Nghiên cứu tách chiết chlorophyll từ tảo xoắn spirulina và chuyển hóa thành methyl pheophorbide a

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI

---------------

LUẬN VĂN THẠC SĨ
Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Mã ngành

: 60420201

Đề tài: NGHIÊN CỨU TÁCH CHIẾT CHLOROPHYLL TỪ

TẢO XOẮN SPIRULINA VÀ CHUYỂN HÓA THÀNH
METHYL PHEOPHORBIDE A

HỌC VIÊN THỰC HIỆN: NGUYỄN CHIẾN THẮNG
HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. BÙI THỊ HẢI HÒA

Hà Nội - 11/2019

0


LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan:
Đây là công trình nghiên cứu của tôi và một số kết quả cùng cộng tác với
các cộng sự khác;
Các số liệu và kết quả trình bày trong luận văn là trung thực, một phần đã
được công bố trên các tạp chí chuyên ngành với sự đồng ý và cho phép của các
đồng tác giả.

Phần còn lại chưa được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác.
Nếu có gì sai sót tôi xin chịu hoàn toàn trách nhiệm./.
Hà Nội, ngày 24 tháng 11 năm 2019
Tác giả

1


LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành luận văn này, tôi xin được gửi lời cảm ơn sâu sắc đến:
TS. Bùi Thị Hải Hòa, Khoa Công nghệ Sinh học Trường Đại học Mở Hà
Nội – người đã định hướng, chỉ bảo những kiến thức khoa học, tận tâm giúp đỡ
và động viên tôi vượt qua những trở ngại và khó khan trong suốt thời gian thực
hiện luận văn.
Ban Lãnh đạo và Thầy cô Khoa Đào tạo Sau đại học, Trường Đại học Mở
Hà Nội đã tạo điều kiện thuận lợi về thời gian, cơ sở vật chất và giúp tôi hoàn
thành mọi thủ tục cần thiết trong quá trình học tập và nghiên cứu.
Cuối cùng, tôi xin cảm ơn gia đình, bạn bè – những người đã luôn bên
cạnh, khuyến khích và ủng hộ tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện luận
văn này.
Hà Nội, ngày 24 tháng 11 năm 2019
Tác giả

1


MỤC LỤC
MỞ ĐẦU .............................................................................................................. 4
MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU ................................................................................. 9
Mục tiêu nghiên cứu tổng quát ............................................................................. 9

Mục tiêu nghiên cứu cụ thể................................................................................... 9
Nội dung nghiên cứu ............................................................................................. 9
CHƯƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................. 10
1.1. Tổng quan về tảo Spirulina platensis .......................................................... 10
1.1.1. Cấu tạo, hình thái và phân loại học ..................................................... 10
1.1.2. Đặc điểm sinh trưởng của tảo Spirulina ............................................. 11
1.1.3. Vai trò và ứng dụng của Spirulina ...................................................... 11
1.1.3.1. Spirulina, thực phẩm bổ sung hoàn hảo và an toàn ......................... 11
1.1.3.2. Vai trò của tảo Spirulina với sức khỏe con người ........................... 13
1.2. Chlorophyll và quá trình chuyển hóa các dẫn xuất của Chlorophyll .......... 16
1.2.1. Chlorophyll ......................................................................................... 16
1.2.2. Các phản ứng chuyển hóa một số dẫn xuất từ Chlorophyll a ............. 19
1.3. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước .................................................. 23
1.3.1. Ngoài nước .......................................................................................... 23
1.3.2. Trong nước .......................................................................................... 25
CHƯƠNG II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..................... 27
2.1. Vật liệu nghiên cứu ...................................................................................... 27
2.1.1. Đối tượng ............................................................................................ 27
2.1.2. Hóa chất và thiết bị ............................................................................. 27
2.1.2.1. Thiết bị ............................................................................................. 27
2.1.2.2. Hóa chất ........................................................................................... 28
2.2. Phương pháp nghiên cứu ............................................................................. 30
2.2.1. Khảo sát ảnh hưởng các loại dung môi và nồng độ dung môi đến hiệu
quả tách chiết Chlorophyll từ tảo bột Spirulina ............................................ 30
2.2.2. Khảo sát ảnh hưởng nồng độ cơ chất/dung môi đến hiệu quả tách chiết
Chlorophyll từ tảo bột Spirulina ................................................................... 30
2


2.2.3. Khảo sát ảnh hưởng của thời gian trích ly đến hiệu quả tách chiết

Chlorophyll từ tảo bột Spirulina ................................................................... 30
2.2.4. Phương pháp xác định nồng độ Chlorophyll ...................................... 31
2.2.5. Phương pháp xử lý tảo Spirulina trước khi chiết Chlorophyll bằng bộ
chiết Sohxlet .................................................................................................. 31
2.2.6. Phương pháp chiết Chlorophyll từ tảo bột Spirulina bằng hệ thống
chiết Sohxlet .................................................................................................. 32
2.2.7. Phương pháp tinh chế lượng nhỏ Chlorophyll a ................................. 32
2.2.8. Phương pháp điều chế Methyl Pheophorbide a từ Chlorophyll a....... 33
2.2.9. Phương pháp tinh sạch methyl pheophorbide a .................................. 33
CHƯƠNG III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN.................................................... 35
3.1. Nghiên cứu tách chiết thu nhận hợp chất màu Chlorophyll a sinh khối tảo
Spirulina ở qui mô PTN ...................................................................................... 35
3.3.1. Kết quả khảo sát ảnh hưởng các loại dung môi và nồng độ dung môi
đến hiệu quả tách chiết Chlorophyll a từ tảo bột Spirulina .......................... 36
3.3.2. Kết quả khảo sát ảnh hưởng nồng độ cơ chất/dung môi đến hiệu quả
tách chiết Chlorophyll từ tảo bột Spirulina................................................... 38
3.3.3. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của thời gian trích ly đến hiệu quả tách
chiết Chlorophyll a từ tảo bột Spirulina........................................................ 39
3.2. Kết quả tách chiết thu nhận hợp chất màu Chlorophyll a từ sinh khối tảo
Spirulina trên hệ thống chiết Sohxlet............................................................ 40
3.3. Kết quả định tính và tinh sạch hợp chất màu Chlorophyll a từ sinh khối
tảo Spirulina bằng phương pháp sắc ký bản mỏng và sắc ký cột ................. 42
3.4. Kết quả chuyển hóa hỗn hợp Chlorophyll a tách chiết được từ tảo
Spirulina thành Methyl phephorbide a và xác định cấu trúc methyl
pheophorbide a .............................................................................................. 44
CHƯƠNG IV. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ.................................................... 46
4.1. Kết luận ........................................................................................................ 46
4.2. Kiến nghị ...................................................................................................... 46

