Phát triển phương pháp đánh giá tương tác với protein thụ thể không dùng chất phóng xạ phục vụ chiến lược sàng lọc các hợp chất cơ hoạt tính sinh học từ nguồn dược liệu việt nam

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
T R Ư Ờ N G Đ ẠI H Ọ C K H O A H Ọ C T ự N H IÊ N
___________ o s Q s o ____________

Đ Ề T À I N G H IÊ N c ú ư K H O A H Ọ C

PHÁT TRIỂN PHƯƠNG PHÁP ĐÁNH GIÁ TƯƠNG TÁC VỚI
1‘RƠTEIN THỤ THỂ KHƠNG DÙNG CHẤT PHĨNG XẠ PHỤC v ụ
CHIẾN LƯỢC SÀNG LỌC CÁC HỢP CHẤT CÓ HOẠT TÍNH SINH
HỌC TỪNGUỔN DƯỢC LIỆU VIỆT NAM
(BÁO CÁO TỔNG HỢP)

Chủ trì để tài: PGS.TS. Đinh Đồn Long
C ơ quan c h ủ trì: P T N T Đ C ơng n g h ệ E nzym và P rotein,
T r ư ờ n g Đ ạ i h ọ c K h o a h ọ c T ự n h iê n , Đ ạ i h ọ c Q u ố c g ia H à N ộ i

Hà Nội, 2012

Đ ề tà i n à y đ ư ợ c h o à n t h à n h VƠI s ự la i i r ạ c u a
B ộ K h o a h ọ c v à C ô n g n g h ệ v à Đ ạ i h ọ c Q u ố c g ia H à N ội
( M ã sỏ : K L E P T .0 9 .0 5 )


D A N H S Á C H N H Ữ N G N G Ư Ờ I T H Ự C H IỆ N Đ Ể T À I

1. P G S .T S . Đ in h Đ oàn L o n g , Trường Đ ạ i học K h o a học T ự n hiên, Đ H Q G H N
2. T S . T rịn h T ấ t Cường, Trường Đ ạ i học K h o a học T ự nhiên, Đ H Q G H N
3. T S . Phạm T h a n h H u yền , V iệ n D ược L iệ u , Bộ Y T ế
4. T h S . T rầ n T h ị T h ù y A n h , Trường Đ ạ i học K h o a học T ự n hiên, Đ H Q G H N
5. C N . Hoàng H ả i Y ế n , Trường Đ ạ i học K h o a học T ự n hiên, Đ H Q G H N
6 . H V C H . N g u yễn A n h Lư ơ n g , Trường Đ ạ i học K h o a học T ự nhiên, Đ H Q G H N

LỜ I CẢM ƠN

Đề tài được hoàn thành với sự tài trợ của Bộ Khoa học - Công nghệ và Đại học
Q uốc gia Hà N ội, thuộc diện Đề tài thường xuyên giao cho PTNTĐ Công nghệ Enzym và
Prơtein, mã số: KLEPT.09.05. Nhàn dịp này, tập thể cán bộ thực hiện đề tài xin bày tỏ
lòng biết ơn sâu sắc tới sự ủng hộ và giúp đỡ của Bộ Khoa học - Công nghệ và của Đại
học Q uốc gia Hà N ội. Trong quá trình thực hiện đề tài, các cán bộ của các Vụ và Ban
chức nâng thuộc Bộ Khoa học - Công nghệ và của Đại học Quốc gia Hà Nội đã luôn tạo
mọi điều kiện thuận lợi để chúng tơi có thể hồn thành những công việc được giao.
Chúng tôi cũng xin bày tỏ lời cảm ơn sâu sắc đến lãnh đạo Trường Đại học Khoa
học Tự nhiên, các Phòng ban chức năng của nhà trường, Ban chủ nhiệm Khoa Sinh học,
Ban giám đốc PTNTĐ Công nghệ Enzym và Protein đã luôn tạo điều kiện và ủng hộ để đề
tài được triển khai thuận lợi.
Cuối cùng, xin gửi lời cám ơn đến các cán bộ của Phòng Sinh học thụ thể và Phát
triển thuốc thuộc PTNTĐ Công nghệ Enzym và Protein; Khoa Tài nguyên Dược liệu,
Viện Dược liệu (Bộ Y tế) đã ủng hộ và hợp tác với chúng tơi về chun mơn trong q
trình thực hiện đề tài này.
T h a y m ặ t n h ó m n g h iê n cứ u
•

ìỷùỳ^r'

P G S .T S . Đ in h Đ o àn L o n g


TÓM TẮT
Đ Ể T À I N G H IÊ N C Ứ U K H O A H Ọ C
Tên Đề tài: “PHÁT TRIỂN PHƯƠNG PHÁP ĐÁNH GIÁ TƯƠNG TÁC VĨI PROTEIN THỤ THÊ

KHƠNG DÙNG CHẤT PHĨNG XẠ PHỤC vụ CHIÊN Lược SÀNG LỌC CÁC HỢP CHẤT CĨ HOẠT
TÍNH SINH HỌC TỪ NGUỒN Dược LIỆU VIỆT NAM”.
Cơ quan chủ quản: Bộ Khoa học và Cơng nghệ
Cơ quan chủ trì đề tài:
PTNTĐ Công nghệ Enzym và Protein (KLEPT), Trường Đại
học Khoa học Tự nhiên, ĐHQGHN.
Chủ trì đề tài:
PGS.TS. Đinh Đồn Long
Các cán bộ tham gia:
TS. Trịnh Tất Cường, TS. Phạm Thanh Huyền, ThS. Trần Thị
Thùy Anh, CN. Hoàng Hải Yến, HVCH. Nguyễn Anh Lương
Thòi gian thưc hiện:
36 tháng (từ 5 - 2009 đến 5 -2 0 1 2 )
400.000.000 VNĐ (Bơn trăm triệu đồng)
Kinh phí:
Mục tiêu và nội dung nghiên cứu
- Đề tài được thực hiện với các mục tiêu chính như sau: (1) Thu thập được các mẫu sinh phẩm từ
động vật thí nghiệm để từ đó làm giàu các protein thụ thể đặc thù phục vụ cho các phép thử
sinh học, (2) Xây dựng được quy trình đánh giá tương tác giữa các phối tử (ligand, chất gắn thụ
thể đặc hiệu) với các protein thụ thể đặc thù có vai ữị dược lý quan trọng theo ngun tắc
khơng dùng các đồng vị phóng xạ, (3) Bước đầu đánh giá tương tác giữa một số “thuốc thử”
(hợp chất, dịch chiết, phân đoạn) thu được từ các bài thuốc y học cổ truyền trong nước với các
protein thụ thể qua phương pháp đã được thiết lập; từng bước xây dựng mơ hình sử dụng các
protein thụ thể đích phục vụ chiến lược sàng lọc nhanh và nghiên cứu dược lý của các hợp chất
và sản phẩm có hoạt tính sinh học tiém nãng bắt nguồn từ tài nguyên dược liệu Việt Nam.
- Các nội dụng nghiên cứu cùa đề tài gồm có: (1) Thu thập các mẫu sinh phẩm từ động vật thí
nghiộm để từ đó làm giàu được các protein thụ thể đặc thù phục vụ cho các phép thử sinh học;
(2) Xây dựng quy trình đánh giá tương tác giữa các phối tử với các protein thụ thể đặc thù có
vai trị dược lý quan trọng khơng dùng các đồng vị phóng xạ, đảm bảo các kết quả phân tích
tương đương với các phương pháp hiên đang được sử dụng rộng rãi dùng các chất gắn được

đánh dấu đồng vị phóng xạ; (3) Thu thập một số bài thuốc y học cổ truyền ờ Viột Nam có cơng
dụng tương ứng với các giá trị dược học đã biết của các protein thụ thể được lựa chọn trong
nghiên cứu; (4) Bước đầu tiến hành phân tích và xác định được các thành phần (dịch chiết,
phân đoạn, hợp chất) có hoạt tính sinh học từ một sơ' dược liệu cổ ưuyền Việt Nam qua mơ
hình đánh giá tương tác với các protein thụ thể có vai trị dược lý quan trọng
Kết quả
Kết quả khoa học: (1) Đã xây dựng và hồn thiện được các quy trình làm giàu protein thụ thể
angiotensin II (All) từ mô gan và các thụ thể toll-Iike các loại 2, 3, 4 (TLR2-4) và dectin-1 từ đại
thực bào có nguồn gốc tùy xương (BMDM) ờ chuột nhắt dòng Swiss phục vụ cho các phép thử
sinh học; (2 ) đã xây dựng được các quy trình đánh giá tương tác giữa các phối tử (ligand) đặc hiệu
với các thụ thể All, TLR2-4 và dectin-1 không dùng đồng vị phóng xạ bằng cách sử dụng các
phép đo liên kết thụ thể (receptor binding assays) dựa trên nguyên lý ELISA cạnh tranh (với thụ
thể All) và phép đo chức năng thụ thể (receptor functional assay) thông qua theo dõi sự xuất hiện
cùa sản phẩm ưuyển tin đối với các thụ thể TLR2-4 và dectin-1; (3) Dựa trên kinh nghiệm vể y
học cổ truyền, thu thập được một sô' cây thuốc Việt Nam, gồm cò mân trâu (Eleusine indica L.,
Graerth), hạ khơ thảo (Prunella vulgaris L.), hịe (Sophora japonica L.) và Tầm gửi (Taxillus
philippensis Cham.&Schlecht., Ban.) làm "thuốc thử" cho các thí nghiệm đánh giá hoạt tính sinh
học có tiềm nãng tác động lên các thụ thể All (đối với cả 4 loài cây), TLR2-4 và dectin-1 (đối với
cỏ mần trầu); (4) Bước đầu đánh giá được hoạt tính sinh học dịch chiết thơ (methanol) của 4 lồi
cây thuổc lên thụ thể All bằng phương pháp liên kết cạnh tranh với phối tử đặc hiệu, và của cỏ
mần trẩu lèn các thụ thể TLR2-4 và dectin-1 bằng phép đo biểu hiện chức năng của thụ thể.


