Nghiên cứu sự biểu hiện mRNA của gen CIZ1b, VEGF và đột biến EGFR với nhiễm virus Merkel cell ở bệnh nhân ung thư phổi không tế bào nhỏ (Luận án tiến sĩ)
Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (2.33 MB, 168 trang )
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
BỘ QUỐC PHÒNG
HỌC VIỆN QUÂN Y
N VĂN HOÀN
HỒ VĂN SƠN
NGHIÊN CỨU SỰ BIỂU HIỆN mRNA CỦA GEN CIZ1b,
VEGF VÀ ĐỘT BIẾN EGFR VỚI NHIỄM VIRUS
MERKEL CELL Ở BỆNH NHÂN UNG THƯ PHỔI
KHÔNG TẾ BÀO NHỎ
LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC
HÀ NỘI – 2020
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
BỘ QUỐC PHÒNG
HỌC VIỆN QUÂN Y
NGUYỄN VĂN HOÀN
HỒ VĂN SƠN
N VĂN HOÀN
NGHIÊN CỨU SỰ BIỂU HIỆN mRNA CỦA GEN CIZ1b,
VEGF VÀ ĐỘT BIẾN EGFR VỚI NHIỄM VIRUS
MERKEL CELL Ở BỆNH NHÂN UNG THƯ PHỔI
KHÔNG TẾ BÀO NHỎ
Chuyên ngành: Khoa học y sinh
Mã số: 9 72 01 01
LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC
HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:
1. GS.TS. Nguyễn Lĩnh Toàn
2. TS. Ngô Tất Trung
HÀ NỘI – 2020
LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan luận án này là công trình nghiên cứu của riêng bản
thân tôi, tất cả các số liệu trong luận án hoàn toàn trung thực và chưa công bố
trong bất kỳ công trình nào.
TÁC GIẢ
Hồ Văn Sơn
LỜI CẢM ƠN
Đầu tiên tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Đảng ủy, Ban Giám đốc
Học viện Quân y, Bộ môn Sinh lý Bệnh, Phòng Sau Đại học, Học viện Quân y
đã tạo điều kiện thuận lợi, giúp đỡ tôi trong quá trình học tập và nghiên cứu.
Tôi xin trân trọng cảm ơn Đảng ủy, Ban giám đốc Bệnh viện Quân y
175, Trung tâm tư vấn di truyền và sàng lọc ung thư (CGC), Trung tâm nghiên
cứu y học Việt Đức (VG-CARE), Khoa Sinh học phân tử (C17) bệnh viện Trung
ương Quân đội 108 và các cơ quan chức năng đã tạo mọi điều kiện cho tôi học
tập và thực hiện luận án.
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc với GS.TS. Nguyễn Lĩnh Toàn và TS.
Ngô Tất Trung, hai thầy hướng dẫn khoa học, đã tận tụy dành thời gian, trí
tuệ, công sức giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện và hoàn chỉnh luận án.
Tôi chân thành cảm ơn Trung tâm chẩn đoán và điều trị ung bướu, Khoa
Sinh hoá Bệnh viện Quân y 175 đã giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện đề tài.
Nhân dịp này chúng tôi chân thành cảm ơn các bạn bè, đồng nghiệp đã
ủng hộ, động viên tôi trong quá trình thực hiện đề tài.
Tôi dành tình cảm biết ơn sâu sắc tới gia đình, bố mẹ và vợ con đã luôn
động viên, giúp đỡ trong quá trình học tập, nghiên cứu để hoàn thành luận án.
TP Hồ Chí Minh 03/2020
Hồ Văn Sơn
MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN
LỜI CẢM ƠN
MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
DANH MỤC BẢNG
DANH MỤC HÌNH
ĐẶT VẤN ĐỀ.................................................................................................1
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU......................................................3
1.1. Đại cương về ung thư phổi.....................................................................3
1.1.1. Tình hình ung thư phổi trên thế giới.....................................................3
1.1.2. Tuổi và giới...........................................................................................4
1.1.3. Tỷ lệ tử vong..........................................................................................5
1.1.4. Tình hình ung thư phổi ở Việt Nam.......................................................5
1.1.5. Nguyên nhân gây ung thư phổi.............................................................6
1.2. Cơ chế phân tử của ung thư phổi..........................................................8
1.2.1. Gen gây ung thư (oncogene) trong ung thư phổi..................................9
1.2.2. Gen ức chế khối u................................................................................10
1.3. Các dấu ấn phân tử trong chẩn đoán, tiên lượng ung thư phổi
không tế bào nhỏ.................................................................................12
1.3.1. Các dấu ấn protein..............................................................................13
1.3.2. Tự kháng thể (Autoantibody)..............................................................14
1.3.3. Methyl hóa DNA..................................................................................14
1.3.4. DNA khối ung thư trong máu (ctDNA)................................................15
1.3.5. RNA lưu hành trong máu ngoại vi......................................................16
1.4. Yếu tố tăng trưởng nội mô mạch máu................................................18
1.4.1. Đặc điểm cấu trúc và hoạt động chức năng của VEGF.....................18
1.4.2. Hoạt động của gen mã hóa cho VEGF...............................................19
1.4.3. Mối liên quan giữa VEGF và ung thư.................................................20
1.5. CIZ1 và biến thể CIZ1b trong ung thư phổi.......................................22
1.5.1. Đặc điểm cấu trúc và hoạt động chức năng của CIZ1.......................22
1.5.2. Hoạt động của gen CIZ1.....................................................................24
