Nghiên cứu và sử dụng chế phẩm vi sinh vật bản địa đối kháng với một số nấm gây hại rễ cây hồ tiêu tại đăk lắk tt

1

MỞ ĐẦU
Tây Nguyên có gần 2 triệu ha đất bazan màu mỡ, chiếm đến 60 % đất bazan của cả nước, rất phù
hợp với những cây công nghiệp như cà phê, ca cao, hồ tiêu, dâu tằm, chè. Hồ tiêu là một trong những cây
công nghiệp quan trọng ở Tây Nguyên. Theo số liệu của Bộ NN và PTNT, năm 2019, cả nước hiện có gần
145.447 ha hồ tiêu. Diện tích hồ tiêu ở Tây Nguyên chiếm hơn 1/2 diện tích hồ tiêu của cả nước.
Khu vực Tây Nguyên, cây tiêu thường bị bệnh thối rễ tác nhân chính do các loại nấm bệnh
Fusarium oxysporum, Fusarium solani, Rhizoctonia solani, Phytophthora sp.và một số tác nhân gây hại
khác làm tình trạng hồ tiêu chết hàng loạt diễn biến phức tạp. Việc sử dụng thuốc hóa học trong nơng
nghiệp trong đó có thuốc trừ nấm ngày càng nhiều gây ảnh hưởng xấu đến môi trường và làm giảm chất
lượng sản phẩm khi dư lượng thuốc cao.
Tây Nguyên từ lâu được xem là mỏ “vàng đen” của Việt Nam, “vàng đen” đã từng giúp rất nhiều
nông dân trở thành tỷ phú. Nhưng hiện nay, “thủ phủ vàng đen” đang trong vịng xốy của nợ nần.
Nguyên nhân do hàng loạt rẫy tiêu bị dịch bệnh chết cây, héo rũ phủ kín. Diên tích hồ tiêu tăng nhanh,
người nông dân sản xuất hồ tiêu theo kiểu tận thu, áp dụng nhiều biện pháp canh tác miễn sao đạt được
mục đích năng suất cao dẫn đến tình trạng bệnh càng hại nặng. Chính vì vậy, đề tài “Nghiên cứu và sử

dụng chế phẩm vi sinh vật bản địa đối kháng với một số nấm gây hại rễ cây hồ tiêu tại Đăk Lắk”
sử dụng kỹ thuật metagenomics phân tích đầy đủ hơnvề tác nhân chính gây bệnh hồ tiêu và ứng dụngsản
xuất chế phẩm vi sinh từ vi sinh vật bản địa khu vực nghiên cứu đểphòng trừ nấm bệnh hại rễ, tăng năng
suất, tạo ra sản phẩm sạch, an tồn, có tiêu chuẩn chất lượng đáp ứng nhu cầu trong nước và xuất khẩu,
qua đó góp phần phát triển kinh tế xã hội một cách bền vững.
Mục tiêu nghiên cứu:
- Xác định được tác nhân chính gây bệnh trên cây hồ tiêu dựa vào cơ sở dữ liệu của gene 18s RNA
metagenome tách chiết từ đất hồ tiêu bị bệnh và không bị bệnh.
- Phân lập và tuyển chọn được các chủng vi sinh vật bản địa có khả năng ức chế các tác nhân gây
bệnh trên cây hồ tiêu.
- Sản xuất 01 chế phẩm dựa trên các vi sinh vật bản địa đã được tuyển chọn có khả năng đối
kháng với một số bệnh hại rễ trên cây hồ tiêu và xây dựng mô hình thử nghiệm.
Nội dung luận án

- Đánh giá quần thể eukaryote đất vùng rễ hồ tiêu khu vực bị bệnh và không bị bệnh tại Đăk Lắk.
- Phân lập và tuyển chọn các chủng vi sinh vật bản địa để phòng chống một số tác nhân gây bệnh
rễ trên cây hồ tiêu.
- Đánh giá khả năng phòng trừ bệnh hại rễ cây hồ tiêu tại Đăk Lắk của chế phẩm vi sinh vật bản
địa kháng nấm bệnh.
Những đóng góp mới của luận án
- Bằng kỹ thuật metagenomic đã đánh giá được sự đa dạng của vi nấm và giới phụ Stramenopiles
ở đất trồng vùng rễ cây hồ tiêu tại Đăk Lắk.
- Phân lập và tuyển chọn được một số chủng vi sinh vật bản địa hữu ích kháng một số nấm gây
bệnh cây hồ tiêu.
- Đánh giá hiệu quả của việc sử dụng chế phẩm Polyfa – TN3 đối với cây hồ tiêu.
Cấu trúc của luận án


2

Luận án gồm 119 trang bao gồm: Mở đầu (3 trang); Chương 1: Tổng quan tài liệu (26
trang); Chương 2: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu (15 trang); Chương 3: Kết quả nghiên cứu (40
trang); Chương 4: Bàn luận (17 trang); Kết luận, kiến nghị (2 trang). Danh mục cơng trình cơng bố (1
trang).Tóm tắt luận án bằng tiếng Anh (6 trang); Tài liệu tham khảo (28) có 193 tài liệu, trong đó có 47
tài liệu trong nước và 146 tài liệu ngồi nước, có 40 tài liệu từ 2014 trở lại đây.
CHƯƠNG I: TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU
1.1. Tổng quan về cây hồ tiêu
1.Cây hồ tiêu
2.Tình hình sản xuất và tiêu thụ hồ tiêu trên thế giới
3.Tình hình sản xuất và tiêu thụ hồ tiêu tại Việt Nam
4.Một số bệnh hại chính trên cây hồ tiêu
5.Vi sinh vật đối kháng nấm bệnh trên cây hồ tiêu
1.2. Vai trò của các vi sinh vật trong đất trồng tiêu
1.3. Đánh giá khu hệ vi sinh vật bằng kỹ thuật metagenomics

1.4. Tình hình ứng dụng các chế phẩm vi sinh vật trong phòng trừ bệnh trên hồ tiêu
CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Vật liệu nghiên cứu
2.1.1. Vật liệu phân tích metagenome trong đất vùng rễ cây hồ tiêu khu vực bị bệnh và không bị
bệnh
Nguồn mẫu: các mẫu đất thu thập từ các vườn hồ tiêu bị vàng lá, thối rễ và vườn không bị bệnh
tại huyện Cư M’gar, tỉnh Đăk Lăk (tọa độ thu mẫu 12o49’48.9”N, 108o05’22.5”E). Các mẫu đất được lấy
ở độ sâu 5-30 cm, mỗi vườn lấy 10 điểm và trộn đều chia 4 phần theo đường chéo, chọn hai phần đối diện
nhau để lấy mẫu trung bình, lượng mẫu là 1kg, cho mẫu đất vào túi polypropylen đã được khử trùng ghi
đầy đủ địa điểm, ngày, tên người lấy mẫu và giữ ở 4 oC, đem về phịng thí nghiệm để tách chiết DNA tổng
số và bảo quản ở -20 oC cho các nghiên cứu tiếp theo.Sử dụng túi polypropylen đã được khử trùng, nhãn
ghi chép và bút; hộp giữ lạnh.
Vật liệu tách chiết DNA metagenome
- Dung dịch Lysozyme (10% w/v); dung dịch RNase không chứa DNase (1% w/v); Proteinase K
(1% w/v); dung dịch SDS (10% w/v); dung dịch Cetyltrimethylammonium bromide (CTAB) 10% w/v
hoà trong 0,7 M NaCl; ChCl3 :Isoamyl alcohol; Isopropanol; Ethanol (70% v/v); đệm TE pH 8,0.
- Tách chiết DNA metagenome bằng Kit thương mại: Bộ KIT tách chiết DNA từ đất PowerMax®.
Catalog No.12988-10 của cơng ty MO BIO Laboratories. Xác định nồng độ DNA metagenome: QuantiT™ PicoGreen® Kit.
2.1.2. Vật liệu tạo nguồn gene vi sinh vật phục vụ nghiên cứu
- Các mẫu đất thu thập từ các vùng trồng cây công nghiệp (hồ tiêu, cà phê, cao su) và đất hoàn thổ
sau khai thác bauxit tại Tây Nguyên.
- Các chủng vi sinh vật hữu ích được lựa chọn sản xuất chế phẩm
- Môi trường MPA (pH: 7.4); Môi trường Gauze II (pH: 7 – 7.4); Môi trường Czapek-Dox (pH :
7); hóa chất và hệ thống lên men cần thiết (phụ lục III)