Các kết luận chính thu được từ đề tài gổm có :
1) Đã xây dựng được phép đo liên kết thụ thể - phới tử trên mơ hình thụ thê angiotensin II (All) sử
dụng phối tử đánh dấu fluorescein (F-AT II) theo nguyên lý ELISA cạnh tranh để thay thế cho
phép đo dùng đổng vị phóng xạ nhằm đánh giá khả năng tương tác liên kết giữa dịch chiết
dược liệu và thụ thể.
2) Trên mơ hình phép đo liên kết thụ thể All theo nguyên lý ELISA cạnh tranh, dịch chiết
methanol cị mần trầu (Eleusine indica Geartn.) và hạ khơ thảo (Prunella vulgaris L.) biểu

hiện khả nãng chẹn thụ thể tương đối mạnh với các giá trị IC50 được xác định quanh 1,0 ng/ml.
Điều này cho thấy thụ thể angiotensin II có thể là đích tác động chính của các thành phần có
trong địch chiết của hai lồi cây dược liệu này. Khả năng chẹn thụ thể angiotensin II của các
dịch chiết hòe (Sophora japonica L.) và tầm gửi (TaxiHus philippensis Cham. & Schl.) tương
đổi yếu với ICịQ khoảng 37 |!g/ml (với hòe), và 419 ng/ml (với tầm gửi). Điều này cho thấy
thụ thể All có lẽ khơng là đích tác động chính cùa các dược liệu này.
3) Đã thiết lập được phép đo tương tác giữa dịch chiết dược liệu và thụ thể liên quan đến đáp ứng
viêm bằng phép thử chức năng trên các thụ thể thuộc họ toll-like (TLR-2,-3,-4) và dectin-1 có
ở đại thực bào nguồn gốc tủy xương (BMDM) được nuôi cấy invitro trên cơ sờ theo dõi quá
trình sinh sản phẩm của đáp ứng viêm (các cytokine) được kích ứng bời các phối tử đặc hiệu.
4) Khi BMDM được kích ứng bằng P-glucan, dịch chiết methanol cỏ mần trầu (Eleusine indica
Geartn.) làm giảm rõ rệt các cytokine tiển viêm TNF-a, IL-6 và IL-12p40. Điều này chứng tỏ
tác động kháng viêm của dịch chiết cỏ mần trầu có thể liên quan đến thụ thể dectin-1 và cây
thuốc này đáng được quan tâm về khả năng kháng viêm quá mẫn gây ra bởi nấm. Khi BMDM
được kích úng bởi các phối tử lipoprotein vi khuẩn (BLP), axit polyinosinic:polycytidylic (poly I:Q
và lipopolysaccharide (LPS), dịch chiết cỏ mần ừầu không làm giảm các cytokine tiển viêm và
kháng viêm. Điều này chúng tỏ nhiều khả năng các thụ thể TLR2 -4 khơng phải đích tác động trục
tiếp liên quan đến tính kháng viêm của cị mần trầu.
Kết quả nghiên cứu của đề tài đồng thời khẳng định các mơ hình đánh giá tương tác với các
protein thụ thể không sử dụng chất phóng xạ phục vụ định hướng phát hiộn và phát triển thuốc từ
tài nguyên dược liệu Việt Nam.
- Kết quả ứng dụng: Hồn thiộn 03 quy trình cơng nghệ: 01 quy trình xử lý mẫu và làm giàu
protein thụ thể, 01 qui trình đánh giá tương tác giữa phối tử đặc hiệu với protein thụ thể không dùng
đổng vị phóng xạ; 01 qui ưình sàng iọc các sản phẩm có hoạt tính sinh học tiẻm năng từ dược liệu
Việt Nam qua hoạt tính ức chế cạnh tranh giũa phối tử đặc hiệu với protein thụ thể.
- Kết quả đào tạo: Đào tạo được 02 Thạc sỹ Sinh học (HVCH. Nguyễn cẩm Dương, tốt nghiệp
năm 2010; HVCH. Nguyễn Anh Lương, tốt nghiộp năm 2011); Đào tạo được 05 c ử nhân (SV.
Nguyễn Anh Lương, K50 Sinh học, tốt nghiệp năm 2009; sv . Phạm Thị Hồng Nhung, K10
CN'fN Sinh học, tốt nghiệp năm 2010; sv. Đặng Ngọc Hoa, K51 Sinh học, tốt nghiôp năm 2011;
sv . Trần Hoang Mai, K52B CNSH, tốt nghiệp năm 2012; sv . Nguyễn Thị Quyên, K12 CNTN

Sinh học, tốt nghiệp năm 2012).
- Kết quả công bố: Đã công bô' 03 bài báo: 01 bài báo toàn văn tiếng Anh tại Hội nghị Khoa học
Quổc tế (Indochina Pharma VII, Bangkok, Thái Lan, 14-16 / 12 / 2011), 02 bài báo tiếng Anh
trơn Tạp chí Khoa học (ĐHQGHN), 01 bài báo tiếng Việt trên Tạp chí Dược liệu (Bộ Y tế).
PT N T Đ Công nghệ
E nzym và Protein (K LEPT)

Chủ nhiệm đề tài

PG S.T S. Đ inh Đoàn Long
TRƯ Ờ NG ĐẠI HỌC KH O A HỌC T ự N H IÊ N


SU M M A RY
S C IE N T IF IC R E S E A R C H P R O JE C T
P ro je c t title:

“ D e v elo p m en t o f n o n -ra d io a c tiv e

re c e p to r assays to w a rd s

h ig h -th ro u g h p u t

screening of bioactive compounds derived from Vietnamese medicinal materials”
Code: KLEPT.09.05
Managing institution: Ministry of Science and Technology
Implementing institution: Key Laboratory for Enzvme and Protein Technology (KLEPT)
Hanoi University of Science
Key implementer: Dinh Doan Long (PhD)
Participating investigators: Trinh Tat Cuong (PhD), Pham Thanh Huyen (PhD), Tran Thi Thuy Anh

(MSc), Hoang Hai Yen (BSc), Nguyen Anh Luong (MSc student)
Duration: 36 months (since May 2009 through May 2012)
Grant budget: 400.000.000 V N D
Objectives and major activities

Objectives: (1) Selection of suitable tissue samples from experimental animals from which receptors
of interest for bioassays can be enriched, (2) Development of protocols for non-radioactive ligandreceptor binding assays, (3) Preliminary assessment of using non-radioactive ligand-receptor binding
assays for determination of the interaction between the Vietnamese medicinal plant extracts with their
potential targeted receptors.
Major activities: (1) Collection of tissue samples from mice (Swiss strain) for isolation and/or
enrichment of the receptor of interest, including angiotensin II receptor, toll-1 ike-2,-3,-4 receptors and
dectin-1 receptors; (2) Studies on optimization of protocols for non-radioactive receptor binding and
functional assays so as to be comparable to the conventional methods; (3) Collection of medicinal
plants whose modes of action might be involved in the receptors of interest from different localities in
Vietnam, including “co man trau” (Eleusine indica L., Graerth), “ha kho thao” (Prunella vulgaris L.),
“hoe” (Sophora japonica L.) and “tam gui” (Taxillus philippensis Cham.&Schlecht., Ban.) (4)
Preliminary studies on interaction between receptors of interest with Vietnamese herbal products
based on nonradioactive receptor binding and functional assays.

Results
- Scientific results: Research data resulted in the following major conclusion
1) A nonradioactive assay for angiontensin II (All) receptor binding studies based on principles
of competitive ELISA comparable to the conventional radioligand binding method for the
purpose of assessment of the receptor - medicinal plant extract interaction were successfully
established, optimized and validated.
2) Competitive ELISA-based receptor binding studies with methanolic extracts of different
accessions of various Vietnamese medicinal plants revealed that E. indica and p. vulgaris
exhibited relatively potent binding inhibition on All receptor. Thus, this receptor subtype
might be involved in the mode of action of these two medicinal plants. Whereas, the weak and
hardlv inhibition of the extracts obtained from s. japonica and T. philippensis suggest the All

receptors are probably not involved in the pharmacological actions of them.
3) A nonradioactive assay for toll-like receptors, including TLR2-4, and dectin-1 receptor based
on principles of receptor functional assays by using cultured bone-marrow derived
macrophages (BMDMs) for the purpose of the receptor - medicinal plant extract interaction
were successfully established and validated.
4) Competitive receptor functional studies with methanolic extracts of different accessions of
Vietnamese medicinal plant E. indica revealed that the extracts of this plant inhibited potently
the production of inflammatory cytokines, including TNF-a, IL-6 and IL-12p40, through the
V


dectin-1 pathway, whereas they hardy exerted any effects on the other investigated toll-like
pathways. Thus, dectin-1 receptors might be one of the major targets for the anti-inflammatory
activity well-known for this medicinal plant. Whereas, toll-like receptors, including TLR2-4,
are probably not direct targets of E. indica extracts.
- Applied results'. 03 standard operating procedures (SOP1-3): SOP1 - procedure for tissue specific
membrane preparation for receptor binding assay, SOP2 - procedure for nonradioligand receptor
binding assay, SOP3 - procedure for assessment of interaction between receptors with medicinal plant
extracts.
- Training results'. 02 Masters of Science in Biology (Ms. Nguyen Cam Duong, 2010; and Mr.
Nguyen Arth Luong, 2011), 05 Bachelors in Biology (three graduates from the Honor Program for
Bachelor of Science in Biology, i.e. Ms. Pham Thi Hong Nhung - 2010, Ms. Nguyen Thi Quyen 2012; three graduates from the Regular Program for Bachelor of Science in Biology, including Mr.
Nguyen Anh Luong - 2009, Ms. Dang Ngoc Hoa - 2011, Ms. Tran Hoang Mai - 2012).
- Publications. 03 papers. One full paper in English published in the Proceedings of the 7Ih Indochina
Conference of Pharmaceutical Science (held in December 2011 in Bangkok, Thailand), 02 papers in
English published in the VNU Journal of Science (in 2011), 01 paper in Vietnamese published in the
Vietnam’s Journal of Medicinal Material Research (in 2010).