1.5.3. CIZ1b và mối liên quan với ung thư phổi...........................................25
1.6. Yếu tố tăng trưởng biểu bì trong ung thư phổi không tế bào
nhỏ........................................................................................................26
1.6.1. Chức năng của EGFR.........................................................................26
1.6.2. Mối liên quan giữa EGFR và ung thư phổi không tế bào nhỏ............28
1.7. Virus Merkel cell và ung thư phổi.......................................................28
1.7.1. Đặc điểm chung của Virus Merkel Cell..............................................28
1.7.2. Cơ chế gây ung thư của virus Merkel cell..........................................30
1.7.3. Mối liên quan giữa virus Merkel cell và ung thư phổi........................31
1.8. Mối liên quan giữa VEGF, CIZ1b, đột biến EGFR với nhiễm
virus Merkel cell..................................................................................32
CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
...............................................................................................................34
2.1. Đối tượng nghiên cứu...........................................................................34
2.1.1. Tiêu chuẩn chọn mẫu nghiên cứu.......................................................34
2.1.2. Tiêu chuẩn loại trừ..............................................................................34
2.2. Phương pháp nghiên cứu.....................................................................35
2.2.1. Thiết kế nghiên cứu.............................................................................35
2.2.2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu.......................................................35
2.2.3. Phương pháp chọn mẫu......................................................................35
2.2.4. Phương pháp thu thập số liệu.............................................................35
2.3. Định lượng mRNA bằng kỹ thuật real-time PCR.............................37
2.4. Phương pháp đánh giá mức độ biểu hiện mRNA của gen VEGF
và CIZ1b...............................................................................................39
2.4.1. Lấy mẫu xét nghiệm............................................................................39
2.4.2. Vật liệu, hóa chất................................................................................40
2.4.3. Thiết bị, máy móc................................................................................41
2.4.4. Phương pháp tách chiết, tinh sạch RNA.............................................41
2.4.5. Phương pháp tổng hợp cDNA.............................................................42
2.4.6. Phương pháp đo quang phổ kế xác định nồng độ, độ tinh sạch
cDNA.................................................................................................43
2.4.7. Phương pháp xác định mức độ biểu hiện mRNA của gen CIZ1b
và VEGF huyết tương.......................................................................43
2.5. Quy trình xét nghiệm đột biến EGFR................................................44
2.5.1. Tách DNA từ mẫu sinh thiết đúc paraffin (FFPE) bằng bộ sinh
phẩm Gene JET FFPE DNA Purification Kit...................................45
2.5.2. Thực hiện phản ứng real-time PCR bằng bộ sinh phẩm EGFR
Mutation Detection Kit.....................................................................45
2.5.3. Phân tích kết quả.................................................................................47
2.6. Phương pháp phát hiện MCV.............................................................47
2.6.1. Phát hiện MCV huyết tương và trong mô bằng phương pháp realtime PCR...........................................................................................47
2.6.2. Phương pháp phân tích xác định MCV...............................................50
2.7. Một số tiêu chuẩn áp dụng trong nghiên cứu....................................51
2.7.1. Chẩn đoán ung thư phổi không tế bào nhỏ.........................................51
2.7.2. Đánh giá mức độ biểu hiện của mRNA VEGF, mRNA CIZ1b, đột
biến EGFR với tình trạng nhiễm virus Merkel ở nhóm bệnh ung
thư phổi không tế bào nhỏ................................................................60
2.8. Xử lý số liệu...........................................................................................60
2.9. Đạo đức trong nghiên cứu....................................................................61
2.10. Sơ đồ nghiên cứu................................................................................62
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU..................................................63
3.1. Đặc điểm chung của nhóm nghiên cứu...............................................63
3.1.1. Tuổi và giới của nhóm bệnh nhân ung thư phổi không tế bào nhỏ
và nhóm chứng..................................................................................63
3.1.2. Triệu chứng lâm sàng của bệnh nhân khi nhập viện...........................64
3.1.3. Tiền sử cá nhân của các bệnh nhân ung thư phổi không tế bào