3

2.1.4. Vật liệu bố trí thí nghiệm xây dựng mơ hình sử dụng sản phẩm nghiên cứu trên đất trồng hồ
tiêu

Vật liệu nghiên cứu là các vườn hồ tiêu nằm trong vùng đất đang có dấu hiệu bị thối hố đất,
vườn đang bị sâu bệnh gây hại. Các vườn hồ tiêu được lựa chọn tại huyện Cư M’gar, Đắk Lắk. Hồ tiêu
trên 10 năm tuổi, giống tiêu Vĩnh Linh; mật độ 1.600 cây/ha. Thời gian: Diện hẹp: từ tháng 3/2014 đến
tháng 12/2014; Diện rộng từ tháng 11/2014 đến tháng 12/2015.
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Phương pháp phân tích metagenome trong đất vùng rễ cây hồ tiêu khu vực bị bệnh và không
bị bệnh
Phương pháp tách chiết DNA tổng số của hai mẫu đất lấy từ vườn tiêu bị bệnh và không bị
bệnh: nguyên lý tách DNA metagenomics cơ bản gồm ba bước: (1) phá vỡ tế bào, (2) loại bỏ các thành
phần không mong muốn, (3) thu nhận DNA. Sử dụng bộ KIT tách chiết DNA metagenome từ đất
PowerMax® - Catalog No.12988-10 của công ty MO BIO Laboratories.
Phương pháp phân tích tin sinh học
Cơ sở dữ liệu 18S metagenome được giải trình tự 2 chiều (paired-end) bằng thiết bị giải trình tự
thế hệ mới Illumina HiSeq. Dữ liệu thơ được lưu trữ dưới dạng file fastq. Chất lượng được trình tự được
đánh giá bằng phần mềm FastQC. Hai file fastq được ghép với nhau bằng phần mềm FLASH (Magoč,
2011). Các đoạn trình tự kém chất lượng bị loại bỏ bằng phần mềm Qiime (Caporaso, Gregory và cộng
sự, 2010; Bokulich, Nicholas và cộng sự, 2013). Dữ liệu sau khi tinh sạch sẽ được chia thành các đơn vị
phân loại OTUs bằng phần mềm Upase. Trong đó, các đoạn trình tự giống nhau ≥97% sẽ được xếp vào 1
OTU (Wang, Qiong và cộng sự, 2007). Các OTUs được chú giải phân loài bằng thuật toán RDP classifier
phiên bản 2.2, trên cơ sở dữ liệu SILVA (Quast, Pruesse và cộng sự, 2013). Sắp xếp chuỗi được thực hiện
bằng phần mềm MUSCLE (Phiên bản 3.8.31). Chuẩn hóa dữ liệu, các thơng tin đa dạng của các OTUs
được chuẩn hóa theo tiêu chuẩn số thứ tự tương ứng với mẫu có trình tự ít nhất.
2.2.2. Phương pháp tạo nguồn gene vi sinh vật phục vụ nghiên cứu
2.2.2.1 Phương pháp phân lập
Loại bỏ rác từ các mẫu đất, sau đó nghiền nhỏ trong cối chày sứ (đã khử trùng). Hịa 10 g mỗi
mẫu trong bình nón chứa 90ml nước cất vô trùng, lắc trên máy lắc 200 vòng/phút trong 10-20 phút, lấy 1
mL dung dịch sang ống nghiệm có 9 mL nước vơ trùng và tiếp tục pha loãng tới 10 -3, 10-4, 10-5. Từ mỗi
nồng độ pha lỗng cấy 100 µL vào đĩa petri chứa mơi trường phân lập thích hợp (MPA đối với vi khuẩn,
ISP4 đối với xạ khuẩn, Czapek – Dok đối với vi nấm), ủ ở 37 oC đối với vi khuẩn, 30 oC đối với xạ khuẩn
và 25-30 oC đối với vi nấm. Quan sát sự phát triển của các khuẩn lạc sau các khoảng thời gian ni cấy

thích hợp.
Mật độ vi sinh vật tổng số được tính theo cơng thức sau:

Trong đó: A: số tế bào (đơn vị hình thành khuẩn lạc) trong 1 mL mẫu; N: tổng số khuẩn lạc đếm trên các
đĩa đã chọn; ni: số lượng đĩa cấy tại độ pha lỗng I; V: thể tích dịch mẫu (mL) cấy vào trong mỗi đĩa; fi:
độ pha loãng tương ứng.


4

Các khuẩn lạc mọc riêng rẽ sẽ được làm sạch và giữ giống trong glyxerol lỏng (70 % giống + 30
% Glyxerol) ở -80 oC.
2.2.2.2. Phương pháp xác định hoạt tính đối kháng nấm bệnh của vi sinh vật
Các chủng vi khuẩn/xạ khuẩn được nuôi trong môi trường dịch thể, lắc trên máy lắc 220
vòng/phút. Sau 1-2 ngày, lọc lấy dịch trong, nhỏ vào các lỗ thạch đã đục sẵn trong đĩa petri đã cấy vi sinh
vật kiểm định. Để tủ lạnh 30 phút cho cơ chất khuếch tán vào thạch, sau đó ni ở 30 oC. Sau 1-3 ngày,
xác định vịng đối kháng. HTKS = D-d (mm);
D: Đường kính vịng kháng khuẩn; d: Đường kính lỗ
2.2.2.3 Phương pháp xác định khả năng ức chế nấm bệnh của các chủng nấm (Abdel-Motaal FF và
cộng sự, 2010)
Hai khoanh nấm (nấm phân lập và nấm bệnh) được cấy đối xứng nhau trên đĩa Petri và mỗi bên cách
tâm 3cm, trong đó nấm bệnh được cấy trước 1 ngày.
Đánh giá khả năng ức chế sự phát triển hệ sợ nấm(PIMG): Sau 7 ngày ni cấy đối kháng trực
tiếp, đo đường kính của khuẩn lạc nấm bệnh trên đĩa có cấy chủng được cho là có hoạt tính đối
kháng (R2) và đường kính của khuẩn lạc nấm bệnh trên đĩa đối chứng (R1). Phần trăm ức chế được tính
theo cơng thức:
PIMG = (R1 –R2)/R1 ×100
R1, R2 - đường kính khuẩn lạc nấmbệnh; T- khuẩn lạc chủng nấm đối kháng
Đánh giá mức độ đối kháng: (+++) Đối kháng mạnh: chủng nấm phân lập mọc trùm lên và lấn át
sự phát triển của nấm bệnh, làm cho sợi nấm chết lụi dần; (++) Đối kháng trung bình: chủng nấm phân

lập mọc trùm lên nấm bệnh nhưng sợi nấm bệnh không bị chết lụi; (+) Đối kháng yếu: chủng nấm phân
lập lúc đầu phát triển mạnh, nhưng bị chậm lại và không phủ lên nấm bệnh; (-) Không đối kháng: nấm
bệnh phát triển mạnh phủ lên chủng nấm phân lập.
2.2.2.4. Phương pháp tách chiết DNA tổng số
Cặn tế bào sau khi ly tâm 10000 rpm trong 5 phút được hòa lại trong dung dịch đệm TE 10:1 (Tris
HCl + EDTA), ly tâm tiếp 10000 rpm trong 2 phút, loại bỏ dịch nổi. Bổ sung 400 μL TE, 20μL SDS 10 %
và 3 μL proteaza K, đảo đều và ủ ở 37 oC trong khoảng 1h để phá vỡ tế bào và loại bỏ protein.
Bổ sung tiếp100 μL NaCl 5M, đảo đều, ủ ở 65 oC trong 10 phút. Thu dịch, loại bỏ polysaccrit và
chất bẩn ở đáy. Chiết DNA hai lần bằng 500 μL dung dịch chloroform:isomylalcohol (24:1). Tủa DNA
bằng cách bổ sung NAOAc 3M, cồn 100 % và giữ ở -20 oC tối thiểu trong 1h. Ly tâm loại bỏ dịch nổi,
rửa cặn DNA bằng cồn 70 %, làm khơ DNA. Hịa lại cặn trong đệm TE chứa RNAaza (100 µg/mL), ủ ở
37 oC trong 1h để loại RNA. Nồng độ và độ sạch của DNA được xác định bằng phổ hấp phụ trên máy
quang phổ tử ngoại và điện di trên gel agaroza 1%.
2.2.2.5. Phương pháp PCR khuếch đại đoạn gen 16S rRNA
Bảng 2.1. Cặp mồi sử dụng cho PCR khuếch đại gen 16S rRNA vi khuẩn
Mã hiệu
16SF
16SR

Trình tự
AGA GTT TGA TCA TGG CTC A
AAG GAG GTG ATC CAG CC

Tm(oC)
51
56

%GC
42
59

Cặp mồi sử dụng để khuếch đại gen 16S rRNA của Streptomyces spp. có trình tự:
(St-F): 5´- AAGCCCTGGAAACGGGGT - 3´
(St-R): 5´- CGTGTGCAGCCCAAGACA - 3´) cho sản phẩm PCR ~ 1500 bp.


5

Chu trình nhiệt PCR cho gen 16S rRNA vi khuẩn: 94 oC - 5 phút; 30 chu kỳ (94 oC - 1 phút; 56 oC
- 50 giây; 72 oC - 1 phút 30 giây); 72 oC - 7 phút; kết thúc ở 4 oC.
Chu trình nhiệt PCR cho gen 16S rRNA xạ khuẩn: 94 oC-5 phút; 35 chu kỳ (94oC - 1 phút; 57oC - 1
phút; 72oC - 1 phút 30 giây); 72oC - 10 phút; kết thúc - 4oC.
Bảng 2.2. Thành phần PCR khuếch đại gen 16S rRNA
Thành phần phản ứng
H2O khử ion vô trùng
Taq buffer (+ MgCl2)
DNTP
16SF
16SR
Taq-polymeraza
DNA khuôn

Nồng độ
5 nMol
10 pMol/ µL
10 pMol/ µL
5 U/ µL
50 ng/ µL

Lượng (µl)

15,7
2,5
2,5
1,5
1,5
0,3
1,0

2.2.2.6. Phương pháp giải trình tự gen và xây dựng cây phát sinh loài
Sản phẩm PCR khuếch đại gen 16S rRNA sau khi đã được tinh sạch sẽ được giải trình tự bằng
máy giải trình tự tự động ABI PRISM 3100 (Applied Bioscience). Xử lý trình tự nhận được bằng phần
mềm Bioedit v.2.7.5 và so sánh với cơ sở dữ liệu của ngân hàng gen NBCI bằng phần mềm BLASTn
nhằm tìm ra các chủng có độ tương đồng cao với chủng nghiên cứu. Cây phát sinh loài của các chủng
nghiên cứu được xây dựng bằng phần mềm DNASTAR. Lasergene v.710.
2.2.2.7. Phương pháp xác định đặc tính sinh hóa của vi khuẩn
- Phương pháp nhuộm gram: Chuẩn bị vết bôi, cố định tế bào, sau đó nhuộm bằng dung dịch
Tím kết tinh trong 1 phút, thấm khô. Nhuộm lại bằng dung dịch Iod trong 1 phút, thấm khô. Nhỏ dịch tẩy
màu, giữ khoảng 30 giây, rửa nước, thấm khô. Nhuộm bổ sung bằng dung dịch Safranin trong 2 - 3 phút,
rửa nước, để khơ trong khơng khí. Soi kính: dùng vật kính dầu 100x.
- Xác định khả năng sử dụng đường
- Xác định khả năng lên men – oxi hóa
- Xác định khả năng phân giải tinh bột và casein
- Xác định khả năng phân giải gelatin
- Xác định hoạt tính catalaza
- Xác định khả năng sử dụng citrate
2.2.2.8. Xác định đặc tính sinh hóa của xạ khuẩn
- Khả năng sử dụng các nguồn cacbon (đường
- Sự hình thành sắc tố melanin
- Khả năng sinh enzyme ngoại bào
- Khả năng chịu muối

2.2.2.9. Xác định đặc tính sinh học của nấm
- Khả năng sử dụng các nguồn cacbon và nitơ
- Xác định khả năng chịu muối của nấm
- Thử khả năng sinh enzyme cellulase, protease, amylase


