Đánh giá hoạt động của màng chọn lọc ion trong thiết bị điện thẩm tách ( ED )

Đ Ạ I HỌC Q U Ố C GIA H À NỘI
TRƯỜNG Đ Ạ I HOC K H O A HỌC T ự N H IÊ N
í|csjesfc 5fe

PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG
AZOTOBACTER ĐỂ ỨNG DỤNG TRONG NÔNG NGHIỆP

M ã sô Q T - 0 2 - 1 7

Chủ trì đ ề tài: TS. Ngô Tự Thành
Các cán bộ tham gia:

Ths. Vũ Thị Minh Đức
CN. Hoàng Thị Lan Anh
Ths. Nguyễn Thu Hà
TS. Nguyễn Ngọc Quyên

H à n ộ i, 2003


BÁO CÁO TÓM TẮT
a. Tên đề tài
Phàn lập và tuyển chọn các chủng Azotobacter đe ứng dụng trong nông
nghiệp
Mã số : QT - 02 - 17
b. Chủ trì đề tài: TS Ngô Tự Thành
c. Các cán bộ tham gia:
- Ths. Vũ Thị Minh Đức, khoa Sinh học, ĐHKHTN
- CN Hoàng Thị Lan Anh, Khoa Sinh học, ĐHKHTN
- Ths. Nguyễn Thu Hà, Viện Khoa học Kỹ thuật Nông nghiêp. Vãn
Điển, Thanh Trì, Hà nội

- TS. Nguyễn Ngọc Quyên, Viện Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp. Vãn
Điển, Thanh Trì, Hà nội
d. Mục tiêu và nòi dung nghiên cứu:
Phân lâp và tuyển chọn các chủng Azotobacter có một số hoat tính sinh
học quý nhằm sử dụng trong việc sản xuất phàn vi sinh vật.
e. Các kết quà đat được:
- Từ 50 mảu đất canh tác thu thâp ờ các địa phương đã phàn lâp đươc 18
chúnơ Azotobacter. Tuy vậy không phải tất cả các mâu đất đêu có mật
loại vi khuẩn này. Chúng tôi chí phàn lập đươc Azotobacter từ các
mẫu đất có pH trong khoang 5.15 đến 7,15. Những mẫu đất có pH
thấp hơn khong phàn lâp đươc loai vi khuán này. Việc hong khô đất
làm tãng tính chọn lọc khi phàn lâp Azotobacter do phần nào đã loai
trừ được Azom onas, loại vi khuấn giống Azotobacter nhưng không tao
-

-

-

-

thành bào nang.
Tronơ số các chủng phân lâp. đã chon đươc 03 chủng (ký hiệu 86.2,
76.6 20.2) có hoạt tính khử axetylen - etylen (acetylene reduction
assay - ARA) la 181.58 ; 141.9 ; 167,55 nM C H ^ m l/h . Cả 3 chung
này đểu hình thành axit mdol axetic (indole - 3- acetic acid - IAA)
mọt hocmon sinh trướns thưc vật thuôc nhóm auxin, VỚI hàm lương
7 57 • 9.50 ; 5,73 LLg/ml dịch nuôi cấy. Cả hai hoat tính ARA và IAA
của 3 chủnơ nàv đểu cao hơn hoạt tính biểu hièn ớ chùng Azotobacter
chroococcum A T I 9 nhâp nội dùng để sản xuất phân vi sinh vàt.

Chủnơ 86.2 có khả năng phàn d ả i chất dièt cò 2,4D. Tuy hoat tính
chưa cao nhưng đây là một đăc điểm rất đáng đươc chú ý.
Các thư nghiệm sinh hoc cho thấy cả 3 chủng phân lâp đươc đều kích
thích sư nay mầm của hạt ngô té p . l l lên 5,71%. Đãc biệt với ngỏ lai
ĐK888 (loại hat khó nảy mầm), dịch nuôi VI khuẩn đã làm tăng tì lệ
nảv mầm từ 8,57 - 14,29% so với đối chứng ngầm ủ bãng nước.
Các cònơ thức bón thêm chung 86.2 ; 76.6 ; 20.2 ờ qui mổ chậu vại
tronơ cu xuân và hè thu đều cho nâng suất rau cao hơn công thức đối
chứnơ. Hơn nữa, chất lương rau cải trắng thí nghiêm đã đươc cải thiên;
hàm lươnơ đường tổng số, vitamin c đều cao hơn đối chứng. Hàm
lươnơ N O ’,' ơiám rõ rệt trong rau quả lô thí nghièm.
Chun2 tỏi cho rằng ca 3 chung A zotobacter do chúng tôi phân lâp và
tuvểrTchọn đều có thể đươc sư dung để sản xuất phân bón VI sinh vật
va cán đươc trưc tiếp đánh giá trẽn quy mò đổng ruông.


-

Bài báo: 01
Đ ào tạo: 01 Cử nhân

f.
-

Tình hình kinh phí của đề tài
T ổ n g số kinh phí được phân bổ: 8.000.000 đ (Tám triệu đồn g)

-

Đ ã chi các khoản sau:

•

Q u ản lí phí

320.000đ

•
•

Đ iện nước
Thuê khoán chuyên m ôn

160.000đ
4.800.000đ

•

Vât tư

2.720.000 đ
8.000.000đ

Cộng

Đ ã quyết toán xong nãm 2002

Chủ trì đề tài
(Kí và ghi rõ họ tên)

X ác n hân của B C N khoa
(Kí và ghi rõ họ tên)

Cơ quan chủ trì đề tài
pHỎ HlỀU TRUONG

\

r;


LIST OF THE SCIENTIFIC PROJECT IN THE YEA R 2002
OF ƯNƯ LEVER
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.

Branch: Biology
P ro je c t: Screening A zotobacter for agriculture purposes.
Numerical code: QT - 02 - 17
Supervising agency: VNU
Responsible agency: Hanoi University of Science
Com bined agency:
M ain responsible person: Dr. Ngo Tu Thanh
Com bined responsible:

