Sử dụng chỉ thị phân tử RAPD PCR để đánh giá tính đa dạng di truyền ở một số loài cây dược liệu bản địa ở việt nam

Đ Ạ I H Ọ C Q U Ố C G I A H À NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HOC K H O A HỌC T ự N H I Ẻ N
_* * * * * _

PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG
AZOTOBACTER ĐỂ ú n g d ụ n g t r o n g n ô n g n g h i ệ p

M ã số QT - 0 2 - 1 7

Chủ trì đê tài'. TS. Ngô Tự Thành
Các cán bộ tham gia:
Ths. Vũ Thị Minh Đức
CN. Hoàng Thị Lan Anh
Ths. Nguyễn Thu Hà
TS. Nguyễn Ngọc Quyên

H à n ội, 2003


BÁO CÁO TÓM TẮT
a. Tên đề tài
Phân lập và tuyển chọn các chảng Azotobacter để ứng dụng trong nông
nghiệp
Mã sổ : QT - 02 - 17
b. Chủ trì đề tài: TS Ngô Tư Thành
c. Các cán bộ tham gia:
- Ths. Vũ Thị Minh Đức, khoa Sinh học, ĐHKHT N
CN Hoàng Thị Lan Anh, Khoa Sinh học, ĐHKHTN
Ths. Nguyễn Thu Hà, Viện Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp, Văn
Điển, Thanh Trì, Hà nội
- TS. Nguyễn Ngọc Quyên, Viện Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp. Vãn

Điển, Thanh Trì, Hà nội
d. Muc tiêu và nòi dung nghiên cứu:
Phân lâp và tuyển chọn các chủng Azotobacter có một số hoat tính sinh
h ọc quý nhằm sứ dụng trong việc sản xuất phàn VI sinh vật.

e. Các kết quả đat được:
- Từ 50 mẫu đất canh tác thu thàp ở các địa phương đã phàn lập đươc 18
chúng Azotobacter. Tuy vậy không phái tất cả các mảu đất đều có mãt
loai vi khuẩn này. Chúng tôi chi phàn lập đươc Azotobacter từ các
mảu đất có pH trong khoảng 5.15 đến 7,15. Những mẫu đất có pH
thấp hơn không phàn lâp được loai vi khuấn này. Việc hong khô đất
[àm tãng tính chon lọc khi phàn làp Azotobacter do phần nào đã loai
trừ đưoc Azomonas. loại vi khuán siống Azotobacter nhưng không tạo
thành bào nang.
- Trong số các chủng phân lâp. đã chon được 03 chủng (ký hiệu 86.2,
76.6. 20.2) có hoat tính khử axetvlen - etylen (acetylene reduction
assav - A R a ) là 181.58 ; 141.9 : 167,55 nM CnHVml/h. Cả 3 chúng
này đều hình thành axit indol axetic (indole - 3- acetic acid - IAA)
mòt hocmon sinh trướng thưc vật thuộc nhóm auxm, VỚI hàm lượng
7,57 ; 9,50 ; 5,73 ug/ml dịch nuôi cấy. Cả hai hoạt tính ARA và IAA
của 3 chùng nàỵ đểu cao hơn hoat tính biểu hiên ớ chùng Azotobacter
chroococcum A T I 9 nhâp nòi dùng để sản xuất phân vi sinh vật.
- Chúng 86.2 có khả năng phàn giải chất diêt cò 2,4D. Tuy hoat tính
chưa cao nhưng đây là một đăc điểm rất đáng được chú ý.
- Các thừ nghiệm sinh hoc cho thấv cả 3 chủng phân lâp được đều kích
thích sư nảy mầm của hat ngô tẻ p . l l lên 5,71%. Đăc biệt với ngò lai
ĐK888 (loai hat khó nảy mám). dich nuôi VI khuẩn đã làm tăng ti [ệ
náy mầm từ 8.57 - 14,29% so với đối chứng ngãm ủ bang nước.
- Các công thức bón thèm chúng 86.2 ; 76.6 ; 20.2 ờ qui mô châu vai
trong 2 cu xuân và hè thu đều cho năng suất rau cao hơn công thức đối

chứng. Hơn nữa. chất lương rau cái trắng thí nghiêm đã đươc cải thien;
hàm [ương đường tổng số, vitamin c đểu cao hơn đối chứng. Hàm
lương NO',' giám rõ rèt trong rau quả lô thí nshiem.
- Chung tỏi cho rãng cả 3 chuna Azotobacter do chúnp tôi phân lâp và
[uyển chon đéu có thể đươc sư duns đế sản xuát phàn bón vi sinh vật
và cán được trực tiếp đánh 2 iá trên quv mò đổng ruòng.


f.

-

Bài báo: 01
Đào tạo: 01 Cử nhân
Tinh hình kinh phí của đé tài
Tổng số kinh phí được phân bổ: 8.000.000 đ (Tám triệu đổng)
Đã chi các khoản sau:

•
•

Quản lí phí
Điện nước

320.000đ
lổO.OOOđ

•

T huê khoán chu yê n m ô n

4.800.000đ

• - Vật tư

2.720.000

đ

8.000.000đ

Cộng

Đã quyết toán xong n ãm 2002

X ác nhân của B C N khoa
(Kí và ghi rõ họ tên)

Chủ trì đề tài
(Kí và ghi rõ họ tên)

7 ^

Cơ quan chủ trì đề tài
PHO HiỀu TRUỎNG

/ \ rL
y

%'

LIST OF THE SCIENTIFIC PR OJECT IN THE YEAR 2002
OF UNU LEVER
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.

Branch: Biology
Pro je c t: Screening Azotobacter for agriculture purposes.
Numerical code: QT - 02 - 17
Supervising agency: VNU
Responsible agency: Hanoi University of Science
Combined agency:
M ain responsible person: Dr. Ngo Tu Thanh
Combined responsible:
- MS. Vu Thi Minh Due, Hanoi University of Science
- BS. Hoang Thi Lan Anh, Hanoi University of Science
- MS. Nguyen Thu Ha, Vietnam Agricultural Science (VASI)
- Dr. Nguyen Ngoe Quyen, VASI
9. Implem enting period: from 2002 to 2003
10. T h e tar get of project: Screening Azotobacter for agriculture purposes.
11. Abstract of the content and the result:
- Result of Science and Technology:
From 50 soil samples, 18 Azotobacter strains were isolated. All of them were