6

2.2.2.10. Phương pháp đánh giá độc tính cấp của chế phẩm vi sinh vật gốc
Động vật thí nghiệm là chuột nhắt trắng chủng Swiss, cả 2 giống, khoẻ mạnh, trọng lượng 18 – 22
g do Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ương cung cấp. Chuột thí nghiệm được ni trong phịng thí nghiệm,
thực hiện các kỹ thuật cần và đủ trước khi thử nghiệm với chế phẩm vi sinh vật gốc.
Xác định LD50 của các loại chế phẩm trên chuột nhắt trắng bằng đường uống theo phương pháp
Litchfield – Wilcoxon và hướng dẫn của WHO.
2.2.3. Phương pháp nghiên cứu hoàn thiện quy trình cơng nghệ lên men các chủng vi sinh vật
nghiên cứu
- Thực hiên phương pháp lên men chìm quy mơ phịng thí nghiệm trong bình tam giác.
- Thực quy mơ pilot với hệ thống lên men thể tích 70 lít.
- Thực hiện lên men xốp thanh trùng (bề mặt) buồng lên men 3m3.
- Thực hiện phương pháp lên men không thanh trùng trên buồng lên men 70 -100 m3.
2.2.4. Phương pháp bố trí thí nghiệm xây dựng mơ hình sử dụng sản phẩm nghiên cứu trên đất
trồng hồ tiêu
Phương pháp bố trí thí nghiệm (theo QCVN-01-172:2014/BNNPTNT)
Đối với thí nghiệm diện hẹp: bố trí khối ngẫu nhiên đầy đủ 3 lần lặp lại gồm 4 công thức (CT),
mỗi công thức 30 cây; lượng phân bón ở các cơng thức sau tính cho 01 cây. Lượng phân POLYFA-TN3
được thí nghiệm áp dụng trên cơ sở quy trình bón phân hữu cơ cho cây hồ tiêu và đặc tính của phân
POLYFA-TN3 với khả năng bổ sung dinh dưỡng khoáng và số lượng VSV hữu ích.
Nền phân vơ cơ đồng loạt cho tồn bộ thí nghiệm (phân NPK 16:8:16) 1,0 tấn/ha. Phân hữu cơ có 4 CT:
CT1: (đối chứng)
bón 2 kg phân chuồng hoai mục

CT2:
bón 1,0 kg phân POLYFA-TN3
CT3:
bón 1,5 kg phân POLYFA-TN3
CT4:
bón 2,0 kg phân POLYFA-TN3
Lượng phân bón trên được bón 2 lần: tháng 6 và tháng 9.
Diện tích ơ cơ sở: 310 m2 tương đương với 60 cây, tổng diện tích thí nghiệm 3.500 m 2 (bao gồm
cả hàng cách ly và bảo vệ). Giữa các cơng thức thí nghiệm có 1 hàng bảo vệ.
Hiệu lực phịng trừ được tính theo cơng thức Henderson – Tilton
Đối với thí nghiệm diện rộng: chỉ sử dụng 2 CT: đ/c bón 2,0 kg/cây phân chuồng hoai mục và
2,0 kg/cây phân POLYFA-TN3 trên nền phân vơ cơ như thí nghiệm diện hẹp; diện tích rộng 10.000 m 2;
Các biện pháp kỹ thuật đã áp dụng
Phân bón vơ cơ được chia làm 4 lần/năm theo tỷ lệ: 40 % - 20 % - 20 % - 20 % vào các tháng:
tháng 5 (mưa ổn định), tháng 7, tháng 9 và tháng 11. Cách bón phân (cả phân vô cơ lẫn phân hữu cơ) hồ
tiêu: rạch hàng theo tán lá, sâu 6-8 cm, rải phân. Tưới nước 3 lần/trong mùa khô. Các biện pháp làm cỏ,
cắt tỉa cành, vét bồn, thu hoạch bằng thủ công. Tất cả biện pháp trên đều đồng đều cho các công thức.
Các chỉ tiêu, phương pháp theo dõi số liệu
Chỉ tiêu đánh giá (theo QCVN – 01 – 172:2014/BNNPTNT)
Đánh giá số gié (chùm quả) trên cây; Yếu tố cấu thành năng suất tiêu: số gié/khung (khung
40x50cm); số quả/gié; Năng suất thực thu (tiêu tươi): dùng cân, cân năng suất thực thu trên mỗi nọc; đơn
vị tính (kg); Điều tra bệnh trên lá: mỗi điểm điều tra 1 trụ, mỗi trụ điều tra 3 tầng tán (tầng gốc, tầng giữa
và tầng ngọn), mỗi tầng điều tra 4 hướng đông, tây, nam, bắc; Tính tỷ lệ bệnh (%); Điều tra bệnh trên


7

cành, thân. Tính tỷ lệ (%) thân bị bệnh. Điều tra định kỳ 30 ngày một lần; Tần số bắt gặp: 1- 25 %: ít phổ
biến (+); ≥ 25 – 50 %: Phổ biến (++); > 50 %: Rất phổ biến (+++)

Hiệu lực phịng trừ được tính theo cơng thức Henderson – Tilton:
Ta x Cb
Hiệu lực (%) = (1 - ------------ ) x 100
Ca x Tb
Thu thấp số liệu trên diện rộng
Chọn 3 mẫu điểm cho mỗi cây trồng, mỗi mẫu điểm 50 cây, từ đó quy đổi cho 01 hecta
- Chỉ tiêu năng suất và bệnh hại: trên diện rộng chỉ lấy số liệu năng suất và bệnh hại chính; chia lơ
lấy 3 điểm với số cây là 50 cây; quy đổi cho 01 hecta.
Ước tính hiệu quả kinh tế
Lợi nhuận tăng thêm = tổng thu sản phẩm công thức thí nghiệm – (tổng thu do phân chuồng + chi
phí tăng thêm do thí nghiệm)
Tỷ suất lợi nhuận tăng thêm (VCR) = lợi nhuận tăng thêm/(tổng chi công thức thí nghiệm – tổng
chi do phân chuồng (Đ/C))
Tỷ suất lợi nhuận tăng thêm (VCR) được tính:

2.2.5. Phương pháp xử lý số liệu
Số liệu được thu thập, tính tốn và xử lý bằng thống kê sinh học bằng phần mềm Excel, IRISTAT
5.0 và SAS 9.1.
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
3.1. Phân tích metagenome trong đất vùng rễ cây tiêu khu vực bị bệnh và không bị bệnh
3.1.1. Tạo cơ sở dữ liệu 18S rRNA metagenome từ mẫu đất
* Tách chiết DNA
Mẫu đất vùng rễ vườn bị bệnh và không bị bệnh từ các vùng trồng hồ tiêu huyện Ea H’Leo tỉnh
Đắk Lắk được dùng để tách DNA metagenome. DNA metagenome được tách bằng bộ KIT tách chiết
DNA từ đất PowerMax® - Catalog No.12988-10 của công ty MO BIO Laboratories theo hướng dẫn sử
dụng của nhà cung cấp. DNA sau khi tinh sạch được chạy điện di để kiểm tra chất lượng. Kết quả cho
thấy, các băng DNA rõ nét, không bị đứt gãy (Hình 3.1) để sử dụng cho phân tích metagenome.
* Đọc trình tự gen 18S rRNA
Gen 18S rRNA được nhân lên bằng cặp mồi EUK1A – 499R với khuôn là ADN metagenome đã
1

tách ở trên được giải trình tự trên máy lllumina Hiseq. Dữ liệu sau khi tinh sạch sẽ được chia thành các
OTUs bằng phần mềm Upase.


8

Hình 3.1. Kết quả điện di ADN tổng số tách chiết từ hai mẫu đất nghiên cứu. Mẫu được điện di với
thể tích 5µl trong thời gian 30 phút ở điện thế 100V
(D1: mẫu đất vườn hồ tiêu bị bệnh; D2: mẫu đất vườn hồ tiêu không bị bệnh)
Giếng 1: ADN maker chuẩn Giếng D1, D2: ADN tách từ mẫu D1 và D1

* Phân tích dữ liệu
Kết quả cho thấy trong mẫu D1 đất vườn tiêu bị bệnh, tổng số tag phân tích là 121.432; số tag
được làm sạch là 105.323; số tag chưa phân loại được là 15.073, số tag chỉ có duy nhất trong mẫu phân
tích là 1.036; số OTUs là 1.574. Mẫu D2 đất vườn tiêu không bị bệnh, tổng số tag phân tích là 103.827;
số tag được làm sạch là 97.102; số tag chưa phân loại được là 4.484, số tag chỉ có duy nhất trong mẫu
phân tích là 2.241; số OTUs là 1.318.

Hình 3.2. Phân tích thống kê các tag và số lượng OTUs của hai mẫu đất phân tích
3.1.2. Thành phần và tỷ lệ eukaryote (sinh vật nhân chuẩn) trong hai mẫu đất trồng tiêu
Dữ liệu trình tự 18S rRNA metagenome sau khi sử dụng phần mềm Mothur để phân tích, thành
phần các eukaryote có trong đất vườn tiêu bị bệnh gồm animalia (42 %), alveolta (18 %) vi nấm (9 %);
Rhizaria (7 %), stramenopiles (6 %), tuyến trùng (2 %), amoebozoa(2 %) và một số giới, giới phụ khác
chiếm tỷ lệ dưới 1 %. Đất vườn tiêu không bị bệnh gồm animalia (63 %), alveolta (6 %), vi nấm (16%);
Rhizaria (3 %), stramenopiles (6 %), tuyến trùng (4 %), amoebozoa(2 %) so với tổng số sinh vật có trong
hai mẫu đất. (Hình 3.3; Hình 3.4)


9

Hình 3.3. Biểu đồ Krona biểu thị thành phần và tỷ lệ các giới sinh vật trong mẫu đất trồng hồ tiêu
bị bệnh tại Tây nguyên (mẫu D1)

Hình 3.4. Biểu đồ Krona biểu thị thành phần và tỷ lệ các giới sinh vật trong mẫu đất trồng hồ tiêu
không bị bệnh tại Tây nguyên (mẫu D2)


10

3.1.3. Thành phần vi nấm trong đất trồng tiêu
Trong nghiên cứu metagenome thường sẽ phân tích dữ liệu 16S rRNA metagenome của vi
khuẩn và 18S rRNA metagenome của eukaryote (bao gồm animalia, stramenopiles, fungi, rhizari,
amoebozoa,…). Với mục tiêu nghiên cứu vi sinh vật đối kháng với nấm bệnh hại tiêu và các nghiên
cứu trước đây đều cho thấy tác nhân gây bệnh hồ tiêu chủ yếu là vi nấm và giới phụ stramenopiles
vì vậy, chúng tơi tập trung đánh giá và phân tích dữ liệu 18S rRNA metagenome của vi nấm và
stramenopiles trong đất vùng rễ trồng hồ tiêu.Thành phần vi nấm trong mẫu đất tiêu bị bệnh thuộc 5
ngành: Ascomycota (34 %), Zygomycota (34 %), Basidiomycota (21 %), Zoopagomycota (8 %),
Chytridiomycota (3 %) so với tổng số vi nấm trong mẫu đất vườn tiêu bị bệnh. Trong mẫu đất hồ
tiêu không bị bệnh, ngành Ascomycota (81 %); Basidiomycota (7 %), Chytridiomycota (1 %),
Zygomycota (8 %), Zoopagomycota (3 %) so với tổng số vi nấm (Hình 3.5).

