Sử Dụng Phương Pháp Sắc Ký Lỏng Khối Phổ (LC-MS-MS) Để Phân Tích Các Sản Phẩm Tạo Thành Của Phản Ứng

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

LÊ THỊ THÙY DƯƠNG
SỬ DỤNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG KHỐI PHỔ
(LC- MS/MS) ĐỂ PHÂN TÍCH CÁC SẢN PHẨM TẠO THÀNH CỦA
PHẢN ỨNG GIỮA DẪN XUẤT BIS (1-NAPHTHALDEHYDE)
VÀ HỢP CHẤT CHỨA NGUYÊN TỬ HIDRO LINH ĐỘNG

LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC

HÀ NỘI, 2018


LỜI CẢM ƠN
Nghiên cứu khoa học này được thực hiện tại phòng thí nghiệm Hóa học Hữu cơ
2 – Khoa Hóa học – Trường Đại học Khoa học Tự nhiên – Đại học Quốc gia Hà Nội.
Lời đầu tiên em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới Tiến Sĩ Đào Thị Nhung là
giáo viên hướng dẫn đã giao đề tài, tận tình hướng dẫn, truyền đạt nhiều kinh nghiệm
quý báu, quan tâm và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho em hoàn thành đề tài này.
Em xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo trong trường Hóa trường Đại học
Khoa học, Đại học Thái Nguyên nói chung và khoa Hóa phân tích nói riêng đã giảng
dạy và trang bị cho em những kiến thức quý giá trong suốt quá trình học.
Em xin gửi lời cảm ơn đến các bạn sinh viên phòng thí nghiệm Hóa hữu cơ 2,
trường Đại học Khoa học Tự nhiên đã giúp đỡ em trong quá trình thực nghiệm đề tài.
Cuối cùng em xin chân thành cảm ơn Hội đồng khoa học đã giúp đỡ em bảo
vệ thành công đề tài này.
Hà Nội, ngày 20 tháng 05 năm 2018

Lê Thị Thùy Dương

2


DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
HPLC:

Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao

SKPB:

Sắc ký phân bố

SKPT:

Sắc ký pha thường

SKPĐ:

Sắc ký pha đảo

ESI:

Ion hóa dầu phun điện tử

APCI:

Ion hóa hóa học ở áp suất khí quyển

CTPT:

Công thức phân tử

DMF:

Dimethylformamdie

LC – MS/MS:

Phương pháp sắc ký lỏng hai lần khối phổ

USA:

United States of America

TLC:

Sắc ký lớp mỏng (thin layer chromatography)

DCM/EtOH:

Dichloromethan/ethanol

H/E:

Hexane/ Ethylacetat

NH4OAc:

Ammoniumacetat

ACN:

Acetonitrile

IR:

Phổ hồng ngoại

Phổ 1H-NMR:

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân pronton

Phổ 13C-NMR:

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân cacbon

NMR:

Cộng hưởng từ hạt nhân

3


DANH MỤC SƠ ĐỒ
Sơ đồ 1.1. Sản phẩm định hướng tổng hợp của phản ứng của dẫn xuất
Bis (1- Naphthaldehyde) và hợp chất chứa nguyên tử Hidro linh động------------------- 20
Sơ đồ 1.2. Sản phẩm trung gian của phản ứng của dẫn xuất Bis (1- Naphthaldehyde)
và hợp chất chứa nguyên tử Hidro linh động -------------------------------------------------- 21
Sơ đồ 3.1. Phản ứng tổng hợp dẫn xuất bis (1-naphthadehyde) ------------------------ 31
Sơ đồ 3.2. Phản ứng của A3 với thioure ------------------------------------------------------ 34

Sơ đồ 3.3. Phản ứng của A3 và N-methylthioure ------------------------------------------ 35
Sơ đồ 3.4. Phản ứng giữa A3 và hợp chất keton ------------------------------------------- 36
Sơ đồ 3.5. Phản ứng của A3 và ethylacetoacetate ------------------------------------------ 37
Sơ đồ 3.6. Phản ứng của A3 và methylethylketone ---------------------------------------- 40
Sơ đồ 3.7. Phản ứng của A3 và dibenzylketone -------------------------------------------- 45
Sơ đồ 3.8. Phản ứng của A3 và cyclohexanone -------------------------------------------- 49
Sơ đồ 3.9. Phản ứng của A3 và acetylacetone ---------------------------------------------- 50
Sơ đồ 3.10. Phản ứng của A3 và malonamide ---------------------------------------------- 53
Sơ đồ 3.11. Phản ứng của A3 và Dimethythioure ------------------------------------------ 55
Sơ đồ 3.12. Phản ứng của A3 và aminoguanidine hydrochloride ----------------------- 56
Sơ đồ 3.13. Phản ứng của A3 và guanidine sulfate ----------------------------------------- 58

4


DANH MỤC HÌNH VẼ
Hình 1.1. Hệ thống LC/MS ---------------------------------------------------------------------------- 13
Hình 1.2. Cấu tạo đầu phun ESI ---------------------------------------------------------------------- 13
Hình 1.3. Chế độ ion hóa phun mù vào điện trường ESI --------------------------------- 14
Hình 1.4. Cấu tạo hệ thống LC-MS ---------------------------------------------------------- 15
Hình 1.5. Cấu tạo bộ tứ cực --------------------------------------------------------------------- 16
Hình 1.6. Thiết bị khối phổ MS/MS ----------------------------------------------------------- 17
Hình 2.1. Quy trình xử lý mẫu từ dung dịch phản ứng ------------------------------------- 25
Hình 3.1. Phổ IR của hợp chất A3 ------------------------------------------------------------- 31
Hình 3.2. Phổ 1H-NMRcủa A3 ----------------------------------------------------------------- 32
Hình 3.3. Phổ giãn của hợp chất A3 ---------------------------------------------------------- 32
Hình 3.4. Phổ 13C-NMR của A3 -------------------------------------------------------------- 33
Hình 3.5. Phổ MS của A3 ---------------------------------------------------------------------- 33
Hình 3.6. Sắc ký đồ LC-MS của dung dịch phản ứng giữa A3 và thioure.----------- 35
Hình 3.7. Sắc ký đồ LC-MS của dung dịch phản ứng giữa A3 và N-methylthioure. ------ 36