isolated from soil samples having pH values from 5.15 to 7.75. In the soils having
lower pH. Azotobacter was not found. Drying soil samples seemed to be a sood
improvement of the isolation: perhaps the selectivity of the soil was increased, a
benificial result to Azotobacter. while Azotomonas was killed because of lacking in
cysts.
Among the isolated strains, 3 strains (N° 86.2, 76.6 and 20.2) were selected
because of their good properties: having activity of acetylene reduction assay (ARA)
and activity of producing indol - 3 acetic acid (IAA) - a plant hormone of auxin
group. The first activity of these 3 strains was of 181.58. 141.90 and 167.55 nM
C2H 4 / ml/ h, respectively. The second one was of 7.57, 9.50 and 5.73 ug/ ml.
respsectively. Both activities ARA and IAA of these 3 strains were greater than
those of Azotobacter chroococcum AT 19 - a imported strain used in microbial
inoculant production.
The strain 86.2 was able to decompose the herbicide 2.4 dichlorophenoxy
acetate (2.4D). It is interesting, although its activity was not very high.
The bio - assay showed that the culture supernatant liquor of all 3 isolated
strains stimulated the germination of maize grains. The grain germination proportion
of the maize race PI 1 was increased by 5.71%, and of the maize hybrid race DK888
(difficult to be germinated) - by 8.57 - 14.29% in comparison with the control
(grains incubated with water)
On pot - scale, in both harvests (spring and summer), in all the soil formulae
for inoculation with 3 above strains, the celery cabbage (Brassica chinensis)
productivity was higher than that of control without inoculation. The quality of this
vegetable was clearly improved: the contents of total susar and vitamin c were
higher than those of control, while the NO-,' amount was decreased.
With the above properties, all the 3 selected strains were considered suitable
for production of microbial inoculant. It IS necessary to evaluate the effectiveness of
these strains on vegetable yields on field - scale.

Result o f training: 01 Bachelor Degree
To contruct the material and technical bases
Practical application possibility
Publication: 01 paper (printing)


Danh mục các chữ viết tắt

- ARA

:

A cetylene reduction assay

- AND

:

A xit dezoxiribonucleic

- CHQ

:

Chlorohydroxyquinol

- 2,4D

:

2. 4 D i c h l o r o p h e n o x y a c e t i c ac id

- DHQ

:

Dihydroxyquinol

- IA A

:

Indol ace tic acid

- N 2 - aza

:

Nitrogenaza

- TCP

:

2,4,6 Tnchlorophenol


MỤC LỤC
Trang
Lời mở đ ầ u ..............................................................................................................................

1

1. Tổng quan tài liệu..............................................................................................................

2

1.1 Đặc điểm của các chi trong họ Azotobacteraceae...........................................

2

1.1.1

Một số đăc điểm của chi Azotobacter.....................................................

2

1.1.2

Một số đặc điểm của chi A zom onas.........................................................

2

1.2 Sự phân bố của Azotobacter tronơ các loai đất..................................................

4

1.3 Chế phấm phân bón sinh học chứa Azotobacter và hiêu quả
trong trổng trọt trong những nghiên cứu ban đầu.............................................

5

1.4 Khả nâng hình thành axit indol axetic (IAA)....................................................

7

1.5 Độc tính của 2,4D và khá nãns phân siãi một số
hợp chất có chứa nhàn thơm cùa Azotobacter...................................................
1.5.1

Đôc tính của 2.4D......................................................................................

1.5.2

Khả nãne phàn giải các hợp chất có chứa

vòng thơm cùa Azotobacter...................................................................................

8
8

9

2. Vật liệu và phương pháp................................................................................................... 10
2.1 Vật l i ệ u ..................................................................................................................... 10
2.1.1 Mẫu đất và vi sinh vật...................................................................................

10

2.1.2 Các hoá chất và chất thử................................................................................ 10

2.1.3 Các máy m ó c .................................................................................................... 10
2.1.4 Các mòi trường................................................................................................

11

2.2 Phương pháp............................................................................................................... 11
2 . 2 . 1 Phàn ỉâp A zotobacter.....................................................................................

11

2 . 2.2 Cách đo pH cua các mẫu đất........................................................................

11


2.2.3 Xác định đãc điểm của tễ bào Azotobacter............................................... 11
2.2.4 Khả nãng cô' định ni tơ................................................................................... 12
2.2.5 Xác định I A A .................................................................................................. 12
2.2.6 Khả năng phân giải 2.4D............................................................................... 12
2.2.7 Tác động của dịch nuôi vi sinh vật tới
sự nảy mầm của hạt ngô.......................................................................................... 13
2.2.8 Thí nghiệm ở qui mô chậu vại với rau cải trắng...................................... 14
2.2.9 Cách làm tiêu bản để quan sát hình dạng tế

bào

Azotobacter dưới kính hiển vi điện tử quét........................................................... 14
3. Kết quả và thảo luận....................................................................................................

15

3.1 Phân lập Azotobacter spp. Từ các mảu đất cópH khác nhau............................ 16
3.2 Một số đặc tính sinh học cùa các chúng
Azotobacter được sứ dụng trong các nghiên cứu...................................................16
3.3 Phản ứn 2 khử axetylen - etylen............................................................................ 19
3.4 Sự chuyển hoá trytophan thành IAA của các chủng Azotobacter...................... 19
3.5 Sự phân giải 2,4D.................................................................................................... 20
3.6 Ảnh hưởng của dịch nuỏi đến sư nảy mầm của hat ngô................................. 26
3.7 Năng suất và chất lương rau cải trắng khi được
bón thèm Azotobacter................................................................................................ 27
Kết [ u à n .........................................................................................................................................29
Tài liệu tham khảo .......................................................................................................................30


LỜI M Ở ĐẨU

Khai chác và sử dụng VI sinh vàt có ích phuc vu cho nông nghièp đang
là một hướng hiện đai góp phần tãng nâng suất câv trồng và làm giảm ô nhiẻm
môi trường. Azotobacter là vi khuẩn hiếu khí, sống tự do trong đất và có khả
nãng cố định mtơ phân tử. Khả năng này đã được biết tới từ rất lâu. Chế phấm
sinh học có chứa Azotobacter được đặt tên là Azotobacterin đã mang lại sự
thay đổi tỉch cưc về nãng suất cũng như chất lượng cày trồnơ. Trước đâv, người
ta lầm tường rằng hiệu quả mà chế phám này mang lại là do sự cố định mtơ
cùa vi khuẩn trong đó. Tuy nhiên, thưc tế cho thấy quá trình cố định nitơ sẽ
không diễn ra khi môi trườns có chứa amon dù chỉ là môt lượng nhỏ. Có lẽ
hiệu quả mà chế phẩm Azotobacterin mang lại là do Azủtobacter tiềm tàng
những khả năng khác. Các nghiên cứu về sau đã khảng đinh: hiệu quả tốt cùa
việc xứ lý hạt VỚI dịch huyền phù Azotobacter trước khi gieo trổng phần lớn là
do Azotobacter có khá nãng tổng hợp các chất kích thích sinh trường thực vật
(axit

indol

axetic,

axit

eibberellic),

các

vitamin

(Bl.