Hình 3.5. Thành phần và tỷ lệ các ngành so với tổng số vi nấm trong mẫu đất vườn tiêu bị
bệnh và không bị bệnh
So sánh thành phần và tỷ lệ các chi xuất hiện trong hai mẫu đất cho thấy trong mẫu đất tiêu
bị bệnh D1 có 27 chi và mẫu đất tiêu khơng bị bệnh có 28 chi nấm xác định được tên chi tập trung
trong 4 ngành Ascomycota, Basidiomycota, Chytridiomycota, Zygomycota. Ngành Zoopagomycota
khơng có chi nào xác định được tên trong cả hai mẫu đất. Có 4 chi chỉ xuất hiện trong mẫu đất bị
bệnh và 5 chi chỉ có mặt trong mẫu đất không bị bệnh.
Bảng 3.1. Thành phần và tỷ lệ (%) các chi nấm chiếm ưu thế so với Eukaryote tổng số trong
hai mẫu đất vườn tiêu tại Tây Nguyên

Ngành

Ascomycota

Basidiomycota

TT

Chi

Đất bị bệnh

1
2
3

Acrospermum
Aspergillus
Calcarisporiell
a
Chaetomella
Cochliobolus
Davidiella
Exophiala
Knufia
Penicillium
Jamesdicksonia
Malassezia
Phanerochaete
Rhizoctonia

Rhodotorula
Schizophyllum
Tapinella
Trechispora
Trichosporon

0,06
0,2
0,02

4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18

0,6
0,09
0,08
0,05

0,05
0,04
0,05
0,05
0,02
0,002
0,07
0,2
0,04

Đất không bị
bệnh
0,02
0,8
0,05
0,2
0,3
0,1
0,004
0,004
0,05
0,02
0,4
0,01
0,01
0,03
0,02
0,008
0,01

11

Ngành

Chytridiomycota

Zygomycota

TT

Chi

Đất bị bệnh

19
20
21
22
23
24
25
26

Blyttiomyces
Rhizidium
Rhizophydium
Spizellomyces
Absidia
Allomyces

Amylomyces
Cunninghamell
a
Edogone
Gongronella
Lichtheimia
Mortierella
Physoderma
Ramicandelabe
r

0,05
0,004
0,02
0,03
0,006
0,006

27
28
29
30
31
32

0,006
0,004
2
0,001
0,04

Đất không bị
bệnh
0,04
0,02
0,03
0,006
0,008
0,06
0,004
0,03
0,2
0,03
0,004

Số liệu bảng 3.1 cho thấy sự đa dạng về thành phần và tỷ lệ các chi nấm. Qua kết quả phân
tích có thể thấy rõ rằng, ở đất trồng cây hồ tiêu bị bệnh những chi gây bệnh chiếm tỷ lệ cao hơn
nhiều so với đất trồng tiêu không bệnh như chi Rhizoctonia, Rhizophydium. Trong khi đó, trong đất
tiêu khơng bị bệnh, tỷ lệ chi đối kháng tác nhân gây bệnh cây cao hơn so với đất trồng tiêu bị bệnh
như Penicillium.
Có 40 lồi nấm đều có mặt ở cả hai mẫu đất, 14 lồi chỉ có trong mẫu đất bị bệnh và 11 lồi
chỉ có mặt trong mẫu đất trồng tiêu khơng bị bệnh. Trong đó, các loại định danh được tên gồm 25
lồi nấm đều có mặt ở cả hai mẫu đất, 4 lồi chỉ có trong mẫu đất bị bệnh và 5 lồi chỉ có mặt trong
mẫu đất trồng tiêu khơng bị bệnh (Bảng 3.2).
Bảng 3.2. Thành phần và tỷ lệ (%) các loài nấm so với Eukaryote tổng số trong hai mẫu đất
vườn tiêu tại Tây Nguyên
TT
1
2
3

4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16

Loài
Talaromyces purpurogenus
Aspergillus penicillioides
Hamigera avellanea
Knufia perforans
Exophiala dermatitidis
Cephaliophora tropica
Calcarisporiella sp. NBRC 105922
Mycosphaerella mycopappi
Cochliobolus sativus
Davidiella tassiana
Chaetomella oblonga
Trichosporon coremiiforme
Phanerochaete chrysosporium
Tapinella atrotomentosa
Schizophyllum commune

Sterigmatomyces halophilus

Đất bị bệnh
0,000374067
0,0000591
0,0000197
0,000521725
0,000492194
0,000954856
0,000196878
0,000846573
0,000895793
0,000777666
0,005896482
0,000364223
0,000511882
0,001545489
0,000669384
0,000108283

Đất không bị bệnh
0,000521725
0,00000984
0,0000197
0,0000394
0,0000394
0,0000984
0,000502038
0,004823499
0,002687378

0,0009647
0,00157502
0,000118127
0,000118127
0,000226409
0,000492194
0,000452818


12

TT
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
34

Loài
Spizellomycetes sp. JEL355
Gongronellasp.w5
Physoderma maydis
Conidiobolus firmipilleus
Ramicande laber cf. Longisporus
Endogonelactiflua
Mortierella wolfii
Mortierella alpina
Rhizidium endosporangiatum
Yarrowia lipolytica
Geastrumsaccatum
Rhodotorula glutinis
Rhizidiumendosporangiatum
Hortaea werneckii
Trechispora alnicola
Sympodiomycopsispaphiopedili
Asterotremellahumicola
Amylomycesrouxii

Đất bị bệnh
0,0000984
0,0000394
0,00000984
0,0000984
0,000315004
0,0000591
0,010916859
0,006300081

0,0000394
0,0000492
0,00000984
0,0000197
0,0000394
-

Đất không bị bệnh
0,000157502
0,0000394
0,000295316
0,0000197
0,0000295
0,000561101
0,000590633
0,001643927
0,0000394
0,00000984
0,0000788
0,0000394
0,0000394
0,0000591

Như vậy, những loài phổ biến bao gồm Mortierella wolfii (1,09 %), Mortierella alpina (0,66
%), Ramicandelabercf .L KYK00166 (0,03 %), Tapinella atrotomentosa (0,15 %), Chaetomella
oblonga (0,59 %), Cephaliophora tropica (0,095 %) trong mẫu đất bị bệnh và Mortierella wolfii
(0,06 %), Mortierella alpina (0,16 %), Ramicandelabercf .L KYK00166 (0,002 %), Tapinella
atrotomentosa (0,02 %), Chaetomella oblonga (0,16 %) và Cephaliophora tropica (0,001 %) trong
mẫu đất không bị bệnh. Trong cả hai mẫu đều xuất hiện chi nấm Mortierella thuộc họ
Mortierellaceae với tỷ lệ rất cao, đây là chi xuất hiện phổ biến trong các loại hình sinh thái đất, sống

hoại sinh trong đất, trên thực vật mục nát và các vật liệu hữu cơ khác.
3.1.4. Thành phần loài phân loại trong giới phụ Stramenopiles có trong đất trồng tiêu
Kết quả phân tích cho thấy, các chi nấm gây bệnh trên cây trồng trong mẫu đất vườn tiêu
bệnh đều cao hơn so với vườn tiêu không bị bệnh.
Bảng 3.3. Thành phần và tỷ lệ (%) các chi Stramenopiles chiếm ưu thế so với Eukaryote tổng
số trong hai mẫu đất vườn tiêu tại Tây Nguyên
TT
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11

Chi
Amphora
JBNA46
cafeteria
Pythium
Phytophthora
Pytium
Orchromonas
Poterioochromonas
Spumella
Nitzschia

Skeletonema

Đất bị bệnh
0,08
0,4
0,5
1
0,05
0,008
0,004
0,5
0,5
0,2
0,1

Đất không bị bệnh
0,5
0,4
0,2
0,03
0,002
0,2
0,1
0,1
0,03
0,003


13

Các chi Pythium, Phytophthora, Pytium là các chi có nhiều loài gây bệnh trên thực vật
chiếm tỷ lệ lần lượt là 1 %, 0,05 % và 0,008 % trong đất tiêu bị bệnh. Trong khi đó, trong đất khơng
bị bệnh tỷ lệ này là thấp hơn rất nhiều 0,2 %, 0,03 % và 0,002 %.
Có 16 lồi định danh được tên xuất hiện trùng nhau trong giới phụ Stramenopiles (năm1989,
Stramenopiles do Patterson đặt tên giới). Trong mẫu đất trồng tiêu bị bệnh Stramenopiles chiếm 6
% so với Eukaryote tổng số; mẫu đất trồng tiêu không bị bệnh Stramenopiles chiếm 4 % so với
Eukaryote tổng số.
Kết quả trong Bảng 3.4 thể hiện thành phần và tỷ lệ các loài thuộc giới phụ Stramenopiles
xác định được trong hai mẫu đất trồng tiêu ở Tây Nguyên.
Bảng 3.4. Thành phần và tỷ lệ (%) các loài thuộc giới phụ Stramenopiles xác định được trong
hai mẫu đất tiêu
TT
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16