- MS. Vu Thi Minh Due, Hanoi University of Science
- BS. Hoang Thi Lan Anh, Hanoi University of Science
- MS. Nguyen Thu Ha, Vietnam Agricultural Science (VASI)
- Dr. Nguyen Ngoe Quyen, VASI
9. Im plem enting period: from 2002 to 2003
10. T h e ta rg e t of project: Screening Azotobacter for agriculture purposes.
11. Abstract of the content and the result:
- Result of Science and Technology:
From 50 soil samples, 18 Azotobacter strains were isolated. All of them were
isolated from soil samples having pH values from 5.15 to 7.75. In the soils having
lower pH, Azotobacter was not found. Drying soil samples seemed to be a good
improvement of the isolation: perhaps the selectivity of the soil was increased, a
benificial result to Azotobacter. while Azotom onas was killed because of lacking in
cysts.
Among the isolated strains, 3 strains (N° 86.2, 76.6 and 20.2) were selected
because of their ơood properties: having activity of acetylene reduction assay (ARA)
and activity of producing indol - 3 acetic acid (IAA) - a plant hormone of auxin
ơroup. The first activity of these 3 strains was of 181.58, 141.90 and 167.55 mM
C ,H 4 / ml/ h, respectively. The second one was of 7.57, 9.50 and 5.73 ug/ ml,
resp ectiv ely . Both activities ARA and IAA of these 3 strains were greater than
those of Azotobacter chroococcum AT 19 - a imported strain used in microbial
inoculant production.
The strain 86.2 was able to decompose the herbicide 2.4 dichlorophenoxy
acetate (2.4D). It is interesting, although its activity was not very high.
The bio - assay showed that the culture supernatant liquor of all 3 isolated
strains stimulated the sermination of maize grains. The grain germination proportion
of the maize race PI 1 was increased by 5.71%, and of the maize hybrid race DK888
(difficult to be germinated) - by 8.57 - 14.29% in comparison with the control
(grains incubated with water)
On pot - scale, in both harvests (spring and summer), in all the soil formulae

for inoculation with 3 above strains, the celery cabbage (Brassica chinensis)
productivity was higher than that of control without inoculation. The quality of this
vegetable was clearlv improved: the contents of total sugar and vitamin c were
higher than those of control, while the NO-,' amount was decreased.
With the above properties, all the 3 selected strains were considered suitable
for production of microbial inoculant. It is necessary to evaluate the effectiveness of
these strains on vegetable yields on field - scale.


R esult of training: 01 Bachelor Degree
To contruct the m aterial and technical bases
Practical application possibility
Publication: 01 paper (printing)


Danh mục các chữ viêt tát

- ARA

:

A c e ty le n e red uction assa y

- AND

:

A x it d ezo x irib o n u cleic

. CHQ

:

C h lo ro h y d ro x y q u in o l

- 2 4D

:

2 .4 D ic h lo r o p h e n o x y a c e tic acid

- DHQ

:

D ih y d ro x y q u in o l

. IA A

:

Indol acetic acid

- N 2 - aza

:

. TCP

:

N itro g en a za

2 .4 .6 T n ch lo ro p h en o l


MỤC LỤC
Trang
Lời m ở đ ầ u ...............................................................................................................................

1

1. Tổng quan tài liệu..............................................................................................................

2

1.1 Đặc điểm của các chi trong họ Azotobacteraceae...........................................

2

1.1.1

Một số đãc điểm của chi Azotobacter......................................................

2

1.1.2

Một số đặc điểm cùa chi A io m o n a s..........................................................

2

1.2 Sự phân bố của A zotobacter trong các loại đất.................................................

4

1.3 Chế phấm phân bón sinh hoc chứa Azotobacter và hiệu quả
trons trồng trọt trong những nghiên cứu ban đầu.............................................

5

1.4 Khả năng hình thành axit indol axetic (IAA)....................................................

7

1.5 Độc tính của 2,4D và khá nãng phân giải một số
hơp chất có chứa nhàn thơm của A zotobacter...................................................
1.5.1

Độc tính của 2.4 D ........................................................................................

1.5.2

Khả nãng phân giải các hơp chất có chứa

vòns thơm của A zotobacter...................................................................................

8
8

9

2. Vật liệu và phương pháp................................................................................................... 10
2.1 Vật l i ệ u ..................................................................................................................... 10
2.1.1 M ẫu đất và vi sinh vật...................................................................................

10

2.1.2 Các hoá chất và chất thử................................................................................ 10
2.1.3 Các máy m ó c .................................................................................................... 10
2.1.4 Các mỏi trường................................................................................................

11

2.2 Phương pháp...............................................................................................................
2.2.1 Phàn làp A zotobacter....................................................................................

11

T ? ? Cách đo pH của các mảu đ ất........................................................................

11


2.2.3 Xác định đặc điểm của tế bào A zotobacter...................................................11
2.2.4 Khả năng cố định ni tơ................................................................................... 12
2.2.5 Xác định IA A .................................................................................................. 12
2.2.6 Khả nâng phân giải 2.4D .................................................................................. 12
2.2.7 Tác động của dịch nuôi vi sinh vật tới
sự nảy mầm của hạt ngô.......................................................................................... 13

2.2.8 Thí nghiệm ờ qui mô chậu vại với rau cải trắng...................................... 14
2.2.9 Cách làm tiêu bản để quan sát hình dạng tế bào
A zotobacter dưới kính hiển vi điện tử quét....................................................... 14
3.

Kết qưả và thảo luàn....................................................................................................

15

3.1 Phân làp Azotobacter spp. Từ các mẫu đất cópH khác nhau.......................... 16
3.2 Một số đăc tính sinh học cúa các chủng
Azotobacter được sử dụng trong các nghién cứu................................................ 16
3.3 Phản ứna khử axetylen - etylen........................................................................... 19
3.4 Sư chuyển hoá trytophan thành IAA của các chủng A zotobacter................19
3.5 Sự phân giải 2,4D .................................................................................................... 20
3.6 Ảnh hưởng của dịch nuôi đến sư nảy mầm của hạt n gô ................................. 26
3.7 Nãng suất và chất lương rau cải trắng khi được
bón thèm A zotobacter............................................................................................... 27
Kết l u à n ....................................................................................................................................... 29
Tài liệu tham khảo.....................................................................................................................30


LỜI M Ở ĐẨU

Khai thác và sử dụng vi sinh vật có ích phuc vụ cho nòng nghiêp đang
là một hướng hiện đại 2 Óp phần tăng nãng suất cây trồng và làm 2 Íảm ô nhiễm
môi trường. A zotobacter là vi khuẩn hiếu khí, sống tự do trong đất và có khả
nâng cố định nitơ phàn từ. Khả năng này đã được biết tới từ rất lâu. Chế phấm
sinh học có chứa A zotobacter được đặt tên là Azotobacterin đã mang lại sự
thay đổi tích cưc về năng suất cũng như chất lượng cây trồng. Trước đây, người

ta lầm tưởng rằng hiệu quả mà chế phám này mang lại là do sự cố định nitơ
cùa vi khuẩn trong đó. Tuy nhiên, thưc tế cho thấy quá trình cố định nitơ sẽ
không diễn ra khi mỏi trường có chứa amon dù chỉ là môt lượng nhỏ. Có lẽ
hiệu quả mà chế phấm Azotobactenn mang lại là do Azotobacter tiềm

tàng

những khả năng khác. Các nghiên cứu vé sau đã khảng định: hiệu quả tốt của
việc xử lý hạt với dịch huyền phù Azotobacter trước khi gieo trồng phần lớn là
do Azotobacter có khả nãng [ổng hợp các chất kích thích sinh trướng thực vật
(axit

mdol

piridoxvl..

axetic.

axit

sibberellic),

các

vitamin

(Bl.