3

DANH MỤC BẢNG BIỂU
1. Bảng 1: Các thiết bị…………………………………………………28
2. Bảng 2: Hóa chất……………………………………………………29
3. Bảng 3.1: Hàm lượng Chlorophyll thu được khi chiết với các dung môi
và nồng độ dung môi khác nhau (24h chiết) ……………………….37
4. Bảng 3.2: Hàm lượng Chlorophyll khi thay đổi tỷ lệ cơ chất/dung
môi………………………………………………….……………….39
5. Bảng 3.3: Hàm lượng Chlorophyll tại các thời gian chiết khác
nhau………………………………………………………………….40

4


DANH MỤC HÌNH ẢNH
1. Hình 1: Vòng đời tảo Spirulina……………………………………....12
2. Hình 2: Cấu tạo của Chlorophyll a và Chlorophyll b………………...19
3. Hình 3: Phản ứng chuyển hóa Chlorophyll a thành pheophytin a……21
4. Hình 4: Phản ứng chuyển hóa Chlorophyll a thành methyl
pheophorbide a và các loại dẫn xuất Chlorin……………………………22
5. Hình 5: Phản ứng chuyển hóa methyl pheophorbide a thành Chlorin e6
trimethylester…………………………………………………………23
6. Hình 6: Phản ứng chuyển hóa Chlorin e6 trimethylester thành Chlorin
e6 monomethylester(C1) …………………………………………….24
7. Hình 7: Ống lọc chứa Spirulina bột khô và hệ thống chiết
Sohxlet……………………………………………………………….42
8. Hình 8: Ống lọc Sohxlet trước và sau khi chiết (màu xanh không
còn).………………………………………………………………......42
9. Hình 9: Tảo bột Spirulina trước và phần bã sau khi chiết Sohxlet…...42

10. Hình 10: Các mẫu dịch chiết Spirulina………………………………43
11. Hình 11: Kết quả TLC dịch chiết Spirulina [SiO2, (n-hexane: EtOAc:
Acetone: MeOH = 7,6:1:1:0,4), Rf = 0,4] và phổ UV-VIS trong
acetone………………………………………………………………...…44

5


DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
1. FDA: Cục quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Hoa Kỳ
2. SFDA: Cơ quan Dược phẩm và Thực phẩm quốc gia Trung Quốc
3. PDT: Liệu pháp quang động - Photodynamic theraphy
4. DMSO: Dimethyl sulfoxit
5. UV/VIS: Quang phổ tử ngoại khả kiến

6


MỞ ĐẦU
Ung thư cũng như nhiều bệnh lý khác đều có đặc điểm chung là hậu
quả tương tác của 03 yếu tố cơ bản sau: (1) tác nhân gây bệnh, (2) yếu tố môi
trường và (3) cơ thế vật chủ (vật chủ ở đây chính là con người). Hiện nay, sự
phát triến của Y học tuy đã đạt được nhiều thành tựu to lớn và các số liệu
nghiên cứu cho thấy tỷ lệ tử vong do ung thư từ những năm 1980 đến 2007 có
xu thế giảm rõ rệt, tuy vậy ung thư vẫn là vấn đề Y tế lớn đối với nhân loại và
đồng thời cũng là thách thức đối với Y học. Mục tiêu của điều trị bệnh lý ung
thư là loại bỏ tổ chức ung thư, hiện nay có rất nhiều phương pháp điều trị
khác nhau được phát triển và áp dụng trong thực tiễn điều trị bệnh nhân ung
thư như: phẫu thuật (bao gồm cả ghép tạng), tia xạ (xạ trị liệu), phẫu thuật
bằng tia gamma, điều trị bằng hóa chất (hóa trị liệu), nút mạch thông thường

hoặc nút mạch có kết họp với hóa chất hay kết hợp với chất đồng vị phóng xạ,
đốt điện, tiêm cồn, điều trị bằng các phương pháp phân tử (tế bào gốc, gen trị
liệu)...
Liệu pháp quang động (Photodynamic theraphy - PDT) là phương
pháp mới trong điều trị ung thư. Đây là phương pháp sử dụng tia laze và chất
cảm quang, tiêu diệt hiệu quả các tế bào ung thư, đây là một liệu pháp không
xâm lấn. Được FDA của Mỹ phê chuẩn ứng dụng lâm sàng năm 1996 và
SFDA của Trung Quốc phê chuấn ứng dụng lâm sàng năm 2003. Khi tiêm
chất cảm quang qua đường tĩnh mạch, tổ chức ung thư sẽ hấp thụ một lượng
lớn chất này. Dùng tia lazer chuyên biệt chiếu vào khối u, dưới tác động của
ánh sáng, các chất cảm quang sẽ phản ứng đối với tê bào ung thư khiến các tế
bào này bị trúng độc và hoại tử. Khối u sẽ dần dần bị tan biến. Quá trình điều
trị bao gồm tiêm chất cảm quang cho bệnh nhân, sau một thời gian chiếu tia
lazer vào khối u, tiêu diệt tế bào ung thư. Đây là phương pháp điều trị tiên
tiến với nhiều ưu diêm như không phẫu thuật, ít đau đớn, hiệu quả nhanh và
tiêu diệt cả những mầm bệnh nhỏ, giảm tỷ lệ tái phát ung thư. Đông thời ít
7