B2.

nicotinic,

piridoxyl...), khả nâng tiết axit amin ra mỏi trường [7], Những khá nãng đó
được xem là những đặc tính tốt cần khai thác. Gần đâv, mỏt số nhà khoa hoc
đã nghiên cứu và tháo luận về khả nãns phàn siải một số hợp chất vòng thơm
(những chất độc đối với con người và môi trường) cùa VI khuẩn này. Đâỵ là
đăc tính quí còn ít được biết tới. VI vậy, viêc phàn lâp và tuyển chọn các chủng
Azotobacter có đặc tính quí, ổn định sứ dung để sản xuất các chế phẩm vi sinh
dùnơ cho nỏns nghiệp là rất cần thiết, bời lẽ các chế phẩm nàv sẽ góp phần
giải quvết vấn đề vể ô nhiễm môi trườns cũns như đảm bảo sư an toàn đối với
thưc phám .

NỘI DUNG CHÍNH
1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Đặc điểm của các chi trong họ Azotobacteraceae
Beijerinck là người đầu tiên phàn lập và mò tả hai loài Azotobacter là
A.chroococcum sống trong đất và A. agiiis sống trong nước. Sau đó. các loài A.
vmelandỉi, A. beijerinckii, A. niasignis, A. macrocytogenes và A. paspali được tìm
ra, mô tả, định tên. Trong khoá phân loại, họ Azotobacteraceae được chia thành hai
chi là Azotobacter và Azomonas. khác nhau bởi khả nãng hình thành bào nang trong
chu trình sống [18].
1.1.1.M ột sô' đặc điểm của chi Azotobacter
Các loài trong chi này có tế bào dạng hình trứng lớn, đường kính khoảng 1,5 2.0um . Có tính đa hình, từ hình que tới dang như hình cầu (coccoid). Tế bào có thể
đứng đơn độc từn2 cãp hoăc từng cum. Azotobacter không có khả nâng hình thành
bào tứ nhưnơ các tế bào có thể chuyến thành dang bào nans (cỵst). Thuộc nhóm hoá
dưỡng hữu cơ, sử dung nhiều loai đường, rươu và axit hữu cơ làm nguồn cacbon.
Hiếu khí nhưns cũnơ có thể sinh trưởng ở nồna độ oxi thấp. Có khá nâng cố đinh
nitơ khòng cộnơ sinh. ít nhất 10 mg nitơ khí quyển đươc cố đinh trên lg
cacbonhỵdrat (thường là glucoza) đã tiêu thu. Các ion molvpđen cần cho quá trình
cố định nitơ nhưns có thế thay thế bằng vanadium. Khôns có khả nănơ phân giải
protein. Có thể sừ dụng nitrat. muối amon và môt số axit amin làm nguồn nitơ. Phản
ứn 2 catalaza dươna tính. pH thích hơp để sinh trường với sự có mãt nitơ hợp chất
nằm trong phạm vi 4.8 - 8,5. pH tối thích cho sinh trường và cố định mtơ khoána 7,0
-7,5.
Aiotobacter có mãt trona đất. nước. Chi có mỏt loài liên kết với rễ cỏ là ,4.
paspali. Trong mỏi trường khônơ có nitơ và nguồn cácbon là glucoza. các tế bào
non cúa tất cá các loài đéu có hình dạng giống nhau: dạng que ngăn với hai đáu
tròn, ở tr an s thái già. tế bào thường có hình enlíp và hình SƠ1 VỚI các hat dư trữ ưa

thuốc nhuộm Sudan và metachromatic. Khác VỚI hình dạng đãc trưng cùa các loài
trong chi Azotobacter. tế bào ,4. paspali luòn ờ dang sợi dài ngay cả khi còn non.
Trên môi trườnợ thach - pepton. nước chiết nấm men. hình dang tế bào của tất ca các

loài tronơ chi này đểu trớ nẽn dị dang. Bào nang đươc hình thành trona các óng
ơiốnơ già với đường là nguồn cácbon. iMột số loài chi hình thành bào nang tế bào
trẽn mỏi trường có chứa butan - 1 - ol là nguồn cơ chất hữu cơ có tác dung kích
thích vièc hình thành nang. Tất cả các thành viên cua chi Azotobacter đêu là vi


khuấn Gram âm. A. beijerinckii và A. nigricans không có khả năng chuyển động.
Các loài khác di động nhờ chu mao.
Trên môi trường thach không chứa nitơ với đường là nsuổn cácbon, khuẩn
lạc của Azotobacter xuất hiện sau 48 giờ ở 30°c. Đường kính khuẩn lac 2 - 8mm sau
một tuần nuôi cấy. Nhìn chung, khuẩn lạc của Azotobacter trơn, nhẵn, đục nhớt và
không lồi.
Tuỳ từng loài, trên môi trường saccaroza hoăc rafinoza các homo polysaccarit khuếch tán được hình thành sẽ tao nên các quầng khuếch tán xung
quanh khuấn lạc. A. vinelanclii và A. paspali không tạo thành các homo polysaccarit
khuếch tán. A. chroococcum và một vài chúng ,4. beijerinckii, A. nigricans hình
thành các homo - polysaccant khuếch tán trẽn cả hai loại đường. Trẽn mỏi trường
không có nitơ, A. chroococcum hình thành sác tố nàu đen không khuếch tán và khả
nãng này rất phụ thuộc vào môi trường nuôi cấy. Nhiéu chún 2 của loài này hình
thành sắc tố xám nâu trên môi trường Stamer có chứa 0,2% gluconat. Trons mòi
trường chứa benzoat, khả năng hình thành sắc tố nàu đen thay đổi trong các chúng
thuôc loài A. chroococcum. sắc tố nâu đen cũn 2 được hình thành ờ .4. urmeniacus
và ,4. nigricans. A. beijerinckii hình thành sác tố vàng đên nâu nhat khòns khuếch
tán. Khi có mặt benzoat. sắc tô nâu khuếch tán được hình thành ớ hai loai vi khuán
này.
Azotobacter đòi hỏi nhiệt độ tối thiểu 14°c để sinh trướns. Tuỵ nhièn. một
vài chủng thuộc A. nigricans và A. beijerinckii có khả nâng sinh trương ờ khoảng
9°c. Nhìn chung, nhiệt độ thích hợp nằm trong khoảng 28 - 32°c. Tuy nhiên, A.
vinelandii .4. paspơli và mỏt vài chúng A. chroococcum cần nhièt độ tối thích là
37°c. Tất cả các loài đều chịu được nhièt độ 50uc trong 10 phứt nhưng không sống
sót sau khi xừ lý 60°c trong 10 phứt.

Hoat tính N-ì- aza dươns tính có ở tế bào sinh dưỡng trong môi trườns không
chứa nitơ. Hoat tính giảm đáng kể ớ những tế bào già và không phát hiên đươc khi tế
bào bước vào ơiai đoan hình thành bào nang. Trong thời gian náy mầm. các tế bào
bèn tronơ nan 2 biếu hiên hoat tính N:- aza trước khi phá vỡ lớp exo - cystonưm.
Bacteriophaơơ phàn lãp từ đất có kha năng làm tan khuán lac A.chroococcum
và 4 vinelandii và ở mức đô ít hơn đối với ,4. beijerinckii. Không có loai phagơ nào
có khả nãnơ tấn còng Azomonas. Không có thõng báo nào về sư tấn còng cùa phagơ
đối với tế bào A. nigricans, -4. armeniacus và .4. paspali. Tat cả các chùng
A~otobacter đéu man cam với streptomycin.