Key implementer

Dinh Doan Long

vi


M ực

LỤC
Trang

M ĩ ờ đ ã u .............................................................................................................................................................................

1

Clnương 1. TỔ NG Q UAN T À I L IỆ U ...............................................................................................................................................

3

1.1. Lược sừ phát triển của dược lý học và vai trò của các thụ thể trong nghiên cứu phát hiện và
phát triển thuốc.............. ....................................................................................*.....................
1.2. Chiến lược sàng lọc các hợp chất tự nhiên có hoạt tính sinh học dựa trên phân tích tương tác
thuốc - thụ thể (drug - receptor interaction).........................................................................

6

1.3. vể các phương pháp nghiên cứu tương tác thuốc - thụ th ể .....................................................

8

1.3.1. Lý thuyết động học tương tác thụ thể - phối t ử ..............................................................

8

1.3.2. Các phương pháp phân tích tương tác thụ thể - phối từ .................................................

11

1.3.2.1. Các phép thừ liên kết thụ thể - phối từ dùng đồng vị phóng x ạ ..........................
1.3.2.2. Sơ lược về các phép thử liên kết thụ thể - phối tử khơngdùngđổng vị phóng xạ

12
13

1.3.2.3. Sử dụng phối tử đánh dấu huỳnh quang fluorescein trong các phép thử tương
tác thụ thể - phối t ử ............................................................................................

14

1.4. úng dụng các phưcmg pháp phân tích tương tác thụ thể - phối từ trong sàng lọc dược chất
từ dược liệu thực v ậ t...............................................................................................................

16

1 .5. Sơ lược vể các thụ thể được lựa chọn ưong nghiên c ứ u ..........................................................

17

1.5.1. Thụ thể angiotensin II (A ll)............................................................................................

17

1.5.2. Về các thụ thể nhận diện mầm bệnh trong đáp ứng viêm nhóm Toll-like (TLR) và
Dectin-1 ................................... ............. 7.......................................................................

19

1.5.2.1. Vế các thụ thể Toll-like (TLR)............................................................................

19

1.5.2.2. Vể thụ thể D e c tin -1 ..............................................................................................................

22

1.6. Sơ lược vể các loài cây thuốc được nghiên cứ u ........................................................................

23

1.6.1. Cỏ mần trầu (Eleusine indica L., Graerth.)....................................................................

23

1.6.2. Hạ khô thảo (Prunella vulgaris L .) ..............................................................................................

24

3

1.6.3. Hòe (Sophora japonica L .)..............................................................................................

25

1.6.4. Tầm gửi Ợaxillus philippensis (Scham.&SchIecht.)Ban)..............................................

25

Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ứ u ................................................................................
2.1. Các thí nghiệm thiết lập phép thử liên kết thụ thể angiotensinII (All) theo nguyên lý Elisa
cạnh tranh và thử nghiêm với dược liệu Việt N am .........................................................................

26

2.1.1. Vật liệu sinh h ọ c ..............................................................................................................

26

2.1.2. Hóa chất và thiết b ị .........................................................................................................

27

2.1.3. Phương pháp nghiên c ứ u ...............................................................................................

27

2.1.3.1. Chuẩn bị dịch chiết methanol dược liệ u ...........................................................

27

2.1.3.2. Thu thụ thể m àng.................................................................................................

28

2. 1 .3.3. Đánh giá khả nãng liên kết thụ thể của phối tử đặc h iệu....................................

28

2.1.3.4. Phương pháp ELISA............................................................................................

29

2.1.3.5. Đánh giá khả năng cạnh tranh liên kết với thụ thể cùa dịch chiết dược liệu với
phối từ đặc hiệu (ELISA cạnh tranh) .................................................................

29

2.1.3.6. Phương pháp xử lý số liệu ...................................................................................
2.2. Đánh giá khả năng kháng viêm cùa cỏ mần trầu (Eleusine indica L., Gaertn) thông qua
phép thử chức năng cùa một số thụ thể thuộc họ Toll-like và Dectin-1 ..........................................
2.2.1. Vật liệu sinh h ọ c ..............................................................................................................
2.2.2. Hóa chất và thiết b ị .........................................................................................................

vii

26

30
30
31
31

2.2.2.1. Hóa c h ất................................................................................................................
2.2.2.2. Chuẩn bị hóa c h ất................................................................................................
2.2.2.3. Dụng cụ và thiết b ị ...............................................................................................
2.2.3. Phương pháp nghiên c ứ u ......................................... ......................................................
2.2.3.1. Thử độc tính dịch chiết cỏ mần trầu trên dịng đại thực bào ni c ấy ...............
2.2.3.2. Đánh giá khả năng tiết các cytokine cùa đại thực bào được kích thích bằng các
phối tử đặc h iệ u ....................................................................................................
2.2.3.3. Phương pháp xử lý số liệu ....................................................................................
Clnucmg 3. KẾT QUẢ NGHIÊN cứ u VẢ THẢO LUẬN......................................................................................
3.1. Các thí nghiêm thiết lập phép thử liên kết thụ thể angiotensin II (All) theo nguyên lý Elisa
cạnh tranh và thừ nghiêm với dược liệu Viột N am ..........................................................................
3.1.1. Tối ưu điểu kiện ELISA...................................................................................................
3.1.2. Xác định ảnh hường cùa nồng độ màng và thời gian ù ..................................................
3.1.3. Thí nghiệm xác định Kd của phối tử đặc hiệu F-ATII(thí nghiêm bão hòa thụ th ể)......
3.1.4. Phản ứng cạnh ưanh với F-ATII cùa một sơ' phối tử đã biết (thí nghiêm đối chứng dương)
3.1.5. Đánh giá khả nàng tương tác thụ thể angiotensin II của một sớ dịch chiết dược liệu
Việt Nam bằng phương pháp ELISA cạnh tranh...........................................................
3.1.5.1. Hoạt tính cạnh tranh của các dịch chiết cỏ mần trầu ..........................................
3.1.5.2. Hoạt tính cạnh tranh của các dịch chiết hạ khơ thảo .........................................
3.1.5.3. Hoạt tính cạnh tranh của các dịch chiết hịe và tầm gửi.......................................
3. 1 .6. Thảo lu ận ........................................................................................................................
3.2. ỉ)ánh giá khả năng kháng viêm của cỏ mấn trầu (Eleusine indica L., Gaertn) thông qua
phép thử chức năng của một số thụ thểthuộc họ Toll-Likevà Dectin-1 ............................................

3]

32
32
32

32
33
34

35
35
35
37
39
41
43
43
44
44
46
50

3.2.1. Ảnh hường cùa dịch chiết methanol cỏ mẩn trầu (Eleusine indica (L.) Gaerth) tới khả
năng sống cùa đại thực b à o ............................................................................................
3.2.2. Đánh giá khả năng tiết các cytokine của đại thực bào ni cấy được kích thích bằng
các phối từ đặc hiộu thụ thể ..................................................... ................................... .

51

3.2.3. Ảnh hưởng cùa dịch chiết cò mần trầu (Eleusine indica (L.)Gaerth) đến khả nãng tiết
các cytokine sau khi các thụ thểđược hoạt hóabời các phốitử đạc h iệu.......................
3.2.3.1. Tác động đến thụ thể TLR-2...............................................................................
3.2.3.2. Tác động đến thụ thể TLR-3...............................................................................
3.2.3.3. Tác động đến thụ thể TLR-4...............................................................................
3.2.3.4. Tác động đến thụ thể dectin-1..........................................................................

3.2.4. Thảo lu ận ........................................................................................................................

53
53
54
55
56
58

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .......................................................................................................................................

61

Kết l u ậ n ...................................................................................................................................................................

61

Kiến n g h ị.........................................................................................................................................
Tài liệu tham khảo.................................................................................................................................
Phụ lụ c ....................................................................................................................................................
Phụ lục ỉ. Các quy trình kỹ thuật (SOP)

62
63
68

Phụ lục 2. Bàn sao các cơng trình cơng bố liên quan đến đề tài
Phụ
Phụ
Phu

Phụ
phụ

lục 3. Bản sao minh chứng các sản phẩm đào tạo của đề tài
lục 4. Bàng đối chiếu sản phẩm đã đạt được cùa đề tài với Thuyết minh để tài
lục 5. Bàn sao minh chứng vể thanh, quyết toán đề tài
lục 6. Bàn sao biên bản họp hội đổng nghiệm thu cấp cơ sờ
lục 7. 'ITiuyẽt minh đề tài được phẽ duyệt

V I 11

50


BẢNG CÁC KÝ H IỆ U VÀ T Ừ V IẾ T T Ắ T
Từ viết tết

Nghĩa tiếng Việt

_______

Nghĩa tiếng Anh

___________

ADN
ARN
cs
HPLC
MS

FP
FRET
SPR
ELISA
RP-HPLC
TRF
PDGF-R
HRP
OD
All
ATI
ATII
F-ATII
F-ESA
BSA
TLR
GA3A
NMDA
NK-1
cc<
GP3R
ACE
AR3
PRR
CLP.
LPS
PoM:C
BLF
INF

