................35
Hình 3.8. Ảnh hưởng của loại chất hấp phụ đến tỷ lệ cafein loại đi và tỷ lệ EGCG còn
lại trong dịch chiết .........................................................................................................35
Hình 3.9. Động học hấp phụ cafein trên MMT 4 ở điều kiện tĩnh ...............................36
Hình 3.10. Đường đẳng nhiệt hấp phụ cafein trên MMT ở 25°C.................................37
Hình 3.11. Dung lượng hấp phụ, dung lượng giải hấp phụ và tỷ lệ giải hấp phụ EGCG
của các nhựa macroporous ............................................................................................41
Hình 3.12. Động học hấp phụ EGCG trên nhựa HPD826 ở điều kiện tĩnh (25°C) ......41
Hình 3.13. Đường đẳng nhiệt hấp phụ EGCG từ dịch chiết trên nhựa HPD826 ở 25°C
.......................................................................................................................................42
Hình 3.14. Ảnh hưởng của pH dịch chiết đến dung lượng hấp phụ EGCG trên nhựa
HPD826 ở điều kiện tĩnh ...............................................................................................44
Hình 3.15. Ảnh hưởng của nồng độ ethanol đến tỷ lệ giải hấp phụ EGCG ở điều kiện
tĩnh, 25°C .......................................................................................................................44
Hình 3.16. Đường hấp phụ EGCG trên cột HPD826 (Co: 0,5 mg/mL, 25°C, tốc độ: 2
BV/giờ) ..........................................................................................................................46
Hình 3.17. Đường biểu diễn quá trình giải hấp phụ EGCG trên cột HPD826 .............47


Hình 3.18. Dung lượng hấp phụ EGCG trên nhựa HPD826 ........................................48
Hình 3.19. Sơ đồ tóm tắt quy trình chiết xuất, loại cafein và làm giàu catechin từ lá
Chè xanh quy mô phòng thí nghiệm (100 g/mẻ) ...........................................................49
Hình 3.20. Sắc ký đồ một số mẫu cao Chè ...................................................................52
Hình 3.21. Hình ảnh cao thô (A), cao sau loại cafein (B) và cao sau làm giàu catechin
(C) ..................................................................................................................................52
Hình 4.1. Minh họa cơ chế hấp phụ cafein trên MMT .................................................56


ĐẶT VẤN ĐỀ

Chè (Trà, Camellia sinensis L.) là một trong những đồ uống phổ biến nhất ở Việt
Nam và trên thế giới do hương vị đặc trưng và các tác dụng sinh học quan trọng của

các hợp chất polyphenol (chủ yếu là các catechin) trong lá như chống oxy hóa [43],
chống dị ứng, chống viêm, kháng khuẩn [84], chống ung thư [55]. Trong các catechin
Chè xanh, epigallocatechin gallat (EGCG) là thành phần có hàm lượng lớn nhất và có tác
dụng chống oxy hóa mạnh nhất. Trong công nghiệp dược phẩm, cao chiết Chè xanh chuẩn
hóa (Polyphenon® E, Theaphenon® E) đã được sản xuất đã và đang trải qua nhiều thử
nghiệm lâm sàng quan trọng [25]. Một trong các thuốc đã được FDA chấp nhận trong
điều trị mụn cóc sinh dục (Condyloma acuminata) từ năm 2006 dưới tên thương mại
Veregen® (hoạt chất Sinecatechins) [51].
Ngoài ra lá Chè chứa 2-5% cafein - một alcaloid có tác dụng kích thích thần kinh
mà nếu sử dụng thường xuyên và quá mức sẽ gây nhiều tác dụng bất lợi như kích ứng
đường tiêu hóa; hồi hộp, mất ngủ [4]; nhịp tim nhanh, tăng huyết áp [34]; nguy cơ dị tật
thai nhi, sẩy thai và thai chết lưu [50]. Do đó, hiện nay nhu cầu về các sản phẩm chứa
hàm lượng cafein thấp từ cây Chè nói riêng và các loại đồ uống nói chung đang ngày
càng tăng. Lá Chè loại cafein và polyphenol Chè xanh loại cafein là những sản phẩm nổi
bật nhất trong xu hướng này [11, 80].
Trên thế giới, nhiều công ty đã sản xuất được các sản phẩm loại cafein từ Chè
bằng nhiều công nghệ khác nhau như chiết dung môi siêu tới hạn, công nghệ màng lọc
và kỹ thuật hấp phụ. Đây cũng là chủ đề nghiên cứu thu hút được sự quan tâm rất lớn của
các nhà khoa học. Tuy nhiên ở Việt Nam chưa có nghiên cứu nào đề cập đến việc loại
cafein đồng thời làm giàu catechin trong điều chế cao lá Chè xanh ứng dụng trong dược
phẩm mặc dù Việt Nam là một trong những quốc gia sản xuất và tiêu thụ Chè lớn trên
thế giới và Chè Việt Nam được đánh giá là có chất lượng ngang bằng với Chè Trung
Quốc, Nhật Bản hay Australia [72]. Do đó đề tài “Nghiên cứu phương pháp loại cafein
và làm giàu catechin từ lá Chè xanh” được thực hiện với các mục tiêu:
1. Xây dựng được quy trình chiết xuất, loại cafein và làm giàu catechin từ lá
Chè xanh quy mô phòng thí nghiệm.
2. Điều chế được 20 g cao khô lá Chè xanh có hàm lượng EGCG và giới hạn

cafein đạt tiêu chuẩn USP 41.