Sư mẫn cam

với

ơentamicin.

oxvtetracvclin polvmicin vu ncomvcin thíìv đoi tuv thuọc chuns.
3


1.1.2.M ộ t sô đặc điểm của chi Azom onas
Chi A zom onas có nhiều đặc điểm giông với chi Azotobacter vổ hình dạng tế
bào và một số đặc điểm sinh lý, sinh hoá. Thêm vào đó, các loài trong chi này
thường hình thành sắc tô huỳnh quang tan trong nước, pH tối thiểu để cô định nitơ
gần trung tính nhưng có một số chủng có thể cố định nitơ ở pH 4,6 - 4.8 [ 18].
Đậc điểm khác biêt nhất giữa chi Azotobacter và Azom onas là viẽc hình
thành bào nang. A zom onas không có khả nâng này. Hơn nữa, không có loài nào
trong chi A zom onas hình thành homo - polysaccant khuếch tán, nghĩa là không tạo
thành các quầng xung quanh khuẩn lạc. Sự hình thành sắc tố ờ Azomonas cũng
khác. Trên môi trường thạch không có ion sắt, sắc tố vàng xanh đươc hình thành.

Trẽn các môi trường khác, sắc tô đỏ tím khuếch tán đươc hình thành ở tất cả các
loài. A zom onas insignis tao thành sắc tố nàu đen trên môi trường có benzoat.
Bacteriophagơ phân lập từ ,4. chroococcum và A. vinelandii không có khả nâng tấn
công A zom onas agilis, /4. insignis và A. macrocvtogenes.
1.2.

Sự phân bỏ của Azotobacter trong các loai đất
Các loài Azotobacter thường sống trons đất hơi axit cho tới kiém [18]. Trons

đất axit, chúng có thể sông trong các hốc có phản ứn 2 trung tính. Do có như cầu rát
lớn vể photpho, Azotobacter thườn 2 tồn tai ờ đất màu mỡ. A.vinelandii là đối tượng
tốt cho việc nghiên cứu sinh hoá và di truvén nhưng có mãt han chế trong tư nhiên.
Đất axit thích hợp cho A.beijerinckii. Loài này chiu được pH thấp.
Trong chi Azotobacter chì có .4. paspali sống liên kết VỚI rẻ thưc vật (cò
Paspalum notatum). ở vùn 2 rẻ cò này các chát hữu cơ dồi dào và pH thích hơp cho
sư phát triển của chúns. Thèm vào đó <4. paspali có khả nãng đối kháng với vi khuẩn
Gram dương, một đặc điểm quan trọng cùa các VI khuấn sống ở vùng rẻ.
Số lươn 2 ,4. chroococcum trong đất Ân Đô hiếm khi vưcn quá 1 0 M 0 5 tế
bào/ơ đất [17]. Có hai yếu tố chính ảnh hường đến quần thể Azotobacter trong đất.
đ ó là ho at đ ộ n 2 liên kết đối k h á n g củ a hệ VI sinh vật đất và h à m lương chất hữu cơ

tronơ đất Nhiều vi sinh vật có thể kích thích sinh trường của Azotobacter và ngược
lai Các VI khuấn phân giải xenluloza trong đất đươc xem là có tác dung kích thích
sinh trướnơ của Azotobacter trong đất. và ngươc lai Cephalosporm m sp. lai ức chế
sư sinh trướn2 của Azotobacter.
K'otobacter có nhiéu trons đất trồng trot và đươc bón phàn. Còn trong đất
đồnơ cỏ nơuvên sơ và đất rừng thì tháp hoãc hầu như không có. Bón phân nitơ có thể


ức chế sinh trưởng của Azotobacter. Bón phàn vô cơ có kết quả ngược lại. Phân

photphat có tác dụng kích thích sinh trường, tãng nhanh sô lượng tế bào Azotobacter
trong đất. Azotobacter thường ít có mặt ở vùng bể mật rễ (rhizoplane) nhưng lại rất
phong phú ở vùng cãn quyển. Những chất tiết của rẻ chứa các loai đường, axit amin.
axit hữu cơ cùng với các sản phấm phân giải từ xác các rẻ đã cung cấp nguồn nãng
lượng để Azotobacter nhân lên trong đất.
Sự có mật của Azotobacter trong đất trổng trọt Nhật Bản tuản theo quy luật
sau: số lượng- tế bào trong đất trổng lúa > đất cao nguyên không phải tro núi lửa >
đất cao nguyên tro núi lửa. Sự khác nhau nàỵ do sự khác biệt về độ ẩm trong các loại
đất [8].
Tại Côet hệ VI sinh vật ờ vùng đầm lầy ngãp mãn nghèo hơn so với vùng khô hạn.
Azotobacter spp. chỉ được phát hiện ở vùng rễ các cày Salicornia herbacea. Cvperits
conglomeratus, Rhantenum epapposum, Convolvulus oxyphyllus. Với đất xa vùng
rễ, Azotobacter chi gãp ớ những nơi có trồng cày Mensembry anthemum [5].
1.3. C h è p h á m ph àn bón sinh học chứa Azotobacter và hièu quà trong tróng
trọt trong những nghiên cứu ban đầu
Chế phấm phân bón sinh học chứa Azotobacter đươc các nhà khoa hoc Liên
Xô (cũ) đặt tên là Azotobacterin. Qui trình sản xuất chế phấm có chứa Azotobacter
c ũ n 2 tương tư như qui trình sản xuất các chè phấm chứa Rhizobium. Đế tao thành
chế phấm, nsười ta sử dung các chất mang như bôt than bùn. Ugnin, phàn chuồng
dạng bột. Các chất mang được trung hoà bans CaCO?. khứ trùng và trôn VỚI dịch
nuỏi cáy Azotobacter. Hỗn hơp vi khuẩn và chất man 2 đươc nuôi tiếp trên khay 2 - 5
n ơàv rồi đ ó n ơ 2 Ó1 trong túi PE, bảo quản ờ nơi thoáng mát. Khi sừ dung, chế phẩm
đươc hoà với lượng nước tối thiểu đế tao thành dang vữa mịn. Hạt giỏng đươc trôn
đểu VỚI vữa này. hong khô nơi râm mát trước khi gieo. Cây con (bắp cái. súp lơ...),
trước khi cấy rẻ được nhúng vào vữa và đem trổng ngay.
Hiẽu quả của chế phấm Azotobacterin đến năng suất cày trổng ờ Liên Xô
(cũ) và Ấn Độ được tổng kết ờ bảng 1,2 sau đây [13. 17].