nhỏ....................................................................................................65
3.1.4. Một số đặc điểm cận lâm sàng nhóm bệnh nhân ung thư phổi
không tế bào nhỏ...............................................................................65
3.1.5. Một số đặc điểm cận lâm sàng nhóm người bình thường...................71
3.2. Kết quả so sánh các chỉ số cận lâm sàng giữa 2 nhóm đối tượng
nghiên cứu............................................................................................72
3.3. Kết quả tách chiết RNA và tổng hợp cDNA.......................................74
3.4. Kết quả real-time PCR phát hiện biểu hiện mRNA của CIZ1b
và VEGF huyết tương.........................................................................74
3.4.1. Kết quả Ct của phản ứng real-time PCR cho gen CIZ1b....................75
3.4.2. Kết quả Ct của phản ứng real-time PCR cho gen VEGF....................75
3.4.3. Kết quả Ct của phản ứng real-time PCR cho gen ABL.......................76
3.5. Biểu hiện mRNA của CIZ1b và VEGF huyết tương ở đối tượng
nghiên cứu............................................................................................76
3.5.1. Biểu hiện của mRNA của CIZ1b huyết tương ở bệnh nhân ung
thư phổi không tế bào nhỏ và người bình thường............................76
3.5.2. Biểu hiện của mRNA của VEGF huyết tương ở bệnh nhân ung
thư phổi không tế bào nhỏ và người bình thường.............................77
3.6. Đột biến gen EGFR ở bệnh nhân ung thư phổi không tế bào
nhỏ........................................................................................................78
3.7. Kết quả xác định MCV ở người khỏe mạnh và bệnh nhân ung
thư phổi không tế bào nhỏ bằng kỹ thuật real-time PCR...............79
3.7.1. Kết quả xác định MCV huyết tương nhóm người khỏe mạnh bằng
kỹ thuật real-time PCR......................................................................79
3.7.2. Kết quả xác định MCV ở mô ung thư và huyết tương bệnh nhân
ung thư phổi không tế bào nhỏ bằng phản ứng real-time PCR........80
3.7.3. Kết quả xác định dương tính với MCV bằng phản ứng PCR..............80
3.7.4. Kết quả giải trình tự và so sánh đoạn giải trình tự với trình tự
MCV trên dữ liệu NCBI....................................................................81
3.7.5. Tỷ lệ nhiễm MCV ở nhóm bệnh nhân ung thư phổi không tế bào
nhỏ và nhóm chứng người bình thường............................................81
3.8. Mối liên quan giữa biểu hiện mRNA của CIZ1b và VEGF với
các đặc điểm lâm sàng và cận lâm sàng............................................82
3.8.1. Mối liên quan giữa biểu hiện mRNA của CIZ1b và VEGF với
các rối loạn tế bào máu ngoại vi......................................................82
3.8.2. Mối liên quan giữa biểu hiện mRNA của CIZ1b và VEGF với rối
loạn hoạt độ men gan........................................................................83
3.8.3. Mối liên quan giữa biểu hiện mRNA của CIZ1b và VEGF với rối
loạn nồng độ Glucose máu...............................................................83
3.8.4. Mối liên quan giữa biểu hiện mRNA của CIZ1b và VEGF với mô
bệnh học của khối u..........................................................................84
3.8.5. Mối liên quan giữa biểu hiện mRNA của CIZ1b và VEGF với độ
biệt hóa của khối u............................................................................85
3.8.6. Mối liên quan giữa biểu hiện mRNA của CIZ1b và VEGF với
giai đoạn của bệnh............................................................................85
3.8.7. Mối liên quan giữa biểu hiện mRNA của CIZ1b và VEGF với đột
biến gen EGFR..................................................................................86
3.8.8. Mối tương quan giữa biểu hiện mRNA của CIZ1b và VEGF với
các chỉ số cận lâm sàng....................................................................87
3.9. Mối liên quan giữa nhiễm MCV và ung thư phổi không tế bào
nhỏ........................................................................................................91
3.9.1. Mối liên quan giữa nhiễm MCV với giai đoạn bệnh và độ biệt
hoá tế bào khối u trong ung thư phổi không tế bào nhỏ...................91
3.9.2. Mối liên quan giữa nhiễm MCV với các đặc điểm cận lâm sàng
..........................................................................................................92
3.9.3. Mối liên quan giữa nhiễm MCV với marker ung thư..........................93
3.9.4. Mối liên quan giữa nhiễm MCV với đột biến EGFR...........................93
3.9.5. Mối liên quan giữa nhiễm MCV với mức độ biểu hiện gene
VEGF và CIZ1b................................................................................94
3.10. Giá trị chẩn đoán ung thư phổi không tế bào nhỏ của CIZ1b
và VEGF...............................................................................................94
3.10.1. Giá trị chẩn đoán ung thư phổi không tế bào nhỏ của biểu hiện
mRNA của CIZ1b..............................................................................95
3.10.2. Giá trị chẩn đoán ung thư phổi không tế bào nhỏ của biểu hiện