B2.

nicotinic,

khả nâng tiết axit amin ra môi trường [7], Những khả năng đó

được xem là những đặc tính tốt cần khai thác. Gần đây, môt sô' nhà khoa hoc
đã n ơhiên cứu và tháo luận về khả nâng phàn giải mòt số hợp chất vòng them
(nhữnơ chất độc đối với con người và mỏi trường) cùa VI khuẩn này. Đây là

đăc tính quí còn ít được biết tới. VI vậy, việc phân lập và tuyển chọn các chủng
A zotobacter có đãc tính qưí, ổn định sử dung để sản xuất các chế phẩm vi sinh
dùnơ cho nòng nghiệp là rất cần thiết, bời lẽ các chế phám này sẽ góp phần
ơiải quvết vấn đề về ỏ nhiễm môi trường cũng như đám bảo sư an toàn đối VỚI
thưc phẩm .


NỘI DUNG CHÍNH
1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Đặc điểm của các chi trong họ Azotobacteraceae
Beijerinck là người đầu tiên phàn lập và mô tả hai loài Azotobacter là
A.chroococcum sống trong đất và A. agilis sốns trong nước. Sau đó. các loài A.
vinelandii, A. beijerinckii, A. niasignis, A. macrocytogenes và A. paspali được tìm
ra, mô tả, định tên. Trong khoá phân loại, họ Azotobacteraceae được chia thành hai
chi là Azotobacter và Azomonas, khác nhau bới khả nãng hình thành bào nang trong
chu trình sống [18].
1.1.1.M ột sô' đặc điểm của chi Azotobacter
Các loài trong chi này có tế bào dạng hình trứng lớn, đường kính khoảng 1,5 2.0um . Có tính đa hình, từ hình que tới dang như hình cầu (coccoid). Tế bào có thể
đứng đơn độc từng cãp hoác từng cum. Azotobacter không có khá nãng hình thành
bào tử nhưna các tế bào có thể chuyến thành dang bào nang (cyst). Thuộc nhóm hoá
dưỡng hữu cơ, sử duna nhiều loại đườns, rươu và axit hữu cơ làm nguồn cacbon.
Hiếu khí nhưnơ cũng có thể sinh trướng ở nồng độ oxi thấp. Có khá năng cô' định

nitơ khòng cộns sinh. ít nhất 10 mg nitơ khí quyển đươc cố đinh trẽn lg
cacbonhydrat (thường là glucoza) đã tiêu thu. Các ion molypđen cần cho quá trình
cố định nitơ nhưng có thể thay thế bằng vanadium. Không có khả năng phàn giải
protein. Có thể sử duna nitrat. muối amon và một số axit amin làm nguồn nitơ. Phản
ứnnằm tronơ pham vi 4.8 - 8,5. pH tối thích cho sinh trường và cố định mtơ khoảng 7,0
-7 ,5 .
A~otobacter có mặt trong đất, nước. Chi có mòt loài liên kết với rễ cỏ là ,4.
paspali. Tronơ mòi trường khôna có nitơ và nguồn cácbon là glucoza. các tế bào
non của tất cả các loài đều có hình dang giông nhau: dang que ngăn với hai đáu
tròn ở trạnơ thái ơià. tế bào thường có hình enlíp và hình sợi VỚI các hat dư trữ ưa

thuốc nhuộm Sudan và metachromaúc. Khác với hình dạng đăc trưng cùa các loài
trong chi Azotobacter. tế bào A. paspaii luỏn ớ dang sợi dài ngay cả khi còn non.
Trên môi trườnơ thach - pepton. nước chiết nấm men. hình dang tế bào của tất ca các
loài tronơ chi này đểu trớ nên dị dang. Bào nang được hình thành trong các ống
ơiống ơià với đườnơ là nauồn cácbon. Một sỏ' loài chi hình thành bào nang tế bào
trèn mỏi trườnơ có chứa butan - 1 - ol là nguồn cơ chất hữu cơ có tác dung kích
thích viêc hình thành nans. Tát cả các thành viên cua chi Azotobacter đêu là vi


khuẩn Gram âm. A. beijerinckii và A. nigricans không có khả nãng chuyển động.
Các loài khác di động nhờ chu mao.
Trên môi trường thạch không chứa nitơ với đường là nauồn cácbon, khuẩn
lạc của Azotobacter xuất hiện sau 48 giờ ở 30°c. Đường kính khuẩn lac 2 - 8mm sau
một tuần nuôi cấy. Nhìn chung, khuẩn lạc của Azotobacter trơn, nhẵn, đục nhớt và
không lồi.
Tuỳ từng loài, trên môi trường saccaroza hoăc rafinoza các homo polysaccarit khuếch tán được hình thành sẽ tao nên các quầng khuếch tán xung
quanh khuẩn lạc. A. vinelandii và A. paspali khỏng tao thành các homo polysaccarit
khuếch tán. A. chroococcum và một vài chúng -4. beijerinckii, A. nigricans hình

thành các homo - polysaccarit khuếch tán trẽn cả hai loai đường. Trẽn mòi trường
không có nitơ, A. chroococcum hình thành sắc tố nâu đen không khuèch tán và khả
năng này rất phụ thuộc vào môi trường nuôi cấy. Nhiều chùng cùa loài này hình
thành sắc tố xám nâu trẽn môi trường Stanier có chứa 0,2% gluconat. Trong mỏi
trường chứa benzoat. khả năng hình thành sắc tố nâu đen thay đổi trong các chủng
thuộc loài A. chroococcum. sắc tô' nâu đen cũng đươc hình thành ờ A. armemacus
và A. moricans. A. beijennckii hình thành sắc tố vàng đến nâu nhat khỏng khuếch
tán. Khi có mật benzoat, sắc tô' nâu khuếch tán được hình thành ơ hai loai vi khưán
này.
Azotobacter đòi hòi nhiệt độ tối thiếu 14°c để sinh trương. Tuy nhiên, một
vài chủng thuộc A. nigricans và A. beijerinck.il có khả nâng sinh trương ờ khoảng
9°c. Nhìn chunơ, nhiệt đô thích hơp nằm trong khoảng 28 - 32°c. Tuy nhiên, ,4.
vinelandii A. paspali và môt vài chủng A. chroococcum cần nhiệt độ tối thích là
37"c Tất cả các loài đều chịu đươc nhiệt độ 50°c trong 10 phút nhưng không sống
sót sau khi xử lý 60°c trong 10 phút.
Hoat tính N: - aza dương tính có ở tế bào sinh dưỡng trong môi trường không
chứa nitơ. Hoat tính giảm đáng kể ờ những tế bào già và không phát hiên đươc khi tế
bào bước vào siai đoan hình thành bào nang. Trong thời gian nảy mầm. các tế bào
bèn trong nans biểu hièn hoat tính N:- aza trước khi phá vỡ lớp exo - cystonum.
Bacteriophaơơ phàn lâp từ đất có kha nãng làm tan khuán lac A.chroococcum
và 4 vineỉandii và ờ mức đô ít hơn đối VỚI A. beijerinckii. Khòng có loai phagơ nào
có khả nâng tấn công Azomonas. Khòng có thòng báo nào về sư tấn công cua phagơ
đối với tế bào A. nigricans, A. armeniacus và .4. paspali. Tất cả các chủng
4 zotobacter đều mẫn cảm với streptomycin.