Bảng 1. Hiệu quả của Azotobacterin đến năng suất cày trồng.

Loại cây trổng

Tăng năng suất (%)

Lúa mì xuân

8.20

Lúa mì đông

9,80

Yến mạch

12,00

Lúa mạch

9.00

Ngô

8.00

Củ cải đường

7,00

Khoai tây

8.00

Kết quả trung bình

8,86

Bảng 2. Tóm tắt các còng bó kết quà thí nghiêm vè ảnh hường của
A.chroococcum đến nãng suát cày trồng ờ Ân Độ trẽn qui mò đồng ruộng
Loại cày

Chế
phàn

độ

Phương pháp xừ lv với chế phẩm VI Tăng nãn 2 suất so với
khuấn

đối chứng khônă xứ

lý vi khuân (%)
---------------------------------- 4
Nhúng rễ vào chế phẩm dạng vữa 22

Hành

trước khi trổng
Hành

-)*
Lm

nt

Lúa mì

3*

Hat giốns u VỚI dich tế bào VI 2 - 8

18

khuẩn
Lúa nước

3

nt

1 - 2°

Lúa nước

4*

nt

23

Cà

5*

Nhúng rễ vào chế phẩm trước khi

1 - 42

trồng
Cà chua

5

nt

2 - ^9

Cai bãp

5

m

26-45

Cà

5

nt

15 - 62

*Chú thích về chế độ phàn bón:
1 ■0 k° N + 40 xe bò phàn chuổng + 50 kg PịO, + 100 kg K:0 .

?■ 100 k 2 N + 40 xe bò phân chuổng + 50 kg P ; 0 5 + 100 kg K;0 .
3; Với các lương NPK khác nhau.
4- P 0 k 2 N + 60 k s P ; 0 5 + 60 kg K:0 .

5- Với các lương NPK và phàn chuồng khác nhau.
6


Gần đây, người ta khẳng định rằng han chê lớn của việc sử dụna các vi khuẩn
dinh dưỡng nitơ nhằm thay thè một phần phân bón chứa nitơ là ờ chỗ N_j-aza không
được tông hợp khi nuôi các vi khuẩn này trong môi trường đủ hoặc dư thừa nguồn
nitơ hợp chất. Ngoài ra, ở hầu hết vi khuẩn cố định nitơ. Ni - aza bị bất hoạt bới
amon.

ơ

các loài của chi Azospiriỉlum, Rhodospirilhtm, Rhodobacter và ờ

Azotobacter chroococcum việc thèm 1 - 10 m M amôn vào môi trườns làm giảm
hoạt tính N2 - aza gần như tức thời, tới 10% hoãc nhỏ hơn so với hoạt tính ban đầu.
ơ các vi khuẩn này cũng không phát hiện thày các Nn - aza mới được tons hơp [15].
Việc tăng nâng suất cây trổng nhờ bón các vi khuẩn cố định nitơ. có lẽ là do
chúng tiết ra các chất kích thích sinh trướng thực vật. các axit amin, phàn giải một
số chất độc có trong đất.

1.4. Khả năng hình thành axit indol axetic (IAA)
Tác dụng chủ yếu của IAA là kích thích sinh trường theo chiều dài tế bào,
kích thích sư phân chia tế bào trong thương tầng, đăc biệt ở cày 2 0 . ảnh hưởng đến
sư tổng hơp ADN. Naoài ra. chất này còn kìm hãm sinh trường của các chồi phu. do
đó tạo điểu kiên thuận lơi cho chồi chính phát triển. Đãc bièt IAA kích thích sư ra rễ
cùa mô sẹo, ngăn ngừa sư run2 đài. nu. hoa. qưa. lá [3].
Sự có mật cùa IAA và axit gibberellic trong dịch nuòi cấv Azotobucter đã
đươc thông báo. Tuy nhiên, sư hình thành chất kích thích sinh trường thưc vàt này
lúc đầu chi được phát hiện ớ /4. chroococcum . Sau đó, IAA cũng đươc phát hièn
troníĩ dịch nuôi cấy của một chùng ,4. vinelandii dù rầng nồns độ cưc đai cua chát
này chi là 0,01 ug/ml sau 3 - 6 ngày [11].
Tryptophan có thể chuyển hoá thành IAA với sư có mặt của các chất nhận
nhóm amin. Các chúng Azotobacter có the tạo thành mỏt lượng nhỏ IAA ngay cả
khi khônơ có mãt tryptophan. Tuv vãy, khi bổ sung tryptophan sinh tổng hơp chất
nàv sẽ nânơ cao rõ rệt. Pyruvat. a - ketoglutarat rất có hièu lực trong vièc loai amin
cúa tryptophan Nổnơ đô a - ketoslutarat 4m M là thích hơp nhất cho sư hỉnh thành
IAA với nổnơ đô tryptophan ban đẩu là ImM [16]. Tryptophan là môt trong những
axit amin đươc tiết ra từ rễ cày. Các câv khác nhaư thì chất tiết của rễ sẻ khac nhau.
Nếu chất tiết chứa tryptophan có nghĩa là tryptophan sẽ đươc chuyến hoá thành
[AA Điểư đó ơiai thích sự đáp ứng khác nhau cùa các loai cày trổng với vièc bón
Azotobacter.
Các vitamin các chát phu 2Ía hữu cơ. các yếu tố VI lương cũng đóng mòt vai
trò nhất đinh trong qua trình trao đốt chất cua Azotobacter [6]. Các san pham trung
ai-in cua chu trình tricacboxylic như pvruvat. a - ketoglutarat làm tâng sư nết hooc


môn thực vật cua loại vi khuẩn này. Tuy nhiên, các sản phám trung 2 ian khác của
chu trinh như axetat lại kìm hãm quá trình. Về vai trò của vitamin, mặc dù
A.chroococcum được coi là cỗ máy tiẽt các vitamin nhưns bất kỳ loai vitamin nào
bô sung vào môi trường cũng làm tăng sự đồng hoá nitơ của vi khuẩn nàv. Với sự có