biến chứng , có độc tính thấp, phù hợp với các bệnh nhân giai đoạn cuối hoặc
thế trạng già yếu. Phương pháp này đươc ứng dụng điều trị các bệnh như: ung
thư khoang miệng thời kỳ sớm, ung thư vòm họng (hiệu quả trên 75%), ung
thư thực quản, bệnh Barrett thực quản, ung thư phê quản: ung thư phế quản
giai đoạn sớm, hiệu quả điều trị đạt 90%, đôi với những khôi u phế quản phát
triền gây tắc nghẽn, hiệu quả cải thiện 85%, ung thư dạ dày: Ung thư dạ dày
giai đoạn sớm, hiệu quả điêu trị là 85%; có hiệu quả cải thiện các biến chứng
của ung thư dạ dày, ung thư bàng quang, ung thư trực tràng, ung thư ống mật,
đặc biệt thích hợp sử dụng cho ung thư ống mật trong gan, ung thư tuyến tụy,
u bóng vante, ung thư phúc mạng, ung thư gan, u não...
Chất cảm quang có nhiều loại và nhiều thế hệ, với tên gọi khác nhau

như Photofrin®, RadarChlorin (Nga)...Chủ yếu trong thành phần chất cảm
quang có 95% Chlorin e6, thuộc nhóm Chlorin, thuốc nhạy quang thế hệ 2,
tương tự m-THPC (meso- tetrahydroxyphenyl Chlorin), được phép sử dụng
trong lâm sàng ở châu Ậu và Mỹ. Chlorin e6 (Ce6) là một chất cảm quang thế
hệ thứ hai với sự hấp thụ mạnh mẽ trong quang phổ màu đỏ của ánh sáng, có
thể được tổng hợp từ Chlorophyll. Những lợi ích lâm sàng đáng chú ý đã thu
được với PDT qua trung gian C6 (Ce6-PDT) trong điều trị các loại ung thư
khác nhau, bao gồm u ác tính, ung thư bàng quang và ung thư biểu mô vòm
họng. Hiện nay, một số PS cấu trúc porphyrin và non-porphyrin đã được
nghiên cứu và tổng hợp. Trong số đó, Chlorin là chất có tiềm năng cho PDT
bởi khả năng hấp thụ và phát xạ trong dải phồ hồng ngoại (khoảng 660 nm).
Nhờ đó ánh sáng thâm nhập sâu vào các mô, gây độc quang cao hồ trợ cho
quá trình điêu trị. Người bệnh được sử dụng liều lượng thuốc thấp và nhẹ,
loại bỏ nhanh khối u và rút ngắn thời gian tiếp xúc với da. Có nhiêu loại
thuốc cảm quang Chlorin trong điều trị lâm sàng ngày nay - Temoporfin
(Foscan, mTHPC, 5,10,15,20-Tetra (m-hydroxyphenyl) Chlorin), Talaporfin
(LS11, MACE, N- aspartyl Chlorin e6, NPe6), RadaChlorin (hỗn hợp của ba

8


Chlorin), và Photodithazine (muối glucosamine của Chlorin e6).
Xuất phát từ thực trạng diễn biến bệnh ung thư trên thế giới và tại Việt
Nam, kết hợp với các hướng điều trị ung thư và những lợi ích do phương
pháp điều trị liệu pháp quang động mang lại, chúng tôi tiến hành thực hiện đề
tài “Nghiên cứu tách chiết hợp chất màu Chlorophyll từ tảo xoắn Spirulina
và chuyển hóa thành methyl pheophorhide a” làm cơ sở phục vụ cho việc
nghiên cứu tạo chế phẩm Chlorin e6 trimethyester do Việt Nam sản xuất,
giảm chi phí điều trị cho người bệnh, tiến đến có thể ứng dụng phương pháp
điều trị hiệu quả và đem lại lợi ích sức khỏe lớn cho cộng đồng.

MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU
Mục tiêu nghiên cứu tổng quát
Nghiên cứu tách chiết Chlorophyll từ tảo xoắn Spirulina và chuyển hoá
thành methyl pheophorbide a
Mục tiêu nghiên cứu cụ thể
- Xây dựng quy trình thu nhận hợp chất màu Chlorophyll a từ tảo xoẳn
Spirulina.
- Chuyển hóa hỗn hợp Chlorophyll a tách chiết từ tảo xoắn Spirullina thành
metyl pheophorbide a.
- Xác định cấu trúc methyl pheophorbide a.
Nội dung nghiên cứu
- Nghiên cứu tách chiết thu nhận hợp chất màu Chlorophyll a sinh khối tảo
Spirulina.
- Chuyển hóa hỗn hợp Chlorophyll a tách chiết được từ tảo Spirulina thành
Methyl phephorbide a.
- Xác định cấu trúc methyl pheophorbide a.