Loài

Cyclotella meneghiniana
Cyclotella choctawhatcheeana
Skeletonema subsalsum
Ditylum brightwellii
Phytophthora nicotianae
Pythium splendens
Pythium monospermum
Poterioochromonas malhamensis
Ochromonadaceae environmental sample
Ochromonadaceae environmental sample
Eustigmatos magnus
Diplophrys sp. ATCC 50360
Caecitellus parvulus
Stramenopile sp. MAST-12KKTS_D3
Adriamonas peritocrescens
Oikomonas sp. SA-2.1

[%]/Eukaryote
tổng số của D1
0,000656667
0,000656667
0,000328333
0,000328333
0,008531367
0,2415031
0,001313333
0,082196367
0,058407
0,042328667
0,000164

0,011648583
0,008859483
0,00082
0,00082
0,00344535

[%]/Eukaryote
tổng số của D2
0,000246
0,000738
0,028301
0,000246
0,007629
0,013781
0,000493
0,035684
0,022641
0,028547
0,000493
0,00566
0,008613
0,013535
0,015504
0,000246

3.1.4.1. Trong mẫu đất vườn tiêu bị bệnh
Có 29 lồi được xác định thuộc giới phụ Stramenopiles với 16 loài định danh được tên trùng
với các loài thuộc giới phụ Stramenopiles của mẫu đất vườn tiêu không bị bệnh. Trong đó, 2 lớp
Diatomea và Peronosporomycetes chiếm 49 % tổng số trong giới phụ Stramenopiles. Lớp
Diatomea chiếm 19 % trong giới tảo so với các lớp khác. Lớp Peronosporomycetes chiếm 30 %

trong giới tảo so với các lớp khác.
Trong lớp Peronosporomycetes, chi Pythium (84 %) còn lại là chi Phytophthora (3 %) và chi
khác chưa xác định là 12 %. Trong chi Pythium thì lồi P.splendens (99,4 %) và lồi P.
monospermum (0,55 %) và một loài chưa xác định rõ tên chiếm 0,6 %. So với tỷ lệ các loài xuất
hiện trong giới phụ Stramenopiles, chi Pythium chiếm tỷ lệ rất cao và cao nhất với 25 %.
Bảng 3.5. Thành phần và tỷ lệ (%) các loài thuộc giới phụ Stramenopiles xác định
được chỉ có trong mẫu đất tiêu bị bệnh và không bị bệnh


14

TT
1
2
3
4
5
6
1
2
3
4
5

[%]/tổng số
Eukaryote
Trong mẫu đất tiêu bị bệnh
Lithodesmium undulatum
0,00000984
Skeletonema menzellii

0,00000984
Amphora montana
0,000846573
Pelagomonas calceolata
0,0000591
Bicosoeca petiolata
0,000442974
Leukarachnion sp. ATCC_PRA-24
0,000315004
Trong mẫu đất tiêu không bị bệnh
Melosira varians
0,000265785
Oikomonas sp. SA-2.1
0,00000984
Spumella like flagellate JBC27
0,000108283
Spumella like flagellate JBNZ43
0,0000788
Chrysophyceae sp. CCMP2296
0,0000492
Lồi

[%]/Stramenopiles
tổng số
0,000164
0,000164
0,01410955
0,000985
0,0073829
0,005250067

0,006644625
0,000246
0,002707075
0,00197
0,00123

3.1.4.2. Trong mẫu đất vườn tiêu khơng bị bệnh
Có 6 loài Stramenopiles xác định được tên chỉ hiện diện trong mẫu đất vườn tiêu bị bệnh, 5
loài Stramenopiles chỉ hiện diện trong mẫu đất vườn tiêu bị bệnh được trình bày trong Bảng 3.5.
Trong đó, 2 lớp Diatomea và Peronosporomycetes chiếm 24% tổng số trong giới phụ
Stramenopiles. Lớp Diatomea chiếm 13 % trong giới tảo so với các lớp khác. Lớp
Peronosporomycetes chiếm 11 % trong giới tảo so với các lớp khác.
Trong lớp Peronosporomycetes, chi Pythium chiếm tỷ lệ 43 % cịn lại là chi Phytophthora
có lồi Phytophthora nicotianae 7 %, chi Aphanomyces 2 % và chi khác chưa xác định là 47 %. So
với đất vườn tiêu bị bệnh, chi Pythium 5 % trong đó, hai lồi P. splendens và P. monospermum ít
hơn rất nhiều, lần lượt là 1,48 % và 0,05 % so với Stramenopiles tổng số.
3.1.5. Một số nấm bệnh và nấm đối kháng với nấm gây bệnh hồ tiêu trong hai mẫu đất nghiên
cứu
3.1.5.1. Một số nấm gây bệnh hồ tiêu chiếm ưu thế trong hai mẫu đất nghiên cứu
Kết quả dữ liệu phân tích metagenome của hai mẫu đất cho thấy, các tác nhân gây bệnh hồ
tiêu phổ biến bao gồm các loài thuộc chi Pytium, Pythium Phytophthora và Rhizoctonia. Kết quả
thể hiện trong Hình 3.6.
Chi Rhizoctonia thuộc lớp Agaricomycetes, ngành Basidiomycota, giới nấm trong mẫu đất
bị bệnh chiếm 0,02 % so với Eukaryote tổng số trong đất bị bệnh.
Trong lúc đó, chi Rhizoctonia chỉ chiếm 0,01 % so với Eukaryote tổng số trong mẫu đất
không bị bệnh. Trong mẫu đất trồng tiêu bị bệnh, chi Phytophthora thuộc phân lớp Oomycota, lớp
Peronosporomycetes, giới phụ Stramenopiles chiếm 3 % so với các chi thuộc lớp
Peronosporomycetes; chiếm 0,05 % so với tổng số Eukaryote. Trong mẫu đất trồng tiêu không bị
bệnh, chi Phytophthora chiếm 7 % so với các chi thuộc lớp Peronosporomycetes; chiếm 0,03 % so
với tổng số Eukaryote.

Cả hai mẫu đất đều xuất hiện các đối tượng gây bệnh như nhau thuộc các chi Pythium,
Pytium, Rhizoctonia và Phytophthora. Trong đó, tỷ lệ các chi gây bệnh thực vật trong đất bị bệnh
cao hơn so với đất không bị bệnh, chi Rhizoctonia và Phytophthora trong mẫu đất bị bệnh cao hơn


15

nhưng không quá chênh lệch so với tỷ lệ hai chi này trong mẫu đất không bị bệnh. Trong lớp
Peronosporomycetes, chi Pytium xuất hiện với tỷ lệ thấp nhất 0,008 % trong đất tiêu bị bệnh và
0,002 % trong đất tiêu không bị bệnh. Đáng quan tâm là chi Pythium, tỷ lệ chi này hiện diện trong
đất trồng tiêu bị bệnh cao vượt trội so với mẫu đất của vườn tiêu không bị bệnh. Chi Pythium chiếm
25 % trong mẫu đất vườn tiêu bị bệnh nhưng chỉ 5 % trong mẫu đất vườn tiêu khơng bị bệnh.

Hình 3.6. Thành phần và tỷ lệ một số chi nấm bệnh hồ tiêu phổ biến trong hai mẫu đất nghiên
cứu
Mặc dù cả hai mẫu đất đều có sự hiện diện của các tác nhân gây bệnh nhưng ở mẫu đất bị
bệnh, tỷ lệ các tác nhân gây bệnh xuất hiện cao hơn và đã vượt ngưỡng gây bệnh nên xuất hiện triệu
chứng bệnh trên vườn hồ tiêu bị bệnh. Ngược lại, ở đất hồ tiêu khỏe, mặc dù có xuất hiện của các chi
gây bệnh nhưng tỷ lệ không vượt ngưỡng gây bệnh nên các vườn này không xuất hiện triệu chứng hồ
tiêu bị bệnh.
3.1.5.2. Chi nấm đối kháng nấm bệnh hại hồ tiêu xuất hiện trong hai mẫu đất nghiên cứu
Dữ liệu phân tích cho thấy, trong hai mẫu đất phân tích đều xuất hiện chi Penicillium có khả
năng đối kháng với đối tượng gây bệnh trên thực vật.
Chi Penicillium thuộc họ Trichocomaceae, bộ Eurotiomycetes, ngành Ascomycota. Mẫu đất
vườn tiêu bị bệnh, chiếm 0,4 % so với Eukaryote tổng số. Mẫu đất vườn tiêu không bị bệnh, chi
Penicillium chiếm đến 1 % so với Eukaryote tổng số. Nghiên cứu này lựa chọn Penicilium
oxalicum – phân lập được từ mẫu đất trồng hồ tiêu tại Tây Nguyên, thuộc chi nấm Penicilium để
đưa vào bộ vi sinh vật sử dụng để sản xuất chế phẩm vi sinh vật tăng khả năng kháng nấm bệnh của
cây hồ tiêu.
3.2. Tạo nguồn gene vi sinh vật phục vụ nghiên cứu sản xuất chế phẩm vi sinh vật .

3.2.1. Phân lập và tuyển chọn các chủng vi sinh vật đối kháng từ vùng sinh thái ở Tây Nguyên


16

Qua phân lập, thử hoạt tính đối kháng, bốn chủng vi khuẩn (CM4.10crk, CM5.5crk, CS1.5 trk và
CM5crk), và 2 chủng xạ khuẩn (CS2.6trk, CM5.11cdk) có hoạt tính đối kháng cả 3 loài nấm gây bệnh
F.oxysporium, Rh.solani và P. splendens đã được tuyển chọn.
3.2.2. Ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử định danh các chủng vi sinh vật có hoạt tính cao
được tuyển chọn làm chế phẩm vi sinh vật.
3.2.2.1 Định danh vi sinh vật kháng nấm gây bệnh thối rễ vàng lá ở cây tiêu
Sử dụng kỹ thuật sinh học phân tử định danh các chủng vi sinh vật có hoạt tính cao được
tuyển chọn làm chế phẩm vi sinh vật. Chúng tôi định danh được vi khuẩn CM4.10 crk tương đồng với
Pseudomonas fulva 2-5 (Acc. No EU594555.1); chủng xạ khuẩn CS2.6trk tương đồng 99% với trình
tự của chủng Streptomyces sp. YIM30823 (Acc.NoAY237555.1); chủng xạ khuẩn CM5.11cđk có trình
tự gen 16S tương đồng 99% với trình tự của chủng Streptomyces diastatochromogenes (Acc.
NoAB026218.1). Chủng CS1.5trk có trình tự 16S rRNA tương đồng 99 % với với chủng Enterobacter
ludwigii PUFSTb09(Acc. No KR476387.1), trình tự gen 16S của chủng CM5.5crk tương đồng 99 %
với trình tự của chủng Kosakonia cowanii G5C (Acc. No KM041130.1), trình tự gen 16S của chủng
CM5crk tương đồng 99% với trình tự gen 16S của chủng Bacillus subtilis NB-12 (Acc. No
HQ222831.1).
Riêng chủng vi nấm N1CS1trk có hoạt tính đối kháng đã được định danh dựa trên khóa phân
loại của Gevens, Barnet et Hunter (1973); Booth (1971); Domsch, Gams (1980); Raper và Thom
(1968), Raper và Fennell (1965) bằng các đặc điểm hình thái. Các đặc điểm hình thái tương đồng
với các đặc điểm của Penicillium oxalicum.