mật của các vitamin nhóm B, sự hình thành các chất kích thích sinh trường thực vật
không tăng lên rõ rệt [6]. Các yếu tô vi lượng như molypden, sắt, bo. đồng đóng vai
trò trong việc hình thành IAA.
1.5. Độc tính của 2,4D và khả năng phàn giải một sò hợp chát có chứa nhân
thơm của Azotobacter
1.5.1. Độc tính của 2,4D
2,4D là một trong các chất trư cỏ dại có cơ chế tác dung theo kiểu bất chước
hoạt đông của auxin như IAA. Dưới tác động cùa 2,4D thưc vàt phát triển với tốc độ
nhanh bất thường và bị chết [9]. Tuy nhiên, cơ chế hoat động cuả auxin và 2,4D có
sự khác biẽt rõ rêt. Với nồng độ dao động ờ mức binh thườns, auxin tác động trực
tiếp vào quá trình phát triển của thưc vật mòt cách chính xác. Sau khi phưn. các tẽ
bào nhiễm 2.4D ờ nồng độ cao hơn. bén vững và ổn định hơn auxin. Kết quà là 2.4D
kích thích tổng hợp và gày ra sư bất thường tron 2 sinh trướns. Thưc vật bi chết khi
hè thống vận chuyển của nó (xvlem và phloem) bi ép lai và bi bit kín do sư phát
triển quá mức. Hoat tính các enzvm cúa quá trình sinh nãnơ lươns và sư phàn chia tê
bào cũ ns như các quá trình sinh lý khác cũns bị phá vỡ bời tác đỏng của 2.4D [4],
Là chất diệt cò nhưng 2.4D cũng ánh hườns xấu lên các quá trình sinh học ở
cơ thể đông vật. Dưới tác đòng của 2,4D các enzym của ty thể. cùa qưá trình sinh
tons hơp protein, của quá trình trao đối lipit bị ức chế. 2.4D làm tãng hoat tính
enzvm của tế bào cơ (p - mtrophenylphotphataza) có chức nâng vàn chuyến ion qua
m à n ơ 2.4D ức chế hoat độns của 4 enzvm trong máu. Khá nâng vàn chưvến oxi và
tao thành cạc máu đôns cua máu bị giảm, ơ hè thống thần kinh: 2.4D kết hơp với
axetvlcholin (chất dẫn truyền xung động thần kinh) ức chế hoat động của enzvm
axetvlcholinesteraza. Tổng hơp ADN cũng bị ức chế bời 2.4D [4]. 2.4D gày nèn
nhữnơ tòn thương về di truvển ờ những thư nghiêm có sừ dung tế bào nuôi cấy và
trẽn đônơ vật 2.4D làm táng tần số gen đột biến trong các tế bào nưòi cấy. tăng số
lươnơ c-íc nhiễm sác thể bất bình thường trong các tế bào tuý xương cùa chuõt và cả
những đoan ADN đứt gãy ở người.
Hôi chứnơ nhiẻm đôc 2.4D và các muòì cua nó thể hiên qua vièc nòn mừa. uể
oái thân da bi tổn thương, co cơ. Thị giác bi kích thích manh khi nhiẻm 2.4D [2],

8


1.5.2. K ha năng phán giải các hợp chất có chứa vòng thơm của Azotobacter
Vể khả năng chẻ, bổ" các vòng thơm trong một sô hợp chất, trước tiên phải
kê

đên

các

loài

trong

chi

Pseudomonas,

Achromobacter,

Alcaligenes,

Corynebacterm m . Tuy nhiên, khả nãng phàn giải các hợp chất chứa vòng thơm
cũng đã được phát hiện ở Azotobacter. Người ta đã sử duns benzoat Na làm nguồn
cácbon duy nhất để phàn lập A. chroococcum và A. beijennckii. p - cresol cũng
được đồng hoá bởi hai loại vi khuẩn này .
Các hợp chất clorophenol được sử dung rộng rãi như một chất tẩv uế, bảo
quản, và thải vào môi trường một lượng đáng kể. Li và cộng sự [12] đã phân lập

được chủng Azotobacter sp. GP1 có khả nãng phàn giải TCP. Một số đăc tính cùa
chủng này đã được mô tả. 2,6 DHQ đươc xem là hợp chất trung 2 Ían đầu tiên của
quá trình phân giải TCP. Chất trung gian tương tự cũng đươc tìm thấỵ ờ các chùng
phân giải TCP như Pseudomonas pickettii và Streptomyces rochei 303. Bước tiếp
theo trong quá trình phân 2 iái TCP là việc loại đ o của 2,6 DHQ thành 6 CHQ. Hợp
chát này biếu hiộn cấu trúc catechol và là cơ chất cùa enzvm phân giai vòng thơm có
trong Azotobacter sp. GP1.
Hydroxyquinol 1.2 dioxysenaza tinh chế từ Azotobacter sp. GPl sứ duns
TCP làm nguồn cácbon chù yếu. Chức năng cua enzvm này trong con dường phàn
ơiải TCP đươc dư đoán và tháo luân. Dioxvsenaza đăc hiệu cao VỚI 6 CHQ

và

hỵdroxyquinol. Enzvm này phàn cát ở vị trí octo cùa hơp chất hvdroxỵquinol tao
thành cloromalevlaxetat và maỉeylaxetat. Để chuyển hoá lmol 6 CHQ cđn Imol oxy
tao ra lm ol cloromaleylaxetat. Enzym đươc cảm ứng và sẽ bị mất hoat tỉnh khi mòi
trường có succinat. Trọng lượng phàn từ cua hỵdroxyquinol 1,2 dioxygenaza khoảng
58 000 độ lắnơ là 4.32. Trong lượn 2 phàn tử đơn VỊ là 34.250 cho tháy dioxvgenaza
có cấu trúc dime. Ion Fe:+ làm tâng rõ rệt hoat tính cùa enzvm. Ngươc lai, các nhãn
tô chelat hoá kim loại lại ức chẽ [10].
Như vậv rõ ràns là enzym phàn giải các hơp chất chứa vòng đã được phát
hièn ớ A-otobacter. Tuy chưa thu thâp đươc tài liêu vé khả nãng phân giải 2.4 D cua
chúng 4 zotobacter nhưng chúng tôi cho răng việc tìm kiếm chùng có hoat tính này
tronơ
o tư nhiên là điều có thê thực hiẹn đươc.

9


2. V Ậ T LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

.1. Vật liệu
.1.1. M ẫu đất và vi sinh vật
- Mâu đất lấy ở các vùng chuyên canh rau màu trẽn miền Bắc.
- Chủng Azotobacter chroococcum AT 19 do Viện Khoa học kỹ thuật nônạ
nghiệp Việt N am cung cấp.
2.1.2. Các hoá chất và thuốc thủ
- Đường kính

Việt Nam

- Glucoza
- K2H P 0 4
- M g S 0 4.7H20
- KH2P 0 4
- CaC03
- FeClv 6 H 20

Thương Hải - Trung Quòc

- Na: M o 0 4.2H:0

Thương Hái - Trung Quốc

- 2.4D

Trung Quốc

- Khoanh 2 Ìấy kháng sinh chuán:

Bio - rad (Pháp)