Sư mẫn cam

oxytetracvclin, polymicin và neomycin thay đổi tuỳ thuộc chung.

với gentamicin.

1.1.2.M ộ t sò' đặc điểm của chi Azom onas
Chi A zom onas có nhiều đặc điểm giống với chi A zotobacter về hình dạng tế
bào và một số đặc điểm sinh lý, sinh hoá. Thèm vào đó, các loài trong chi này
thường hình thành sắc tố huỳnh quang tan trong nước, pH tối thiểu để cố định núơ
gần trung tính nhưng có một số chủng có thể cố định mtơ ờ pH 4,6 - 4,8 [18].
Đặc điểm khác biệt nhất giữa chi Azotobacter và Azom onas là việc hình
thành bào nang. Azom onas không có khả năng này. Hơn nữa, không có loài nào
trong chi A zom onas hình thành homo - polysaccant khuếch tán, nghĩa là không tạo
thành các quầng xung quanh khuẩn lạc. Sự hình thành sắc tỏ' ờ Azom onas cũng
khác. Trên môi trường thach không có ion sắt. sác tố vàng xanh đươc hình thành.
Trên các môi trường khác, sắc tố đỏ tím khuếch tán đươc hình thành ớ tất cả các
loài. A zom onas insignis tạo thành sắc tố nâu đen trên mỏi trường có benzoat.
Bactenophagơ phân lập từ A. chroococcum và A. vineỉandỉi không có khả nâng tấn
công A zom onas agilis, A. insignis và A. macrocytogenes.
1.2.

Sự phân bô của Azotobacter trong các loai đất
Các loài A zotobacter thườnơ sống trong đất hơi axit cho tới kiềm [18]. Trong

đất axit, chúng có thể sống trong các hốc có phản ứng trung tính. Do có nhu cầu rát
lớn về photpho, Azotobacter thường tồn tại ờ đất màu mỡ. A.vinelandii là đối tương
tốt cho việc nghiên cứu sinh hoá và di truyền nhưng có mật han chế trong tự nhièn.
Đất axit thích hợp cho A.beiịerinckii. Loài này chiu đươc pH thấp.
Tronơ chi A io to b a cter chi có A. paspali sống liên kết VỚI rễ thưc vật (cò
Paspalum notatum ). ỏ vùng rễ cò này các chất hữu cơ dồi dào và pH thích hợp cho
sư phát triển của chúnơ. Thèm vào đó A. paspali có khả nãng đối kháng VỚI vi khuấn
Gram dươns, một đặc điểm quan trọng của các VI khuấn sống ờ vùng rễ.
Số lượnơ A. chroococcum trong đất Ấn Đô hiếm khi vươt quá 104-105 tế

bào/ơ đất [17]. Có hai vếu tố chính ảnh hưởng đến quần thể A zotobacter trong đất.
đó là hoat đ ộ n ơ liên kết đối kháng của hệ vi sinh vật đất và hàm lương chất hữu cơ
tronơ đất Nhiều vi sinh vật có thể kích thích sinh trường của A zotobacter và ngược
lai Các vi khuẩn phàn giải xeniuloza trong đất đươc xem là có tác dung kích thích
sinh trườnơ của Azotobacter trong đất. và ngược lai C ephalosporutm sp. lại ức chế
sư sinh trườna của Azotobacter.
\-o to b a c te r có nhiéu trons đất trổng trot và đươc bón phân. Còn trong đất
đồn* co n ơuvên sơ và đất rừng thì thấp hoặc hầu như không có. Bón phân mtơ có thế


ức ch ế sinh trường của Aiotobacter. Bón phân vô cơ có kết quả nơược lại. Phàn
photphat có tác dụng kích thích sinh trường, tãng nhanh số lượng tế bào Azoiobacter
trong đất. Azotobacter thường ít có mặt ở vùng bề măt rễ (rhizoplane) nhưng lại rất
phong phú ở vùng cãn quyển. Những chất tiết của rẻ chứa các loai đường, axit amin.
axit hữu cơ cùng với các sản phẩm phàn giải từ xác các rễ đã cung cấp nsuồn năng
lượng để A zotobacter nhân lên trong đất.
Sự có mặt của Azotobacter trong đất trồng trọt Nhật Bản tuân theo quy luật
sau: số lượng- tế bào trong đất trổng lúa > đất cao nguyên không phải tro núi lửa >
đất cao nguyên tro núi lửa. Sự khác nhau nàv do sự khác biệt về độ ẩm trong các loại
đất [8].
Tại Côet hệ vi sinh vật ờ vùng đầm lầy ngập mặn nghèo hơn so với vùng khò hạn.
A zotobacter spp. chỉ được phát hiện ờ vùng rễ các cày Salicornia herbacea. Cyperus
conglom eratus, Rhanterium epapposum, Convolvulus oxyphyllus. VỚI đất xa vùng
rễ. A zotobacter chi găp ờ những nơi có trổng cày M ensembry antkem um [5].
1.3. Chè phẩm phân bón sinh học chứa Azotobacter và hiẻu quả trong trồng
trọt trong những nghiên cứu ban đáu
Chế phẩm phân bón sinh học chứa A zotobacter đươc các nhà khoa hoc Liên
Xô (cũ) đặt tên là Azotobacterm. Qui trình sản xuất chế phám có chứa Azotobacter
cũnơ tươnơ tư như qui trình sán xuất các chế phám chứa Rhizobium. Đế tao thành
chế phám nơười ta sử dung các chất mang như bột than bùn. lignin. phàn chuồng

dạng bột. Các chất mang được trunơ hoà bang C a C 0 3, khừ trùng và trộn với dịch
nuôi cấv A zotobacter. Hỗn hơp vi khuẩn và chất mang đươc nuôi tiếp trên khay 2 - 5
nơàv rồi đónơ ơói trong túi PE, bảo quản ờ nơi thoáng mát. Khi sứ dung, chế phấm
được hoà với lượng nước tối thiểu để tao thành dang vữa mịn. Hạt giông đươc trôn
đều VỚI vữa nàv. hon£ khỏ nơi ràm mát trước khi gieo. Cây con (bấp cải. súp lơ...),
trước khi cấy rễ được nhúng vào vữa và đem trồng ngay.
Hiệu quả của chế phám Azotobacterin đến nâng suất cày trồng ờ Liên Xô
(cũ) và Ấn Độ đươc tổng kết ớ bảng 1,2 sau đây [13. 17].