9


CHƯƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Tổng quan về tảo Spirulina platensis
1.1.1. Cấu tạo, hình thái và phân loại học
Spirulina là vi khuẩn lam đa bảo và có dạng sợi. Tảo gồm nhiều tế bào
hình trụ xếp không phân nhánh, đường kính tế bào từ 1 – 12 µm, chiều dài tế
bào có thể đến 10 µm và chiều dài chuỗi có thể đến 110 µm. Các sợi tảo có
tính di dộng trượt dọc trục của chúng. Sprirulina có dạng xoắn trong môi
trường chất lỏng và có hình xoắn trôn ốc thật sự trong môi trường đặc. Độ
xoắn của tảo là đặc điểm để phân loại của loài. Loài Spirulina thuộc:
Chi: Spirulina

Họ: Oscillatoriales
Bộ: Oscillatoriales
Lớp: Cyanophyceae
Ngành: Cyanophyta
Chi Spirulina có nhiều loài trong đó có 2 loài Spirulina maxima và
Sprirulina platensis là quan trọng nhất và được nghiên cứu nhiều nhất.
Năm 1827, Turpin đã phân lập được Spirulina từ một mẫu nước ngọt.
Năm 1844, Wittrock và Nordstedt6t phát hiện sự hiện diện loài tảo có màu
xanh lam, dạng xoắn, có vách ngăn có tên là Spirulina jeneri, Spirulina
platensis gần thành phố Montevideo, nhưng đến năm 1852, việc phân loại học
đầu tiên của loài này mới được Stizenberger công bố. Ông đưa ra tên loài mới
là Arthrospira dựa vào cấu trúc chứa vách ngăn, đa bào, dạng xoắn. Gomont
đã khẳng định những nghiên cứu này vào năm 1892, đồng thời bổ sung thêm
loài không có vách ngăn là Spirulina và loài có vách ngăn mà Arthrospira.
Nhưng trong các hoạt động khảo sát và nghiên cứu Arthrospira thường được
gọi là Spirulina và tên đó được dùng phổ biến cho đến ngày nay.
10


1.1.2. Đặc điểm sinh trưởng của tảo Spirulina
* Sự sinh trưởng: Spirulina trải qua các giai đoạn: thích nghi, logarit, đường
thẳng, giảm, ổn định, lão suy.
* Sự sinh sản có phương thức sinh sản: vô tính (phân chia từ một sợi tảo mẹ
trưởng thành). Từ một sợi tảo mẹ, hình thành nên những đoạn Necridia (gồm
các tế bào chuyên biệt cho sự sinh sản). Trong các Necridia hình thành các
đĩa lõm ở hai mặt và sự tách rời tạo các hormogonia bởi sự chia cắt tại vị trí
các đĩa này. Trong sự phát triển, dần dần phần đầu gắn tiêu giảm, 2 đầu
hormogonia trở nên tròn nhưng vách tế bào vẫn có chiều dày không đổi. Các
hormogonia phát triển, trưởng thành và chu kì sinh sản được lập đi lập lại một
cách ngẫu nhiên, tạo nên vòng đời của tảo. Trong thời kì sinh sản tảo

Spirulina nhạt màu ít sắc tố xanh hơn bình thường. Vòng đời tảo đơn giản,
tương đối ngắn. Trong điều kiện tối ưu (nuôi trong phòng thí nghiệm) vòng
đời khoảng 1 ngày. Ở điều kiện tự nhiên là khoảng 3 – 5 ngày.

Hình 1. Vòng đời tảo Spirulina
1.1.3. Vai trò và ứng dụng của Spirulina
1.1.3.1. Spirulina, thực phẩm bổ sung hoàn hảo và an toàn
Spirulina chứa hơn 100 chất dinh dưỡng, la một trong những nguồn
giàu nhất va đầy đủ nhất các chất dinh dưỡng hữu cơ. Năm1974 tại Rome,
Hội nghị Thực phẩm toàn cầu do Liên Hợp Quốc tổ chức đã tuyen bố:
11


"Spirulina là thực phẩm tốt nhất cho nhân loại”, sau đo Tổ chức Y tế Thế
giới cũng công nhận: "Tảo Spirulina là thực phẩm bảo vệ sức khỏe tốt nhất
của loài người trong thế kỷ 21”, Tổ chức Nông lương Thế giới (FAO) cho
rằng "Spirulina la nguồn dinh dưỡng va dược liệu đặc biệt quý giá",
Spirulina đã được phê duyệt như một thực phẩm bổ sung ở Mỹ, Châu Âu,
Nhật Bản, Anh, Australia, Ấn Độ, Trung Quốc, New Zealand và nhiều nước
khac tren thế giới. Cục Quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Hoa Kỳ (FDA)
khẳng định rằng thực phẩm này là một nguồn cung cấp protein, chứa nhiều
vitamin, khoáng chất khác nhau, do đó có thể được sử dụng trên thị trường
như một nguồn thực phẩm bổ sung. Từ cuối thập niên 80 và đầu thập niên 90
của thế kỷ XX, NASA và Cơ quan Vũ trụ châu Âu (MELISSA) đã đề xuất
Spirulina là một trong các loại thực phẩm chủ yếu được trồng để phục vụ
trong hoạt động không gian lâu dài (Cornet J.F., Du-bertret G. -1990). Nhận
thức được tiềm năng của Spirulina, trong Chương trình nghị sự phát triển bền
vững, một số quốc gia thành viên của Liên Hiệp Quốc hợp tác với nhau để tạo
thành một tổ chức liên chính phủ có tên là Các tổ chức liên chính phủ cho
việc sử dụng của vi tảo Spir-ulina chống suy dinh dưỡng (IIMSAM). Kết quả