mRNA của VEGF..............................................................................95
CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN...........................................................................97
4.1. Một số đặc điểm chung của nhóm bệnh nhân ung thư phổi
không tế bào nhỏ.................................................................................98
4.1.1. Tuổi mắc bệnh.....................................................................................98
4.1.2. Giới.....................................................................................................98
4.1.3. Đặc điểm lâm sàng và cận lâm sàng ở bệnh nhân ung thư phổi
không tế bào nhỏ...............................................................................99
4.2. Mức độ biểu hiện mRNA của gen CIZ1b, VEGF, đột biến
EGFR và tỷ lệ nhiễm Virus Merkel Cell ở bệnh nhân ung thư
phổi không tế bào nhỏ.......................................................................101
4.2.1. Mức độ biểu hiện mRNA của gen CIZ1b ở bệnh nhân ung thư
phổi không tế bào nhỏ.....................................................................101
4.2.2. Mức độ biểu hiện mRNA của gen VEGF ở bệnh nhân ung thư
phổi không tế bào nhỏ.....................................................................104
4.2.3. Đột biến EGFR ở bệnh nhân ung thư phổi không tế bào nhỏ
trong nghiên cứu.............................................................................108
4.2.4. Tỷ lệ nhiễm MCV ở bệnh nhân ung thư phổi không tế bào nhỏ
trong nghiên cứu.............................................................................110
4.3. Mối liên quan giữa mức độ biểu hiện mRNA của gen CIZ1b,
VEGF, đột biến EGFR với nhiễm virus Markel cell và một số
triệu chứng lâm sàng, cận lâm sàng ở bệnh nhân ung thư phổi
không tế bào nhỏ................................................................................111
4.3.1. Mối liên quan giữa biểu hiện gen CIZ1b với lâm sàng và cận lâm
sàng ở ung thư phổi không tế bào nhỏ............................................111
4.3.2. Hiệu quả chẩn đoán của CIZ1b trong ung thư phổi.........................112
4.3.3. Mối liên quan giữa biểu hiện gen VEGF với lâm sàng và cận lâm
sàng của ung thư phổi.....................................................................113
4.3.4. Kiểu gen VEGF và tiên lượng điều trị ung thư phổi.........................114
4.4. Mối liên quan giữa tình trạng nhiễm MCV và ung thư phổi.........117
KẾT LUẬN.................................................................................................119
KIẾN NGHỊ...............................................................................................121
DANH MỤC BÀI BÁO ĐÃ CÔNG BỐ KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
CỦA ĐỀ TÀI LUẬN ÁN...........................................................................122
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
Phần viết tắt
Phần viết đầy đủ
ALK
Anaplastic lymphoma kinase
ALT
Alanin transaminase (enzyme chuyển amin của Alanin)
AFP
Alpha-fetoprotein
ATP
Adenosine triphosphate
AST
Aspartate transaminase (Enzym chuyển amin của Aspartate)
AUC
Area under the curve (diện tích dưới đường cong)
BN
Bệnh nhân
CIZ1
Protein Cip1-interacting zinc finger
CIZ1b
Biến thể b của Protein Cip1-interacting zinc finger
COPD
Chronic obstructive pulmonary disease (Bệnh phổi tắc nghẽn
mạn tính)
CT
Computed Tomography (chụp cắt lớp vi tính)
CEA
Carcinoma Embryonic Antigen
DNA
Deoxyribonucleic Acid
EGFR
epidermal growth factor receptor (gen mã hóa thụ thể yếu tố
tăng trưởng biểu bì - EGFR)
ELISA
Enzyme linked immuno sorbent assay (Xét nghiệm miễn
dịch gắn enzyme)
FDA
Food and Drug Administration (Cơ quan Quản lý Thực phẩm
và Thuốc Hoa Kỳ)
IARC
International Agency for Research on Cancer (Cơ quan
nghiên cứu ung thư thế giới)
IL
Interleukin
mRNA
Messenger RNA (RNA thông tin)
MCC
Merkel cell carcinoma
MCV/
MCPyV
Merkel Cell Polyomavirus
NCBI
National Center for Biotechnology Information (Trung tâm
quốc gia về thông tin công nghệ sinh học)
PCR
Polymerase chaine reaction (Phản ứng chuỗi polymerase)
PET
Positron Emission Tomography (Chụp cắt lớp bằng phóng
xạ)
PSA
Prostate-specific antigen (Kháng nguyên đặc hiệu tuyến tiền
liệt)
ROC
Receiver Operating Characteristic (đường cong đặc trưng
hoạt động của bộ thu nhận)
cDNA
complementary Deoxyribonucleic Acid
RNA
Ribonucleic acid
SNP
Single Nucleotide Polymorphism (Đa hình Nucleotide đơn)
UTBMT
Ung thư biểu mô tuyến
UTBMTBG
Ung thư biểu mô tế bào gai
UTP
Ung thư phổi
UTPKTBN
Ung thư phổi không tế bào nhỏ
UTPTBL
Ung thư phổi tế bào lớn
UTPNP
Ung thư phổi nguyên phát
VEGF
Vascular Endothelial Growth Factor (Yếu tố tăng trưởng nội
mô mạch máu)
VEGFR
Vascular Endothelial Growth Factor Receptor (thụ thể của
yếu tố tăng trưởng nội mạch - VEGFR)
WHO
World Health Organization (Tổ chức Y tế Thế giới)
DANH MỤC BẢNG
Bảng
Tên bảng
Trang
2.1. Trình tự các mồi được sử dụng trong nghiên cứu................................40
2.2. Một số trang thiết bị, máy móc chính sử dụng trong nghiên cứu.........41
2.3. Thành phần phản ứng tổng hợp cDNA.................................................42
2.4.