1


Chương 1. TỔNG QUAN
1.1. Cây Chè
Cây Chè (Trà, Camellia sinesis L.) thuộc họ Chè - Theaceae, được trồng phổ biến
ở nhiều nước trên thế giới, tiêu biểu là Trung Quốc, Ấn Độ, Việt Nam, Nhật Bản và một
số nước châu Á. Ở nước ta, Chè được trồng chủ yếu ở Thái Nguyên, Tuyên Quang, Hà
Giang, Phú Thọ, Quảng Nam, Đà Nẵng, Lâm Đồng, Đắc Lắc. Năm 2018, tổng diện tích
trồng Chè cả nước là trên 130 nghìn hecta, sản lượng chè búp đạt 1 triệu tấn, với trên 500
cơ sở sản xuất, chế biến và rất nhiều loại Chè thương phẩm khác nhau, trong đó chủ yếu
là Chè đen, còn lại là Chè xanh và các loại khác.
Bộ phận dùng là búp (tôm) và lá Chè non. Trong lá Chè có polyphenol (30 – 36%),
cafein (2-5%), protein, carbohydrat, theanin, acid amin, acid hữa cơ, chlorophyll, enzym,
chất khoáng,…. Trong đó polyphenol (chủ yếu là các catechin), cafein, theanin,
chlorophyll là những thành phần quyết định màu sắc, hương vị của sản phẩm.
1.1.1. Các thành phần quan trọng trong lá Chè
1.1.1.1.

Catechin

Catechin là tên gọi chung để chỉ nhóm các hợp chất polyphenol mang khung
flavan-3-ol. Trong cấu trúc của catechin có 2 C bất đối (C2 và C3), mỗi dẫn chất có 4
đồng phân nên có thể có 24 catechin khác nhau, tuy nhiên hiện nay mới có 12 catechin
đã được được phân lập và xác định cấu trúc từ lá Chè xanh. Về cấu tạo, các catechin có
thể chia thành 2 nhóm: epicatechin (đồng phân 2R và 3R) và nonepicatechin (catechin),
cũng có thể phân thành catechin tự do và catechin ester hóa.

2


Hình 1.1. Cấu trúc một số catechin trong lá Chè
Catechin chè xanh chủ yếu là các epicatechin, trong đó EGCG chiếm 10 - 50%
tổng lượng catechin. Nonepicatechin chỉ chiếm một lượng nhỏ. Hàm lượng mỗi catechin
trong các giống Chè và các bộ phận của Chè khác nhau, giảm dần theo thứ tự EGCG >
EGC > ECG > EC.
* Các tính chất của catechin:
+ Catechin là các chất không màu, khối lượng phân tử từ 290-458 kDa [56], khi
kết tinh có dạng tinh thể hình kim hoặc hình lăng trụ, đa số có vị chát ở các mức độ khác
nhau, riêng EGC và EGCG có vị chát hơi đắng khi ở dạng tự do và chuyển thành vị chát
dịu khi ngưng tụ thành các dicatechin. Các catechin tan trong nước và một số dung môi
hữu cơ: methanol, ethanol, aceton, ethyl acetat,…. Tính tan tốt trong nước và trong ethyl
acetat đã được ứng dụng rộng rãi trong công nghiệp sản xuất các catechin từ hỗn hợp
polyphenol Chè xanh.
+ Các catechin có tính khử mạnh nên rất nhạy cảm với tác động của các enzym
oxy hóa. Ngoài ra, catechin kém bền với acid mạnh, các chất kiềm và nhiệt độ cao [23].
Catechin bền vững nhất trong môi trường acid nhẹ (pH 3-4) và bị phân hủy nhanh trong
khoảng pH từ 5 - 8, đặc biệt kém bền trong môi trường kiềm có pH > 8 [89]. Do đó, để
tăng độ ổn định của các catechin trong quá trình chiết xuất, thường bổ sung các chất
chống oxy hóa và điều chỉnh pH như acid ascorbic, acid citric [1]. Các epicatechin kém
ổn định và dễ bị epime hóa thành các nonepicatechin ở nhiệt độ trên 80°C [7, 41]. Tốc
độ epime hóa nhanh hơn trong môi trường nước máy so với nước tinh khiết. Tuy nhiên,
ở pH < 6 quá trình epime hóa chậm đi đáng kể [49]. Để hạn chế quá trình này, có thể

3


chiết xuất catechin Chè xanh bằng hỗn hợp cồn - nước, kiểm soát chất lượng nước và

nhiệt độ chiết xuất [41], hoặc bổ sung các chất ổn định như EDTA [49].
+ Các catechin có thể phản ứng tạo tủa với cafein và protein [48]. Đặc tính này có
thể được ứng dụng trong phân lập các catechin từ dịch chiết. Catechin cũng phản ứng với
một số enzym như lipoxygenase, α-amylase, pepsin, trypsin và lipase tạo thành các kết
tủa đồng thời ức chế hoạt động của các enzym này. Các catechin ester hóa (EGCG, ECG)
có khả năng tạo kết tủa với các enzym mạnh hơn các catechin tự do. Một số catechin có
thể liên kết với sắt và cản trở quá trình hấp thu sắt. Do đó cần chú ý khi sử dụng catechin
Chè xanh với các thực phẩm chứa nhiều sắt hoặc các chế phẩm bổ sung sắt cho cơ thể.
* Các tác dụng của catechin Chè xanh:
+ Tác dụng chống oxy hóa, trong đó EGCG có hoạt tính cao nhất, hoạt tính chống
oxy hóa của EGCG cao gấp 100 lần vitamin C và hơn 25 lần so với vitamin E [43].
+ Tác dụng chống ung thư [35, 55], kháng khuẩn, kháng virus [67, 79, 84], kháng
viêm [70], giảm cholesterol [83], chống lão hóa [62]. Do vậy, catechin Chè xanh được
sử dụng rộng rãi trong ngành công nghệ thực phẩm, dược phẩm, mỹ phẩm và dinh dưỡng.
1.1.1.2.