nghiên cứu về độc tính và các tác động của Spirulina tiêu thụ trên người và
động vật đã cho thấy Spirulina không có tác dụng độc hại. Đối với khả năng
sinh sản, gây quái thai và các sự cố sau khi sinh, kết quả nghiên cứu trên động
vật cũng đã cho thấy không có ảnh hưởng bất lợi từ tiêu thụ Spir-ulina. Theo
Chamorro-Cevallos,
G.; B.L. Barron, J. Vasquez-Sanchez (2008), lượng Spirulina cũng đã
được tìm thấy để ngăn chặn thiệt hại gây ra bởi các độc tố ảnh hưởng đến tim,
gan, thận, tế bào thần kinh, mắt, buồng trứng, ADN và tinh hoàn. Trong một
nghiên cứu năm 2009, ở 550 trẻ em bị suy dinh dưỡng được cho ăn lên đến
10g bột Spirulina/ngày, đều không có tác dụng phụ. Hàng chục các nghiên
cứu lâm sàng của con người tương tự như vậy đã cho thấy không có tác dụng

12


có hại khi sử dụng Spirulina bổ sung. Cục Quản lý Thực phẩm và Dược phẩm
Hoa kỳ (FDA) cũng đã trao chứng nhận an toàn sản xuất (GRAS) cho các
công ty Dược phẩm Parry Ấn Độ. Ở Việt Nam, từ năm 1970 đến nay đã có
nhiều nhà khoa học nghiên cứu về Spirulina như: GS. TSKH. Nguyễn Hữu
Thước (Viện Khoa học Việt Nam), GS. TSKH. Dương Đức Tiến (Đại học
Tổng hợp Hà Nội), GS.TS. Võ Hành, PGS.TS. Nguyễn Đình San (Khoa Sinh,
Đại học Vinh) … và trên cơ sở phân tích ADN nhằm tìm kiếm những chủng
tốt nhất, từ đó sản xuất sinh khối và ứng dụng trongthực tiễn sản xuất, đời
sống và xử lý môi trường. Spirulina thường được nuôi cấy trong môi trường
nhân tạo và có sự kiểm soát nghiêm ngặt nên sản phẩm tạo ra đảm bảo tinh
khiết và an toàn tuyệt đối. Một số cơ sở như Bệnh viện Nhi Trung ương, Viện
Quân y 108… đã khá thành công trong việc sử dụng Spirulina làm thực phẩm
chức năng, làm thuốc... để điều trị cho các bệnh nhi bị suy dinh dưỡng.
1.1.3.2. Vai trò của tảo Spirulina với sức khỏe con người
Tác dụng của tảo với hệ miễn dịch con người

Trong nhiều năm qua, những người sử dụng cho biết, họ cảm thấy tình
trạng ốm vặt giảm hẳn, hỗ trợ điều trị các bệnh mãn tính rất tốt, những vết
thương mau lành và sớm hồi phục hơn. Các nhà khoa học đã khám phá ra một
số tác dụng của tảo Spirulina là không chỉ giúp tăng cường hệ miễn dịch mà
còn hỗ trợ tạo ra các tế bào máu mới trong cơ thể. Các thành phần quan trọng
của hệ miễn dịch: các tế bào tủy xương, các tế bào T (là các tế bào kháng
thể), các bạch cầu và tế bào sát trùng tự nhiên… đều cho thấy có sự tăng
cường khả năng hoạt động. Các nhà khoa học quan sát thấy lượng bạch cầu
tăng lên, hoạt động tích cực hơn và diệt khuẩn hiệu quả hơn. Những chất
chống oxy hóa giúp tăng cường hệ miễn dịch là Beta-caroten, Phycocyanin
và Polysaccharid có nhiều trong tảo Spirulina.
Những kết quả nghiên cứu mới của khoa học Nhật Bản cho biết một
hợp chất mới được phát hiện đặt tên là Spirulan, chiết xuất từ Spirulina giúp
13


ngăn cản sự sinh sôi của virus HIV-1, bệnh Herpes, bệnh cúm, quai bị và sởi
trong cơ thể nhưng lại rất an toàn cho các tế bào của cơ thể con người.
Tác dụng của tảo với hệ tim mạch và giảm lượng cholesterol trong
máu
Cholesterol cao trong máu làm tăng khả năng bị bệnh tim mạch, là một
trong những vấn đề nghiêm trọng nhất đối với sức khoẻ con người. Việc giảm
lượng cholesterol cũng là một phương thức nhằm giảm nguy cơ bị bệnh tim.
Những nghiên cứu khoa học trên con người ở Nhật và Ấn Độ đã cho thấy sử
dụng vài gram Spirulina hàng ngày là có thể giảm được đáng kể lượng
cholesterol trong máu. Đặc biệt là giảm lượng cholesterol máu xấu (LDL) và
tăng lượng cholesterol tốt (HDL).
Tác dụng của tảo với tăng cường chống lão hoá và ngừa ung thư
Những phân tử hóa học tự do (hay còn gọi là gốc tự do) phá hủy các tế
bào trong cơ thể chúng ta. Chúng được sinh ra bởi ô nhiễm, ăn thiếu chất,

stress và bị thương. Những chất chống oxy hóa sẽ loại bỏ những gốc tự do
nguy hiểm này ra khỏi cơ thể và giúp tăng cường hệ miễn dịch để bảo vệ cơ
thể khỏi bệnh ung thư và làm chậm tiến trình lão hóa. Những chất chống oxy
hóa giúp ngăn ngừa lão hóa và ngừa ung thư là Beta-caroten, vitamin E, các
sắc tố Carotenoid, Chlorophyll và Phycocyanin. Những khoáng chất chống
oxy hóa: selenium, magan, kẽm, đồng, sắt và crôm cũng hình thành các men
chống oxy hóa trong cơ thể. Nhà khoa học Trung Quốc cũng đã tìm ra chất
Polysaccharid cũng có đặc tính chống oxy hóa và ngừa ung thư. Tất cả thông
tin trên đã chứng minh tảo Spirulina Spirulina là một trong những thực phẩm
hoàn hảo chống oxy hoá mạnh mẽ.
Tác dụng của tảo giúp tăng cường khả năng tiêu hoá
Các nghiên cứu chứng minh rằng, tảo Spirulina Spirulina giúp tăng
cường hệ tiêu hoá và chức năng bài tiết. Nó hạn chế những vi khuẩn gây hại
14