Thành phần phản ứng real-time PCR cho gen ABL, CIZ1b và
VEGF...................................................................................................43
2.5. Thành phần phản ứng real-time PCR bằng bộ sinh phẩm
Super-ARMS® EGFR Mutation Detection Kit................................47
2.6. Giá trị Cut off của các loại đột biến..................................................48
2.7. Thành phần phản ứng real-time PCR phát hiện MCV..................51
3.1. Đặc điểm tuổi của các nhóm nghiên cứu..............................................63
3.2. Phân bố về tuổi của các bệnh nhân ung thư phổi không tế bào nhỏ
.............................................................................................................63
3.3. Đặc điểm về giới của các nhóm nghiên cứu.........................................64
3.4. Đặc điểm tế bào máu ngoại vi của nhóm bệnh ung thư phổi không
tế bào nhỏ............................................................................................66
3.5. Hoạt độ men gan của nhóm bệnh ung thư phổi không tế bào nhỏ
.............................................................................................................66
3.6. Chức năng thận của nhóm bệnh nhân ung thư phổi không tế bào
nhỏ.......................................................................................................67
3.7. Nồng độ Glucose máu của bệnh nhân ung thư phổi không tế bào
nhỏ.......................................................................................................67
3.8. Đặc điểm Ion đồ của nhóm bệnh ung thư phổi không tế bào nhỏ........67
3.9. Một số đặc điểm của dấu ấn ung thư liên quan đến ung thư phổi
không tế bào nhỏ.................................................................................68
3.10. Vị trí khối u tại phổi ở bệnh nhân ung thư phổi không tế bào
nhỏ........................................................................................................69
3.11. Vị trí hạch ở các bệnh nhân ung thư phổi không tế bào nhỏ.........69
3.12. Kết quả đặc điểm mô bệnh học...........................................................70
3.13. Độ biệt hóa của khối u ở các bệnh nhân ung thư phổi không tế
bào nhỏ................................................................................................70
Bảng
Tên bảng
Trang
3.14. Phân loại giai đoạn theo TNM của nhóm bệnh nhân ung thư phổi
không tế bào nhỏ.................................................................................71
3.15. Một số chỉ số tế bào máu ngoại vi của nhóm người bình thường........71
3.16. Một số đặc điểm về xét nghiệm hoạt độ men gan thận và dấu ấn
ung thư của nhóm người bình thường.................................................72
3.17. Kết quả so sánh các chỉ số cận lâm sàng giữa nhóm bệnh nhân
ung thư phổi không tế bào nhỏ và nhóm người bình thường..............73
3.18. Kết quả nồng độ DNA và OD 260/280 của nhóm bệnh nhân ung
thư phổi không tế bào nhỏ và nhóm người bình thường.....................74
3.19. Giá trị Ct của CIZ1b thu được từ phản ứng real-time PCR..................75
3.20. Giá trị Ct của VEGF thu được từ phản ứng real-time PCR..................75
3.21. Giá trị Ct của ABL thu được từ phản ứng real-time PCR.....................76
3.22. Biểu hiện mRNA của CIZ1b huyết tương ở nhóm nghiên cứu............76
3.23. Biểu hiện mRNA của VEGF huyết tương ở nhóm nghiên cứu............77
3.24. Vị trí đột biến trên gen EGFR ở bệnh nhân ung thư phổi không tế
bào nhỏ................................................................................................79
3.25. Tỷ lệ nhiễm MCV ở nhóm bệnh và nhóm chứng.................................82
3.26. Biểu hiện mRNA của CIZ1b và VEGF và các rối loạn tế bào máu
ngoại vi................................................................................................82
3.27. Biểu hiện mRNA của CIZ1b và VEGF và rối loạn hoạt độ men
gan.......................................................................................................83
3.28. Biểu hiện mRNA của CIZ1b và VEGF với rối loạn Glucose máu
.............................................................................................................84
3.29. Biểu hiện mRNA của CIZ1b và VEGF và đặc điểm mô bệnh học
của khối u............................................................................................84
3.30. Biểu hiện mRNA của CIZ1b và VEGF và độ biệt hóa của khối u
.............................................................................................................85
3.31. Biểu hiện mRNA của CIZ1b và VEGF và giai đoạn của bệnh.............86
3.32. Biểu hiện mRNA của CIZ1b và VEGF và đột biến gen EGFR............86
3.33. Mối tương quan quan giữa biểu hiện mRNA của CIZ1b và VEGF
với các chỉ số tế bào máu ngoại vi......................................................87
3.34. Mối tương quan quan giữa biểu hiện mRNA của CIZ1b và VEGF
với các chỉ số Ion đồ............................................................................88
Bảng
Tên bảng
Trang
3.35. Mối tương quan quan giữa biểu hiện mRNA của CIZ1b và
VEGF với các chỉ số hoạt độ men gan.............................................88
3.36. Mối tương quan quan giữa biểu hiện mRNA của CIZ1b và VEGF
với các chỉ số chức năng thận..............................................................90
3.37. Mối tương quan quan giữa biểu hiện mRNA của CIZ1b và VEGF
với các marker ung thư........................................................................90
3.38. Mối liên quan giữa giai đoạn bệnh và nhiễm MCV........................91
3.39. Mối liên quan giữa độ biệt hoá tế bào khối u và nhiễm MCV
...............................................................................................................91
3.40. Mối liên quan giữa nhiễm MCV với một số chỉ số tế bào máu
ngoại vi và Sinh hoá............................................................................92
3.41. Mối liên quan giữa nhiễm MCV với marker ung thư.....................93
3.42. Mối liên quan giữa nhiễm MCV với đột biến EGFR......................93
3.43. Mối liên quan giữa nhiễm MCV với mức độ biểu hiện gen