- Phiến loc khuán 0.2 um

Advantec TOYO - Nhát Ban

- Thuốc thứ Salkovvski [14]
FeCl} 0.5iM

: I5ml

H:S 0 4 (d = 1.84 ): 300ml
H: 0

: 500ml

Bảo quản trong lọ có màu
2.1.3. Các m áy móc
- Tú thổi khí vò trùng BK

Việt Nam

- Máy lắc ổn nhiệt Stuart Scientific S I 50

Anh

- Máy trộn dung dịch ống nghiệm

Đức

- Máy li tâm Kubota

Nhật Bán

- Máy so màu Coming 252

Anh

- iMáy đo pH

Trung Quỏc

- Thiết bi từ nsoai - khá biến - hổng ngoai gán
líV - VIS - NIR - Scanning spectrophotometer

u v 3101 PC Shimazu

Nhât Bán

- Kính hiển vi đièn từ quét
JSM - 5410 LV. JEOL

Nhãt Bàn

10


2.1.4. C ác công thức mòi trường
* Môi trường Bulk cải tiến (g/1) (MT B)
Đường kính

20,0

M g S 0 4.7H20

0.2

C a S 0 4.2H20

0,1

FeCl3.6H2Õ

0.01

N a , M o 0 4.2H: 0

0.002

Thạch

16.0

Nước cất

500 ml

Đệm phosphat kali 0,005 M, pH 7.1: 500 ml
* Môi trường xác định khả nãng hình thành axit indolaxetic (IAA)
MT B dịch thế 1000ml. tryptophan lOOmơ. pH 7.
* Môi

trường xác định khả nãng phãn 2 iải 2.4D
MT B dịch thể 1000ml. bổ sung 200m2 2,-D.

2.2. Phương pháp
2.2.1. P hán láp Azotobacter
Đất được thu thâp từ các vùng chuvẽn canh rau màu gồm 2 lô: lô 1 giữ
nguvên độ ẩm ban đáu. ỉô 2 đã hong khỏ ớ nhiệt độ phòno, nghiền mịn. Làm giàu
A ío to b a cter bằn2 cách cho lg đất khô (hoăc 2.2 đất ướt) vào bình chứa 50ml MT B
dịch

thế. Sau 1 tuần Iấỵ 1 vòng que cấy lớp ván 2 mỏn 2 trẽn bề mát dịch thế. na

lên đĩa thach M T B. ủ 30°c trong 3 ngày. Soi kính và thu nhân các

cây

khuấn lac

Azotobacter có màu nâu đen đặc trưng. Tièp tuc làm sach nhiéu lần băng cách ria
cấy 3 pha. Sau đó cấy truyèn vào ốns thach nghiêng, nuỏi cấy ở 30°c để giữ gióng.
2.2.2. Cách đo p H của cac mẫu đát
Pha dunơ dich KC1 IN, sau đó trộn mảu đất VỚI dung dịch này theo ti lê Ig
đất : 2.5 ml KC1 IN. Lãc hỗn hơp trong 1 giờ. Đo pH trẽn máy đo.
2.2.3. X ác đinh đác điếm cùa té bao Azotobacter
Các đãc điếm như kha nãn2 sinh trường trẽn mòi trường nhãn tao. hình dang
khuán lac hình dang tế bào. kích thước tẽ bào. kha nâng di chuyển, sư hình thành
bào nang tạo homo - polisaccarit khuếch tan. phân huy tinh bôt. aư dung benzoat là
n ^ u ổ n c á c b o n d u y nh ất, tinh m ả n c a m VỚI m ò t sỏ k h a n g s in h đ ư ơ c tiến h a n h t h e o

chí dẫn cùa [18].


2.2.4. X ác định khả năng c ổ định ni tơ
Được xac đinh gián tiêp qua phản ứng khử axetvlen - etvlen (acetvlene
reduction assay —ARA). Hoạt tính được xác định và tính toán trẽn máv sắc kv khí
PYE UN ICA M senes 240 chromatograp (Anh).
2.2.5. X ác định axit indol • 3 -axetic (indole - 3 - acetic acid - IAA)
Khả năng tổng hợp IAA thỏ được xác định theo phương pháp Salkovvski cải
tiến như sau: vi sinh vật được cấy vào bình nón chứa MT B dịch thể có bổ suns
tryptophan 100mg/lít đã khử trùng. Nuôi lắc 200 vòns/phút ờ 30°c trong 5 ngày. Li
tâm loại bỏ tế bào. Lấy 2ml dịch trong thêm vào ống nghiêm chứa 8ml thuốc thử
Salkowski cải tiến, lắc đều. Để ờ nhiệt độ phòns 30 phút. Màu hồng xuất hiên chứns
tỏ sự có mặt của IAA. So màu ờ bước sóng 530nm. Dưa vào đồ thị chuẩn để tính
hàm lượng IAA [14].
2.2.6. K h ả năng phàn giải 2,4D
Trước khi cấy vi khuẩn, bổ sung 200 mg/1 lít 2.4D vào mòi trườns MT B vò
trùng có hàm lượng glucoza 0; 5; 10: 15 và 20g/l. Nuôi lắc 200 vòng/phút trong 5
ngàv. Li tâm lanh 6500 vòng/phút trong 15 phút. Dich trong được loc qua phiến loc
khuẩn 0,2|am đê’ loai hết các tế bào còn sót lai. Đo phổ hấp phu trên thiết bi tư ngoai
- khả biến - hổn2 ngoai 2 ần (ƯV - VIS - NIR - Scanning - Spectrophotometer)

uv

3101 PC Shimazu (Nhật bản). Đối chứng là dịch nuôi VI khuẩn nhưng không bổ
sun? 2 4D và dịch môi trường có bổ sung 2,4D nhưng không cấy VI khuân. Hàm
lương ~>4D đươc tính theo đồ thị chuấn đã đươc xác đinh trên máy ờ bước sóng 283
■ ữ

*

■

■

am.
* Cách dưng đồ thị chuán xác đinh hàm lương 2.4D:
Pha chất chuẩn gốc: m = 2244 mg/1
CM = 0,01015 mol/1
Cân 0 1 P 2 ơ 9 4D cho vào bình đinh mức 50 (đã rửa sach bâng nước cất 2
lần và sấy khỏ). Đinh mức bâng nước deion đến vach đế có nồng đô gốc là 0.01015
mol/1. Dưng đường chuấn 2.4 D trong khoang nồng đô từ 50 đến 200 mg/1. Láy 4
binh đinh mức. lần lươt lấy mỏt lương thể tích tâng dán dung dich gốc vào bình đinh
mức 25 thêm nước cất deion đến ngấn đế có các dung dich với nòng đô tăng dán 50.
100

150 và 200mơ. Đo mật đô quang các dung dich này tren máy u v - 3 101 và

i:


dựng đo

th ị

chuàn

VỚI

trục tung là độ hấp phụ, trục hoành là nồns độ 2.4D (bảnơ 3

và hình 1).
Bảng 3. Độ hấp phụ của các dung dịch 2,4D đo ở bước sóng 283,5 nm
1

1

3

50

100

150

o
o

V dung dịch gỗc(ml)

0,557

1.114

1,671

2,228

Độ hấp phụ

0,338

0.689

1,046

1.401

STT
C2,4D (m g)