Cafein

Cafein là alcaloid chiếm hàm lượng lớn nhất (2-5% trọng lượng khô) trong số các
chất cùng nhóm methyl xanthin trong lá Chè, bên cạnh theophyllin và theobromin.

Hình 1.2. Công thức cấu tạo của cafein
+ Tính chất hóa lý: Tinh thể không màu, không mùi, vị đắng, nóng chảy ở 238°C
và thăng hoa ở 178°C. Kích thước phân tử 0,69 nm, khối lượng phân tử 194 kDa [74].
Cafein hơi tan trong nước ở nhiệt độ thường, dễ tan trong nước nóng, chloroform, ít tan
trong ethanol và ether, tan trong các dung dịch acid và các dung dịch đậm đặc của benzoat
hay salicylat kiềm.
+ Tác dụng dược lý: Cafein có tác dụng kích thích thần kinh trung ương ưu tiên
trên vỏ não; kích thích tim làm tim đập nhanh, mạnh, tăng lưu lượng tim và lưu lượng

4


mạch vành; kích thích trung tâm hô hấp, làm giãn phế quản và giãn mạch phổi; giảm nhu
động ruột, gây táo bón, tăng tiết diệt vị (có thể gây loét dạ dày - tá tràng); giãn cơ trơn
mạch máu, mạch vành, cơ trơn phế quản và cơ trơn tiêu hóa; giãn mạch thận, tăng sức
lọc cầu thận, giảm tái hấp thu Na+ nên có tác dụng lợi tiểu [52].
+ Tác dụng bất lợi của cafein: Cafein là chất kích thích và gây nhiều tác dụng bất
lợi như hồi hộp, mất ngủ [4], nhịp tim nhanh, tăng huyết áp [26]. Sử dụng cafein trong
thời gian dài làm tăng nguy cơ mắc các bệnh về xương (như loãng xương); rối loạn hấp
thu, thải trừ các ion kim loại và các quá trình tái hấp thu ở ruột và thận, bệnh thiếu máu
do thiếu sắt và các bệnh mạch vành. Phụ nữ có thai sử dụng thường xuyên cafein có nguy
cơ gây dị tật cho thai nhi, sẩy thai và thai chết lưu [50], do đó đây là đối tượng rất nhạy
cảm với cafein và cần có các tư vấn cụ thể về lượng cafein có thể sử dụng hàng ngày.
Cafein làm tăng cường quá trình chết tự nhiên (apoptosis) của các tế bào biểu bì do tia
UVB [45]. Ngoài ra các nghiên cứu cho thấy, nếu sử dụng thường xuyên cafein sẽ gây
hội chứng “caffeinism” đặc trưng bởi các triệu chứng như bồn chồn, lo âu, khó chịu, kích
động, run cơ, mất ngủ, đau đầu, tiểu tiện nhiều, rối loạn cảm giác (như ù tai), các triệu
chứng tim mạch (nhịp tim nhanh, rối loạn nhịp tim) và rối loạn tiêu hóa (buồn nôn, nôn,
tiêu chảy,...).
1.1.1.3.

Các thành phần khác

Ngoài các thành phần chính trên, lá Chè còn chứa một số thành phần khác như
protein, carbohydrat, theanin, acid amin, acid hữa cơ, chlorophyll, enzym, chất khoáng.
Trong quy trình chiết xuất các các sản phẩm cao Chè xanh, đây là những tạp chất có thể
xuất hiện trong dịch chiết, ảnh hưởng đến hiệu suất quy trình và hàm lượng hoạt chất
trong sản phẩm chiết.
1.1.2. Các phương pháp loại cafein Chè xanh

Mặc dù có một số tác dụng dược lý nhất định, sử dụng thường xuyên và quá mức
cafein gây ra nhiều tác dụng bất lợi như trên. Cùng với sự phát triển của đời sống xã hội,
hiện nay nhu cầu về các loại sản phẩm chứa hàm lượng cafein thấp từ cây Chè (lá Chè
loại cafein, cao Chè loại cafein) là rất lớn. Nhiều phương pháp loại cafein đã được nghiên
cứu và một số đã được ứng dụng trong thưc tiễn, bao gồm:
1.1.2.1.

Loại cafein bằng dung môi hữu cơ

5


Phương pháp này sử dụng khả năng hòa tan chọn lọc của các dung môi hữu cơ đối
với cafein so với catechin để chiết loại bỏ cafein. Đây là phương pháp sử dụng phổ biến
trong khoảng những năm 1970. Một số dung môi có thể sử dụng là chloroform,
dichloromethan, ethyl acetat [8, 9, 27]. Ưu điểm của phương pháp này là chi phí thấp,
một số dung môi thể hiện tính chọn lọc khá tốt với cafein so với catechin. Tuy nhiên,
phương pháp này cần sử dụng một lượng lớn các dung môi hữu cơ độc hại. Do đó, tồn
dư dung môi trong sản phẩm và các vấn đề liên quan đến sức khỏe người tiêu dùng và
môi trường đã hạn chế các ứng dụng của nhóm dung môi này. Gần đây, một dung môi
hữu cơ khác thân thiện hơn với môi trường đã được nghiên cứu khả năng loại bỏ cafein
là ethyl lactat cho thấy tính chọn lọc với cafein khá cao [12, 13]. Tuy nhiên, đây là dung
môi phân hủy sinh học nên đắt tiền và chưa được ứng dụng nhiều.
1.1.2.2.