VEGF và CIZ1b...................................................................................94
DANH MỤC HÌNH
Hình
Tên hình
Trang
1.1. Dịch tễ học ung thư phổi trên thế giới....................................................4
1.2. Tăng sinh mạch (angiogensis) là một trong sáu đặc điểm nổi bật
của tế bào ung thư...................................................................................9
1.3. Cấu trúc phân tử của gen VEGF.........................................................19
1.4. Sơ đồ cấu trúc protein CIZ1.................................................................23
1.5. Cấu trúc các biến thể của CIZ1...........................................................25
1.6. Con đường tín hiệu qua EGFR.............................................................27
1.7. Hình ảnh Merkel cell polyomavirus phân lập được trong bệnh ung
thư tế bào merkel...................................................................................29
1.8. Cấu trúc bộ gen của MCV..........................................................................................30
2.1. Hình ảnh giải phẫu bệnh của ung thư biểu mô tế bào gai....................54
2.2. Hình ảnh giải phẫu bệnh của ung thư biểu mô tuyến...........................55
2.3. Hình ảnh giải phẫu bệnh của ung thư biểu mô tế bào lớn ...................55
2.4. Độ 1 - Carcinom tế bào gai biệt hóa rõ................................................56
2.5. Độ 2 - Carcinom tế bào gai biệt hóa vừa..............................................56
2.6. Độ 3 - Carcinom tế bào gai biệt hóa kém.............................................57
2.7. Độ 1 - Carcinom tuyến biệt hóa rõ.......................................................57
2.8. Độ 2 - Carcinom tuyến biệt hóa vừa....................................................58
2.9. Độ 3 - Carcinôm tuyến biệt hóa kém.........................................................................58
3.1. Triệu chứng lâm sàng của bệnh nhân ung thư phổi không tế bào
nhỏ khi nhập viện..................................................................................64
3.2. Tiền căn cá nhân của các bệnh nhân ung thư phổi không tế bào
nhỏ.........................................................................................................65
3.3. Mức độ biểu hiện của mRNA của CIZ1b huyết tương ở các nhóm
nghiên cứu.............................................................................................77
3.4. Mức độ biểu hiện của mRNA của VEGF huyết tương ở các nhóm
nghiên cứu.............................................................................................78
3.5. Tín hiệu real-time PCR phát hiện đột biến EGFR trên exon 21 (đột
biến L858R) ở bệnh nhân ung thư phổi không tế bào nhỏ....................78
Hình
Tên hình
Trang
3.6. Tín hiệu real-time PCR phát hiện MCV huyết tương ở người bình
thường....................................................................................................79
3.7. Tín hiệu real-time PCR phát hiện MCV huyết tương ở bệnh nhân
ung thư phổi không tế bào nhỏ..............................................................80
3.8. Kết quả điện di sản phẩm PCR nhân bản MCV- DNA trong huyết
tương của một số bệnh nhân ung thư phổi không tế bào nhỏ và
người bình thường.................................................................................80
3.9. Kết quả giải trình tự đoạn gen MCV (A) và so sánh với trình tự
MCV trên dữ liệu NCBI (B)..................................................................81
3.10. Mối tương quan giữa biểu hiện mRNA của CIZ1b hoạt độ ALT.........89
3.11. Mối tương quan giữa biểu hiện mRNA của CIZ1b hoạt độ AST.........89
3.12. Giá trị chẩn đoán ung thư phổi không tế bào nhỏ của biểu hiện
mRNA của CIZ1b..................................................................................95
3.13. Giá trị chẩn đoán ung thư phổi không tế bào nhỏ của biểu hiện
mRNA của VEGF..................................................................................95
4.1. Nồng độ protein CIZ1 trên các nhóm bệnh ung thư phổi ..................102
1
ĐẶT VẤN ĐỀ
Ung thư phổi nguyên phát (UTPNP) là một trong những bệnh lý ác tính
thường gặp nhất hiện nay và là nguyên nhân gây tử vong hàng đầu trong các
bệnh lý ung thư. Theo Tổ chức nghiên cứu ung thư quốc tế (IARC), UTPNP
chiếm khoảng 12% ung thư các loại và chiếm 18% tỷ lệ tử vong trong các
bệnh ung thư [1]. Trong đó, ung thư phổi không tế bào nhỏ (UTPKTBN)
chiếm hơn 80% các trường hợp UTPNP [2], [3]. Tại Việt Nam, ung thư phổi
(UTP) có sự gia tăng nhanh chóng, đó là hậu quả của tình trạng hút thuốc lá, ô
nhiễm không khí, khói bụi và chất thải công nghiệp…
Mặc dù đã có nhiều tiến bộ trong chẩn đoán sớm và điều trị UTP,
nhưng khi phát hiện hầu hết các trường hợp thường đã muộn. Tỷ lệ sống thêm
5 năm chỉ khoảng 16% đối với các bệnh nhân được chẩn đoán UTP thời kỳ
cuối so với 70-90% khi bệnh được chẩn đoán và điều trị ở các giai đoạn sớm
hơn [1]. Vì vậy, chẩn đoán và điều trị sớm UTP là một chiến lược nhiều triển
vọng để giảm tỷ lệ tử vong và kéo dài thời gian sống cho bệnh nhân. Với sự
phát triển nhanh chóng của y sinh học, đặc biệt là sinh học phân tử ngày càng
góp phần đáng kể vào công tác chẩn đoán, theo dõi điều trị, cũng như tiên
lượng UTPNP. Gần đây, các nghiên cứu về gen Cip1-interacting zinc finger
(CIZ1), một gen mã hoá cho một protein nội bào tham gia vào sự khởi đầu tái
bản Deoxyribonucleic Acid (DNA), trong đó, biến thể b của Cip1-interacting
zinc finger (CIZ1b), biểu hiện nhiều ở mô ung thư UTPKTBN, là một dấu ấn
phân tử có thể phát hiện sớm UTPNP. Biểu hiện của CIZ1b trong huyết tương,
có giá trị chẩn đoán 98% các trường hợp UTPNP so với bình thường, hoặc
95% trường hợp so với u phổi lành tính [3]. Bên cạnh đó, yếu tố tăng trưởng
nội mô mạch máu - Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) có vai trò hết
sức quan trọng trong sự phát triển của khối u. VEGF vừa thúc đẩy hình thành
2
mạch máu nuôi vừa thúc đẩy khối ung thư phát triển. Biểu hiện VEGF ở huyết
tương có giá trị trong chẩn đoán, tiên lượng và dự đoán kết quả điều trị
UTPNP [4],[5].