4

Độ hấp phu

il.uuu

1.500

1.000

s'
0.500

Nóng đò
0.0001—
0.000

51000

100.000

I5Ũ.GŨC

200.000

250. GŨO

ppm

Hình 1. Đổ thi chuán 2.4D.
2.2.7. Tác đ ô n ° của dỉch nuôi A zotobacter tới sư nảy mãm của hạt ngo
Hat ngô te p . l l và ngõ lai ĐK.888 được khư trùng bâng HgCl, 0.1% trong 4
phút. Rửa lại nhiều lần băng nước cất vò trùng. Ngảm hat trong nước cất vô trùng 3
- 4 ơiờ sau đó ú hạt với dịch nuôi A zotobacter đã h tâm loai bo tẻ bao (pha loang ti
lệ 5% ) ờ 30 °c trong 2 ngày.
13


2.2.8. T h í nghiệm ở qui mô chậu vại với rau cải tráng
Thí nghiệm được tiến hành trong 2 vụ đông xuân và xuân hè trong chậu 7kg đất/
chậu. Nền phân bón 40N: 80P20 4: 40K 20 . Công thức thí nghiêm được bón thêm 10:
CFU Azotobacter/chậ\i. Thí nghiệm được lăp lại 3 lần. Sau 45 ngàv trồns, thu hoach.
đánh giá theo các chỉ tiêu: số lá/chậu, khôi lượng tươi thân lá, chiều cao cày. % vật
chất khô. Hàm lượng vitamin c, đường tổng số và hàm lượng N 0 3' được xác đinh tai
Trung tâm kiểm tra và tiêu chuẩn hoá chất lượng nông sản thuộc Viện sau thu
hoạch.
2.2.9. Cách làm tiêu bản đ ể quan sát hinh dang tế bào Azotobacter dưới kinh hiển
vi điện tử quét
C hảng nghiên cứu đươc nuôi lắc 180 vòng/phút trên môi trường MT B dịch

thể 48 giờ ở

30°c. Li tâm lanh 6500 vòng/phút trons

10 phút. Sinh khối tế bào đươc

hoà lại trong nước muối sinh lý vô trùng. Đãt 1. 2 2 iot dịch huyền phù tế bào lên
mặt phẳng giấy cacbon 2 ắn trên đế đồng, hon 2 khô. phù vàn 2 và quan sát dưới kính
hiển vi điện tử quét JSM - 5410 LV, JEOL - Japan.

14


3. K Ế T Q Ư Ả VÀ T H Ả O LƯẬiN
3.1. Phân lập A zotobacter spp. từ các mảu đất có pH khác nhau
Từ 13/38 mâu đât hong khô và 6/12 mẫu đất giữ nauvên độ ẩm. chúng tỏi đã
phát hiện sự có mật của Azotobacter. Tuy nhiên, các chùng thu nhàn từ đất khỏ tồn
tại tôt trong điêu kiện nuôi cấy nhân tạo. Các chủng phân lập từ đất ẩm dễ bị chết
sau một thời gian dài bẫo quản trong ống nghiệm và dễ bị nhầm lẫn với Azomonas
(loại vi khuẩn cô định nitơ có hình dạng giông Azotobacter nhưnặ không hình thành
bào nang). Để tãng cường tính chọn lọc, việc hons khô đất ở nhiệt độ phòna trước
khi phân lập Azotobacter là cần thiết.
Phân tích pH của các mẫu đất cho thấv Aiotobacter có măt ờ các mẫu có pH
5,15 - 7,75 (bảng 4). T r o n ơ các mẫu đất có pH thấp hơn. qua nhiều lần kiếm tra,
không thấy loại vi khuẩn này. Kết quả của chúng tôi phù hơp với những cõng bố
trước đây rằng Azoiobacter thường tồn tại trong các mẫu đất có pH axit yếu đến
kiềm [18].
Bảng 4. pH của các mảu đất phát hiện chứa Azotobacter
STT

Mẫu đất

pH

STT

Mảu đất

pH

1

1

6.35

,0

20

6,45

—

7

7.25

11

21

6.35

3

4

6,85

12

24

6.70

4

6

5.95

13

25

6.70

5

8

7.75

14

26

6,60

6

9

7.05

15

28

6.15

7

11

5.95

16

32

7.45

8

18

6.35

17

35

5.15

9

19

6.45

18

36

5.40

I

15


3.2. M ọ t so đa c tinh sinh học của các chủ ng Azotobacter được sử dụ ng trong các
ng hiên cứu
Trong sỏ các chung Azotobacter phàn lập từ đất, qua sơ tuvển theo môt sỏ chi
tiêu như kha nang sinh trương trên mỏi trường nhân tao, sinh tổng hơp IAA, chúns
tôi đa chon được 3 chung có các hoat tính ổn định. Các chủng nàv đươc xem xét kv
về một số đặc tính sinh hoc. Kết quả đươc trình bày ở ban* 5 dưới đâv.
Bang 5. Đặc tính sinh học của các ch ủn g Azotobacter dùng trong nghièn cứu

Chủng vi sinh vật
Đặc tính
86.2
Nguồn gốc

76.1

Phàn lập từ đất

Phân

trổng

trổng lúa tại Gia

trổnơ rau tai Điên

Thuv - Gia Làm

Bièn

rau

tại

Đièn Biên
Sinh

trường

20.2

trên

lập

từ

đất

Phàn

Tốt

Tốt

lập

từ

đất

Tốt

MTB
Hình dang khuán lac

Lức còn non có

Lúc

màu tráng đuc,

màu

đục.

màu trãns đục. Khi

trơn nhầy.

nhầy. Khi già ngả

2 Ìà ngà màu vàng.

màu

khỏnă tiết sác tò ra

già

ngả

Khi
màu

còn

non

trăng
đen.

có

không

đen. khòng tiết

tiết sãc tỏ ra môi

sắc

trường, ướt.

tố ra

mỏi

Lúc

còn

non

có

mòi trườna. nhầy.

trườna. khò.
Hình dang té bào

còn

non

non

có

dang ovan. 2 tê

dans ovan, thườnơ

dang hình trứng. 2

bào thường dính

2 đến 3 tè bào dính

tế bào thườna dính

hển nhau thành

liền nhau

liền

^ 1.3

Khả náng di chuyến

Di chuyển chàm.

X

1,7 um

+-

nhau

thành

hình sô 8.

hình sỏ 8

Hình thành cyst

còn

Khi

Kích thước tế bào

có

Khi

Khi còn non có

' 1.1

X

1.7 um

Di chuyến chàm.
*

= 1 . 3 x 2 um
Khònạ di chuyến.
-

Tao
homopolisaccarit

i-

khuếch tán
16


Phàn huỷ tinh bột

+

+
■

Benzoat

là

nguồn

+

-

cácbon
Tính mẫn cảm với
một số kháng sinh
+

- Chloramphenicol
+

- Tetracyclin
- Penicillin
- Gentamicin

Chú thích:

+

+

+

__

_

4-

-ệ-

(+) mẫn cảm
(-) khôna mần cam

Hình 2. Khuẩn lạc cua chùng 86.2 sau 4 ngày nuòi cáy irén mỏ. truong MT B