(a)

(b)

(c)

Hình 3.10. Hình ảnh chủng N1CS1trk: (a) khuẩn lạc trên môi trường Czapek-Dox ở
20 oC/ 48 giờ; (b, c) cơ quan sinh bào tử và bào tử dưới kính hiểu vi 40X
3.2.2.2. Phân tích các đặc tính sinh học kết hợp phân loại theo khóa phân loại truyền thống của
các chủng vi sinh vật được lựa chọn làm chế phẩm
Để nghiên cứu hoàn thiện quy trình sản xuất phân bón hữu cơ đa chức năng ứng dụng cho
vùng Tây Nguyên, chúng tôi đã tuyển chọn những chủng vi sinh vật đối kháng nguồn bệnh, các
chủng vi sinh vật có các hoạt tính sinh học khác. Cụ thể, dựa vào hoạt tính sinh học của các chủng
vi sinh vật được tuyển chọn và nhận dạng các chủng bằng phân tích gen 16S rRNA, đã chọn ra 9
chủng để sử dụng làm chế phẩm vi sinh vật gốc để cung cấp sản xuất phân bón hữu cơ Polyfa TN3
(Bảng 3.9).
Bảng 3.9. Hoạt tính sinh học của các chủng sử dụng sản xuất chế phẩm
ST

Chủng

Tên khoa học

Hoạt tính sinh học


17

T
1

BX-F9

Bacillus megaterium

Sinh chất kết tụ sinh học, chịu Fe,Al

2

TIVP18

Bacillus subtilis

3
4
5
6
7

CF-vp17
CM5crk
CFB3
Ti6
CM5.11cdk

8
9

N1CS1trk
TiN1

Bacillus megaterium
Bacillus subtilis
Bacillus megaterium

Bacillus flexus
Streptomyces
diastatochromogenes
Penicilium oxalicum
Penicilium oxalicum

Phân giải P, kháng nấm, sinh chất kết tụ
sinh học, chịu Fe, Al
Phân giải P, kháng nấm, chịu Fe, Al
Kháng nấm, chịu Fe, Al
Sinh IAA, cố định N, chịu Fe, Al
Phân giải thuốc BVTV, chịu Fe, Al
Kháng nấm, chịu Fe,Al
Kháng nấm, chịu Fe,Al
Phân giải P, chịu Fe,Al

Chín chủng vi sinh vật được lựa chọn để sản xuất chế phẩm gốc có 3 chủng có khả năng đối
kháng nấm bệnh là vi khuẩn Bacillus subtilis; xạ khuẩn Streptomyces diastatochromogenes và vi
nấm Penicilium oxalicum.
Đặc tính sinh học của chủng vi khuẩn CM5crk
Kết quả nghiên cứu cho thấy chủng Bacillussubtilis mang hầu hết các tính chất của vi khuẩn chi
Bacillus
Đặc tính sinh học của chủng xạ khuẩn CM5.11 cdk
Chủng xạ khuẩn được chọn để sử dụng trong sản xuất chế phẩm đã được định danh đến loài
Streptomyces diastatomonogenes. Một số đặc điểm hình thái và sinh hóa của chủng xạ khuẩn này đã
được tiến hành nghiên cứu. Kết quả nhận được cho thấy chủng xạ khuẩn CM5.11 cdk sau 14 ngày
trên môi trường ISP-6 ở nhiệt độ 30 oC làm cho màu của môi trường chuyển từ vàng nhạt sang nâu
đậm, điều đó chứng tỏ chủng CM5.11cdk có khả năng hình thành sắc tố melanin trên mơi trường có
chứa sắt. Ngồi ra, các đặc điểm hình thái và sinh hóa cho thấy chủng CM5.11cdk mang nhiều đặc
tính của lồi Streptomyces diastatomonogenes.

Đặc điểm hình thái và sinh hóa của các chủng vi nấm N1CS1trk
Đặc điểm hình thái và sinh hóa của chủng vi nấm N 1CS1trk cũng đã được nghiên cứu. Dựa
vào phân loại theo hình thái, chủng vi nấm này thuộc chi Penicilium, các đặc điểm hình thái và sinh
hóa cũng khẳng định sự định danh này là đúng.
3.2.2.3. Đánh giá khả năng đối kháng giữa các chủng vi sinh vật lựa chọn làm chế phẩm
Đã đánh giá khả năng đối kháng lẫn nhau của các chủng vi sinh vật được chọn để sản xuất
chế phẩm bằng phương pháp cấy vng góc trên mơi trường MPA. Kết quả cho thấy các chủng vi
sinh vật có khả năng kháng nấm bệnh và các chủng vi sinh vật hữu ích khác đều phát triển đồng
thời và không đối kháng lẫn nhau trên mơi trường MPA. (Bảng 3.10 và Hình 3.8).
Bảng 3.10. Xác định tính đối kháng giữa các chủng vi sinh vật tuyển chọn
Tên chủng
TI6
TIVP18
CM5crk
CF-VP17

TIVP18

CM5crk

–

–
–

–
–

–

CFVP17
–
–
–

CFB3
–
–
–
–

BXF9
–
–
–
–

CM5.11
cdk
–
–
–
–

N1CS1
trk
–
–
–
–

18

Tên chủng
CFB3
BX-F9
CM5.11 cdk
N1CS1trk
TiN1

TIVP18

CM5crk

–
–
–
–
–

–
–
–
–
–

CFVP17
–
–

–
–
–

CFB3
–
–
–
–

BXF9
–
–
–
–

CM5.11
cdk
–
–
–
–

N1CS1
trk
–
–
–
–

Hình 3.8. Khả năng đối kháng giữa các chủng vi khuẩn lựa chọn làm chế phẩm
3.3. Nghiên cứu hồn thiện quy trình sản xuất chế phẩm vi sinh vật gốc
Luận án thực hiện nghiên cứu đầy đủ và đưa ra tất cả các thông số kỹ thuật cần thiết để hồn
thiện quy trình sản xuất chế phẩm vi sinh vật gốc.
Các thơng số cơng nghệ lên men chìm quy mơ phịng thí nghiệm thích hợp bao gồm: nhiệt
độ, pH và tốc độ lắc thích hợp để lên men chìm các chủng vi khuẩn Bacillus CM5crk là 35 oC – 37
o
C ; pH 7, lắc 175-200 vòng/phút. Xác định được nhiệt độ, pH và tốc độ lắc thích hợp để lên men
chìm các chủng vi nấm được tuyển chọn như sau: nhiệt độ 25 oC – 30 oC, pH 6-7, tốc độ lắc 175200 vịng/phút, thời gian ni cấy 72-96 giờ. Đã xác định nhiệt độ và pH thích hợp để lên men chìm
chủng xạ khuẩn CM5.11cdk là 30 oC, pH 7, tốc độ lắc 175-200 vòng/phút, thời gian nuôi cấy 48 ± 1
giờ. Trên cơ sở này, tiếp tục nghiên cứu cho kết quả các thông số công nghệ lên men chìm quy mơ
pilot với thiết bị lên men 70 lít/mẻ thích hợp.
Từ các kết quả nghiên cứu cũng đã xác định được các điều kiện thích hợp cho quá trình lên
men xốp các chủng vi sinh vật lựa chọn làm chế phẩm: nhiệt độ lên men xốp thích hợp nhất cho các
chủng vi khuẩn Bacillus CM5crk là 37 oC; cho nấm P.oxalicum N1CS1trk/N1EH3td, và xạ khuẩn
S.diastatochromogenes CM5.11cdk là 30 oC, pH thích hợp nhất cho chủng vi khuẩn và xạ khuẩn
tuyển chọn là 6,8-7,0; cho chủng vi nấm là 6,5-7,0. Độ ẩm thích hợp cho q trình lên men xốp các
chủng vi khuẩn nghiên cứu là 40 % - 50 % và cho chủng vi nấm, xạ khuẩn 50-60 %.
3.3.1. Xác định thời gian bảo quản
Các chủng vi sinh vật có hoạt tính sinh học tuyển chọn được lên men rắn riêng rẽ dưới các
điều kiện thích hợp. Sau khi lên men, sản phẩm được làm khô ở 50 oC để ẩm độ còn khoảng 12-14
%, sau đó được phối trộn với nhau theo tỷ lệ 1:1, đóng gói trong bao kẽm có trọng lượng 500 g, bảo
quản trong điều kiện tự nhiên khơ ráo, thống, nhiệt độ mơi trường khơng khí trong khoảng 18 oC
về mùa đông và 35 oC về mùa hè. Sau các khoảng thời gian nhất định, chế phẩm được kiểm tra mật
độ vi sinh vật và hoạt tính. Tỷ lệ sống sót của vi khuẩn được xác định bằng cách cấy trải trên môi
trường MPA (đối với các chủng thuộc chi Bacillus), môi trường ISP4 (cho xạ khuẩn) và CzapekDox (cho vi nấm).