Axit deoxyribonucleic
Axit ribonucleic
Cộng sự
Sắc ký lỏng cao áp / Sắc ký hiệu năng cao
Khối phổ
Phân cực huỳnh quang
Truyén năng lượng cộng huớng huỳnh quang
Cộng hưởng plasmon bé mặt
Phép thử hấp thụ miễn dịch gắn kết enzym
Sắc ký lỏng cao áp đảo pha
Huỳnh quang phân giải thời gian
Thụ thể yếu tố tăng sinhnguổn gốc tiểu cáu
Peroxidase cây cải ngựa
Mật độ quang học
Thụ thể angiotensin II
Angiotensin I
Angiotensin II
Angiotensin II gắn fluorescein
Albumin huyết thành bò gắnfluorescein
Albumin huyết thành bò
Thụ thể toll-like
Axit y-aminobutyric
Axit /V-methyl-D-aspartic
Neurokinin-1
Cholecystokinin
Thụ thể kết cặp G-protein
Enzym chuyển hóa angiotensin
Thuốc chẹn thụ thể angiotensin II
Thụ thể nhận biết mẩm bệnh
Thụ thể lectin loại c

Lipopolysaccharit
Axit polyinosinic: polycytidylic
Lipoprotein vi khuẩn
Interferon

Deoxyribonucleic acid
Ribonucleic acid
Co-workers
High pressure liquid chromatography
Mass spectrophotometry
Fluorescence polarization
Fluorescence resonance energy transfer
surface plasmon resonance
Enzyme-Linked Immunosorbent Assay
Reverse-phase high pressure liquid chromatography
Time-resolved fluorescence
Platelet derived growth factor receptor
Horseradish peroxidase
Optical density
Angiotensin II receptor
Angiotensin I
Angiotensin II
Fluorescein-labeled angiotensin II
Fluorescein-labeled bovine serum
albumine
bovine serum albumine
Toll-like receptor
gamma-aminobutyric acid
/V-methyl-D-aspartate
Neurokinin-1

Cholecystokinin
G-protein coupled receptor
Angiotensin converting enzyme
Angiotensin II receptor blocker
Pathogen-associated/ pattern recognition receptor
C-type lectin receptor
Lipopolysaccharide
Polyinosinic:polycytidylic acid
Bacterial lipoprotein
Interferon

IL-

Interleukin

Interleukin

TNF

Yếu tố hoại tửu

Tumor necrosis factor

ĐC

Đối chúng

Control

FD/

Cục quản lý thuốc và thực phẩm Hòa Kỳ

Food and Drug Administration

HTS

Sàng lọc hiệu năng cao

High-throughput screening

Số vị trí liên kết tối đa

Maximum binding sites

Kj

Hằng số phân ly

Dissociation constant

K,

Hằng số ức chế

Inhibitory constant

ICM

Nồng độ ức chế 50%

50% inhibitory concentration

BMfM

Đai

thực bào nguồn gốc tủy xương

Bone marrow derived macrophage_____________

ix


DANH M Ụ C C Á C BẢNG

T rang

Bảng 1. Một số hựpchất và sản phẩm dược liệu được xác định qua các phép phân tích tương tác thụ thể - phối tử

17

Bảng 2. Các thụ thê’ trong nghiên cứu và các phối tử đặc hiệu tương ứng với con đường truyển tin của chúng........

23

Bảng 3. Các mảu dược liệu được thu thập và sử dụng trong nghiên cứ u..................................................................

27

Bảng 4. Giá trị Kd của phối tử angiotensin II (ATII) liên kết vào thụ thểangiotensin II (A ll) thu được từ các
nghiôn cứu khác n hau....................................................................................................................................

36

Bảng 5. Các giá trị K, cùa AT II và losartan liên kết cạnh tranh trẻn thụ thể angiotensin II thu được từ các nghiẽn
cứu khác nhau............................................... .......................... ........................................ .........................

38

Bảng 6. Các giá trị IQo và K, cùa các dịch chiết dược liệu được sử dụng trong nghiên cứ u......................................

42

Bảng 7. Sự tiết các cytokine cùa đại thực bào (BMDM) chuột nuôi cấy invitro được kích thích bởi các phối tử đâc
hiẽu với các thụ thể toll-like (TLR-2,-3, -4) và Dectin-1 ............................................................................

51

DANH M ỤC CÁC H ÌN H
Hình 1. Mơ hình minh họa về sự khác biệtgiữa các chế phẩm thuốc tân dược và các thuốc có nguồn gốc tự nhiên
chưa tiêu chuẩn h ó a .......................................................................... ................................

6

Hình 2. Mơ hình giản lược vể ngun lý phân tích tươngtác “ thuốc-thụ thể” trong sàng lọc thuốc mới từ dược liệu

7

Hình 3. Mơ hình sàng lọc thuốc từ dược liêu sử dụngprotein Ihụ th ể ........................................................................

7

Hình 4. Thí nghiệm bão hịa thụ th ể ...........................................................................................................................

10

Hình 5. Nguyên lý cùa phép đo liên kết thụ thể - phối tử ................................................................................................

13

Hình 6. Nguyên lý cùa phản ứng ELISA cạnh tranh..........................................................................................................

15

Hình 7. Tóm tắt các con đường truyển tin qua thụ thể A T ,.........................................................................................

18

Hình 8. (^ u ưúc, sự phân bô'và phối tử cùa các thụ thể toll-like (T L R )...................................................................

20

Hình 9. Quá trình truyển tin của các thụ thể TLR-2, -3, và - 4 ...................................................................................

21

Hình 10. Quá ưình truyền tin của thụ thể dectin-1.............................................................................................................
Hình 11. C3Ỏ mần ưẩu - Eleusine indica (L.) Graerth..........................................................................................................

22
23

Hình 12. Hạ khơ thảo - P runella vulgaris L .................................................................................................................

24

ỉ lình 13. Hịe - Sophora ja p o n ica L ...............................................................................................................................

25

Hình 14. Táin gừi - Taxillus philippensis (Cham.&Schlecht.) Ban................................................................................

25

Hình 15. Ảnh hưởng của nồng độ kháng nguyên F-BSA và kháng thể kháng fluorescein đến khả nâng xác định tín
hiệu O D ^, qua phép thử E L IS A ....................................................................................................................

31

Hình 16. Ảnh hường cùa nổng độ F-ATII đến sự hình thành màu cùa sản phẩm phản ứng ELISA cạnh tranh.......

32

Hình 17. Ảnh hường của nổng độ màng đến phép đo ELISA cạnh tranh..................................................................

34

Hình 18. Ảnh hường cùa thời gian ù đến khả nấng liên kết thụthể cùa F-A TII............................................................

34

Hình 19. Thí nghiêm bão hòa thụ thé giữa phối tử F-ATU và thụ théangiotensin II ( A ll) ..........................................

36

Hình 20. Sự cạnh tranh angiotensin n (hình trái) và losartan (hình phải) với phối tử F-AT n trong liên kết với thụ

thể angiotensin II (A ll)...........................................................................................................................................

37

Hình 21. úc chế liên kết F -A T II với thụ thể angiotensin II bời dịch chiết cỏ mấn trầu (Eleusine indica Gaertn.).....

39

Hình 22. út chế liên kết F-ATII với thụ thể angiotensin II bời dịch chiết hạ khơ thảo (Prunella vulgaris) ...............

40

Hình 23. ú t chế liên kết F -A T II với thụ thể angiotensin II bời dịch chiết hịe (Sophora japonica)..............................

41

Hình 24. úc chế liên kết F -A T II với thụ thể angiotensin II bởi dịch chiết tầm gửi cTaxillus philippensis).............

41

Hình 25. Ành hường cùa dịch chiết methanol cỏ mần trầu (Eleusine indica) tới khả nâng sổng của các đại thực bào
có nguồn gốc tùy xương (BMDM) nuỏi cấy invitro........................................................................................

50

Hình 26. Sự tiết các cytokine của đại thực bào nguổn gốc tùy xương (BMDM) chuột ni cấy invitro được kích
thích bời các phối tử đặc hiệu các thụ thể toll-like (TLR-2,-3, -4) và Dectin-1.............................................

52

Hình 27. Ảnh hưởng của dịch chiết methanol cỏ mần trầu (Eleusine indica (L.) Gaerth) đến sự tiết các cytokine
cùa đại thực bào nguồn gốc tủy xương (BMDM) qua con đường hoạt hóa thụ thể toll-like 2 (TLR-2)......

54

Hình 28. Ành hường của dịch chiết methanol cỏ mần trầu (Eleusine indica (L.) Gaerth) đến sự tiết các cytokine
cùa đại thực bào nguổn gốc tùy xương (BMDM) qua con đường hoạt hóa thụ thể toll-like 3 (TLR-3)........

55

Hình 29. Ành hường cùa dịch chiết methanol cỏ mán trầu (Eleusine indica (L.) Gaerth) đến sự tiết các cytokine
cùa đại thực bào nguổn gốc tùy xương (BMDM) qua con đường hoạt hóa thụ thể toll-like 4 (TLR-4).......

56

Hình ;0. Ảnh hưcmg cùa dịch chiết methanol cỏ mán trầu (Eleusine indica (L.) Gaerth) đến sự tiết các cytokine
cùa đại thực bào nguổn gốc tủy xương (BMDM) qua con đường hoạt hóa thụ thể Dectin-1........................