Đột biến Epidermal growth factor receptor (EGFR) đóng vai trò hết sức
quan trọng trong cơ chế bệnh sinh UTP và là đích phân tử có giá trị trong việc
điều trị. Mang lại những hiệu quả rõ rệt trong việc kéo dài thời gian sống
thêm và cải thiện chất lượng cuộc sống của bệnh nhân UTPKTBN.
Vai trò của truyền nhiễm trong UTP đã được nghiên cứu và chứng
minh, trong đó có vai trò của nhiễm virus như Human papillomavirus (HPV),
Epstein-Barr virus (EBV) và gần đây là nhiễm Virus Merkel cell (Merkel cell
Carcinoma virus - MCV). Các nghiên cứu cho thấy có sự liên quan rõ rệt giữa
nhiễm MCV với nguy cơ UTPKTBN và đột biến EGFR.
Tuy nhiên, ở nước ta giá trị của biểu hiện gen CIZ1b, VEGF và đột biến
EGFR với tình trạng nhiễm MCV trong UTP nói chung và UTPKTBN nói
riêng chưa được nghiên cứu. Chính vì vậy, chúng tôi thực hiện đề tài:
“Nghiên cứu sự biểu hiện mRNA của gen CIZ1b, VEGF và đột biến EGFR
với nhiễm virus Merkel cell ở bệnh nhân ung thư phổi không tế bào nhỏ”
với mục tiêu:
1. Đánh giá mức độ biểu hiện mRNA của gen CIZ1b, VEGF, đột biến EGFR
và tỷ lệ nhiễm virus Merkel cell ở bệnh nhân UTPKTBN.
2. Phân tích mối liên quan giữa mức độ biểu hiện mRNA của gen CIZ1b,
VEGF, đột biến EGFR với nhiễm virus Merkel cell và một số triệu chứng lâm
sàng, cận lâm sàng ở bệnh nhân UTPKTBN.
3
CHƯƠNG 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Đại cương về ung thư phổi
1.1.1. Tình hình ung thư phổi trên thế giới
Ung thư phổi hiện nay vẫn là loại phổ biến nhất cả về tần suất mắc
bệnh và tử vong, đặc biệt tại Mỹ, Hàn Quốc và hầu hết các nước châu Á- Thái
bình dương [1]. Trên toàn thế giới có khoảng 2,1 triệu ca UTP mới được phát
hiện và dự đoán có đến 1,8 triệu ca tử vong trong năm 2018 chiếm đến hơn
18% tổng số ca tử vong do ung thư. Ở nam giới, UTP là nguyên nhân hàng
đầu gây tử vong ở hầu hết các nước ở Đông Âu, Tây Á (đáng chú ý là ở Liên
Xô cũ), Bắc Phi, Trung Quốc và Đông Nam Á (ví dụ: Myanmar, Philippines
và Indonesia). Ở nữ, UTP là nguyên nhân hàng đầu gây tử vong ở 28 quốc
gia. Tỷ lệ mắc cao nhất được thấy ở Bắc Mỹ, Bắc và Tây Âu (đáng chú ý là ở
Đan Mạch và Hà Lan), Úc/New Zealand, đặc biệt Hungary đứng hàng đầu tỷ
lệ mắc bệnh lý này [1].
Tại Mỹ, năm 2018, theo Global cancer statistics 2018, dự báo có
khoảng 234.030 case mắc mới (nam 121.680 case, nữ 112.350 case) [1].
Ở các nước Châu Âu, tỷ lệ mắc UTP năm 2018 có khác nhau giữa các
vùng: cao nhất là ở Đông Âu 49,3 case/100.000 người đối với nam và 11,9
case/100.000 đối với nữ, Tây âu và Nam Âu tương tự nhau khoảng 43
case/100.000 đối với nam và hơn 16 case/100.000 đối với nữ. Đông- Nam Á
gặp 26,3 case/100.000 với nam và 9,6 case/100.000 với nữ. UTP thường gặp
ở nam nhiều hơn nữ. Tuy nhiên, tỷ lệ này đang có xu hướng giảm dần, nhất là
ở những nước phát triển. Tỷ lệ mắc bệnh giữa nam và nữ thay đổi theo địa lý
và thời gian. Tại Mỹ và Bắc Mỹ tỷ lệ nam/nữ hiện nay tương ứng là 1/1, tại
4
Đông Âu 4/1, Tây Âu là 2/1. Đông – Nam Á tỷ lệ nam/ nữ khoảng 3/1 [1].