Bảng 1. Hiệu quả của Azotobacterin đèn năng suất cày trồng.
Loại cây trồng

Tăng nãng suất (%)

Lúa mì xuân

8,20

Lúa mì đông

9.80

Yến mạch

12,00

Lúa mạch

9.00

Ngô

8.00

Củ cải đường

7,00

Khoai tây

8.00

Kết quả trung binh

8.86

Bảng 2. Tóm tắt các còng bô kết quả thí nghiêm vé ảnh hường của
A.chroococcum đến năng suất cày trỏng ờ Ân Độ trên qui mò đổng ruộng
-------------- ----------------------------------------- --■'■■■
■1
Chế
độ Phương pháp xừ lý với chế phẩm vi Tăng nãn 2 suất so với
Loại cây
—

phàn

khuán

đối chứnơ khònơ xứ
[ý vi khuán (%)
------------------------------------------------------------------------------------------------

Hành

1*

Nhúng rễ vào chế phẩm dạne vữa

1

22

trước khi trồng
18

Hành

?*
í*

nt

Lúa mì

3*

Hat giỏng u VỚI dich tế bào VI 2 - 8
khuẩn

nt

1 - ~>2

Lúa nước

3
4*

nt

23

Cà

5*

Nhúns rễ vào chế phẩm trước khi

1 -42

Lúa nước

trồng
Cà chua

5

nt

9 . Tộ

Cải bãp

5

nt

26-45

Cà

5

nt

15 - 62

*Chú thích về chế độ phàn bón:
r 0 k ơ N + 40 xe bò phàn chuổng + 50 kg P20 5 + 100 kg K:0 .
2 ’ 100 k ơ N + 40 xe bò phân chuồng + 50 kg p:0 5 + 100 kg K:0 .
3; Với các lương NPK khác nhau.
4- 120kz N + 60 kg p :0 5 + 60 kg K ;0.
ỹ Với các lươns NPK và phàn chuồng khác nhau.
6


Gần đây, người ta khẳng định rằng han chế iớn của việc sử du ns các vi khuẩn
dinh dưỡng nitơ nhằm thay thế một phần phân bón chứa nitơ là ờ chỗ Ni-aza khòns
được tổng hợp khi nuôi các vi khuẩn này trong môi trường đủ hoãc dư thừa nguồn

núơ hợp chất. Ngoài ra, ở hầu hết vi khuẩn cố định mtơ, Nị - aza bị bất hoạt bời
amon. ơ

các loài của chi Azospirillum , Rhodospirillum, Rhodobacter và ờ

A zo tobacter chroococcum việc thèm 1 - 1 0 m M amôn vào môi trườns làm giảm
hoạt tính N2 - aza gần như tức thời, tới 10% hoặc nhỏ hơn so với hoạt tính ban đầu.
ở các vi khuẩn này cũng không phát hiện thấy các N: - aza mới được tổng hơp [15].
Việc tãng nảng suất cây trồng nhờ bón các vi khuấn cố định nitơ. có lẽ là do
chúng tiết ra các chất kích thích sinh trường thực vật. các axit amin, phàn ăiải một
số chất độc có trong đất.
1.4. K hả năng hình thành axit indol axetic (IAA)
Tác dụng chủ yếu cúa IAA là kích thích sinh trường theo chiều dài tế bào,
kích thích sự phân chia tế bào trong thượng tầng, đăc bièt ở cày 20 , ảnh hường đến
sư tổng hơp ADN. Ngoài ra, chất này còn kìm hãm sinh trường cúa các chồi phu. do
đó tạo điều kiên thuận lợi cho chồi chính phát triển. Đãc biệt IAA kích thích sư ra rễ
của m ô sẹo, naãn ngừa sư rung đài, nụ, hoa, quả, lá [3].
Sự có mặt của IAA và axit sibberellic trong dịch nuòi cấv A zotobacter đã
được thôna báo. Tuv nhiên, sự hình thành chất kích thích sinh trường thưc vật này
lúc đầu chí được phát hiện ờ A. chroococcum . Sau đó. IAA cũng đươc phát hiên
tronơ dich nuôi cấy của mỏt chủng A. vinelandii dù ráng nồng độ cưc đai cua chát
này chi là 0.01 ug/ml sau 3 - 6 ngày [11].
Tryptophan có thể chuyển hoá thành IAA VỚI sự có mật của các chất nhận
nhóm amin. Các chún 2 Azotobacier có thể tạo thành mòt lương nhỏ IAA ngay cả
khi k h ô n ơ có mát tryptophan. Tuy Vày, khi bổ sung tryptophan sinh tổng hơp chất
này sẽ nân° cao rõ rệt. Pyrưvat, a - ketoglutarat rất có hiệu lực trong việc loai amin
của tryptophan. Nồng đô a - ketoglutarat 4m M là thích hơp nhất cho sư hình thành
IAA với n ồ n ơ đô trvptophan ban đầu là ImM [16]. Tryptophan là môt trong những
axit am in đươc tiết ra từ rễ cây. Các cây khác nhau thì chất tiết cùa rễ sẽ khac nhau.
Nếu chất tiết chứa tryptophan có nghĩa là tryptophan sẽ đươc chuyển hoá thành

IAA Điều đó ơiải thích sự đáp ứng khác nhau của các loai cày trồng với việc bón
A zotobacter.
Các vitamin các chất phu gia hữu cơ. các yếu tố VI lương cũng đóng mỏt vai
trò nhất định trong quá trình trao đổi chất cua A zotobacter [6], Các sản phàm trung
ơian cua chu trình tncacboxylic như pỵruvat. a - ketoglutarat làm tâng sư tiết hooc


môn thực vật của loại vi khuẩn này. Tuy nhiên, các sản phám trung 2ian khác của
chu trình như axetat lại kìm hãm quá trình. Về vai trò cùa vitamin, mặc dù
A .chroococcum được coi là cổ máy tiết các vitamin nhưna bất kỳ loai vitamin nào
bổ sung vào môi trường cũng làm tâng sự đồng hoá mtơ của vi khuẩn này. Với sư có
mật của các vitamin nhóm B. sự hình thành các chất kích thích sinh trường thực vật
không tãng lên rõ rệt [6], Các yếu tố vi lượng như molypden, sát. bo. đồns đóng vai
trò trong việc hình thành IAA.
1.5. Độc tính của 2,4D và khả nâng phàn giải một số hợp chát có chứa nhàn
thơm của Azotobacter
1.5.1. Độc tính của 2,4D
2,4D là một trong các chất trứ cỏ dại có cơ chế tác dung theo kiểu bất chước
hoạt độns của auxin như IAA. Dưới tác đông cùa 2,4D thưc vật phát triển với tốc độ
nhanh bất thường và bị chết [9]. Tuv nhiên, cơ chế hoat đông cuả auxin và 2,4D có
sự khác biêt rõ rệt. Với nồng độ dao đông ờ mức bình thường, auxin tác động trưc
tiếp vào quá trình phát triển của thưc vật môt cách chính xác. Sau khi phun, các tế
bào nhiễm 2,4D ớ nồng độ cao hơn, bền vữna và ốn định hơn auxin. Kết quả là 2.4D
kích thích tons hợp và gàv ra sư bất thường trong sinh trưởng. Thưc vật bị chết khi
hè thống vàn chuyển cua nó (xylem và phloem) bị ép lai và bị bit kín do sư phát
triển quá mức. Hoat tính các enzym của quá trình sinh năng lương và sự phàn chia tế
bào cũng như các quá trình sinh lý khác cũng bị phá vỡ bời tác đòng của 2.4D [4],
Là chất diệt cỏ nhưng 2.4D cũng ảnh hướns xấu lên các quá trình sinh học ở
cơ thể độnơ vật. Dưới tác đôns của 2,4D các enzym cua ty thể. của quá trình sinh
tốnơ hơp protein, cua quá trình trao đổi lipit bị ức chế. 2.4D làm tãng hoat tính