57

X

MỞ ĐẦU
Là m ột q u ốc g ia có m ột ngu ồn tài n gu yên đ ộn g, thực vật ph ong phú và
đa d ạn g, từ bao đời nay, cộ n g đ ô n g các dân tộc V iệt nam có nhiều kinh
n gh iệm trong v iệ c sử dụng các loài cây co n sẵn c ó trong tự nhiên để trị bệnh
và bôi b ổ sứ c k h oẻ. T h eo điều tra của V iện D ư ợ c L iệu (B ộ Y tế), nước ta có
gân 4 0 0 0 lồi thực vật, 2 2 loài tảo, trên 4 0 0 loài đ ộ n g vật và hơn 70 loại
k h oán g vậ t đư ợc dùng làm thuốc trong y h ọ c cổ truyền. H iện nay, v iệ c tiêu
chuẩn h ố các sản phẩm dược có ngu ồn g ố c tự nh iên (g ọ i chung là “dược
liệu ” tron g báo cáo này) đang là m ột địi hỏi cấp bách trong q trình hiện đại
hố, c ơ n g n gh iệp hố ngành dược kết hợp giữ a đ ôn g y và tây y ở nước ta.
M uốn v ậ y , các n gh iên cứu nhằm xác định các c ơ ch ế tác dụng, phát hiện các
m ục tiêu phân tử, xác định các thành phần c ó hoạt tính sinh h ọc và cả độc tính
của d ư ợ c liệu cần đư ợc triển khai m ột cách toàn diện v à hệ thống.
K ể từ khi L a n g ley (năm 19 0 4 ) đưa ra khái n iệm v ề “các chất thụ cảm ”
(recep tiv e su b sta n ces), mà sau này đư ợc biết v à g ọ i là các protein thụ thể
(recep tor), qua thời gian chúng ta h iểu rằng tiền đề đ ể m ột phần lớn các phân
tử th uôc b iểu h iện tác đ ộn g lên c ơ thể là qua sự tư ơ n g tác của chúng với các
protein đ íc h này. Đ â y cũ n g là nền tảng c ơ bản để ch ú n g ta g iả i thích v ề nhiều
q trình sin h lý và dược lý ờ cấp phân tử và tế bào. T h eo ph ư ơ ng châm đó,
các n g h iê n cứu tư ơ n g tác “thuốc - thụ th ể” (d rug-receptor) hay “thụ th ể-phối
tử” (recep to r-lig a n d ) đã trờ thành nền tảng c ơ bản ch o cá c nghiên cứu tìm
hiêu c ơ c h ế tác đ ộ n g của thuổc và phát triển thuốc m ới. Đ e đánh g iá tương tác
th uốc - thụ thể, các phép đo liên kết thụ the (receptor bin d in g a ssa y s) đã được
phát triển v à ứ ng dụng trong các n g h iên cứ u phát h iện và đánh giá thuốc.
T h eo cá ch truyền th ốn g, trong những phép đ o này, các n ồ n g độ xác định của
th uổc và thụ thể đ ư ợ c ủ với nhau, sau đó các phân tử thuốc kh ông liên kết với
thụ th ể (p hân tử thuốc tự d o) được tách khỏi phức hệ các phân tử thuốc liên
kết thụ thể bằng các phương pháp vật lý, rồi tiến hành định lư ợ n g phần thuốc
liên k êt v ớ i thụ thể. Phần lớn các p h ư ơ ng pháp định lư ợ n g thuốc liên kết thụ

thể kinh đ iển đều dùng thuốc (phối tử) đánh dấu p h ón g xạ. M ặc dù v iệ c dùng
phối tử đánh dấu p h ón g xạ c ó ưu đ iểm rất nhạy và ch o phép định lượng trực
tiếp, s o n g p h ư ơ ng pháp này cũ n g b ộc lộ nhiều hạn chế: c ó nguy cơ phơi
nh iễm p h ó n g xạ và ảnh hưởng đến sứ c kh ỏe của ngư ời n gh iên cứu, cộ n g đồng
và m ôi trường x u n g quanh; cần chi phí cao ch o thiết kế và xây dưng phịng thí
n gh iệm nhằm đảm bảo an tồn p h ón g xạ; chi phí n gh iên cứu cao khi triển
khai ở quy m ô lớn.
T ron g bối cảnh đó, việc ứng dụng m ột số ph ư ơ ng pháp nghiên cứu
protein nhằm cải tiến và phát triển các ph ư ơ ng pháp m ới ch o phép đánh giá

1


tư ơng tác “th u ôc - thụ thê” hay “thụ thê - phôi tử” mà k h ôn g cân dùng các
đ ơ n g vị p h ó n g xạ sẽ giúp hạ giá thành n gh iên cứu, đ ồ n g thời có thể m ở rộng
các n gh iên cứu th eo hướng này ở nhiều p h ị n g thí n gh iệm kh ơng được trang
bị v ề an tồn p h ó n g xạ, điều cịn thiếu ở hầu hết các p h ị n g thí nghiệm th u ộc
lĩnh vự c sinh h ọc dư ợc phẩm ờ V iệt N am . Đ â y là lý do chún g tôi tiến hành đề
tài “P h á t tr iể n p h ư ơ n g p h á p đ á n h g iả tư ơ n g tá c v ớ i p r o te in th ụ th ể k h ô n g
d ù n g c h ấ t p h ó n ụ x ạ p h ụ c vụ c h iế n lư ợ c s à n g lọ c c á c h ợ p c h ấ t có h o ạ i tín h
s in h h ọ c t ừ n g u ồ n d ư ợ c liệ u V iệt N a m ”.
M ụ c tiêu củ a đề tài là phát triển đư ợc m ột số p h ư ơ ng pháp trên cơ s ở các
kỹ thuật protein ch o phép đánh giá sự tư ơng tác giữ a d ịch ch iết dược liệu V iệ t
N a m v ớ i m ột so protein thụ thể đích có vai trị dư ợc lý quan trọng n h ư ng
k h ôn g dù n g cá c phối tử (thuốc) đánh dấu p h ón g xạ.
Đ ể đạt đ ư ợ c m ục tiêu đó, đề tài đã đư ợ c triển khai vớ i các nội dung
n gh iên cứ u ch ín h như sau:
1) T hu thập các m ẫu sinh phẩm từ đ ộ n g vật thí n g h iệm để từ đ ó làm
g ià u các protein thụ thể được quan tâm n g h iên cứ u phục vụ ch o v iệ c
th iết lập các phép đo tư ơng tác “th u ốc - thụ th ể” .

2 ) X â y d ự n g quy trình đánh g iá tư ơ ng tác giữ a “th u ố c” (h oặc p h ối tử)
v ớ i các protein thụ thể k h ôn g dù ng đ ồ n g vị p h ó n g xạ, đảm bảo các
k ết quả phân tích tương đương.
3 ) T hu thập m ột số cây dược liệu V iệ t N am c ó c ô n g dụng tư ơng ứ ng
v ớ i cá c g iá trị dược học đã biết của cá c protein thụ thể được lựa ch ọ n
trong n gh iên cứu.
4 ) B ư ớ c đầu phân tích và xác định khả năng tư ơ ng tác của dịch c h iết
d ư ợ c liệu đư ợc lựa chọn vớ i các protein thụ thể đư ợc quan tâm bằng
cá c q u y trình đánh giá tư ơng tác “th uốc - thụ th ể” th iết lập được.

2


C h u ô n g 1. T Ố N G Q U A N T À I L I Ệ U
1.1. L ư ợ c s ử p h á t t r i ể n c ủ a d ư ơ c lý h ọ c v à v a i t r ò c ủ a c á c th ụ th ể tr o n g
n g h iê n c ứ u p h á t h iệ n v à p h á t tr i ể n th u ố c
C ó thể nói y d ư ợ c h ọc h iện đại n gày nay có nền tảng phát triển từ
nên y dư ợc h ọ c c ô truyền. T ron g lịch sử nhân loại từ n g có thời kỳ m ọi
văn h o á và k_hu v ự c lãnh thổ đ ều có nền y h ọc c ổ truyền riêng. C ác nền y
cô truyên n ôi tiế n g thế g iớ i gồm : nền y h ọc c ổ truyền Trung Q uốc và

các
nền
h ọc
các

nư ớc P h ư ơ n g Đ ô n g v ớ i lý th u yết v ề “âm d ư ơ n g n gũ hành” ; nền y h ọc cổ
truyền A n Đ ộ v ớ i tên g ọ i “k iến thức cu ộ c số n g ” (A y u v e d a ) được hình thành
k h o ả n g 6 0 0 0 năm trước c ô n g nguyên; và nền y h ọ c c ổ truyền Châu  u với
triết lý cơ bản là y h ọ c G alen. T ron g lịch sử, các nền y h ọ c c ổ truyền có đặc

đ iêm ch u n g là ch ủ y ế u dựa trên các loại thuốc có n gu ồn g ố c từ cây cỏ (E m st,
1 9 9 9 ).
Q u a th ời g ian , cá c n ền y h ọ c c ổ truyền P h ư ơ n g Đ ơ n g đã có những cải
tiên v à phát triển, n h ư n g v ề c ơ bản triết lý ít thay đ ổi. C òn ờ Phư ơng tây
(C hâu  u ), triết lý y h ọ c G a len đã đư ợc thay thế bằng y h ọ c hiện đại với
n g u y ê n lý c ơ bản là sự h iểu biết v ề c ơ ch ế hoạt đ ộ n g của th uốc và căn ngu yên
gâ y c á c bệnh lý. C ác thành tựu quan trọng nhất của y h ọ c Phư ơng tây h iện đại
có thê kể đến là các lĩn h vự c y học chẩn đoán, xá c định căn nguyên các bệnh
truyền n h iễm , bệnh h ọ c n ội tiết và c ô n g n gh iệp h o á dư ợ c (V o g e l và cs, 2 0 0 2 ).
T ron g khi các lĩn h vự c y h ọ c chẩn đoán, x á c định căn ngu yên gây các
bệnh lý khác nhau đã phát triển th eo thời gian cù n g v ớ i nh ữ ng hiểu biết ngày
cà n g sâu v à rộng hơn củ a c o n n gư ờ i v ề các n g u y ên nhân hoặc tác nhân gây
bệnh, c h ẳ n g hạn v iệ c x á c định n gu ồn g ố c củ a nh iều bệnh truyền nhiễm gắn
liền v ớ i sự phát m in h v à phát triển của kính h iển vi. N e n c ô n g ngh iệp hoá
dư ợc là m ột lĩnh vự c quan trọng như ng ra đời sau này và phát triển chủ yếu
trong v ò n g 100 năm gần đây. C ó thể coi v iệ c x á c định đư ợc các hợp chất có
hoạt tính sin h h ọc c ó n gu ồn g ố c từ các loài cây c ỏ (ban đầu phần lớn là các
a lk a lo it) đ ư ợ c ch iết xu ất thành c ô n g vào đầu thế kỷ 20 là điểm khởi đầu cho
c ô n g n g h iệp hóa d ư ợ c, trong đó c ó thể xem m orphin và papaverine chiết xuất
từ câ y P apaver somniferum như nhữ ng v í dụ điển hình. Từ hai hợp chất cơ
bàn n ày, c o n n gư ờ i sau đ ó đã phát triển và tổ n g hợp được thêm nhiều hợp
c h ấ t giả m đau. A tropin từ câ y A tropa belladonna và dẫn xuất được sử dụng
làm th u ố c c h ổ n g CO that. C o ca in e từ cây Ery’throxylon coca được dùng để sản
x u ấ t c á c hợp chất g â y tê cụ c bộ. Q u in in e và qu in id in e từ cây Cinchona
ju ccin u b ra dù ng chữa sốt rét v à đ iều hoà nhịp tim . E phedrine từ cây Ephedra
LSÌnica d ù n g đ ể tổ n g hợp các chất k ích thích hoặc ức ch ế thần kinh giao cảm
th e o c ơ ch ế ứ c ch ế thụ thể p (P -b lo ck er), các hợp chat xanthine kiểu coffein e;
th eo b ro m in e và th eo p h y llin e từ các cây Coffea arabica, Theobroma cacao,