Hình 1.1. Dịch tễ học ung thư phổi trên thế giới
*Nguồn: theo Global cancer statistics (2018) [1]
1.1.2. Tuổi và giới
* Tuổi
Các nghiên cứu nhận thấy ở tuổi càng cao thì nguy cơ mắc bệnh càng
cao [6]. Theo tác giả de Groot P. M. và cs (2018) thì bệnh thường gặp ở 55-74
tuổi (chiếm 53%) [6]. Tuổi trung bình cho cả nam và nữ là 70, có 37% mắc
UTP là trên 75 tuổi [6]. Có 10% bệnh nhân UTP tuổi dưới 55 [6]. Tuy nhiên
người ta nhận thấy UTP đang có xu hướng trẻ hóa, đã có các nghiên cứu về
UTP ở lứa tuổi 20-46, nhất là ung thư biểu mô tuyến. Đặc biệt là ở nữ giới và
không liên quan đến thuốc lá. Việc UTP có xu hướng trẻ hóa, nhất là không
5
liên quan đến thuốc lá có lẽ liên quan đến mối tương tác giữa yếu tố gen và
môi trường sống [6].
* Giới
UTP thường gặp ở nam nhiều hơn nữ. Tỷ lệ mắc bệnh giữa nam và nữ
thay đổi theo địa lý và thời gian. Theo Global cancer statistics 2018, Tại Đông
Âu tỷ lệ nữ /nam 1/4, Bắc Âu 1/1,3 , Đông Á 1/1,8, Tây Á 1/5, Bắc Mỹ tỷ lệ
này là 1/ 1,3, Nam và Trung Mỹ 1/1,6, Nam Phi 1/3 [1].
Tại Việt Nam, tỷ lệ mắc UTP cũng đang có xu hướng cân bằng giữa
nam và nữ, theo Globocan cancer statistics 2018 tỷ lệ nam/nữ là 2,5/1 [1].
1.1.3. Tỷ lệ tử vong
UTP là nguyên nhân tử vong hàng đầu trong các bệnh ác tính trên thế
giới ở cả nam và nữ với số tử vong hàng năm chiếm gần 1/5 (18,4%) trong số
tử vong do các bệnh ung thư [1]. Năm 2018, toàn thế giới có khoảng 2,1 triệu
người mắc mới UTP trong đó có khoảng 1,8 triệu trường hợp tử vong, chiếm
18,4% tổng số tử vong do ung thư [1]. Số tử vong do UTP năm 2018 nhiều
hơn tổng số tử vong do ung thư vú, tụy, tiền liệt tuyến và cũng nhiều hơn tổng
số tử vong do ung thư gan và ung thư dạ dày [1]. Tỷ lệ tử vong do UTP đứng
đầu số tử vong do ung thư ở nam và đứng thứ 2 ở nữ sau ung thư vú [1]. Ở
Nam giới, UTP là nguyên nhân gây tử vong hàng đầu ở các nước thuộc Đông
Âu, Tây Á, Bắc Phi, một số nước Đông Á và Đông – Nam Á (Myanmar,
Philippines và Indonesia) [1].
1.1.4. Tình hình ung thư phổi ở Việt Nam
Ở Việt Nam, theo Globocan cancer statistics 2018, hàng năm có khoảng
23.667 người mắc mới UTP (sau ung thư Gan), chiếm 15,48% tổng số các
loại mắc mới ung thư. Trong đó khoảng 90% tử vong trong 5 năm đầu. Tỷ lệ
nam mắc nhiều hơn nữ (Nam/ nữ gần 2,5/1) [1].
6
UTP đứng hàng thứ 2 ở nam giới sau ung thư gan, năm 2018 có 16.722
trường hợp nam giới bị UTP, chiếm 14,4 % tổng số các bệnh ung thư [1]. Ở
nữ, UTP đứng thứ 3 sau ung thư vú và ung thư trực tràng. Năm 2018 có 6945
case mắc mới chiếm 9,4% trong tất cả các loại ung thư.
UTP đang có sự gia tăng nhanh chóng ở Việt Nam, nó liên quan đến
tình trạng hút thuốc lá, nạn ô nhiễm không khí, khói bụi và chất thải công
nghiệp cũng như tình hình nhiễm một số virus gây ung thư như Human
papillomavirus (HPV), Merkel cell poliomavirus (MCV hoặc MCPyV).
1.1.5. Nguyên nhân gây ung thư phổi
1.1.5.1. Hút thuốc lá
Theo tổ chức Y tế thế giới (World Health Organization - WHO), thuốc
lá vẫn là nguyên nhân hàng đầu gây UTP hiện nay trên thế giới. Thuốc lá
cũng là nguyên nhân gây UTP và tử vong ở Mỹ và các nước châu Âu và tỷ lệ
người trẻ và nữ giới có xu hướng tăng lên do có liên quan đến thuốc lá ở các
nước này [6].
Theo WHO (2015), thuốc lá là nguyên nhân liên quan đến cái chết của
965.500 bệnh nhân UTP trong năm 2010 [7]. WHO cũng chỉ ra rằng hút thuốc
lá làm tăng nguy cơ UTP lên 20-30 lần so với người không hút thuốc [7].
1.1.5.2. Sợi Amian
Amian là những sợi silicat rất nhỏ và nhẹ mà mắt người không thể nhìn
thấy được. Tiếp xúc với amian gây ra những nguy cơ nghiêm trọng về loạn
sản biểu mô và UTP . Mối liên quan giữa tiếp xúc với amian và UTP đã được
chứng minh. Những người thường xuyên tiếp xúc với amian có nguy cơ mắc
UTP cao gấp 5 lần người thường. Nhưng những người thường xuyên tiếp xúc
với amian mà hút thuốc lá thì nguy cơ phát triển UTP càng tăng [6].
1.1.5.3. Khí Radon