Loại cafein bằng nước

Dựa vào tính tan tốt của cafein trong nước nóng để chiết loại bỏ cafein trong lá
Chè xanh là một phương pháp kinh tế và thân thiện với môi trường. Các yếu tố ảnh hưởng
đến hiệu suất loại cafein là nhiệt độ, thời gian, tỷ lệ dung môi/nguyên liệu. Tuy nhiên

phương pháp này chỉ áp dụng với mẫu lá Chè tươi, vì một phần lớn catechin cũng bị mất
đi khi thử nghiệm trên các mẫu lá Chè khô [42].
Để tăng hiệu suất loại cafein bằng nước, các tác giả đã bổ sung acid citric trong
pha nước và sử dụng kỹ thuật chiết phân bố lỏng lỏng. Dịch chiết nước từ lá Chè được
chiết phân bố với ethyl acetat, pha dung môi hữu cơ sau đó được chiết phân bố với dung
dịch acid citric giúp loại bỏ 78,8% lượng cafein trong dịch chiết. Tuy nhiên sản phẩm thu
được trong pha dung môi hữu cơ vẫn chứa 3,7% cafein [15].
1.1.2.3.

Loại cafein bằng vi sinh vật và enzym

Cơ chế của phương pháp này là vi sinh vật dùng cafein làm nguồn carbon và nitơ
cho quá trình sinh trường và phát triển, do đó giúp giảm hàm lượng cafein trong lá Chè.
Các chủng cho tác dụng tốt là Bacillus sp. [22, 24]. Tuy nhiên phương pháp này rất khó
để nâng cấp quy mô và đòi hỏi các điều kiện kiểm soát nghiêm ngặt như chủng vi sinh
vật, hàm lượng cafein ban đầu, nhiệt độ tiến hành, thời gian ủ. Do đó, cần có các nghiên
cứu sâu hơn để tối ưu hóa việc sử dụng vi sinh vật trong loại cafein từ lá Chè.
1.1.2.4.

Loại cafein bằng công nghệ biến đổi gen

6


Con đường sinh tổng hợp cafein trong Chè được đề xuất liên quan đến 3 enzym
N-methyltransferases

gồm

xanthosin

methyltransferase,

7-N-methylxanthin

methyltransferase và 3, 7-dimethylxanthin methyltransferase. 2 bước cuối trong quá trình
này được xúc tác bởi enzym có tên gọi cafein synthase. Do đó, một phương pháp loại
cafein được để xuất là tiến hành bất hoạt mRNA sau quá trình dịch mã của cafein synthase
mRNA. Các giống Chè biến đổi gen cho thấy mức độ giảm biểu hiệu gen cafein synthase
và làm giảm 44-61% lượng cafein và 46-67% lượng theobromin so với nhóm chứng [53].
Tuy nhiên, đây là công nghệ mới cần được tiếp tục nghiên cứu thử nghiệm, kiểm chứng
về mức độ hiệu quả và các ảnh hưởng của thực vật biến đổi gen đến sức khỏe con người.
1.1.2.5.

Loại cafein bằng dung môi siêu tới hạn

Sử dụng dung môi siêu tới hạn là phương pháp hiện đại nhất để loại cafein từ lá
Chè xanh. Quá trình được tiến hành như sau: lá Chè được nghiền thành các tiểu phân có
kích thước nhỏ (< 1mm), sau đó trộn với đồng dung môi (như ethanol 95%) để tăng hiệu
suất chiết cafein và nạp vào bình chiết. CO2 lỏng được bơm theo áp suất định trước, qua
hệ thống gia nhiệt và chảy vào bình chiết. Cafein hòa tan trong CO2 siêu tới hạn và được
chảy qua bình tách, tại đây, cafein được tách khỏi khí CO2 bằng cách giảm áp suất. Nhiều
yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất loại cafein như kích thước nguyên liệu, hàm lượng cafein
trong nguyên liệu ban đầu, loại và lượng đồng dung môi sử dụng, áp suất, nhiệt độ và tốc
độ dòng CO2. Ưu điểm của phương pháp này là tiến hành nhanh, không tồn dư dung môi
do CO2 dễ dàng được loại bỏ, ít làm phân hủy các catechin và giữ lại được mùi vị đặc
trưng của lá Chè [36, 68].
1.1.2.6.

Loại cafein bằng các chất hấp phụ chọn lọc

Đây là nhóm phương pháp được nghiên cứu nhiều nhất trong những năm gần đây,
rất nhiều các chất hấp phụ từ tự nhiên đến tổng hợp đã được nghiên cứu khả năng loại bỏ
chọn lọc cafein khỏi dịch chiết lá Chè, có thể kể đến một số nhóm chất hấp phụ như than
hoạt [80], cyclodextrin [85], nhựa hấp phụ macroporous [10, 77, 87], vật liệu trao đổi ion
[65]. Ưu điểm lớn nhất của nhóm phương pháp này là việc không sử dụng các dung môi
hữu cơ độc hại. Một số chất hấp phụ có dung lượng hấp phụ cao, chọn lọc với cafein, có
thể tái sử dụng tốt và dễ dàng khi nâng quy mô.
Cafein có các tính chất lý hóa kích thước phân tử và độ tan tương tự như các
catechin trong lá Chè, do đó việc loại bỏ triệt để thành phần này rất khó khăn. Trong

7


nhiều trường hợp cần kết hợp các phương pháp khác nhau như chiết dung môi siêu tới
hạn và kỹ thuật hấp phụ [80] hay chiết phân bố lỏng lỏng và kỹ thuật hấp phụ [39]. Các
kỹ thuật này có thể tiến hành lần lượt hoặc kết hợp trong cùng một bước tinh chế với
trung tâm là phương pháp hấp phụ trên chất mang.
1.1.3. Các phương pháp chiết xuất và làm giàu catechin Chè xanh
1.1.3.1.