enzvm của tế bào cơ (p - nitrophenylphotphataza) có chức năng vàn chuyến ion qua
mànơ. 2 4D ức chế hoat đông cùa 4 enzvm trong máu. Kha năng vàn chuyến oxi và
tâo thành cuc máu đôns cuâ mâu bi gidm. 0 hô thong thân kinh! 2.4D kct hơp VƠI
axetvlcholin (chất dẫn truvền xung đông thần kinh) ức chế hoat đông cùa enzvm
axetvlcholinesteraza. Tổng hơp ADN cũng bị ức chế bời 2.4D [4]. 2.4D gày nền
nhữnơ tổn thương về di truyền ờ những thư nghiêm có sư dung tế bào nuòi cấy và
trên độnơ vặt. 2.4D làm tâng tần số gen đột biến trong các tế bào nuôi cấy, tăng số
lươno các nhiễm sắc thể bất bình thường trong các tế bào tuỷ xương của chuôt và cả
nhữnơ đoan ADN đứt gãy ờ người.
Hỏi chứnơ nhiễm đôc 2.4D và các muối của nó thể hiên qua viẽc nòn mửa. uể
oải. thân da bị tôn thương, co cơ. Thi giác bi kích thích manh khi nhiễm 2.4D [2].

8


1.5.2. K h ả năng phán giải các hợp chất có chứa vòng thơm của Azotobacter
Về khả nãng "chẻ, bổ" các vòng thơm trong một số hợp chất, trước tiên phải
kể

đến

các

loài

trong

chi

Pseudomonas,

Achromobacter,

Alcaligenes,

C orynebacterium . Tuy nhiên, khả nãng phân giải các hơp chất chứa vòng thơm
cũng đã được phát hiện ở Azotobacter. Naười ta đã sừ dung benzoat Na làm nsuổn
cácbon duy nhất để phàn lập /4. chroococcum và A. beijerinckii. p - cresol cũna
được đồng hoá bởi hai loại vi khuẩn này .
Các hợp chất clorophenol được sử dung rộng rãi như một chất tẩy uế, bảo
quản, và thải vào môi trường một lượng đáns kể. Li và cộn 2 sự [12] đã phàn lập
đươc chủng Azotobacter sp. GP1 có khá náng phàn giải TCP. Một sò' đăc tính của
chủng này đã được mò tả. 2,6 DHQ đươc xem là hợp chất trung gian đầu tiẻn của
quá trình phân giải TCP. Chất trung gian tương tự cũng được tìm thấy ờ các chủng
phân giải TCP như Pseudomonas pickettii và Streptomyces rochei 303. Bước tiếp
theo trong quá trình phàn giải TCP là việc loai clo của 2.6 DHQ thành 6 CHQ. Hợp
chất này biếu hiện cấu trúc catechol và là cơ chất của enzym phàn giải vòng thơm có
trong A zotobacter sp. GP1.
Hydroxvquinol 1.2 dioxygenaza tinh chế từ Azotobacter sp. GP1 sử dung
TCP làm nơuổn cácbon chủ yếu. Chức nũng cua enzvm này trong con đường phàn
ơiải TCP được dư đoán và thảo luận. Dioxygenaza đặc hiệu cao với 6 CHQ

và

hvdroxyquinol. Enzvm này phàn cắt ờ vị trí octo của hơp chất hydroxyquinol tao
thành cloromalevlaxetat và maleylaxetat. Để chuyển hoá lmol 6 CHQ cần lmol oxy
tao ra lm o l cloromaleylaxetat. Enzym đươc cảm ứng và sẽ bị mát hoat tính khi mòi
trường có succinat. Trọns lượng phàn tử cua hydroxyquinol 1,2 dioxygenaza khoảng
58 000 độ lắnơ là 4.32. Trong lượng phàn tử đơn vị là 34.250 cho thấy dioxygenaza
có cấu trúc dime. Ion Fe:+ làm tâng rõ rệt hoạt tính cùa enzvm. Ngươc lại, các nhãn

tô chelat hoá kim loại lai ức chê [10].
Như vậy rõ ràns là enzym phàn giải các hơp chất chứa vòng đã đươc phát
hiện ở Azotobacter. Tuy chưa thu thập đươc tài liệu về kha năng phân giải 2.4 D cua
chúng A zotobacter nhưng chúng tôi cho ràng việc tìm kiếm chung có hoat tính này
trong tư nhiên là điều có thể thực hiên được.

9


2. V Ậ T LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
2.1. Vật liệu
2 J .2 . M ẩu đất và vi sinh vật
- M ẫu đất lấy ở các vùng chuyên canh rau màu trên miền Băc.
- Chùng Azotobacter chroococcum AT 19 do Viện Khoa học kỹ thuật nõna
nghiệp Việt N am cung .cấp.
2.1.2. Các hoá chất và thuốc thủ
- Đường kính

Việt Nam

- Glucoza
-

k 2h p o 4

- M g S 0 4.7H20
- KH 2P 0 4
- C aC O ?
- F eC ụ.6H : 0

Thương Hải - Trung Quốc

- Na2M o 0 4.2H20

Thương Hải - Trung Quốc

- 2.4D

Trung Quốc

- Khoanh giấy kháng sinh chuẩn:

Bio - rad (Pháp)

- Phiên loc khưán 0.2 um

Advantec TO YO - Nhát Ban

- Thuốc thừ Salkovvski [14]
FeCụ 0.5M

: I5ml

H; S 0 4 (d = 1.84 ) : 300ml
H ,0

: 500ml

Bảo quàn trong lọ có màu
2.1.3. Các m áy móc

- Tu thổi khí vỏ trùng BK

V iệt N am

- M áy lắc ổn nhiệt Stuart Scientific S I 50

Anh

- M áy trộn dung dịch ống nghiệm

Đức

- M áy li tâm Kubota
- M áy so màu Corning 252
- M áy đo pH
- Thiết bị tử ngoai - khá biến - hồng ngoai gần