Hình 3.8. Sắc ký đồ LC-MS của dung dịch phản ứng giữa A3 và ethylacetoacetate (1) -- 38
Hình 3.9. Sắc ký đồ LC-MS của dung dịch phản ứng giữa A3 và ethylacetoacetate (2) -- 38
Hình 3.10. Sắc ký đồ LC-MS của dung dịch phản ứng giữa A3 và ethylacetoacetate (3) -- 39
Hình 3.11. Phổ IR sản phẩm (1-1) tách ra được ------------------------------------------- 39
Hình 3.12. Phổ 1H-NMR sản phẩm (1-1) tách ra được ----------------------------------- 40
Hình 3.13. Phổ 13C-NMR sản phẩm (1-1) tách ra được ---------------------------------- 41
Hình 3.14. Phổ MS sản phẩm (1-1) tách ra được ------------------------------------------ 41
Hình 3.15. Sắc ký đồ LC-MS của dung dịch phản ứng giữa A3 và methylethylketone (1)--- 43
Hình 3.16. Sắc ký đồ LC-MS của dung dịch phản ứng giữa A3 và methylethylketone(2) - 43
Hình 3.17. Phổ 1H-NMR sản phẩm (2-1) tách ra được ----------------------------------- 44
Hình 3.18. Phổ 13C-NMR sản phẩm (2-1) tách ra được ---------------------------------- 45
Hình 3.19. Sắc ký đồ LC-MS của dung dịch phản ứng giữa A3 và dibenzylketone------- 46
Hình 3.20. Phổ 1H-NMR sản phẩm (3-1) tách ra được ----------------------------------- 47
Hình 3.21. Phổ 13C-NMR sản phẩm (3-1) tách ra được --------------------------------- 48
Hình 3.22. Phổ MS của sản phẩm (3-1) tách ra được ----------------------------------- 48
Hình 3.23. Sắc ký đồ LC-MS của dung dịch phản ứng giữa A3 và cyclohexanone ------- 50
Hình 3.24. Sắc ký đồ LC-MS của dung dịch phản ứng giữa A3 và acetylacetone (1)----- 51

5


Hình 3.25. Sắc ký đồ LC-MS của dung dịch phản ứng giữa A3 và acetylacetone (2)----- 52
Hình 3.26. Sắc ký đồ LC-MS của dung dịch phản ứng giữa A3 và acetylacetone (3)----- 52
Hình 3.27. Sắc ký đồ LC-MS của dung dịch phản ứng giữa A3 và acetylacetone (4)----- 53
Hình 3.28. Sắc ký đồ LC-MS của dung dịch phản ứng giữa A3 và malonamide (1) ------ 54
Hình 3.29. Sắc ký đồ LC-MS của dung dịch phản ứng giữa A3 và malonamide (2) ------ 55
Hình 3.30. Sắc ký đồ LC-MS của dung dịch phản ứng giữa A3 và Dimethylure---------- 56
Hình 3.31. Sắc ký đồ LC-MS của dung dịch phản ứng giữa A3 và aminoguanidine hydrochloride-- 57
Hình 3.32. Sắc ký đồ LC-MS của dung dịch phản ứng giữa A3 và guanidine sulfate ---- 58

6


DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1. Một số phản ứng ngưng tụ đa tác nhân là phương pháp tổng hợp kinh điển --- 18
Bảng 2.1. Điều kiện phân tích trên thiết bị LTQ Orbitrap XL --------------------------- 26
Bảng 3.1. Số khối m/z tìm thấy và hợp chất dự đoán tạo thành của phản ứng giữa
A3 và ethylacetoacetate------------------------------------------------------------------------------ 37
Bảng 3.2. Số khối m/z tìm thấy và hợp chất dự đoán tạo thành của phản ứng giữa
A3 và methylethylketone --------------------------------------------------------------------------- 42
Bảng 3.3. Số khối m/z tìm thấy và hợp chất dự đoán tạo thành của phản ứng giữa
A3 và đibenzylketone ------------------------------------------------------------------------------ 44
Bảng 3.4. Số khối m/z tìm thấy và hợp chất dự đoán tạo thành của phản ứng giữa
A3 và cyclohexanone ----------------------------------------------------------------------------- 49
Bảng 3.5. Số khối m/z tìm thấy và hợp chất dự đoán tạo thành của phản ứng giữa
A3 và acetylacetone ------------------------------------------------------------------------------- 50
Bảng 3.6. Số khối m/z tìm thấy và hợp chất dự đoán tạo thành của phản ứng giữa
A3 và malonamide --------------------------------------------------------------------------------- 54
Bảng 3.7. Số khối m/z tìm thấy và hợp chất dự đoán tạo thành của phản ứng giữa
A3 và aminoguanidine hydrochloride --------------------------------------------------------- 57

7


MỤC LỤC
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT --------------------------------------------------------------- 3
DANH MỤC SƠ ĐỒ ----------------------------------------------------------------------4
DANH MỤC HÌNH VẼ -------------------------------------------------------------------5
DANH MỤC BẢNG -----------------------------------------------------------------------7
MỞ ĐẦU ----------------------------------------------------------------------------------- 10