Chiết xuất catechin

Có nhiều phương pháp để chiết xuất catechin Chè xanh. Dưới đây là một số
phương pháp đã được nghiên cứu nhiều nhất.
-

Phương pháp ngâm với dung môi: Đây là phương pháp phổ biến nhất và có ý

nghĩa thực tế nhất hiện nay. Dựa trên tính chất đặc trưng của các catechin là các hợp chất

phân cực, dễ tan trong nước nóng và các dung môi hữu cơ có độ phân cực cao như ethanol,
methanol. Các dung môi/hỗn hợp dung môi này thường được dùng để chiết xuất các
catechin [73]. Ngoài ra một số dung môi khác như aceton [66], acetonitril, cholin
chlorid/ethylene glycol (1:5, kl/kl) [86], ethyl acetat [15], ethyl lactat [12] hay dung môi
ion lỏng [20] cũng đã được nghiên cứu. Các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất chiết chủ
yếu gồm kích thước dược liệu, nhiệt độ, thời gian chiết xuất, tỷ lệ dung môi/dược liệu và
số lần chiết. Trong quá trình chiết xuất có thể bổ sung các tác nhân chống oxy hóa và/hoặc
điều chỉnh pH như acid ascorbic, acid citric, acid phosphoric [1].
-

Phương pháp ngâm với hỗ trợ siêu âm: Sóng siêu âm lan truyền trong môi trường

lỏng gây nên những dao động mạnh của các phân tử, làm xuất hiện nhất thời các bóng
khí trong lòng chất lỏng (bóng khí xuất hiện khi nhiệt độ dung môi dưới điểm sôi của
nó). Quá trình bóng khí hình thành và xẹp đi gây ra một số tác dụng: tạo ra các sóng va
đập và lực cắt xé mạnh, tăng nhiệt độ, tạo các tia dung môi nhỏ va đập vào bề mặt pha
rắn. Kết quả là siêu âm làm phá vỡ một phần màng tế bào dược liệu, tăng khả năng thấm
của thành tế bào, giảm kích thước tiểu phân, phát sinh các kênh khuếch tán trong dược
liệu và tăng cường sự xáo trộn của hỗn hợp chiết, giúp tăng hiệu suất chiết và rút ngắn
thời gian chiết [8, 69].
-

Phương pháp ngâm với hỗ trợ vi sóng: Dưới tác dụng của vi sóng, nhiệt độ hỗn

hợp chiết tăng nhanh. Nhiệt độ tăng làm tăng tính thấm, tăng khả năng hòa tan và tăng
tốc độ khuếch tán của dung môi. Hơi ẩm trong tế bào dược liệu bốc hơi và tạo áp lực
mạnh lên thành tế bào, gây phá vỡ tế bào và thúc đẩy giải phóng hoạt chất [57]. Tuy

8

nhiên, cũng như phương pháp ngâm với hỗ trợ siêu âm, phương pháp này gặp khó khăn
ở khả năng nâng quy mô mẻ chiết và đòi hỏi trang thiết bị chuyên dụng.
-

Phương pháp chiết dưới áp suất cao: Ưu điểm của phương pháp này là khi tăng

áp suất, nhiệt độ sôi của dung môi chiết tăng, do đó có thể chiết ở nhiệt độ cao hơn. Điều
này giúp làm tăng độ tan của chất tan và tăng hiệu suất chiết. Ngoài ra ở nhiệt độ cao,
quá trình chiết xảy ra nhanh hơn vì dung môi có tốc độ khuếch tán cao, tương tác chất
tan - bã dược liệu giảm [12, 32, 33]. Nhược điểm của phương pháp là đòi hỏi trang thiết
bị phức tạp, tốn năng lượng đồng thời các catechin kém bền trong nước ở nhiệt độ cao.
-

Phương pháp sử dụng dung môi siêu tới hạn: Sử dụng dung môi siêu tới hạn trong

chiết xuất giúp bảo vệ các tính chất đặc trưng của catechin do nhiệt độ chiết thấp và hạn
chế sự tiếp xúc với các tác nhân oxy hóa, thân thiện với môi trường. Tuy nhiên, catechin
là các hợp chất phân cực nên độ tan trong dung môi siêu tới hạn thấp, ngoài ra chi phí lắp
đặt cao cũng là những trở ngại lớn khi ứng dụng phương pháp này [5].
1.1.3.2.

Tinh chế và làm giàu catechin

Bên cạnh các catechin, lá Chè xanh còn chứa rất nhiều các thành phần khác như
cafein, theanin, chlorophyll, carbohydrat, enzym, protein,…. Trong số đó, carbohydrat
và protein là những thành phần tuy chiếm hàm lượng lớn nhưng do liên kết chặt chẽ trong
cấu trúc tế bào và một số ít tan trong nước cũng như các dung môi phân cực nên khó xuất
hiện trong dịch chiết. Còn cafein, theanin, chlorophyll mặc dù chiếm tỷ lệ nhỏ nhưng có
độ tan và kích thước phân tử không khác biệt nhiều so với các catechin nên rất khó để

loại bỏ. Một số phương pháp tinh chế và làm giàu catechin Chè xanh gồm:
-

Chiết phân bố lỏng lỏng sử dụng dung môi hữu cơ
Phương pháp này sử dụng độ tan và sự phân bố chọn lọc của các hợp chất catechin

trong các dung môi để loại bỏ các tạp chất. Đây là phương pháp được áp dụng phổ biến
trong nghiên cứu với ưu điểm là thao tác tiến hành đơn giản. Tuy nhiên nhược điểm của
phương pháp này là sử dụng lượng lớn các dung môi hữu cơ độc hại, quy trình gồm nhiều
bước, khó nâng quy mô, hiệu suất thu hồi và/hoặc hàm lượng catechin thu được không
cao [1, 2, 8, 15].
-