Nhât Bán
Anh
Truna Quốc

u v - VIS - NIR - Scanning spectrophotometer

u v 3101 PC Shimazu

Nhât Bán

- Kính hiến vi điện tư quét
JSM - 5410 LV. JEOL

Nhât Bản

10


2.1.4. C ác công thức mòi trường
* M ôi trường Bulk cải tiến (g/1) (M T B)
Đường kính

20,0

M g S 0 4.7H20

0.2

C a S 0 4.2H: 0

0,1

FeCl3.6H20

0.01

N a2M o 0 4.2H20

0.002

Thạch

16.0

Nước cất

500 ml

Đệm phosphat kali 0,005 M, pH 7.1: 500 ml
* Môi trường xác đinh khả nâng hình thành axit indolaxetic (IAA)
M T B dịch thể lOOOml, trvptophan 100m2. pH 7.
* M ôi trường xác định khả nănơ phàn giải 2.4D
M T B dịch thể 1000ml, bổ sung 200mg 2,4D.
2.2. Phương pháp
2.2.1. P hàn ỉảp Azotobacter
Đất được thu thâp từ các vùng chuyên canh rau màu gổm 2 lô: lô l giữ
nơuyên độ ám ban đầu. lô 2 đã hong khò ở nhiệt độ phòng, nghiền min. Làm giàu
\-o to b a c te r bằng cách cho l s đất khỏ (hoặc 2g đất ướt) vào bình chứa 50ml MT B
dich thế. Sau 1 tuần lấv i vòns que cấy lớp váng mong trẽn bé mãt dịch thể. ria cấy
lên đĩa thạch M T B. ủ 30°c trong 3 ngày. Soi kính và thu nhàn các khuẩn Iac
4 -o to b a cter có màu nâu đen đặc trưng. Tiếp tục làm sạch nhiều lần bằng cách na
cấy 3 pha. Sau đó cấy truvèn vào ống thach nghiêng, nuôi cấy ờ 30°c đểgiữ giống.
2.2.2. Cách đo p H của cac mẫu đất
Pha d u n ơ dich KC1 IN, sau đó trộn mẩu đất với dung dịch này theo ti lệ lg
đất ■7 5 ml KC1 IN. Lắc hỏn hơp trong 1 giờ. Đo pH trên máy đo.
3. X ác đinh đác điểm của tê bào Azotobacter
Các đăc điểm như kha năng sinh trương trẽn môi trường nhân tao. hình dang
khuấn lac hình dang tế bào. kích thước tế bào. khả năng di chuyển, sư hình thành
bao nang 'tạo h o m o " polisaccant khuếch tán. phan huy tinh bột, sư dung benzoat là
n a u ổ n c a c b o n du y nhất, tính mẫn c ả m VỚI một số kháng sinh đươc liến hành theo

chi dẫn của [18].

11


2.2.4. Xác định khả năng cố định ni tơ
Được xac đinh gián tiếp qua phản ứng khừ axetylen - etvlen (acetylene
reduction assay —ARA). Hoạt tính được xác định và tính toán trên máv sắc kv khí
PYE U N IC A M series 240 chromatograp (Anh).
2.2.5. X ác định axit indol - 3 -axetic (indole - 3 - acetic acid - IAA)
Khả năng tổng hợp IAA thô được xác định theo phương pháp Salkowski cải
tiến như sau: vi sinh vật được cấy vào bình nón chứa MT B dịch thể có bổ suns
tryptophan 100mg/lít đã khử trùng. Nuôi lắc 200 vòng/phút ờ 30°c trong 5 ngày. Li
tâm loại bỏ tế bào. Lấy 2ml dịch trong thêm vào ống nghiêm chứa 8ml thuốc thừ
Salkowski cải tiến, lắc đều. Để ờ nhiệt độ phòne 30 phút. Màu hồnơ xuất hiện chứng
tỏ sự có mặt của IAA. So màu ở bước sóng 530nm. Dưa vào đồ thị chuẩn để tính
hàm lượng IAA [14].
2.2.6. K h ả năng phàn gidi 2,4D
Trước khi cấy vi khuẩn, bổ sung 200 mg/1 lít 2.4D vào mòi trườns MT B vò
trùng có hàm lượnơ glucoza 0; 5; 10: 15 và 20g/l. Nuôi lắc 200 vòng/phút trong 5
ngày. Li tâm lanh 6500 vòna/phút trong 15 phút. Dich trong được loc qua phiến loc
khuẩn 0.2|im để loai hết các tế bào còn sót lại. Đo phổ hấp phu trên thiết bi tư ngoai
- khả biến - hổns ngoai gần (UV - VIS - NIR - Scanning - Spectrophotometer)

(JV

3101 PC Shimazu (Nhật bản). Đối chứng là dịch nuôi VI khuẩn nhưng không bổ
sunơ ? 4D và dịch mỏi trường có bổ sung 2.4D nhưng không cấy vi khuẩn. Hàm
lượnơ 2 4D được tính theo đồ thị chuẩn đã đươc xác đinh trên máy ờ bước sóng 283
nm.
* Cách dưns đồ thị chuàn xác đinh hàm lương 2.4D:
Pha chất chuẩn gốc: m = 2244 mg/1

CM = 0,01015 mol/l
Càn 0 1 1 " ơ 9 4D cho vào bình đinh mức 50 (đã rừa sach bâng nước cất 2
lần và sấy khỏ). Đinh mức bâng nước deion đến vach để có nồng đô gốc là 0.01015
mol/1. Dưns đường chuẩn 2.4 D trong khoảng nồng đô từ 50 đến 200 mg/I. Lấy 4
bình định mức. lần lượt lấy mỏt lượng thể tích tâng dần dung dich gốc vào bình đinh
mức 25 thêm nước cất deion đến ngấn để có các dung dich với nồng đỏ tảng dán 50.
100

150 và 200mg. Đo màt đô quang các dung dịch này trẽn máy u v - 3101 và

12


dựng đo thi chuan VƠI trục tung là độ hấp phụ, trục hoành là nồnơ độ 2.4D (bảng 3
và hình 1 ).
Bang 3. Độ hâp phụ của các dung dịch 2,4D đo ờ bước sóng 283,5 nm
1

2

3

50

100

150

ro
o

o

STT

V d u n g dịch gòc(ml)

0,557

1,114

1,671

2,228

Độ h ấ p p h ụ

0,338

0,689

1,046

1,401

C 2,4D (mg)