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN VỀ PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG KHỐI
PHỔ --------------------------------------------------------------------------------------------------- 11
1.1. SẮC KÝ LỎNG HAI LẦN KHỐI PHỔ (LC-MS/MS) ----------------------------- 11
1.1.1. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) ---------------------------------- 11
1.1.2. Khối phổ (Mass Spectrometry) --------------------------------------------------------- 12
1.2. PHẢN ỨNG CỦA DẪN XUẤT BIS (1-NAPHTHADEHYDE) VÀ HỢP
CHẤT CHỨA NGUYÊN TỬ HIDRO LINH DỘNG ----------------------------------- 18
CHƯƠNG 2: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ----------------- 22
2.1. THIẾT BỊ, DỤNG CỤ, HÓA CHẤT, CHẤT CHUẨN ---------------------------- 22
2.1.1. Thiết bị -------------------------------------------------------------------------------------- 22
2.1.2. Dụng cụ --------------------------------------------------------------------------------------- 22
2.1.3. Hóa chất --------------------------------------------------------------------------------------- 22
2.2. MỤC TIÊU ĐỀ TÀI ------------------------------------------------------------------------- 22
2.1.1. Mục tiêu chung ------------------------------------------------------------------------------ 22
2.1.2. Mục tiêu cụ thể ------------------------------------------------------------------------------ 23
2.3. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU --------------------------------- 23
2.3.1. Nội dung nghiên cứu ---------------------------------------------------------------------- 23
2.3.2. Đối tượng nghiên cứu --------------------------------------------------------------------- 23
2.3.3. Phương pháp nghiên cứu ----------------------------------------------------------------- 23
2.4. THỰC NGHIỆM ----------------------------------------------------------------------------- 24
2.4.1. Tổng hợp dẫn xuất bis(1-naphthaldehyde) (A3) ----------------------------------- 24
2.4.2. Phản ứng của bis(1-naphthaldehyde) và hợp chất chứa nguyên tử Hidro
linh động ---------------------------------------------------------------------------------------------- 24
2.4.3. Phân tích trên thiết bị LC-MS/MS ----------------------------------------------------- 24
2.4.3.1. Xử lý mẫu ---------------------------------------------------------------------------------- 25
2.4.3.2. Kết quả phân tích ------------------------------------------------------------------------ 26

8

Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ------------------------------------------------- 31
3.1. TỔNG HỢP DẪN XUẤT BIS (1-NAPHTHADEHYDE) ------------------------- 31
3.2. PHẢN ỨNG GIỮA BIS (1-NAPHTHADEHYDE) VÀ HỢP CHẤT
CHỨA NGUYÊN TỬ HIDRO LINH ĐỘNG ---------------------------------------------- 34
3.2.1. Phản ứng với các dẫn xuất thioure ----------------------------------------------------- 34
3.2.1.1. Phản ứng của A3 và thioure ---------------------------------------------------------- 34
3.2.1.2. Phản ứng của A3 và N-methylthioure ---------------------------------------------- 35
3.2.2. Phản ứng giữa A3 và hợp chất keton ------------------------------------------------- 36
3.2.2.1. Phản ứng của A3 và ethylacetoacetate------------------------------------------37
3.2.2.2. Phản ứng của A3 và methylethylketone ------------------------------------------- 42
3.2.2.3. Phản ứng của A3 và dibenzylketone ----------------------------------------------- 45
3.2.2.4. Phản ứng của A3 và cyclohexanone ----------------------------------------------- 49
3.2.2.5. Phản ứng của A3 và acetylacetone ------------------------------------------------- 50
3.2.2.6. Phản ứng của A3 và malonamide --------------------------------------------------- 53
3.2.2.7. A3 và Dimethyure ----------------------------------------------------------------------- 55
3.2.3. Phản ứng của A3 và dẫn xuất guanidine ---------------------------------------------- 56
3.2.3.1. Phản ứng của A3 và aminoguanidine hydrochloride---------------------------- 56
3.2.3.2. Phản ứng của A3 và guanidine sulfate ---------------------------------------------- 58
Chương 4: KẾT LUẬN ------------------------------------------------------------------------- 60
TÀI LIỆU THAM KHẢO --------------------------------------------------------------------- 61
PHỤ LỤC-------------------------------------------------------------------------------------66

9


MỞ ĐẦU
Phương pháp sắc ký lỏng khối phổ là một kỹ thuật sắc ký hiện đại, có độ nhạy
và tính chọn lọc cao, sử dụng trong nhiều lĩnh vực nghiên cứu bao gồm cả định tính
và định lượng. Thiết bị gồm hai phần ghép nối là phần sắc ký (cho phép tách chất) và
phần khối phổ (phát hiện chất). Bằng việc đo đạc tỉ lệ khối lượng trên điện tích của