Phương pháp kết tủa
Một

số

ion

vô

cơ

như

Al3+,

Zn2+

hay

các

polyme

như

hydroxypropylmethylcellulose và polyvinylpyrrolidon có phản ứng tạo phức với các

9


catechin, tạo thành các kết tủa (quá trình kết tủa/quá trình cream hóa), giúp phân lập các
catechin khá hiệu quả ở quy mô điều chế [6, 19, 54]. Tuy nhiên phương pháp này phải sử
dụng nồng độ tác nhân tạo tủa lớn. Cafein cũng có khả năng tạo phức với catechin, tính
chất này được nghiên cứu ứng dụng trong phân tách điều chế các catechin. Tuy nhiên,
việc loại cafein và phân đoạn catechin sau phản ứng tạo phức lại cần sử dụng các dung
môi hữu cơ độc hại như chloroform, ethyl hexanoat và propyl acetat [9].
-

Phương pháp dùng màng siêu lọc
Màng siêu lọc phân lập các catechin khỏi các thành phần khác trong dịch chiết

theo kích thước phân tử. Một số màng siêu lọc đã được nghiên cứu gồm polyether sulphon
[61], G10, G20 [58], màng siêu lọc từ vật liệu composit cellulose acetat-titanium [40].
Tuy nhiên, nhược điểm của phương pháp này là cần áp suất lọc cao và màng siêu lọc rất
dễ bị tắc làm giảm hiệu suất lọc.
-

Sử dụng các chất hấp phụ chọn lọc
Đây là phương pháp được nghiên cứu nhiều nhất trong những năm gần đây, nhiều

chất hấp phụ chọn lọc catechin được nghiên cứu như poly(styren divinylbenzen) (nhựa
macroporous) [30], polyamid [40, 81, 87], polyvinylpolypyrrolidon [16, 17],
poly(acrylamid-co-ethylen glycol dimethylacrylat) [44], lignocellulose [63, 82], poly(Nvinyl-2-pyrrolidinon) [88]. Ưu điểm lớn nhất của nhóm phương pháp này là việc không
sử dụng các dung môi hữu cơ độc hại do hầu hết catechin được rửa giải bằng các dung
môi “xanh” như nước và ethanol. Một số chất hấp phụ có dung lượng hấp phụ và giải hấp
phụ cao, chọn lọc với catechin, có thể tái sử dụng tốt và thuận lợi khi nâng quy mô. Tuy
nhiên các điều kiện kỹ thuật cụ thể cần được tính toán và nghiên cứu kỹ với từng loại
chất hấp phụ khác nhau.
1.1.4. Một số sản phẩm chiết xuất từ lá Chè
Do tính chất phức tạp của các thành phần trong lá, các sản phẩm chiết xuất từ lá
Chè xanh rất đa dạng, có thể kể đến như:
+ Cao Chè xanh (sản phẩm đơn giản nhất, gồm hỗn hợp các catechin và nhiều
thành phần khác như cafein, theanin, chlorophyll, acid amin). Các sản phẩm này chủ yếu
ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm, thực phẩm chức năng.
+ Catechin Chè xanh/Polyphenol Chè xanh (hỗn hợp các catechin có hàm lượng
cao, tỷ lệ cafein và theanin rất ít). Polyphenon® (sản phẩm của công ty Mitsui Norin Co.,

10


Ltd., Nhật Bản) và Theaphenon® (sản phẩm của công ty Tea Solutions, Hara Office Inc.,
Nhật Bản) là các cao Chè xanh chuẩn hóa trong đó quy định hàm lượng các hoạt chất
gồm EGCG > 65%, EC < 10%, ECG < 10%, EGC < 10%. Các sản phẩm này đã và đang
trải qua nhiều thử nghiệm lâm sàng quan trọng với tham vọng ứng dụng làm làm thuốc
trong công nghiệp dược [25]. Trong đó có thuốc mỡ Veregen® (hoạt chất Sincatechin)
của công ty MediGene AG (Đức) là một trong số ít các thuốc từ dược liệu (Botanical
Drug Products) được FDA chấp nhận trong điều trị mụn cóc sinh dục (Condyloma

acuminata) từ năm 2006 [51].
+ Sản phẩm tinh khiết (các đơn chất có hàm lượng cao như EGCG, EGC, EC
nguyên liệu,…). Khi được chiết xuất ra dưới dạng các đơn chất có độ tinh khiết cao, thì
yêu cầu các sản phẩm này cần đạt các tiêu chuẩn như các thuốc hóa dược nếu muốn ứng
dụng trong dược phẩm như định tính, định lượng, tạp chất liên quan, tồn dư dung môi,
giới hạn kim loại nặng,….
USP 41 có chuyên luận “Powdered Decaffeinated Green Tea Extract” trong đó
yêu cầu hàm lượng EGCG không ít hơn 40%, hàm lượng polyphenol không ít hơn 60%
tính theo EGCG và hàm lượng cafein không lớn hơn 0,1% [71]. Đây là dòng sản phẩm
được loại cafein nhằm hạn chế những tác dụng không mong muốn của nó, đồng thời hàm
lượng các hoạt chất catechin trong cao chiết được cải thiện bằng các kỹ thuật chiết xuất,
tinh chế thích hợp.
1.1.5. Một số phương pháp định lượng cafein và các catechin trong lá Chè
Rất nhiều phương pháp định lượng các thành phần trong Chè xanh đã được nghiên
cứu và áp dụng. Trong đó, phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) và điện di
mao quản (CE) là 2 phương pháp được nghiên cứu nhiều nhất. Phương pháp HPLC với
detector UV tỏ ra thông dụng và phổ biến, ngoài ra các detector khác như khối phổ, điện
hóa, huỳnh quang cũng được sử dụng trong những trường hợp cần thiết. Một số phương
pháp khác như sắc ký khí, sắc ký lớp mỏng, sắc ký giấy, quang phổ, phổ cộng hưởng tử
hạt nhân cũng được sử dụng để phân tích định tính các thành phần trong Chè xanh [31].
Với phương pháp HPLC, hầu hết các nghiên cứu sử dụng chế độ rửa giải gradient
nồng độ nhằm đạt độ phân giải tốt. Sau đây là một số điều kiện:

11


12

UV

YMC-packed ODS
C18, 5 μm, 4,6 × 250 mm.
UV

Diamonsil C18
150 mm × 4,6 mm, 5 µm

0,8 mL/phút
20 μL
35°C
280 nm
[14]

1 mL/phút

10 µL

Nhiệt độ phòng

275 nm

[21]

[39]

[30]

278 nm

30oC

40oC
280 nm

20 µL

1 mL/phút
20 μL

1 mL/phút

(A): ACN, (B): Acid Methanol : nước : acid Methanol (A) và acid acetic 0,5%
orthophosphoric
0,1% acetic (25:73:2, tt/tt)
(B)
trong nước.
20% (A) trong 0-15 phút, 20Tỉ lệ:
50% (A) trong 15-35 phút và 50+ Ban đầu 10% A
80% (A) trong 35-50 phút.
+ 15 phút 30% A
+ 20 phút 35% A
+ 22 phút 20% A
+ 25 phút 10% A

Detector mảng diod

Waters Model 486 detector

(A): Nước : ACN : acid formic
(94,7 : 4,3 : 1, tt/tt)

(B) Nước : ACN : acid formic
(49,5 : 49,5 : 1, tt/tt)
Bắt đầu 90% A-10% B, tăng
dần lên 30% B trong 10 phút,
Tăng dần lên 80% B trong 5
phút

Microsorb-MV100
C18, 5 μm, 4,6 × 250 mm.

ODS - LiChrosorb
RP-18, 5 μm, 4,6 × 250 mm.

Bảng 1.1. Một số chương trình HPLC định lượng cafein và các catechin Chè xanh


13

10 μL
30°C

(A): Nước : ACN : acid phosphoric (1000 : 25
: 1,0, tt/tt)
(B): Nước : methanol : ACN : acid phosphoric
(600 : 300 : 15 : 0,6, tt/tt)
(C): Methanol : ACN : acid phosphoric (800 :
200 : 1,0, tt/tt)
Từ 0-3 phút: 94% A, 6% B
Từ 3-8 phút : 50% A, 50% B
Từ 8-22 phút: 0% A, 100% B

Từ 22-24 phút: 0% B, 100% C,
5 phút tiếp: 100% C
0,9 mL/phút
20 μL
40oC
Cafein: 275 nm; catechin: 230 nm
[65]

Dung môi
pha động

Tốc độ
dòng

Thể tích
tiêm mẫu

Nhiệt độ

Bước sóng

Tài liệu
tham khảo

Detector UV

ODS-C18
4,6 mm × 150 mm

[12]

205 nm

1 mL/phút

[60]

270 nm

40°C

20 μL

1 mL/phút

(A) Nước và ACN (95:5, tt/tt)
(A) Dung dịch natri
Thêm 0,05 % (tt/tt) acid phosphat 10 mM (pH 2,6)
(B) ACN (93:7, tt/tt)
phosphoric
(B) Nước và ACN (50:50, tt/tt)
thêm 0,05 % (tt/tt) acid
phosphoric
0-8 phút 90 % A, 12 phút 85 %
A, từ 12 phút đến 15 phút 85 %
A, 21 phút 70 % A, 33 phút 50 %
A, 40 phút 30 % A

Detector mảng diod

Detector UV

Detector

YMC ODS-A, C18
5 μm, 4,0 × 250 mm

CAPCELL PAK UG120
C18, 3 μm, 4,6 × 150 mm

Cột


1.2. Thông tin về một số chất hấp phụ sử dụng trong nghiên cứu
1.2.1. Nhựa macroporous
Nhựa macroporous hay nhựa hấp phụ macroporous là các polyme liên kết chéo,
không ion hóa, đặc trưng bởi số lượng lớn các lỗ xốp (đường kính >50 Å) và có khả năng
hấp phụ các phân tử nhỏ. Nhựa được sản xuất bằng cách polyme hóa các monome (thường
sử dụng styren divinylbenzen) với sự có mặt của các chất độn (porogens) không polyme
hóa như toluen, n-heptan, isooctan và isobutanol. Các chất độn có thể trộn lẫn với hỗn
hợp monome, không hoà tan polyme, có khả năng bay hơi ở những điều kiện nhất định
sau khi kết thúc quá trình polyme hoá để lại những lỗ hổng trong cấu trúc polyme [38].