như coli, nấm Cadida và kích thích những lợi khuẩn như Lactobacillus và
Bifido. Các lợi khuẩn là nền tảng cho một sức khoẻ tốt và tăng khả năng hấp
thu dưỡng chất từ thực phẩm mà chúng ta ăn, đồng thời ngăn ngừa sự nhiễm
khuẩn.
Tác dụng của tảo giúp tăng cường khả năng tiêu độc cho cơ thể
Khi tảo Spirulina lần đầu tiên được giới thiệu vào 40 năm trước, người
ta nhanh chóng nhận ra rằng nó đẩy nhanh tiến trình tiêu độc của cơ thể. Sau
đó, tại Nhật Bản nhà khoa học phát hiện ra rằng tảo còn làm giảm sự nhiễm
độc của thận do kim loại nặng (thủy ngân) và các loại thuốc khác gây ra. Điều
đó cho thấy thực phẩm có ích cho người bị nhiễm độc kim loại nặng. Năm
1994, người Nga chứng nhận, tảo Spirulina là một loại dược liệu giúp làm
giảm các phản ứng do các bệnh nhiễm xạ gây ra. 270 trẻ em nạn nhân vụ nổ
Chernobyl được dùng 5g tảo Spirulina mỗi ngày liên tục trong vòng 45 ngày
đã giúp lượng nucleic nhiễm xạ xuống 50% và bình thường hóa những cơ

quan nhạy cảm bị dị ứng. Cuộc sống hiện đại đang tiềm ẩn nhiều các chất độc
hại trong không khí, trong thực phẩm. Nên cơ thể con người cần phải được
thanh lọc liên tục giúp loại bỏ các độc tố. Chính vì vậy, tác dụng của tảo
Spirulina đối với việc thanh lọc cơ thể là vô cùng quý giá nhờ các chất chống
oxy hóa Chlorophyll, Phycocyanin và Polysaccharid… giúp bạn dễ dàng
thanh lọc giải độc an toàn và hiệu quả.
Có rất nhiều nghiên cứu về Spirulina, không những vì chúng có giá trị
dinh dưỡng cao mà còn bởi chúng có nhiều tác dụng trong cả y lẫn sinh học.
Theo Prescott, Gorrunov và cộng sự (1969) cho rằng, trong tương lai y dược
và những sự tìm kiếm trong y dược, bao gồm cả việc nghiên cứu và thí
nghiệm các tảo có thể kể ra như việc tìm kiếm thuốc chữa ung thư, dị ứng, tảo
tiết chất kháng sinh có thể thay thế cho Penixilin. Trong tương lai sẽ có môn
chữa bệnh dùng tảo (Algotherapia hay Phycotherapia) (trích dẫn bởi Nguyễn
Văn Tuyên, 2003). Việc tăng sinh khối tảo mà vẫn giữ được chất lượng tốt
15


qui mô phòng thí nghiệm sẽ là hướng mở áp dụng cho qui mô sản xuất công
nghiệp, đồng thời có thể xác định được ảnh hưởng của các thành phần dinh
dưỡng cho sự phát triển tốt hơn của tảo. Kỹ nghệ nuôi trồng Spirulina và một
số vi tảo khác (Chlorella, Klamath...) hoặc nấm sợi đã trở thành một lĩnh vực
được đầu tư phát triển trong công nghệ sinh học để tạo sinh khối protein.
Năm 1970, giá trị của tảo Spirulina được công nhận, với ưu thế nhiều mặt, thì
sự phát triển nuôi trồng ở quy mô công nghiệp giống tảo này nở rộ ở nhiều
quốc gia. Tại Nhật Bản, được sự hỗ trợ kỹ thuật từ Hoa Kỳ tiến sỹ Nakamura
tiến hành những nghiên cứu sớm nhất vào năm 1968, với giống tảo mẹ từ
Tchad. Phương pháp nuôi trồng công nghiệp Spirulina của ông được triển
khai ở vài vùng của Nhật Bản, Thái Lan và Hàn Quốc. Với đầu tư của nhiều
công ty kinh doanh, các dự án này đã phát triển thành những xí nghiệp
chuyên sản xuất tảo Spirulina. Ngoài các nước nêu trên, tảo Spirulina còn

được phát triển ở nhiều quốc gia và vùng lãnh thổ Trung Quốc, Singapore,
Đài Loan, Bulgarie, Ukraina, Hà Lan, Italia, Tây Ban Nha, Czech, Nam Phi,
Chi Lê, Isarel, Maroc, Iran, Cuba, Hồng Kông, v.v...
1.2. Chlorophyll và quá trình chuyển hóa các dẫn xuất của Chlorophyll
1.2.1. Chlorophyll
Chlorophyll là chất có màu xanh lá cây trong thực vật bao gồm cây
xanh và tảo, được tạo thành trong quá trình quang hợp, nó cho phép cây xanh
hấp thụ ánh sáng mặt trời và chuyển phần ánh sáng đó sang dạng năng lượng
sử dụng được. Giáo sư Richard W. Statter đã có công trình nghiên cứu và
phát hiện ra rằng: Cấu tạo tế bào hồng cầu gần như đồng nhất với cấu tạo tế
bào diệp lục, giúp tăng lượng hồng cầu trong cơ thể, công trình này đã đoạt
được giải thưởng Nobel vào năm 1915. Chlorophyll chỉ khác với hemoglobin
trong máu người ở nhân Mg2+ trong vòng Chlorin (thay vì Fe2+). Tới năm
1930 – Giáo sư Han Fisher đã đạt giải thưởng Nobel với nghiên cứu cũng về
diệp lục với tên gọi: Chlorophyll giúp cơ thể loại thải các chất độc tố một
16