3

Cam ellia sinensis , được dùng để tổng hợp nên các d ư ợ c chất chữa bệnh tim ,
inạch

như p en to x y p h illin e; các hợp chất resep in e và ajm aline từ cây
Rauwolfia serpentina được dùng làm thuốc chừa ca o hu yết áp và loạn nhịp
tim; p h y so stig m in e từ cây Physostigm a venenosum chữa chứ ng thần kinh
phân liệt; các hợp chat g ly c o sid e từ các cây D igitalis lanata và D igitalis
purpurea để sản xuất ra các hợp chất g ly c o sid e bán tổ n g hợp chữa bệnh tim
mạch; các hợp chất anthraquinone từ các cây Senna augustifolia hoặc
Rhamnus fran gu la hoặc Rheum officiate và dẫn xuất đư ợc sử dụng như các
thuốc nhuận tràng (V o g e l và cs, 2 0 0 2 ).
N ử a cu ối của thế kỷ thứ 19 được đánh dấu bằng các n gh iên cứu dư ợc lý
đâu tiên nhằm làm sán g tỏ c ơ chế tác dụng của các th uốc đã biết trên các m ơ
hình đ ộ n g vật thí n gh iệm (trích từ K atzung, 2 0 0 7 ). T h eo nhữ ng m ơ hình này,
các dịch ch iết hay các hợp chất từ dược liệu được thử n gh iệm trên các m ơ
hình c ơ quan tách rời, rồi trên đ ộn g vật thí n g h iệm (m ơ hình in v iv o ), m à chủ
yêu là ở chuột và m ột sổ đ ộn g vật khác. P h ư ơ ng pháp n gh iên cứu dược lý mà
ngày nay đã trở thành “kinh đ iển ” này thực tế đã trờ thành m ột phư ơng pháp
hiệu quả để phát hiện ra nhiều dược phẩm m ới trong su ố t thế kỷ 20 vừ a qua
(V o g e l v à cs, 2 0 0 2 ).
T uy vậy, cá c ph ư ơ ng pháp n gh iên cứu dư ợc lý trên các m ơ hình in v iv o
có hạn ch ế là th ư ờn g cần thời gian dài, lư ợ n g m ẫu (g ồ m cả hợp chất thử
n gh iệm và đ ộ n g vật thí n gh iệm ) lớn. C hẳn g hạn, lư ợ n g hoá chất m ới đư ợc
quan tâm n gh iên cứu thường đòi hỏi tối thiểu là 5 gram . H ơn nữa, các p h ư ơ n g
pháp in v iv o k h ôn g cung cấp được các th ông tin v ề c ơ ch ế phân tử của th uốc
liên quan đến các hiệu quả chữa bệnh được quan sát thấy. C ó thể lấy v í dụ v ề
điều này trong trường hợp sulfon ylurea. H ợp chất này đã được sử dụng thành
c ô n g trong đ iều trị hàng triệu bệnh nhân tiểu đ ư ờ n g trong hàng chục năm

trước khi cơ ch ế dược lý phân tử của n ó được biết rõ là g â y tăng giải p h ón g
insulin củ a tế bào p tuyến tụy (B aeder và cs, 1969).
T rong các năm 1970 - 1980, các ph ư ơ ng pháp n gh iên cứu đánh g iá hoạt
tính sinh h ọc trên các m ục tiêu dược lý phân tử là các thụ the (receptor) bắt
đầu được thực hiện. Thực tế, các phép thử sinh h ọ c tư ơ ng tác với các thụ thê
dược lý là m ột b ư ớ c ngoặt về mặt cô n g n gh ệ trong v iệ c phát hiện và phát triển
các hợp chất d ư ợc phẩm c ó tiềm năng m ớ i, đặc biệt là cu n g cấp các th ôn g tin
v ề m ối quan hệ giữ a hoạt tính sinh h ọc v à cấu trúc hoá h ọc của các hợp chât.
C ôn g n gh ệ thụ thể đã ch o phép các nhà ngh iên cứu đánh giá, phân tích m ột
lư ợng nhỏ m ột hợp chất hoặc dịch ch iết m ới (ch ỉ cần vài m iligram ) v ê khả
năng tư ơng tác trực tiếp của chúng với các m ục tiêu dư ợc lý phân tử (V o g e l
và cs, 20 0 2 ).
G ần đây, v ớ i sự phát triển m ang tính cách m ạn g của cô n g nghệ A D N tái
tổ hợp, n gày càn g có nhiều phân tử là m ục tiêu tác đ ộ n g của thuốc (n hư các

4


thụ thể và en zy m dược lý) được phát hiện, phân lập, nhân d ò n g và biểu hiện
phục vụ ch o các n gh iên cứu v ề dược lý phân tử. Đ ây là lĩnh vự c nghiên cứu
v ê tác dụng củ a các phân tử thuốc đến cơ thể qua nhữ ng h iểu biết về hóa sinh,
sinh lý, bệnh h ọ c , sinh h ọc phân tử và hóa hữu c ơ để thấy rõ tác dụng của
th uốc ờ m ức đ ộ phân tử. Q ua dược lý phân tử, chún g ta c ó thể hiểu sâu sắc v ề
c ơ ch ế tác dụ n g của thuốc, định hư ớng phát hiện và phát triển thuốc m ớ i, đề
xuất những h ư ớ n g sử dụng thuốc an toàn, h iệu quả trong điều trị hoặc ngăn
n gừ a những tác dụ ng có hại có thể có của thuốc. N ộ i du n g chủ yếu của d ư ợ c
lý phân tử là làm rõ c ơ thế tác dụng của thuốc ờ m ứ c dư ới tế bào, mà trong đó
các protein thụ thể là đích tác đ ộn g chính củ a phần lớn các thuốc đang đ ư ợ c
lưu hành rộng rãi (L undstrom , 2 0 0 6 ; O verington và cs, 2 0 0 6 ).
T rong các n g h iên cứu tư ơng tác thuốc - thụ thể, p h ư ơ n g pháp gắn p h ó n g

xạ v à o các phối tử đặc hiệu (radioligand) đã là m ột c ơ n g cụ quan trọng nhằm
tìm ra các chất chủ vận (a gon ist) và các chất đối vận (a n tagon ist) đối v ớ i các
thụ thể m ới đ ư ợc phát hiện cũ n g như các thụ thể dư ợc lý đã biết. Đ ến năm
2000 , các n gh iên cứu dùng các phối tử đặc h iệu đánh dấu p h ó n g xạ trong các
n g h iên cứu về sin h h ọc thụ thể đã có nh iều đ ó n g g ó p ch o v iệ c phát h iện và
đánh g iá các d ư ợ c chất có các g iá trị sử dụng khác nhau, như: trên h ệ tim ,
m ạch và thay đ ổi các thành phần m áu, trên hệ tiết n iệu , hô hấp, thần kinh,
thân kinh g ia o cảm ; hoạt tính liên quan đến khả năng h ọ c và ghi nhớ, các hoạt
tính giảm đau, kh áng viêm , hạ sốt; các hoạt tính m iễn dịch; các hoạt tính trên
đ ư ờ n g tiêu hoá, đ iều trị bệnh tiểu đư ờng, b éo phì ...( V o g e l và cs, 2 0 0 2 )
T ất nhiên ch ú n g ta phải thừa nhận rằng, k h ôn g phải m ọi dược phẩm m ới
đư ợc phát hiện tới nay đều bằng cá c n g h iên cứu dư ợc lý trong p h ịn g thí
n gh iệm ; thay v à o đó, m ột số dược phẩm đã đư ợc phát h iện tình cờ trong điều
trị h o ặ c thử n gh iệm lâm sàng, v í dụ như tác dụ ng lợi n iệu của su lfan ilam id e
và aceta zo la m id e theo c ơ ch ế ức ch ế en zym carb onic anhydrase (S ch w artz,
1949; M aren, 1967), hoạt tính hạ đ ư ờ n g hu yết củ a các họp chất kiểu
su lfon ylu rea vốn ban đầu được sử dụ ng như các chất kháng sinh (Franke và
F u ch s, 1955; A c h e lis và H ardebeck, 19 5 5 ), tác dụng an thần của
p h en oth iazin e (C ou rvoisier, 1956), hoạt tính ch ố n g trầm cảm của iso n ia zid
(K lin e , 1958) và của im ipram ine (K uhn, 19 5 8 ), tác dụ ng ch ổ n g co giật của
N a-valp roate, h oặc của sild en afil v ố n ban đầu chì đư ợc dùng để điều trị v iê m
họn g (E nna, 2 0 0 0 ).
N g à y nay, v ớ i sự phát triển của dư ợ c lý phân tử, cù n g v ớ i sự hỗ trợ của
c ô n g n g h ệ A D N và protein tái tổ hợp, ngày cà n g có nh iều m ục tiêu phân tử
của th uốc là các en zym và thụ thể dư ợc lý c ó bản chat protein được phân lập,
nhân d òn g, biểu hiện và tinh sạch. H oạt tính sinh học của các hợp chất m ới c ó
n gu ồn g ố c tổng hợp hoặc tự nhiên c ó thê đư ợc đánh g iá qua tương tác trực
tiếp v ớ i các phân tử đích này hoặc gián tiếp qua sự biểu h iện chức năng của