Hình 1.3. Một phần mạng lưới polyme polystyren liên kết chéo
Các thông số đặc trưng của mỗi loại nhựa macroporous gồm: Diện tích bề mặt,
đường kính lỗ xốp, và độ phân cực bề mặt. Diện tích bề mặt bên trong của nhựa khô
thường từ 100 đến 1000 m2/g, đường kính lỗ rỗng dao động từ 100 đến 300 Å, sự phân
cực của nhựa có thể khác nhau tùy loại monome được sử dụng trong quá trình tổng hợp
hoặc cách xử lý hóa học bổ sung sau trùng hợp. Hàm lượng divinylbenzen cao (tới 20%
(kl/kl)) khiến hạt nhựa macroporous có nhiều liên kết chéo hơn, do vậy có khả năng chịu

được các điều kiện khắc nghiệt hơn như áp suất thẩm thấu cao, các chất oxy hóa mạnh
nhưng đồng thời độ xốp hạt nhựa giảm. Ngoài ra, trong quá trình tổng hợp polyme, các
yếu tố ảnh hưởng tới đặc tính lỗ xốp còn có: bản chất, nồng độ chất pha loãng; bản chất
của chất mồi và nhiệt độ của quá trình polyme hóa [38].
Khả năng hấp phụ chọn lọc của nhựa macroporous phụ thuộc vào nhiều yếu tố
như: bản chất polyme, đường kính lỗ xốp, diện tích bề mặt riêng, độ phân cực, các nhóm

14


chức đặc trưng; khối lượng phân tử, kích thước và độ phân cực của chất tan và các điều
kiện tiến hành (nồng độ, pH dịch chiết, nhiệt độ hấp phụ, dung môi,…).
Xét theo độ phân cực, nhựa macroporous chia làm 4 loại.
Bảng 1.2. Phân loại nhựa macroporous
Cấu trúc

Kích thước
hạt (mm)

Diên tích bề
mặt (m2/g)

Styren

0,3-1,2

500-600

Phân cực yếu

Polystyren

0,3-1,0

500-650

Phân cực trung

Polystyren, Styren-

bình

divinyl benzen

Loại hạt nhựa
Không phân
cực

Phân cực mạnh

Polystyren, Styren,
Sulfonic

0,3-1,2
0,3-1,2

>1050,
550
100-220

Ví dụ
D1400, D101,
D4020
AB-8
XAD-8
DA201

Nhựa macroporous được phát triển và ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực, các
ứng dụng ban đầu có thể kể đến như tinh chế đường, hấp phụ khí, xử lý nước thải. Trong
lĩnh vực chiết xuất và tinh chế các hoạt chất tự nhiên, nhựa macroporous được ứng dụng
để tinh chế, phân lập các hoạt chất tinh khiết, làm giàu hoạt chất trong các cao dược liệu.
Đặc biệt với nhiều ưu điểm như: cấu trúc đa dạng, giá thành rẻ, khả năng lặp lại và ổn
định tốt, phần lớn đều sử dụng các dung môi “xanh” như nước và ethanol, có thể tái sử
dụng, phù hợp với nhiều nhóm hoạt chất, chi phí vận hành rẻ, loại nhựa này phù hợp khi
triển khai ở quy mô lớn.
Nhiều nhóm chất tự nhiên đã được tinh chế và làm giàu nhờ ứng dụng nhựa hấp
phụ macroporous cho độ tinh khiết cao (từ 10 đến 90% tùy thuộc vào mức độ phức tạp
của các thành phần trong dịch chiết) với hiệu suất thu hồi cao (>70%) như
flavonoid/polyphenol, glycosid, saponin, taxol/toxoid, carotenoid, serotonin và các alcol
béo [38]. Tại Việt Nam, nhóm nghiên cứu của Bộ môn Công nghiệp Dược, trường ĐH
Dược Hà Nội bắt đầu tiếp cận và ứng dụng nhựa macroporous để tinh chế, làm giàu nhiều
nhóm hoạt chất cho kết quả khả quan, có thể kể đến như làm giàu flavonoid từ củ Sắn
dây, saponin từ củ Tam thất, phân lập geniposid từ quả Dành dành. Tiếp tục hướng nghiên
cứu này, luận văn thử nghiệm một số loại nhựa macroporous với các đặc tính khác nhau

15


trong làm giàu catechin từ lá Chè, với mục tiêu điều chế cao Chè xanh có hàm lượng hoạt
chất đạt yêu cầu của USP 41.

1.2.2. Montmorillonit
Montmorillonit (MMT) là một loại khoáng sét tự nhiên thuộc nhóm smectit, bên
cạnh saponit, hectorit, beidellit, nontronit. MMT có nguồn gốc từ các nham thạch núi lửa,
được khai thác tự nhiên, tinh chế và biến tính phù hợp theo mục đích sử dụng.
Về cấu tạo, MMT có cấu trúc lớp kiểu 2:1, bề dày và bề rộng của mỗi lớp tương
ứng khoảng 1 và 100-1000 nm, mỗi tinh thể gồm 3 lớp xếp chồng lên nhau bao gồm hai
lớp silica tứ diện (Si4O6(OH)4) kẹp ở giữa một lớp nhôm oxyd bát diện (Al(OH)6). Công
thức hóa học được đề xuất là Si8Al3.5Mg0.5O20(OH)4 [64]. Ở các lớp silic oxyd hoặc nhôm
oxyd trung tâm, sự thay thế đồng hình của Si4+ bởi Al3+ hoặc của Al3+ bởi Mg2+ hoặc Fe2+
tạo ra những lớp có điện tích âm. Để trung hòa điện tích này, các cation (Li+, Na+, Ca2+)
được giữ lại giữa các lớp. Những cation đó tạo thành lớp ion trung tâm và có khả năng
trao đổi với các cation vô cơ và hữu cơ, yếu tố này liên quan đến các tính chất đặc trưng
của MMT như tính thân nước, trương nở và khả năng hấp phụ. Ngoài ra, MMT cũng
mang các nhóm hydroxyl trên bề mặt giúp tăng cường khả năng hấp phụ các phân tử mục
tiêu bằng các liên kết yếu như liên kết hydro [18].

Hình 1.4. Cấu trúc phân tử montmorillonit [59]

16