4

ị

Độ hấp phu

1.500

1.000

0.500

ỵ

Nồng đò
0.000

0.000

5] 000

100.000

15Ũ.Ũ0C
ppm

200.000

250.000

Hình 1. Đồ thị chuấn 2.4D.
2 2 7 Tác đ ộ n ° của dịch nuôi A zotobacter tới sư nay mâm cưa hat ngo
Hat n ơô te p.l 1 và ngỏ lai ĐK.888 đươc khư trung bàng HgCụ 0.1% trong 4

phút. Rùa lại*nhiều lẩn báng nước cất vô trùng. Ngàm bu trong nuóc cát vô trùng 3
- 4 giơ sau dó ủ hạt VỚI dịch nuôi A totobacter đã lí tàm loa. bỏ tẽ bào 'pha loãng ti
lê 5%) ờ 30°c trong 2 ngày.
13


2,2.8• Thi fĩghi6ì7ĩ ơ CỊUI ĩĩĩô châu vai vóĩ TCLU cải trắnơ
Thi nghiẹm được tiên hành trong 2 vụ đông xuân và xuân hè trong chậu 7kg đất/
chậu. N ên phân bón 40N: 80P20 4: 40K20 . Công thức thí nghiêm được bón thèm 10'
CFU Azotobacíer/Q\ìần. Thí nghiệm được lãp lại 3 lần. Sau 45 ngàv trồng, thu hoach,
đánh giá theo các chỉ tiêu: sỏ lá/chậu, khôi lượng tươi thân lá, chiều cao cây, % vật
chất khô. H àm lượng vitamin c , đường tổng sô và hàm lượng N 0 3' được xác định tại
Trung tâm kiêm tra và tiêu chuẩn hoá chất lượng nông sản thuộc Viện sau thu
hoạch.
2.2.9. Cách làm tièu bản đê quan sát hình dang tế bào Azotobacter dưới kính hiên
vi điện tử quét
Chủng nghiên cứu đươc nuôi lắc 180 vòng/phút trẽn mỏi trường MT B dịch
thể 48 giờ ở 30°c. Li tâm lạnh 6500 vòng/phút trong 10 phút. Sinh khối tế bào được
hoà lại trong nước muối sinh lý vô trùng. Đăt 1, 2 giọt dịch huvền phù tế bào lẽn
mặt phẳng giấy cacbon gắn trên đế đồng, hons khỏ, phủ vàng và quan sát dưới kính
hiển vi điện tử quét JSM - 5410 LV, JEOL - Japan.

14


3. K ẾT Q U Ả V À TH Ả O LUẬN
3.1. Phân lập A zotobacter spp. từ các mảu đất có pH khác nhau
Từ 13/38 mâu đất hong khô và ố/12 mẫu đất giữ nsuvên độ ẩm. chúng tỏi đã
phát hiện sự có mặt của Azotobacter. Tuy nhiên, các chủng thu nhận từ đất khỏ tồn
tại tôt trong điêu kiện nuôi cấy nhân tạo. Các chủng phân lập từ đất ẩm dễ bị chết

sau m ột thời gian dài bảo quản trong ống nghiệm và dễ bị nhầm lẫn với Azomonas
(loại vi khuẩn cố định nitơ có hình dạng giống Azotobacter nhưng không hình thành
bào nang). Để tăng cường tính chọn lọc, việc hons khò đất ờ nhiệt độ phòng trước
khi phàn lập Azotobacter là cần thiết.
Phân tích pH của các mẫu đất cho thấv Azotobacter có mặt ờ các mẫu có pH
5,15 - 7,75 (bảng 4). Tronơ các mảu đất có pH thấp hơn. qua nhiều lần kiếm tra,
không thấy loại vi khuẩn nàv. Kết quả của chúng tôi phù hơp với những còng bố
trước đây rằng Azotobacter thường tồn tại trong các mảu đất có pH axit yếu đến
kiềm [18].
Bàng 4. pH của các mảu đất phát hiện chứa Azotobacter
STT

Mẫu đất

pH

STT

Mẫu đất

pH

1

1

6,35

10

20

6,45

í-

9

7,25

11

21

6.35

3

4

6,85

12

24

6.70

4

6

5,95

13

25

6.70

5

8

7.75

14

26

6.60

6

9

7,05

15

28

6.15

7

11

5,95

16

32

7.45

8

18

6.35

17

35

5.15

9

19

6.45

18

36

5.40

1

15


3.2. M ọt so đạc tinh sinh học của các chủng Azotobacter được sử dụng trong các
nghiên cứu
Trong so cac chung Azotobacter phân lập từ đất, qua sơ tuvển theo mồt sô chì
tieu như kha nang sinh trương trên môi trường nhàn tạo, sinh tons hơp IAA, chúns
tồi đa chọn được 3 chung có các hoạt tính ổn định. Các chủns nàv đươc xem xét kv
về m ột sô đặc tính sinh học. Kêt quả được trình bày ờ bảng 5 dưới đây.
Bang 5. Đặc tính sinh học của các chủng Azotobacter dùng trong nghièn cứu

Chủng vi sinh vật
Đặc tính
86.2
Nguồn gốc

76.1

Phàn lập từ đất

Phàn

trổng

trổng lúa tại Gia

trồng rau tại Đièn

Thuv - Gia Làm

Biên

rau

tại

Điên Biên
Sinh

trường

20.2

trẽn

Tốt

lập

từ

đất

Phàn

Tốt

lập

từ

đất

Tốt

MTB
Hình danơ khuán lac

Lúc còn non có

Lúc

màu trân2 đuc,

màu

trơn nhầy.

nhầy. Khi già ngả

già ngá màu vàng.

màu

khòns tiết sắc tỏ ra

già

ngả

Khi
màu

còn

non

trãnơ
đen.

có
đục.

không

đen. khônơ tiết

tiết sắc tô ra môi

sắc

trường, ướt.

tố ra mỏi

Lức

còn

non có

màu trãng đục. Khi !

mòi trường, nhầy.

trườnơ. khò.
Hình dang tế bào

còn

non

có

Khi

còn

non

có

Khi còn non có

Khi

dans ovan. 2 tê

dans ovan. thường

dans hình trứnơ, 2

bào thườn 2 dính

2 đến 3 tế bào dính

tế bào thường dính

lién nhau thành

liền nhau

liền

nhau

thành

hình số 8.

hình sỏ 8
Kích thước tế bào

« 1.3 X 1.7 um

- 1.1 X 1.7 um

= 1.3 X 2 um

Khả năng di chuyển

Di chuyến chàm.

Di chuvển châm.

Khòna di chuyển.
-

Hình thành cyst
Tao
homopolisaccarit

+

khuếch tán
16

Phân huỷ tinh bột

+

+

Benzoat

+

.

là

nguồn

+
_

cácbon
Tính mẫn cảm với
một sô' kháng sinh
—

+

- Tetracyclin

+

+

- Penicillin

_

- Chloramphenicol

- Gentamicin

Chú thích:

+

-

+
_

+

-ệ-

(+) mẫn cảm
(-) không mản cam

H ình 2. Khuẩn lạc cua chung 86.2 sau 4 ngày nuòi civ ,rên môi trường MT B