cách hiệu quả nhất. Một số nghiên cứu cho thấy Chlorophyll có tác dụng tẩy
độc ở gan, chống ung thư, tăng cường hệ miễn dịch, điều hòa huyết áp…
Chlorophyll là một sắc tố tự nhiên và cũng là một chất màu thực phẩm (E
140). Chlorophyll hiện nay chù yếu được ứng dụng trong lĩnh vực chăm sóc
sức khỏe, là nguyên liệu sản xuất thực phẩm chức năng, sản phẩm bổ sung,
uống Chlorophyll 100 mg hai lần một ngày giúp kiểm soát mùi hôi cơ thể như
hôi miệng, hôi nách, hôi chân và các mùi hôi cơ thể khác. Chlorophyll cũng
thường được sử dụng trong các công thức kem đánh răng, kẹo cao su
(singgum) để tăng hiệu quả điều trị hôi miệng, cho hơi thở thơm mát. Ngoài
ra những nghiên cứu gần đây cho thấy thực phẩm bổ sung Chlorophyll còn rất
hứa hẹn trong khía cạnh thải trừ độc tố, tăng cường sức đề kháng phòng
chống ung thư và các bệnh tật nói chung. Trong ngành dược phẩm và thực

phẩm, Chlorophyll được sử dụng như là một tá dược truyền thống để tạo màu
xanh lục cho sản phẩm.
Chlorophyll và các dẫn xuất của nó hấp thụ ánh sáng có bước sóng
khoảng 650 nm nên ánh sáng dễ dàng xuyên qua các tể bào mô. Khi được
chiếu xạ, các dẫn xuất chất này chuyển lên trạng thái kích thích triplet (năng
lượng kích thích với Chlorophyll a. E = 29 kcal/mol) sau đó năng lượng này
được chuyển sang cho oxy để sản xuất oxy ở trạng thái kích thích singlet (E =
22.5 kcal/ mol). Oxy ở trạng thái singlet là một chất oxy hoá hiệu quả dẫn đến
sự hình thành các thành tố rất hoạt động như anion gốc, gốc hydroxyl và
hvdroperoxide. Các gốc hoạt động này sẽ đi vào phán ứng trực tiếp với các
phân tử hữu cơ của các tế bào ung thư. Các gốc tự do phản ứng dây chuyền
để phân huỷ màng lipit cùa các tế bào dẫn đên phá hủy các tế bào ung thư.
Một sổ Chlorin rất quan trọng được sử dụng cho quang trị liệu bao gồm
Chlorin-e6 và các muối natri, monoaspartylChlorin-e6 và photoChlorin. Liệu
pháp quang đã được sử dụng để điều trị các khối u ác tính của da. tuyến vú,
màng nhày của các khoang miệng, lưỡi, môi dưới, thanh quàn, dạ dày, phổi,

17


ruột non, bàng quang và trực tràng.
Chlorophyll có 2 loại: diệp lục a (Chlorophyll a) và diệp lục b
(Chlorophyll b) được tìm thấy ở thực vật. Chất diệp lục a và diệp lục b là các
chất tự nhiên tan trong chất béo, được tìm thấy trong thực vật. Chất diệp lục a
và b chỉ khác nhau nhóm định chức, cho phép từng loại chất diệp lục hấp thụ
ánh sáng ở những bước sóng khác nhau.

Hình 2. Cấu tạo của Chlorophyll a và Chlorophyll b
Là một sắc tố Chlorin, Chlorophyll được tạo thành thông qua con
đường trao đổi chất và có cấu trúc khá giống các sắc tố porphyrin khác

(heme). Tại trung tâm vòng Chlorin là một ion Mg2+ (Duble, 2010). Cấu trúc
tổng quát của Chlorophyll được Hans Fischer tìm ra vào năm 1940 và đến
năm 1960 cấu trúc lập thể của Chlorophyll a đã được tìm ra. Chlorophyll a và
Chlorophyll b khác nhau tại vị trí C7, ở Chlorophyll a là nhóm –CH3 còn ở
Chlorophyll b là nhóm –CHO (Woodward RB, 1960). Sự khác biệt nhỏ trong
một trong các chuỗi bên cho phép mỗi loại chất diệp lục hấp thụ ánh sáng ở
các bước sóng hơi khác nhau. Đuôi hydrocarbon dài (phytol) gắn với vòng
18