ion (m/z), phương pháp khối phổ cho phép xác định các hợp chất chưa biết bằng cách
dựa vào khối lượng của phân tử hợp chất; xác định kết cấu chất đồng vị của các thành
phần trong hợp chất; xác định cấu trúc của một hợp chất dựa trên các thành phần
phân mảnh….
Các hợp chất crown ether được bắt đầu nghiên cứu tổng hợp từ năm 1967 bởi
nhà hóa học Charles Pedersen. Pedersen đã tổng hợp thành công crown ether và
chứng minh được những ứng dụng quan trọng của hợp chất này trong lĩnh vực khoa
học kỹ thuật. Kể từ đó đến nay, hóa học các hợp chất crown ether vẫn tiếp tục phát
triển, nhiều cấu trúc mới đã được thiết lập với tiềm năng ứng dụng khác, đặc biệt là
các hợp chất azacrown ether với sự thay thế của nguyên tử O trong vòng crown bằng
nguyên tử Nitơ. Phương pháp kinh điển để tổng hợp các dẫn xuất azacrown ether là
sử dụng phản ứng ngưng tụ đa tác nhân giữa các hợp chất dialdehit hoặc xeton với
các hợp chất chứa hidro linh động trong dung môi thích hợp và sự có mặt của muối
amonium acetate. Phương pháp này có ưu điểm là rút ngắn được giai đoạn trung gian,
tạo thành các sản phẩm dị vòng 6 cạnh như định hướng, dễ dàng thay đổi tác nhân
phản ứng nên tạo ra thư viện lớn các hợp chất mới. Tuy nhiên, quá trình phản ứng tạo
thành nhiều sản phẩm phụ khác nhau. Để xác định các sản phẩm tạo thành trong phản
ứng ngưng tụ đa tác nhân, trong nghiên cứu này, chúng tôi đã tiến hành phân tích
các sản phẩm tạo thành của phản ứng giữa Bis (1- Naphthaldehyde) và hợp chất
chứa nguyên tử Hidro linh động bằng phương pháp sắc ký lỏng khối phổ. Dựa
trên số khối m/z thu được và dựa vào thời gian lưu của các chất có thể xác định được
số lượng sản phẩm tạo thành trong quá trình phản ứng, từ đó dự đoán chiều hướng ưu
tiên của phản ứng trong điều kiện thí nghiệm cũng như thay đổi các điều kiện tiến
hành để thu được sản phẩm định hướng.

10


CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN VỀ PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG KHỐI PHỔ
1.1. SẮC KÝ LỎNG HAI LẦN KHỐI PHỔ (LC-MS/MS)

1.1.1. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)
Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao - HPLC (High Performance Liquid
Chromatography) ra đời năm 1967-1968 trên cơ sở phát triển và cải tiến từ phương
pháp sắc ký cột cổ điển. HPLC là một phương pháp chia tách trong đó pha động là
chất lỏng và pha tĩnh chứa trong cột là chất rắn đã được phân chia dưới dạng tiểu
phân hoặc một chất lỏng phủ lên một chất mang rắn, hay một chất mang đã được biến
bằng liên kết hóa học với các nhóm chức hữu cơ. Phương pháp này ngày càng được
sử dụng rộng rãi và phổ biến vì: có độ nhạy cao, khả năng định lượng tốt, thích hợp
tách các hợp chất khó bay hơi hoặc dễ phân hủy nhiệt [8].
Trong HPLC, pha tĩnh chính là chất nhồi cột làm nhiệm vụ tách hỗn hợp chất
phân tích, đó là chất rắn, xốp và kích thước hạt rất nhỏ, từ 2 – 7  m.
Dựa vào sự khác nhau về cơ chế tách chiết sử dụng trong HPLC, người ta chia
HPLC thành 4 loại:
- Sắc ký hấp phụ hay sắc ký lỏng rắn (adsorption/liquid chromatography).
- Sắc ký phân bố (partition chromatography).
- Sắc ký ion (ion chromatography).
- Sắc ký rây phân tử (size exclusion/gel permeation chromatography).
Trong đó, sắc ký phân bố (SKPB) được ứng dụng nhiều nhất vì có thể phân
tích được những hợp chất từ không phân cực đến những hợp chất rất phân cực, hợp
chất ion có khối lượng phân tử không quá lớn (<3000đ.v.C).
Sắc ký lỏng phân bố được chia thành hai loại dựa trên độ phân cực tương đối
giữa pha tĩnh và pha động: sắc ký pha thường – SKPT (normal phase
chromatography) và sắc Ký pha đảo – SKPĐ (reversed phase chromatography).
Trong SKPT, pha tĩnh sử dụng có độ phân cực cao, pha động kém phân cực.
Pha tĩnh loại này sẽ có ái lực với các hợp chất phân cực. SKPT dùng để tách và phân
tích các hợp chất có độ phân cực cao với phân tử lượng không lớn lắm.
Sắc ký pha động (SKPĐ) là thuật ngữ để chỉ một loại sắc ký trong đó pha
tĩnh ít phân cực hơn pha động. Phương pháp này dùng phân tích các hợp chất từ
không phân cực đến phân cực. Hầu hết các hợp chất hữu cơ có mạch carbon dài (ít
phân cực) rất thích hợp cho phân tích bằng SKPĐ. Dung môi sử dụng trong SKPĐ là

11


các dung môi phân cực, trong đó dung môi nước đóng vai trò quan trọng mà lại rẻ
tiền. Do đó, SKPĐ được ứng dụng nhiều và phổ biến hơn SKPT.
Pha động trong sắc ký lỏng nói chung có những yêu cầu sau:
- Pha động phải trơ với pha tĩnh.
- Hòa tan được mẫu
- Phải có độ tinh khiết cao
- Có độ nhớt thấp và phù hợp với detector hoặc phần nối tiếp sau
- Không quá đắt
Có thể chia pha động thành hai loại:
- Pha động có độ phân cực cao: có thành phần chủ yếu là nước, tuy nhiên để
phân tích các chất hữu cơ, cần thêm các dung môi khác để giảm độ phân cực. Pha
động loại này được dùng trong sắc ký pha đảo.
- Pha động có độ phân cực thấp là các dung môi ít phân cực như xyclopentane,
pentane, heptane, hexane, 2-chloropropane, CS2, CCl4, toluene…Tuy nhiên pha động
một thành phần đôi khi không đáp ứng được khả năng rửa giải, nên người ta thường
phối hợp 2 hay 3 dung môi để có được dung môi có độ phân cực thấp đến cao phù
hợp với phép phân tích và hỗn hợp mẫu phức tạp. Sự thay đổi thành phần pha động
đôi khi diễn ra theo thời gian, trường hợp này gọi là rửa giải gradient nồng độ.
1.1.2. Khối phổ (Mass Spectrometry)
Khối phổ là loại thiết bị phân tích dựa trên cơ sở xác định khối lượng phân tử
của các hợp chất hóa học bằng việc phân tách các ion phân tử theo tỷ số giữa khối
lượng và điện tích (m/z) của chúng. Các ion có thể tạo ra bằng cách thêm hay bớt
điện tích của chúng như loại bỏ electron, proton hóa,…Các ion tạo thành này được
tách theo tỉ số m/z và phát hiện, từ đó có thể cho thông tin về khối lượng hoặc cấu
trúc phân tử hợp chất.
Cấu tạo của một thiết bị khối phổ gồm 3 thành phần chính: nguồn ion, bộ phận