5

chủn g. C ác n g h iên cứu dư ợc lý phân tử khi áp dụng trên các sản phẩm dược
liệu có thê đ ồ n g th ời g iú p làm sá n g tỏ các vấn đề sau:
- G iải th ích v à làm rõ c ơ ch ế tác động của thuốc.
- X ác định cá c m ụ c tiêu tác dụng của thuốc.
- X á c định cá c hợp chất c ó hoạt tính sinh h ọc th eo các c ơ chế riêng biệt.
R õ ràng, c á c th ô n g tin trên đây là cần thiết ch o q trình phát triển, tiêu
chn hố và h iện đại hoá các sản phẩm dược liệ u , đồng thời định hướng cho
các n gh iên cứ u v ề th u ốc ở các g ia i đoạn sau củ a quá trình phát triển thuốc
(n g h iên cứ u d ư ợ c lý trên đ ộ n g vật thí n gh iệm , n g h iên cứ u lâm sàng, nghiên
cứu dư ợ c đ ộ n g h ọ c , c ô n g n gh ệ bào c h ế , ...).
1.2 . C h iế n lư ợ c s à n g lọ c c á c h ợ p c h ấ t t ự n h iê n c ó h o ạ t tín h s in h h ọ c d ự a
t r ê n p h â n tíc h t ư ơ n g tá c t h u ố c - th ụ th ể ( d r u g - r e c e p t o r in te r a c t io n )
T ron g các ch ư ơ n g
trình sà n g lọ c cá c hợp

-i___
huoc tân dược

Thuốc có nguồn gốc tự
nhiên chưa tiêu chuẩn hóa

chất c ó hoạt tín h sinh
h ọc dựa trên cá c protein
thụ thể, n gư ờ i ta tiến
hành phân tích sự tư ơ n g
tác trực tiếp của c á c hợp
chất
n gu ồn

m ới
gốc

(h o ặ c
tổ n g

có
hợp,

hoặc c ó n gu ồn g ố c tự
n h iên ) v ớ i cá c protein
thụ thể đ ích (x e m

mơ

hình m in h

các

H ìn h

h ọa

ở

Hình 1. Mơ hình minh họa vé sự khác biệt giữa các chế phám thuốc tân
dưực và các thuốc có nguón góc tự nhién chưa tiẻu chuẩn huá
AVií như các sán phẩm lún dược thường chi chứa vác hỢỊ) duit có hoạt lírtlì sinh
học xác (lịnh (hìnlt màu đen) đuực sàn xuất theo các ngu\ẻn lác lổng hợp hoặc

bún lóng hợj>, llii các cliẻ phẩm có ngn gốc tụ nhiên ihmg ủ dạnỊ! ltd chúi,
nglũa lù bẽn cạnh các chđt có hoạt rinh sinli học. có thi có các hợp chất độc
thinh gạch chém, hoặc khống có tác dụng sinh hục (hình chấm).

1 và 2). T ừ kết

quả phân tích n ày, cá c hợp chất c ó khả năng tư ơ ng tác đặc hiệu với các thụ
thể đ ích th ư ờ n g đ ư ợ c x em là các hợp chất c ó hoạt tính sinh học tiềm năng và
tiếp tục đư ợc đư a v à o các ch ư ơ n g trình đánh giá hoạt tính sinh h ọc của chúng
ở cấp đ ộ tế bào h o ặ c c ơ thể (ở đ ộ n g vật thí n gh iệm và lâm sàng trên người;
xem m inh họa ở H ìn h 3 ). T ron g thực tế, các phép thử sinh học tương tác với
các protein thụ th ể đã là m ột bư ớ c ngoặt v ề mặt c ô n g ngh ệ trong v iệc phát
hiện, phát triển và tổ n g hợp các hợp chất c ó hoạt tính sinh học tiềm năng m ới,
đặc biệt là cu n g cấp các th ôn g tin v ề m ối quan hệ “cấu trúc hố học - hoạt
tính sinh h ọ c ” củ a các dư ợc chất và các đích tác đ ộ n g của chúng. Các phép đo

6


Thành phần hố
học của các sản
phẩm thuốc có
ngn gốc tự nhiên

tưưng tác thụ thể cho
phép chúng ta đánh
giá,

phân

lượng

rất

tích

một

nhỏ

một

Cấc dược chát
tiém nàng

hợp chất hoặc d ịch
chiết m ới (c h ỉ cần ở
hàm lượng từ 5 đến

Các mục tiêuphân ử tác
động của thuốc (vfdụcác

10 m g) về khả năng

thụ thể/enzymduợc lý)

tương
của

tác

chúng

trực

tiếp

vớ i

các

[

THỬNGHIỆMTRONGCÁCNGHIÊN
CÚUTIỀNŨMSÀNGVÀLAMsảng
NHẰMXẢCĐỊNHHIỆUQUẢĐIỀUTR|
Hình 2. Mơ hình giản lược về ngun lý phân tích tương tác

đ ích dược lý ở cấp
phân tử (V o g e l và cs,
2 0 0 2 ).

-------------------------Phân đoạn

D ịc h c h iế t
tổ n g cộ n g

C h iế t tá c h

Các phản đoạn, hoặc

hợp chất riẻng rẽ
V.___________________

Hệ thống
sàng lọc
dượcchít

in-vitro

Hlnh 3. Mơ hình sàng lọc thuốc từ dược liệu sử dụng các protein thụ thể

S ự phát triên của công nghệ thụ thê đã dân đên sự ra đời của lĩn h vự c
sàng lọc hiệu năng ■>cao cácr hợp chât có hoạt tính sinh học (high
throughput
»
7
screening - H T S ) . ơ một sô nước công nghiệp dược phát triên, sự phát triên
f

f

*

\

của lĩn h v ự cr này thực tê đã găn liênr vớ i các thành
tựu của cơng
nghệ hốr tơng
T
\

họp. M ột sô lượng lớn các hợp chât thu từ hố tơng hợp, gơm cả các chât bán
*
\
f
tơng hợp có nguôn gôc tự nhiên đã được đưa vào các chương trình sàng lọc

7


(H a rv e y , 2 0 0 8 ). C á c phương pháp sàng lọc nhanh hiện nay khơng những cho
phép đánh g iá hoạt tính sinh học của các hợp chất m ới mà còn cho biết các số
liệu về dược động học và chuyển hóa của các dược chất có tiềm năng mới
(W att v à cs, 2 0 0 0 ; W h ite, 2 00 0). C ùng vớ i sự tự động hố q trình sàng lọc,
một số hệ thống sàng lọc hiện nay cho phép sàng lọc hàng nghìn chất một
ngày trên một đ ích phân tử riêng biệt (Lu n d stro m , 2 0 0 6 ; Zander, 2011). M ặc
dù v ậ y , sự phát hiện v à phát triển các thuốc m ới dường như ngày càng trở nên
khó khăn hơn. C ó nhiều nguyên nhân giải thích cho hiện tượng này, nhưng
một nguyên nhân băt nguồn từ thực tế hiện nay là y học đã có thuốc tương đối
tơt cho nhiều bệnh phổ biến; việ c đầu tư phát hiện v à phát triển một thuốc
mới c ó tác đ ộ n g cù n g đích và hiệu quả hơn th uốc đã biết sẽ ngày càn g hiếm
hơn. V í dụ như trong cả năm 2 0 0 6 , chi có 21 th uốc m ới đ ư ợ c F D A thông qua.
Tuy vậy, đ iều đ án g lưu ý là trong số 1184 thuốc m ới đư ợc phát triển trong
giai đoạn 1981 - 2 0 0 7 , vẫn có đến 6% là các sản phẩm c ó nguồn g ố c tự
nhiên, 2 8 % là các dẫn xuất của các sản phẩm tự nhiên v à 2 4 % là các sản
phâm tổng hợp được phát triển từ các mơ h ình của sản phẩm tự nhiên
(N ew m an v à C rag g , 2 00 7). Đ iều này chứng tỏ dược liệu tự nhiên vẫn là
nguồn tài nguyên có tiềm năng lớn cho sự phát hiện và phát triển thuốc m ới.
T ro n g bối cảnh đó, chúng tơi tin rằng tài nguyên dược liệu V iệ t Nam có
nhiều tiềm năng trong các nghiên cứu sàng lọc và phát hiện thuốc mới theo
m ơ hình thử tư ơ n g tác “th uốc - thụ th ể” .