porphyrin làm cho chất diệp lục tan trong chất béo và không hòa tan trong
nước. Chlorophyll a và Chlorophyll b là chất diệp lục có thể hòa tan trong tự
nhiên được tìm thấy trong thực vật. Theo ước tính, lượng Chlorophyll a được
tổng hợp trong tự nhiên rất lớn, cỡ khoảng 1,7 tỷ tấn/1 năm và là nguồn
nguyên liệu dồi dào cho việc chuyển hóa thành các hợp chất có giá trị và khả
năng ứng dụng. Tảo Spirulina là một sản phẩm đang được nuôi trồng nhân
tạo có chứa rất nhiều Chlorophyll a.
1.2.2. Các phản ứng chuyển hóa một số dẫn xuất từ Chlorophyll a
Chlorophyll a là một hợp chất rất nhạy cảm với oxy, ánh sáng, axit,
kiềm và là hợp chất rất khó để bảo quàn, được các nhà khoa học quan tâm
cho mục đích nghiên cứu cơ bản. Do vậy, định hướng chuyển hóa
Chlorophyll a thành dẫn xuất Methyl pheophorbide a bền hơn, mặc dù hợp
chất này vẫn nhạy cảm với ánh sáng và oxy. Methyl pheophorbide a (MPa) là
chất cảm quang PDT, và cũng là một sản phẩm tự nhiên bán tổng hợp có
nguồn gốc từ diệp lục a. Đỉnh hấp thụ của MPa trong dung môi hữu cơ và
trong các tế bào lần lượt là 667 và 674nm. 3- (4,5-Dimethylthiazol-2-yl) -2,5diphenyltetrazolium bromide cho thấy MPa không có độc tính tế bào tối.
Methyl pheophorbide a tiếp tục được chuyển hóa thành họp chất Chlọrin e6
trimethylester, cũng là một dẫn xuất Chlorophyll bền. Đây là một hợp chất
trung gian rất có ý nghĩa cho việc chuyển hóa tiếp theo thành các dẫn xuất
khác có tiềm năng ứng dụng trong y, dược và khoa học vật liệu (quang điện

hóa).
Chlorin e6 là sản phẩm phân hủy axit tricarboxylic của Chlorophyll a.
Bốn hỗn hợp Chlorin e6 bis (amino axit) được tổng hợp theo phương pháp
sinh học mang hai hợp chất aspartate trong các định dạng 131,173 và 152,
173, hoặc ở 131,152 thông qua liên kết ethylene diamine. Quá trình chuyển
hóa Chlorophyll a thành Chlorin e6 được tiến hành thông qua các bước sau:
chiết tách liên tục Chlorophyll a thực hiện phản ứng chuyển hóa Chlorophyll
19


a thành pheophytin a và methyl pheophorbide a bằng phương pháp chiết và
chuyển vị este một giai đoạn.

Hình 3. Phản ứng chuyển hóa Chlorophyll a thành pheophytin a
Sau đó chuyển hóa methyl pheophorbide a thành Chlorin-e6trimetylester bằng phản ứng mở vòng cacboxylic. Quá trình sinh tổng hợp
Chlorin e6 trimethylester và Chlorin e6 monomethylester từ Chlorophyll a
được trình bày như sau:

20


Hình 4. Phản ứng chuyển hóa Chlorophyll a thành methyl pheophorbide a
và các loại dẫn xuất Chlorin
Chlorin e6 trimethylester đuợc chuyền hóa thành Chlorin e6 hoặc
Chlorin e6 monomethylester. Đối với hợp chất Chlorin e6, (hay
PhytoChlorin): là hợp chất tự nhiên, dã được chứng minh có tiềm năng ứng
dụng trong liệu pháp quang chữa ung thu (Photodymamic therapy). Tuy nhiên
việc tinh chế chất này đòi hòi sự phức tạp và tốn kém. Do vậy, chuyền hóa
Chlorin e6 trimethylester thành dẫn xuất Chlorin e6 monomethylester là việc
cần thiết vì những ưu điểm sau đây: (1) Chlorin e6 monomethylcster là dẫn

xuất Chlorophyll rất bền, (2) Chlorin e6 monomethylester là hợp chất trung
gian rất tốt cho những chuyển hóa hóa học khác, (3) Chlorin e6
monomethylester dược sự quan tâm nghiên cứu cho việc phát triền thuốc, ứng
dụng y học và khoa học vật liệu.
Chlorin e6- trimetylester được tạo thành bởi 46 bước từ các pyrol khác
nhau. Con đường tổng hợp đặc thù từ liên kết giữa hai nửa của bicyclic pyrol
AD 14 và BC 15 để hình thành porphyrin 17. Tiếp theo là phản ứng khử chọn
lọc của một nhánh axit propionic tạo ra dẫn suất acrylic metylester 17.
Porphyrin 17 chuyển thành purpurin 18 và sau đó là isopurpurin-5-methyl
ester 19, một tiền chất cho sự hình thành của Chlorin e6- trimetylester. Sự
21


hoán chuyển giữa porphyrin-Chlorin 17-18 là phản ứng chính cho sự hình
thành Chlorin trong quá trình tổng hợp, đó là quá trình đồng phân hóa giữa
porphyrin thành Chlorin duy nhất được quan sát cho đến ngày nay.

Hình 5. Phản ứng chuyển hóa metyl pheophobide a thành Chlorin e6
trimethylester

22


Hình 6. Phản ứng chuyển hóa Chlorin e6 trimethylester thành Chlorin e6
monomethylester (C1)
1.3. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước
1.3.1. Ngoài nước
Chlorophyll là chất có màu xanh lá cây trong thực vật bao gồm cây
xanh và tảo, được tạo thành trong quá trình quang hợp, nó cho phép cây xanh
hấp thụ ánh sáng mặt trời và chuyển phần ánh sáng đó sang dạng năng lượng

sử dụng được. Giáo sư Richard W. Statter đã có công trình nghiên cứu và
phát hiện ra rằng: Cấu tạo tế bào hồng cầu gần như đồng nhất với cấu tạo tế
bào diệp lục, giúp tăng lượng hồng cầu trong cơ thể, công trình này đã đoạt
được giải thưởng Nobel vào năm 1915. Chlorophyll chỉ khác với hemoglobin
trong máu người ở nhân Mg2+ trong vòng Chlorin (thay vì Fe2+).
Tới năm 1930 – Giáo sư Han Fisher đã đạt giải thưởng Nobel với
23