phân tích phổ và bộ phận phát hiện. Trước hết các mẫu được ion hóa trong nguồn ion,
sau đó đưa về bộ phận phân giải phổ để tách các ion theo tỷ số m/z. Sau đó các ion đi
vào bộ phận phát hiện (detector), sẽ được khuếch đại và chuyển thành tín hiệu. Các
tín hiệu thu được sẽ chuyển vào máy tính để xử lý và lưu trữ.

12


Hình 1.1. Cấu tạo thiết bị sắc ký lỏng-khối phổ
* Nguồn ion
Chất phân tích sau khi ra khỏi cột tách sẽ được dẫn tới nguồn ion để chuyển
thành dạng hơi và được ion hóa nguyên tử. Một số kĩ thuật ion hóa thường được sử
dụng trong sắc ký lỏng khối phổ như: ion hóa đầu phun điện tử (electrospray
ionization – ESI), ion hóa hóa học ở áp suất khí quyển (atmospheric pressure
chemical ionization – APCI).
- Chế độ ion hóa đầu phun điện tử (ESI)
Đầu phun điện tử (electrospray ionization – ESI)

Hình 1.2. Cấu tạo đầu phun ESI
Trong đó:
+ Nebulizing gas: Khí N2 (>99,5%) nén ở áp suất 60 psi được trộn hợp với
dung môi pha động của HPLC tạo dạng sương mù.
+ Heated nitrogen drying gas: Khí N2 (>99,5%) được gia nhiệt ở 330oC tốc độ
5 lit/phút, thổi khô, hóa hơi toàn bộ sương mù.
+ Capilary: Ống mao quản được áp thế 2,5 kV để hút các ion phân tử. Phụ
thuộc dạng ion phân tử là positive/negative mà chiều điện trường có chiều ngược lại.
Kỹ thuật ion hóa bằng cách phun mù vào điện trường gồm ba quá trình cơ bản sau:

13

- Tạo thành các giọt mang điện tích
- Làm giảm kích thước của hạt và phân nhỏ các hạt
- Quá trình hình thành pha hơi các ion
Khi dung dịch mẫu ra khỏi cột sắc ký, được đưa vào ống mao quản bằng kim
loại. Đầu mao quản này được áp điện thế cao (4-6kV). Khi điện tích dư trên đầu mao
quản vượt qua sức căng bề mặt của dịch mẫu thì sẽ tạo thành các giọt mang điện tích.
Tiếp đó các giọt mang điện tích này được làm giảm kích thước nhờ hai quá trình liên
tục xảy ra, đó là sự hóa hơi dung môi nhờ dòng khí N2 được thổi liên tục vào và sự
bắn phá của các giọt điện tích cùng dấu. Cuối cùng dẫn đến sự hình thành pha hơi của
các ion. Nhờ lực hút tĩnh điện mà các ion này được dẫn vào bộ phận phân tích khối
phổ qua một của sổ rất nhỏ. Dung môi và khí trơ N2 được hút ra ngoài.

Hình 1.3. Chế độ ion hóa phun mù vào điện trường ESI
Có hai kiểu ion chính là chế độ ion dương (+) và ion âm (-). Chế độ ion dương
thường cho nhiều thông tin hơn về ion nghiên cứu.
- Chế độ ion dương:
+ Phù hợp phân tích các loại hợp chất có tính bazơ
+ Các ion giả phân tử phổ biến được tạo thành: [M+H]+/ [M+Na]+/ [M+ K] +/
[M+NH4] +…
- Chế độ ion âm phù hợp
+ Chất phân tích có tính axit
+ Loại ion giả phân tử phổ biến được tạo thành: [M-H] ESI là kỹ thuật ion hóa mềm, có độ nhạy cao, ESI-MS thích hợp cho cả phân
tử có phân tử khối lớn cũng như phân tử khối nhỏ (50-2000amu; 2000-4000amu), các
hợp chất khó bay hơi và không bền nhiệt, phân cực trung bình và phân cực. Thông tin

14


khối phổ thu được trên sắc ký đồ thường là các pic ion giả phân tử và rất ít các phân