19

Bảng 3.11. Mật độ các chủng vi sinh vật theo thời gian bảo quản (CFU/g)
Chủng vi sinh
vật
Bacillus spp.
CM5.11cdk
N1CS1trk

0
2,9x109
2,0x109
2,7x109

Thời gian bảo quản (tháng)
4
6
8

2
1,7x109
1,3x109
1,7x109

1,3x109
4,7x108
1,0x109

5,4x108
1,4x108
5,4x108

10

1,5x108
4,7x108
2,7x108

12

3,4x107 1,2x106
4,3x106 1,3x106
4,0x107 1,7x106

Kết quả nhận được cho thấy, tỷ lệ sống sót của các chủng vi sinh vật nghiên cứu giảm dần
theo thời gian. Tuy nhiên, sau 8 tháng bảo quản trong túi kẽm, mật độ của chúng vẫn đạt 1,45,4x108 CFU/g và sau 12 tháng, mật độ của chúng giảm xuống 10 6 CFU/g. Thí nghiệm được nhắc
lại 3 lần. Kết quả thể hiện trên Bảng 3.12.
Bảng 3.12. Hoạt tính sinh học của chế phẩm vi sinh vật theo thời gian bảo quản
Thời gian

Kháng

(tháng)

P.splendens

0
2
4
6
8
10

12

(D-d) mm
24,0 ± 0,2
21,0 ± 0,3
19,4 ± 0,3
17,6 ± 0,3
16,1 ± 0,1
13,2 ± 0,3
10,8± 0,2

Kháng F.

Kháng

oxysporum

Rh.solani

(D-d) mm

(D-d) mm

23,0 ± 0,3
20,0 ± 0,2
18,5 ± 0,4
17,0 ± 0,3
15,3 ± 0,3
12,2 ± 0,2
10,4 ± 0,4

21,0 ± 0,5
19,5 ± 0,3
17,7 ± 0,3
16,0 ± 0,2
14,5 ± 0,1
11,0 ± 0,2
10,0 ± 0,3

Vịng

S/trưởng

p/giải P

trên MT

khó tan

có muối

(D-d)mm
12,0 ± 0,4
11,5 ± 0,3
10,7 ± 0,3
10,2 ± 0,5
9,4 ± 0,2
8,6 ± 0,2
7,2 ± 0,3

Fe
+++
+++
++
++
++
+
+

S/trưởng
trên MT
có muối Al
+++
+++
++
++
++
+
+

Sau 8 tháng bảo quản, chế phẩm VSV vẫn giữ được hoạt tính đối kháng hai chủng nấm gây
bệnh là F.oxysporum, Rh.solani và P. spledens khá tốt, với vòng đối kháng lớn hơn 10 mm. Khuyến
cáo sử dụng chế phẩm vi sinh: có thể bảo quản 12 tháng ở nhiệt độ phòng trong túi kẽm, mật độ
VSV đạt 106-107 CFU/g.
3.3.2. Đánh giá độ an toàn của sản phẩm
Kết quả theo dõi trọng lượng chuột
Theo dõi trọng lượng của chuột sau 7 ngày uống dịch chế phẩm POLYFA-TN3. Sau 7 ngày,
trọng lượng chuột ở tất cả các liều thử nghiệm và đối chứng đều tăng tương tự nhau. Do vậy, chế
phẩm không gây ảnh hưởng đến sự phát triển trọng lượng của chuột thử nghiệm.
Theo dõi tiêu thụ thức ăn của chuột

Chuột ở nhóm đối chứng hoạt động và ăn uống bình thường, và chuột ở các nhóm sử dụng
chế phẩm với các liều lượng khác nhau cũng không nhận thấy các dấu hiệu khác thường gì so với
nhóm đối chúng trong thời gian thử nghiệm.
Quan sát dấu hiệu ngộ độc
Chuột sử dụng chế phẩm ở các mức liều khác nhau khơng có biểu hiện gì khác thường. Khả
năng ăn uống, hoạt động và tăng trọng của chuột thí nghiệm sử dụng chế phẩm khơng khác so với
nhóm chuột đối chứng. Không xác định được liều gây chết 50 % động vật thí nghiệm (LD50).


20

Như vậy các kết quả thử nghiệm độ an toàn của chế phẩm cho thấy chế phẩm vi sinh vật gốc
khơng gây ngộ độc và có thể sử dụng trong thực tiễn.
3.4. Đánh giá khả năng phòng trừ bệnh hại cây tiêu vùng Tây Nguyên của chế phẩm vi sinh
vật bản địa
Mơ hình ứng dụng được bón phân đa chức Polyfa TN3 được sản xuất từ chế phẩm vi sinh
vật gốc gồm 9 chủng vi sinh vật được tuyển chọn.
3.4.1. Hiệu quả phân POLYFA-TN3 đối với hồ tiêu
3.4.1.1. Đánh giá khả năng kháng bệnh vàng lá, thối rễ trên cây hồ tiêu trên diện hẹp
Thí nghiệm được thực hiện trên 3 vườn hồ tiêu tại huyện Cư M’gar, tỉnh Đăk Lăk. Các công
thức sử dụng cho khảo nghiệm như Bảng 3.13. Sau thời gian bón chế phẩm 6 tháng tỷ lệ một số
bệnh hại chính trên hồ tiêu được ghi nhận như sau:
Bảng 3.13. Tỷ lệ các bệnh chủ yếu trên vườn hồ tiêu trong thời gian thí nghiệm (%)
Bệnh chết
Bệnh vàng lá
Bệnh thán thư
nhanh
CT1-ti (Đ/C)
1,86a ± 0,03
9,50a± 0,15

17,13a± 0,55
a
a
CT2-ti (1kg/trụ POLYFA-TN3)
1,78 ± 0,04
8,20 ± 0,17
14,67a± 0,60
CT3-ti (1,5kg/trụ POLYFA-TN3)
1,02 ab±0,03
6,58ab± 0,09
10,20ab± 1,02
b
b
CT4-ti (2,0kg/trụ POLYFA-TN3)
0,50 ± 0,03
3,60 ± 0,12
7,53b± 0,12
CV%
7,4
8,2
9,1
LSD0.05
0,86
3,02
8,54
Các giá trị ký hiệu chữ giống nhau chỉ ra khác nhau giữa các giá trị này khơng có ý nghĩa thống kế
(P<0,05); Cv (%): hệ số biến động; LSD0,05: So sánh kết quả của các cơng thức có ý nghĩa thống kê
Bệnh chết nhanh
Đối với vườn thí nghiệm, trước khi bón phân có 3/300 trụ bị nhiễm bệnh chết nhanh. Qua
thời gian thí nghiệm từ tháng 6 năm 2015 đến tháng 10 năm 2015 không phát hiện thêm trụ hồ tiêu

nào bị chết do bệnh chết nhanh gây ra. Tỷ lệ cây bị bệnh chết nhanh chỉ 0,5 % đến 1,86 %; đây là
mức độ rất nhẹ (Bảng 3.13). Quan sát bằng mắt thường thì vẫn có rải rác các vết bệnh xuất hiện trên
đầu lá non gần mặt đất do nhiễm nấm Phytopthora nhưng cây hồ tiêu vẫn sinh trưởng, sai quả bình
thường. Trong khi các vườn khác trong thơn của xã Ea Hding vẫn bị bệnh chết nhanh, đang tiến
triển.
Bệnh vàng lá, thối rễ (chết chậm)
Bảng 3.13 cho thấy tỷ lệ bệnh vàng lá tại các cơng thức bón phân có sự khác biệt có nghĩa.
Tỷ lệ bệnh qua các cơng thức bón phón phân POLYFA-TN3 đều giảm so với đối chứng. Lượng
phân POLYFA-TN3 1,5-2,0 kg/trụ đã làm giảm đáng kể bệnh vàng lá chết chậm. Vi sinh vật hữu ích
trong phân POLYFA-TN3 đã phát huy tác dụng, nâng cao khả năng kháng bệnh cho hồ tiêu. Phân
POLYFA-TN3 đã có sẵn một số chủng vi sinh đối kháng với nấm bệnh và với cả rệp sáp, tuyến
trùng. Vì vậy, khi bón với lượng phân POLYFA-TN3 1,5-2,0 kg/trụ, kết quả phòng trừ bệnh vàng lá
trong Bảng 3.13 đã thể hiện được hiệu quả ức chế tác nhân gây hại hồ tiêu của chế phẩm này.
Bệnh thán thư
Bệnh thán thư là loại bệnh phổ biến trong các vườn tiêu. Trong thí nghiệm bệnh thán thư
xuất hiện với tỷ lệ vừa phải, từ 7,5 – 17,3 % (Bảng 3.12). Qua các công thức cho thấy các công
Công thức


21

thức đối chứng có tỷ lệ bệnh thán thư cao hơn các cơng thức khác. So với nghiệm thức bón phân
chuồng hoai mục thì cơng thức bón 1,5-2,0 kg POLYFA-TN3 có tỷ lệ bệnh thấp nhất; sự khác biệt
giữa các cơng thức có ý nghĩa thống kê.
3.4.1.2. Yếu tố cấu thành năng suất và năng suất hồ tiêu
Các công thức đều cho các yếu tố cấu thành năng suất đạt mức độ khá cao, phản ánh sự hấp
thụ tốt chất dinh dưỡng từ rễ. CT3-ti và CT4-ti đều có số gié/khung, chiều dài gié, số hạt/gié đều
cao hơn CT1-ti và CT2-ti.
Công thức 4 đã tăng số gié lên 10 %, chiều dài gié lên 1/3 và số quả/gié lên trên 30 % so với
đ/c.