mảnh. Vì vậy kỹ thuật này rất thích hợp cho việc sàng lọc sự có mặt của nhiều hợp
chất khác nhau trong dung dịch.
- Chế độ ion hóa hóa học ở áp suất khí quyển (APCI)
Ion hóa hóa học ở áp suất khí quyển (atmospheric pressure chemical ionization
– APCI) hoạt động theo nguyên tắc sau: Hoạt chất cần phân tích trong pha động sau
khi ra khỏi cột sắc khí HPLC, qua ống mao quản kết hợp khí trơ ở áp suất cao (60
psi). Khi ra khỏi ống mao quản pha động chuyển thành ống sương mù. Các hạt sương
nhỏ được khí trơ ở nhiệt độ cao chuyển hóa hoàn toàn thành thể khí. Ở áp suất khí
quyến, tại đầu que phóng điện Corona (đặt áp suất rất lớn 3-6 kV) tập trung điện
trường rất mạnh các cấu tử xảy ra ion hóa hóa học.
Tại đây có sự trao đổi proton để thành ion dương MH+ và trao đổi electron
hoặc proton để biến thành ion âm MH-. Do điện áp cao 2500 V của các ion được hút.
*Bộ phận phân tích khối phổ
Máy phân tích khối phổ hay chính xác hơn máy phân tích “tỉ lệ khối lượng
theo điện tích (m/z) của ion là thiết bị phân tích dựa trên sự chuyển động của các ion
trong môi trường chân không.
Các máy phân tích khối phổ thường được phân loại tùy vào việc tách các ion
mang điện theo phương pháp nào. Ở đây ta chỉ xét thiết bị thông dụng là khối phổ tứ
cực (quadrupole mass spectrometer). Để rõ đặc điểm của LC-MS/MS (2 lần khối
phổ) ta xét thiết bị LC-MS (một lần khối phổ) trước

Hình 1.4. Cấu tạo hệ thống LC-MS
Phần quan trọng nhất là bộ lọc tứ cực (quadrupole mass spectrometer). Sự ion
hóa mẫu xảy ra tại nguồn ion hóa. Các ion được phân tích bởi bộ tứ cực trước khi tới
detector.

15


Hình 1.5. Cấu tạo bộ tứ cực.

Bộ tứ cực gồm hai trục hình trụ đặt song song với nhau một cách chính xác hai
đầu đặt lên giá đỡ. Từng cặp thanh đối diện được nối điện với nhau. Điện xoay chiều
được áp lên cả 4 thanh, nhưng thanh gắn cực âm đối diện 180 o với thanh gắn cực
dương. Các thanh mang điện (+) hay (-) phụ thuộc vào điện thế một chiều áp lên. Mỗi
cặp thanh đối diện nhau chịu tác dụng dòng điện có tần số rất lớn 108 Hz và chiều
điện áp trên mỗi thanh cũng thay đổi tương ứng. Do ảnh hưởng của lực điện từ trường
các ion vừa di chuyển trong không gian nằm giữa các thanh trụ vừa dao động quanh
trục tâm. Mỗi giá trị điện áp được áp lên chỉ có những ion có tỉ số m/z thích hợp mới
đi qua bộ tứ tới detector. Khi ta chọn mảnh m/z đặc trưng cho chất được nghiên cứu
thì phần mềm chuyển tỷ số này thành sự thay đổi tần số và điện thế áp lên bộ tứ cực
để ion quan tâm được dao động cộng hưởng để di chuyển qua tứ cực và tới bộ phân
ghi nhận tín hiệu.
*Ưu điểm
Kỹ thuật MS một lần không nghiên cứu được cơ chế phân mảnh, sự khác biệt
giữa các đồng phân, xác định thêm chi tiết cấu trúc hóa học, chịu ảnh hưởng rõ rệt
nền mẫu chất phân tích, do kỹ thuật ion hóa êm dịu nên khối đồ phổ chỉ cho thấy các
ion phân tử…[19]
Kỹ thuật MS/MS (2 lần) khắc phục được những nhược điểm này đồng thời
tăng thêm độ nhạy (cỡ fentogram), tăng độ chính xác kết quả loại bỏ ảnh hưởng của
nền mẫu.
Máy khối phổ MS/MS hay máy đo khối phổ hai lần liên tiếp gồm hai hệ máy
khối phổ riêng biệt độc lập nhau được nối liền với nhau cách nhau bởi một buồng va
chạm (collision cell). MS đầu tiên được sử dụng để cô lập ion sơ cấp (precursor ion),
ion này liền ngay sau đó sẽ bị phân mảnh tại buồng va chạm collision cell để cho ra

16


các ion thứ cấp (product ion) tiếp theo MS thứ hai sẽ phân tách các ion này. Những
ion mong muốn sẽ đi đến detector và chuyển thành tín hiệu. [13,14]

Hình 1.6. Mô hình thiết bị khối phổ MS/MS
Trong đó:
+ Rough pump: bơm chân không sơ cấp hút loại bỏ các chất không ở dạng ion
như dung môi, các cấu tử bền không bị ion hóa…
+ Turbo pump: bơm chân không thứ cấp tạo môi trường chân không sâu 2,7x
10-5 - 3,3x10-5 torr nhằm tránh sự phân mảnh ion do va chạm.
+ Collision cell: Nơi các ion bị phân mảnh do va chạm với khí Ar 99,999%.
*Bộ phận phát hiện
Sau khi đi ra khỏi thiết bị phân giải phổ, các ion được đưa tới phần cuối của thiết bị
khối phổ là bộ phận phát hiện ion. Bộ phận phát hiện cho phép khối phổ tạo ra một tín hiệu
của các ion tương ứng từ các electron thứ cấp đã được khuếch đại hoặc tạo ra một dòng
điện do điện tích di chuyển. Có hai loại bộ phận phát hiện phổ biến: bộ phận phát hiện
nhân electron (electron multipler) và bộ phận phát hiện nhân quang (photo multipler).
Bộ phận phát hiện nhân electron là một trong những detector phổ biến nhất, có
độ nhạy cao. Một ion đập vào bề mặt diot làm bật ra các electron. Các electron thứ
cấp sau đó được dẫn tới các diot tiếp theo và tạo ra các electron thứ cấp nhiều hơn
nữa, tạo thành dòng electron (1-106).
Bộ phận phát hiện nhân quang cũng giống như thiết bị nhân electron, các ion ban
đầu đập vào một diot tạo ra dòng electron. Khác với detector nhân electron các electron
sau đó sẽ va đập vào một màn chắn phosphorus và giải phóng ra các nhân electron. Số
lượng các poton tỷ lệ với cường độ tín hiệu. Ưu điểm của phương pháp này là các ống
nhân quang được đặt trong chân không nên loại bỏ được các khả năng nhiễm bẩn.

17


1.2. PHẢN ỨNG CỦA DẪN XUẤT BIS (1-NAPHTHADEHYDE) VÀ HỢP
CHẤT CHỨA NGUYÊN TỬ HIDRO LINH DỘNG
Phản ứng ngưng tụ đa tác nhân hiện nay được coi là một công cụ hữu hiệu

trong việc tổng hợp những phân tử có cấu trúc phức tạp, với sự đa dạng và phong phú
về các nhóm chức, bởi chỉ bằng một quá trình từ các dẫn xuất chứa nhóm cacbonyl,
cacboxyl, amin hay xyan … chúng ta có thể thu được sản phẩm mong muốn. Với các
kết quả nghiên cứu được công bố trên thế giới, chúng tôi nhận thấy rằng các phản ứng
ngưng tụ đa tác nhân thường tập trung vào sử dụng các chất ban đầu có chứa nhóm
cacbonyl, các amin và các dẫn xuất có chứa nguyên tử hydro linh động (các nhóm
hoặc CHn, NHn… tại vị trí α của các nhóm cacbonyl hoặc axit cacboxylic). Một ưu
điểm nữa của phản ứng ngưng tụ đa tác nhân đó là rút ngắn được thời gian phản ứng,
giảm thiểu sản phẩm phụ thải ra môi trường, giảm lượng hóa chất cần thiết cho mục
đích tổng hợp sản phẩm. Có thể nói đây là một phương pháp thân thiện với môi
trường và có hiệu quả kinh tế cao hơn so với phương pháp tổng hợp truyền thống.
Rất nhiều các phản ứng ngưng tụ đa tác nhân sau đó đã được phát triển và trở
thành các phương pháp tổng hợp kinh điển đối với hóa học ngày nay.
Bảng 1.1. Một số phản ứng ngưng tụ đa tác nhân là phương pháp tổng hợp kinh điển

Strecker, 1850
[10]

Tổng hợp amino axit

Debus‐Radzisze
wski, 1858, 1882
[27]
Tổng hợp imidazol

Hantzsch 1881
[12]
Tổng hợp 1,4‐dihydropyridines

Hantzsch 1890

[39]
Tổng hợp pyrroles

18


Biginelli, 1891
[16]
Tổng hợp dihydropyrimidones

Mannich, 1912
[17]
Tổng hợp antipyrine‐derived tertiary amine

Mannich, 1917
[41]

Tổng hợp β‐amino carbonyl

Robinson, 1917
[41]

Tổng hợp tropinone

Passerini, 1921
[38]

Tổng hợp α‐acyloxy amides

Bucherer–Bergs,

1929–1934
[26]

Tổng hợp hydantoins và α‐amino acids

Ugi, 1959
[29]
Tổng hợp α‐N‐acylamino amides
Trên cơ sở nghiên cứu tổng quan tài liệu về phản ứng ngưng tụ đa tác nhân và
những kết quả nghiên cứu đã đạt được, chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu phản ứng
của dẫn xuất Bis (1- Naphthaldehyde) và hợp chất chứa nguyên tử Hidro linh động
với sự có mặt của amoni axetat trong dung môi cồn khan tuyệt đối. Sản phẩm định
hướng tổng hợp của các phản ứng này là các hợp chất azacrown có khả năng thể hiện

19


hoạt tính sinh học tốt trên một số dòng ung thư. [3,4,28,34,43].
Sơ đồ 1.1. Sản phẩm định hướng tổng hợp của phản ứng của dẫn xuất
Bis (1- Naphthaldehyde) và hợp chất chứa nguyên tử Hidro linh động

Các proton thuộc nhóm NH/NH2; CH2/CH3 ở vị trí α của các nhóm C=O, C=S,
C=NH đều là các hidro linh động.

Bên cạnh sản phẩm chính định hướng tạo thành như sơ đồ 1, còn có nhiều sản
phẩm trung gian. Cơ chế phản ứng tương tự như phản ứng Hantzch.
Sơ đồ 1.2. Sản phẩm trung gian của phản ứng của dẫn xuất
Bis (1- Naphthaldehyde) và hợp chất chứa nguyên tử Hidro linh động

20

Sp dạng 2

Sp dạng 1

Sp dạng 5

Sp dạng 6

Sp dạng 3

Sp dạng 4

Sp dạng 7

Các sản phẩm tạo thành có số khối m/z khác nhau, đo đó bằng phương pháp
phổ khối lượng có thể nhận biết được sự có mặt của các sản phẩm tạo thành.

21


CHƯƠNG 2: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. THIẾT BỊ, DỤNG CỤ, HÓA CHẤT, CHẤT CHUẨN
2.1.1. Thiết bị
- Hệ thống sắc ký lỏng khối phổ LTQ Orbitrap XL, ThermoScientific XL, USA
+ Phần sắc ký lỏng: Accela Autosampler và Accela pump; hệ dung môi sắc ký.
+ Detectơ: Ion trap.
+ Cột tách: Hypersil Gold C18, Mỹ với các thông số: chiều dài cột 5cm,
đường kính trong 2,1 mm, cỡ hạt 1,9 μm.