Bảng 3.14. Một số chỉ tiêu cấu thành năng suất và năng suất hồ tiêu
Công thức phân

Số gié (chùm
quả)/khung
50,2b±8,45

Chiều dài
gié (cm)
6,1b±0,93

Số hạt/gié

Năng suất quả
tươi (kg/trụ)
11,0b±3,51

CT1-ti 2,0 kg ph. chuồng
22,4b±2,70
(đ/c)
CT2-ti 1,0 kg POLYFA-TN3
48,4b±4,22
6,5b±0,80
26,6b±3,29
12,4ab±2,93
CT3-ti 1,5 kg POLYFA-TN3
53,6a±6,68
7,6a±0,72
29,8a±2,33
14,1a±2,05

CT4-ti 2,0 kg POLYF-TN3
54,8a±7,74
8,3a±0,56
30,2a±2,20
14,8a±1,92
CV%
5,5
3,7
5,4
8,2
LSD0.05
2,4
2,0
3,8
1,8
Các giá trị ký hiệu chữ giống nhau chỉ ra khác nhau giữa các giá trị này khơng có ý nghĩa thống kế
(P<0,05); Cv (%): hệ số biến động; LSD0,05: So sánh kết quả của các cơng thức có ý nghĩa thống kê
Năng suất tiêu ở 4 CT đều khá cao trên 11 kg/trụ tương ứng gần 5,2 kg tiêu khơ/trụ. Trong
đó cơng thức 4 cho năng suất cao nhất, vượt 30 % so với đ/c; 4 chỉ tiêu trên đều khác biệt này có ý
nghĩa thống kê. Kết quả tăng số gié, chiều dài gié, tăng số quả/gié đã làm tăng năng suất tiêu.
Lượng phân vơ cơ đã bón cho vườn thí nghiệm khơng cao (1 tấn/ha), nhưng năng suất ổn định và
tiến triển khá; chứng tỏ phân POLYA-TN3 đã góp phần giảm lượng phân vơ cơ cho hồ tiêu. Kết quả
này cần quan tâm hơn, bởi những năm gần đây bệnh trên cây hồ tiêu, đặc biệt là bệnh từ rễ có
ngun nhân là lượng bón phân vơ cơ quá cao, đặc biệt là phân đạm.
3.4.2. Đánh giá hiệu quả phân POLYFA-TN3 đối với hồ tiêu trên quy mô 1ha
3.4.2.1. Đối với năng suất thực thu
Năng suất tiêu khơ của CT có sử dụng phân POLYFA-TN3 đều cao hơn đối chứng.
Bảng 3.15. Tác động của POLYFA-TN3 tới năng suất và trọng lượng hồ tiêu
Năng suất quả
Năng suất

Pgam/lit
P1000 hạt (g)
tươi (kg/trụ)
khô (kg/trụ)
CT-ti 2,0 kg phân chuồng (đ/c)
10,5±1,88
3,33±0,40
505±6,88
36±2,42
CT-ti 2,0 kg POLYFA-TN3
14,2±1,72
4,48±0,38
514±6,21 40,9±3,11
CV%
5,1
2,1
3,9
6,8
LSD0.05
1,4
1,8
3,4
2,8
Các giá trị ký hiệu chữ giống nhau chỉ ra khác nhau giữa các giá trị này khơng có ý nghĩa thống kế
(P<0,05); Cv (%): hệ số biến động; LSD0,05: So sánh kết quả của các cơng thức có ý nghĩa thống kê
Công thức phân


22

Năng suất > 4,0 kg tiêu khô/trụ tương ứng với năng suất > 6,4 tấn/ha. Dung trọng và khối
lượng 1.000 hạt của CT3 và CT4 đều cao hơn đối chứng. Phân POLYFA-TN3 làm tăng năng suất
34,5 %, nâng phẩm cấp hồ tiêu trên diện rộng.
3.4.2.2. Đối với các bệnh hại chính
Bảng 3.16. Tác động của POLYFA-TN3 tới tỷ lệ các bệnh chính trên hồ tiêu
ĐVT:%
Bệnh chết nhanh
Bệnh vàng lá
Bệnh thán thư
CT-ti 2,0 kg ph. chuồng
2,2±0,09
9,0±2,01
18,0±3,31
CT-ti 2,0kg/trụ POLYFA-TN3
0,75±0,02
3,2±1,01
7,5±3,03
CV%
6,5
6,0
8,0
LSD0.05
0,6
2,6
4,1
Các giá trị ký hiệu chữ giống nhau chỉ ra khác nhau giữa các giá trị này khơng có ý nghĩa thống kế
(P<0,05); Cv (%): hệ số biến động; LSD0,05: So sánh kết quả của các cơng thức có ý nghĩa thống kê
Cả 3 bệnh chính: chết nhanh, vàng lá và thán thư trên thí nghiệm diện rộng đều xuất hiện,
tuy mức độ khơng cao. Công thức sử dụng phân POLYFA-TN3 đã giúp giảm 2/3 tỷ lệ cây bị bệnh.
Các bệnh trên vốn có từ vùng trồng hồ tiêu của xã Ea HDing đã nhiều năm, trong thời gian 01 năm

chưa thể trừ được tồn diện. Với tỷ lệ bệnh trên diện tích sử dụng chế phẩm POLYFA-TN3 như
Bảng 3.16, khuyến cáo nông dân khơng cần sử dụng đến biện pháp phịng trừ bằng thuốc hoá học.
3.4.2.3. Hiệu quả kinh tế đối với hồ tiêu
Khi bón phân POLYFA-TN3, người nơng dân đầu tư cho các phân bón khác sẽ khơng cao,
chỉ trên 10 triệu đồng nhưng thu nhập đem lại rất đáng kể: 668.800 – 532.800 =136 triệu/ha;
Tỷ suất lợi nhuận do phân POLYFA-TN3
= 4,81
Phân POLYFA-TN3 phù hợp với hồ tiêu ở Tây Nguyên về sinh trưởng ổn định, hạn chế sâu
bệnh, tăng năng suất, hiệu quả kinh tế khá cao.
Như vậy, bón POLYFA-TN3 từ 1,5 đến 2,0 kg/gốc tương ứng với 3,5-4,0 tấn/ha đã tăng khả
năng sinh trưởng cây hồ tiêu: Tăng yếu tố cấu thành năng suất: số gié tăng 10%, chiều dài gié quả
và số lượng quả (hạt) trên gié tăng 30%; năng suất tăng 30-34,5 %; Dung trọng hạt và trọng lượng
1000 hạt tăng nhẹ; Hạn chế đáng kể các bệnh chủ yếu: bệnh chết nhanh, vàng lá và thán thư từ 2,017 % xuống còn 0,5; 3,6 và 10 %; Tỷ suất lợi nhuận đạt 4,81 lần.
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
KẾT LUẬN
1. Đã thu được 02 mẫu DNA metagenome từ hai mẫu đất hồ tiêu tại Đăk Lắk đạt chất lượng
cao. Đã xây dựng cơ sở dữ liệu gene 18S rRNA metagenome: 1.574 OTUs trong mẫu đất vườn tiêu
bị bệnh; 1.318 OTUs trong mẫu đất vườn tiêu không bị bệnh.
2. Các đối tượng nấm gây bệnh chủ yếu trên cây hồ tiêu tại Đăk Lăk gồm: Chi Rhizoctonia
trong mẫu đất bị bệnh chiếm 0,02 % gấp hai lần chi Rhizoctonia có trong mẫu đất khơng bị bệnh
chiếm 0,01 %; Chi Phytophthora trong mẫu đất bị bệnh chiếm 0,05 % gấp 1,7 lần trong mẫu đất
không bị bệnh chiếm 0,03 %; Chi Pytium chiếm 0,008 % trong đất tiêu bị bệnh cao gấp 4 lần so với
trong đất tiêu không bị bệnh chỉ chiếm 0,002 %. Chi Pythium trong mẫu đất bị bệnh chiếm 25 %


23

gấp 5 lần trong mẫu đất không bị bệnh chiếm 5 % so với Eukaryote tổng số; Ngoài ra, xác định
được thành phần của nấm có khả năng ức chế được mầm bệnh trong chi Penicilium: đất tiêu không
bị bệnh chiếm 1 % gấp 2,5 lần so với đất tiêu bị bệnh chỉ chiếm 0,4 % so với Eukaryote tổng số.

3. Lựa chọn được 3 chủng: vi khuẩn Bacillus subtilis CM5crk, xạ khuẩn Streptomyces
diastatochromogenes CM5.11cdk và vi nấm Penicillium oxalicum N1CS1crk trong 44 chủng lựa chọn
để đánh giá hoạt tính đối kháng nấm bệnh, bổ sung vào chế phẩm POLYFA – TN 3 nhằm tăng
cường khả năng kháng bệnh và sinh trưởng phát triển của cây hồ tiêu.
4. Đã xây dựng quy trình lên men: Đối với chủng vi khuẩn Bacillus subtilis CM5crk: môi
trường MTB4.3; nhiệt độ 35-37 oC; pH 6,8-7,0; lắc 200 v/phút (qui mơ phịng thí nghiệm), hoặc
khuấy 150 v/phút và nạp khí 60 lít/phút (qui mơ pilot); thời gian lên men 35-40 giờ; Đối với chủng
xạ khuẩn Streptomyces diastatochromogenes CM5.11cdk: môi trường MTXs1; nhiệt độ 30 oC; pH
6,5-7,0; lắc 200 v/phút (qui mơ phịng thí nghiệm), hoặc khuấy 150 v/phút và nạp khí 60 lít/phút
(qui mơ pilot); thời gian lên men 48-55 giờ; Đối với các chủng vi nấm Penicillium oxalicum
N1CS1crk: môi trường MTnp1; nhiệt độ
30 oC; pH 6,0-6,5; lắc 200 v/phút (qui mơ phịng thí
nghiệm), hoặc khuấy 200 v/phút và nạp khí 70 lít/phút (qui mơ pilot); thời gian lên men 72-96 giờ
để thu nhận chế phẩm vi sinh vật gốc để bổ sung vào nền hữu cơ tạo phân bón vi sinh POLYFA TN3.
5. Phân vi sinh POLYFA-TN3 đã thúc đẩy quá trình sinh trưởng của cây trồng thông qua
cành hữu hiệu, bộ khung tán lá ổn định, hợp lý. Với liều lượng 2,0 kg/gốc; hiệu lực phòng trừ bệnh
các bệnh chết nhanh, vàng lá thối rễ và bệnh thán thư lần lượt là 66 %, 64 % và 58 %; Phân vi sinh
POLYFA-TN3 đã thúc đẩy q trình sinh trưởng của cây trồng thơng qua cành hữu hiệu, bộ khung
tán lá ổn định, hợp lý. Với liều lượng 2,0 kg/gốc; hiệu lực phòng trừ bệnh các bệnh chết nhanh,
vàng lá thối rễ và bệnh thán thư lần lượt là 66 %, 64 % và 58 %; Năng suất hồ tiêu tăng gần 30 %.
Tỷ suất lợi nhuận tăng 4,81 khi sử dụng POLYFA-TN3.
KIẾN NGHỊ
Nghiên cứu, đánh giá ảnh hưởng của chi nấm Pythium đối với cây hồ tiêu và nghiên cứu
ứng dụng vi sinh vật đối kháng các chủng nấm bệnh thuộc chi Pythium.


24