- Cân phân tích
- Máy cô quay chân không
- Bộ đuổi khí N2
2.1.2. Dụng cụ
- Lọ đựng mẫu cho bộ bơm mẫu tự động 1,5 ml tối màu, nắp vặn có lớp lót
teflon, glass insert 250μl (Agilent Technologies, Mỹ).
- Ống falcon: 15ml
- Ống nghiệm cô đuổi dung môi Kuderna Danish: 10ml.
- Dụng cụ thủy tinh: bình cầu 100ml; ống đong 100ml, 250ml, 500ml; cốc
thủy tinh 100ml – 1000ml; sinh hàn hồi lưu, cột tách.
- Bản mỏng sắc ký TLC: TLC Silica gel 60 F254 (Aluminium sheets 20 x 20
cm, Merck) 1 hộp 25 tấm.
- Ống mao quản chấm bản mỏng.
2.1.3. Hóa chất
2.1.3.1. Hóa chất dùng cho tổng hợp
- Các hóa chất như 2-Hydroxy-1-naphthaldehyde, KI, K2CO3, dibenzyketone,
methylethylketone…hãng Merk, được mua và dùng ngay không cần tinh chế.
- Các dung môi DMF, n-hexane, ethylacetate, dichloromethan được mua của
hãng Daejung, Hàn Quốc loại PA.
2.1.3.2. Hóa chất sắc ký
- Chất khí:
+ Khí Ar, độ tinh khiết 99,999%.
+ Khí cô đuổi dung môi: khí nitơ, độ tinh khiết 99,99%.
- Dung môi : Methanol, acetonitrile, Dichloromethan, Merk, loại cho LCMS.

22


- Nước cất: nước cất deion hóa.
2.2. MỤC TIÊU ĐỀ TÀI

2.1.1. Mục tiêu chung
Sử dụng phương pháp sắc ký lỏng khối phổ để phân tích cấu trúc các sản phẩm
tạo thành của phản ứng giữa dẫn xuất bis(1-naphthaldehyde) và hợp chất chứa
nguyên tử Hidro linh động.
2.1.2. Mục tiêu cụ thể
Phân tích, nghiên cứu cấu trúc của các sản phẩm tạo thành trong phản ứng của
dẫn xuất bis(1-naphthaldehyde) và hợp chất chứa nguyên tử Hidro linh động bằng
phương pháp sắc ký lỏng khối phổ trên thiết bị LTQ Orbitrap XL.
2.3. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3.1. Nội dung nghiên cứu
Để đạt được mục tiêu của đề tài, các nội dung cần thực hiện bao gồm:
- Tổng quan về phản ứng giữa dẫn xuất bis(1-naphthaldehyde) và hợp chất
chứa nguyên tử Hidro linh động; tầm quan trọng của việc phân tích cấu trúc các sản
phẩm của phản ứng nghiên cứu.
- Tổng quan về phương pháp sắc ký lỏng khối phổ trong nghiên cứu và xác
định cấu trúc sản phẩm.
- Nghiên cứu khảo sát các sản phẩm phản ứng trên máy sắc ký lỏng- khối phổ
để xác định cấu trúc dự kiến tạo thành:
+ Điều kiện cột
+ Chương trình pha động
+ Các tín hiệu m/z tạo thành
2.3.2. Đối tượng nghiên cứu
Đối tượng nghiên cứu của đề tài các sản phẩm tạo thành trong phản ứng của
dẫn xuất bis(1-naphthaldehyde) và hợp chất chứa nguyên tử Hidro linh động.
2.3.3. Phương pháp nghiên cứu
- Phương pháp tổng hợp đa tác nhân.
- Phương pháp phân tích các chất hữu cơ bằng sắc ký lỏng khối phổ.

23

2.4. THỰC NGHIỆM
2.4.1. Tổng hợp dẫn xuất bis(1-naphthaldehyde) (A3)

Cho 3g KI và 3g K2CO3 18ml dung dịch DMF trong bình cầu 3 cổ, khuấy ở
nhiệt độ thường trong 30 phút. Sau đó thêm 3g (17,5mmol) chất (1), tăng nhiệtlên
60-700C duy trì trong 1h. Để hỗn hợp về nhiệt độ thường rồi thêm từ từ 1ml (2) vào,
tăng nhiệt lên 110-1150C, duy trì trong 10-12 h. Sau khi phản ứng kết thúc để về nhiệt
độ phòng, làm lạnh hỗn hợp bằng nước đá. Lọc chất rắn màu trắng thu được trên
phễu Buchner, rửa nhiều lần bằng nước. Kết tinh trong hệ dung môi DCM/EtOH=2/1.
Rf=0.5. Khối lượng sản phẩm là m= 2,73 g, hiệu suất H=75%.
2.4.2. Phản ứng của bis(1-naphthaldehyde) và hợp chất chứa nguyên tử Hidro
linh động.
*Quy trình chung:
Cho 0,3mmol chất (I), 6mmnol NH4OAc, 0,36mmol hợp chất chứa hidro linh
động, 0,1 mmol CH3COOH băng, 5ml EtOH vào bình cầu. Đun hồi lưu hỗn hợp trên
bếp cách thủy. Lấy mẫu phân tích trong quá trình phản ứng.

24


2.4.3. Phân tích trên thiết bị LCMSMS
2.4.3.1. Xử lý mẫu
100  L dung dịch phản ứng
200  L H2O
200  L DCM

Chiết lỏng-lỏng

Tách lấy pha hữu cơ

1. Rửa bằng nước đến pH=7
2. Rửa bằng NaCl bão hòa
3. Làm khan bằng Na2SO4 khan
Cô đuổi dung môi bằng khí N2
1. 500mL hỗn hợp DCM+ACN (4:1) (dung môi sắc
ký).
2. Lọc qua màng lọc θ 0,25um
Vial

Tiêm mẫu vào hệ
thống LC/MS/MS

Hình 2.1. Quy trình xử lý mẫu lấy ra từ dung dịch phản ứng

25