1.3. v ề c á c p h ư ơ n g p h á p n g h iê n c ứ u tư ơ n g tá c t h u ố c - t h ụ th ể
1 .3 .1 . L ý th u y ế t đ ộ n g h ọ c tư ơ n g tá c t h ụ t h ể - p h ố i t ử
N hiều quá trình sinh học thiết yếu cho hoạt động v à sự tồn tại của tế bào
và c ơ thể đư ợc đ iều hòa bời horm one, các chất dẫn truyền thần kinh, cytok in e
và cá c phân tử truyền tin khác. Sự truyền tin này th eo cá ch phổ biến hơn cả
bắt đẩu từ sự tương tác của các phân tử tín hiệu tự nhiên (horm one, chất dẫn
truyền thần kinh, cy to k in e, . . . ) vớ i các thụ thể trên m àn g tế bào hoặc trong tế
bào chất hoặc nhân tế bào. C ác phân tử tín h iệu th ư ờn g c ó cấu hình khớp với
một v ị trí đặc hiệu trên thụ thể và đính kết vào đó (g ọ i là v ị trí liên kết thụ thể)
giống như sự tương tác giữa một cơ chất vớ i một v ị trí xú c tác của enzym
tương ứng theo kiểu “ ch ìa khóa tra vào 0 khó a” . Phân tử tín hiệu biểu hiện
hoạt đ ộ n g g iô n g như m ột p h ố i t ử (ligand); thuật n gữ này được dùng đê
một phân tử liên kết đặc hiệu vớ i một phân tử kh ác, thường có kích thước
hơn nó. K h i liê n kết vào thụ thể, phối tử thường trực tiếp làm protein thụ
thay đổi hình dạng của nó. Đ ổ i vớ i nhiều loại protein thụ thê (v í dụ nhóm

chỉ
lớn
thể
thụ

thể kết cặp G -protein, G P C R ), sự thay đổi hình dạng như v ậ y sẽ trực tiếp hoạt
hóa thụ thể, giúp nó có thể tương tác v ớ i những phân tử khác trong tế bào.
V ớ i một số loại thụ thể khác (v í dụ nhóm thụ the tyro sine kin ase ), hiệu ứng

8


tức thì của việ c phối tử liên kết vào thụ thể là tạo nên sự tập hợp của hai hay
nh iều phân tử thụ thể; điều này dẫn đến chuỗi cá c sự k iện khác ở cấp độ phân

tử (chuỗi truyền tin ) diễn ra trong tế bào dẫn đến đáp ứng sinh lý của tế bào.
T h eo m ột cách phổ b iến , v iệ c liên kết củ a thụ thể g iố n g với sự liên kết
của một yêu tố đ iều hòa dị lập thể vào en zy m , g â y nên sự thay đổi hình dạng,
dẫn đến làm tăng hoặc giảm hoạt tính enzym . V ớ i quá trình truyền tin, việc
liên kêt của phối tử vào thụ thể làm thay đổi khả năng truyền tin của thụ thể.
Phần lớn các thụ thê truyền tin là các protein liên kết m àng sinh chất. C ác
phối tử của ch ú n g thường là cá c chất tan trong n ư ớ c và c ó kích thước đủ lớn
đến m ức không thể “ tự do” qua màng sinh chất. T u y v ậ y , cũng có một nhóm
các thụ thể có trong tế bào chất hoặc trong nhân (V o g e l và c s, 2 0 0 2 ).
Tro n g các mơ hình thử nghiệm in vitro , thụ thể có thể được dùng để sàng
lọc các thành phần hóa học m ới hoặc để định tính và định lượng các thuốc tác
đ ộn g lên nó. C ác thụ thể trong các phân tích tư ơ n g tác th u ốc - thụ thể có thể
thu được từ các động vật thí nghiệm hoặc gần đây có thể được tạo ra bằng
công nghệ A D N tái tổ hợp (Lu n d stro m , 2 0 0 6 ). T ro n g phép thử tương tác thụ
thể - phối tử, m ột p h ối tử đ ư ợ c đánh dấu và th uốc thử sẽ cạnh tranh liên kết
nếu thụ thể đó là đ ích tác động của thuốc thử. Ở trạng thái cân bàng, các phối
tử không liên kết thụ thể (phối tử tự do) được phân tách kh ỏ i phối tử liên kết
thụ thể (lú c này ở dạng phức “phối tử - thụ th ể”). Sau đó, cá c phối tử liên kết
và/hoặc phổi tử tự do (không liên kết vớ i thụ thể) sẽ được định lượng. Theo
dãy nồng độ tăng dần của thuốc thử (trong trường hợp nó có ái tính vớ i thụ
thể), lượng phối tử đánh dấu liên kết vớ i thụ thể sẽ giảm đi do sự cạnh tranh
liên kết v ớ i thụ thể củ a thuốc thử.
V ì mật độ thụ thể trong mỗi mơ của một lồi nhất định được xem là ổn
định (đại diện bằng B max, tương đương vớ i tổng số v ị trí liên kế t), nên sự liên
kết của một phổi tử đặc hiệu vào thụ thể của nó là một q trình có thể bão
hịa. Đ iều này có nghĩa là kh i nồng độ cùa phối tử đặc hiệu tăng dần, lượng
phối tử liên kết thụ thể (phức hợp “phối tử - thụ th ể” ) lú c đầu tăng nhanh cho
đến khi đạt cận m ức tối đa (B max) thì trở nên ổn định (x em H ìn h 4). T heo
đ ộn g h ọc tư ơng tác phối tử - thụ thể, dựa vào đ ư ờ n g c o n g bão hịa có thể xác
định được B max cũng như ái lự c giữa phổi tử và thụ thể (đ ại diện bằng hằng số

phân ly Kd, là n ồn g độ phổi tử mà ờ trạng thái cân bằng, 50% vị trí liên kêt
của thụ thể được phối tử đính kết). Trong thực n g h iệm , m ột cặp phối tử - thụ
thể c ó g iá trị Kd (thư ờng được biểu diễn qua đơn vị p M /n M ) càng lớn thì ái
lực càng thấp và ngược lại. N hư vậ y , đối vớ i phổi tử nếu có thể định lượng

9


đư ợc số liên kết thụ thể trong dãy
nôn g độ tăng dần của chún g (ch ẳ n g
hạn bằng cách đánh dấu phổi tử),
thì c ó thể xác định được Kd của nó
qua thí n gh iệm bão hòa thụ thể.
T ư ơ n g tác cù a m ột phối tử
đánh dấu với thụ thể được m ô tả
băng p h ư ơ ng trình phản ứng sau:
L* + R ĩ i Ư R

Hình 4. Thí n ghiệm b ão hịa thụ thể. Thí

(p h ư ơ n g trình 1 )

nghiệm này cho phép xác định Bma, (mật độ
thụ thể) và Kđ (hẳng số phân ly giữa phối tử
và thụ thể).

T ron g đó L* là phối tử đánh
dấu (la b eled ligan d ), R là thụ thể

(receptor) và L *R là phức hợp phối tử đánh - thụ thể.

T ừ đ ồ thị bão hịa, c ó thể tính được B max và Kd qua p h ư ơ n g trình:
[L*R] = — - J - * —
[L ] + K đ
(p hư ơ ng trình 2 )
K hi c ó m ột p h ối tử thứ 2, v í dụ như “th uốc thử” (D ) được bổ sung v à o ,
sự tư ơ n g tác giữ a th uốc thử và phối tử với thụ thể c ó th ể đư ợc biểu diễn bằng
phương trình:
D + L* + R

D R + L*R

(p hư ơ ng trình 3 )

T ron g đó, D là th uốc thử, D R là phức hợp đư ợc tạo thành của thuốc thử
với thụ thể và L*R là phức hợp thụ thể và phối tử đánh dấu.
T ron g dãy n ồ n g độ tăng dần của thuốc thử D , n ếu D tư ơ n g tác với R thì
lượng ph ứ c hệ L R sẽ giảm đi. N ồ n g độ của D m à ở đ ó chỉ c ó 50% vị trí liên
kết thụ thể đư ợc bắt g iữ bởi phối tử được g ọ i là g iá trị IC 50. G iá trị này tư ơng
quan n gh ịch vớ i ái lực của thuốc thử D với thụ thể. Á i lực của thuốc thử đối
với m ột thụ thể (đại diện bằng hằng số ức ch ế Kị) c ó thể x á c định được từ g iá
trị IC 50 trong m ối tư ơ ng quan vớ i ái lực của phối tử đặc h iệu và thụ thể (đại
diện bằng hàng sổ phân ly K d) qua phư ơng trình C h e n g -P r u so ff (C heng và
Prusoff, 1973):
1C „ = K, • ( ! + t p )
d

(phư ơng trình 4 )

10

1.3.2. C á c p h ư ơ n g p h á p p h â n tíc h tư ơ n g tá c t h ụ t h ể - p h ổ i t ử
C ác phép tử tư ơng tác thụ thể - phối tử (receptor-ligand bin d in g/
interaction a ssa y s) g iữ vai trò quan trọng trong các n g h iên cứu sinh học và
g iờ đây đã trở thành m ột phần quan trọng trong các n gh iên cứu dược phẩm
h iện đại. T ùy th eo m ô hình thử ngh iệm đơn thuần dựa trên phân tử protein thụ
thê hay tê bào n g u y ên vẹn m an g thụ thê, các phép thử tư ơng tác thụ thê - phối
tử (haỵ thụ thê - th u ôc) được chia làm hai cách tiêp cận chính: 1 ) các phép thử
liên kêt thụ thê (receptor binding a ssa y s) hay còn g ọ i là các phép thử dựa v à o
thụ the (recep tor-b ased assays); và 2 ) các phép thử chứ c năng thụ thể
(receptor fu n ction al a ssa y s) hay còn g ọ i là các phép thử dựa trên tế bào (c e llb ased a ssays). Ư u điểm của các phép thử liên kết thụ thể là khả năng đánh g iá
tư ơ n g tác trực tiếp của m ột phối tử (ligand; hay m ột d ư ợ c chất) với m ột thụ
thê nhất định v à xác định được các th ông số đ ộ n g h ọ c tư ơ ng tác giữ a chún g
(ch ẳ n g hạn nh ư m ật độ thụ thể - B max, ái lực tư ơ ng tác - Kd). T uy vậy, nhược
đ iêm của cách tiếp cận này là k h ôn g xác định đư ợc liệu nhữ ng tương tác đó
c ó g â y ra đáp ứ n g tế bào hay khơng; nói cách khác, ph ép thử kh ông ch o phép
ch ỉ ra m ột p h ổ i tử tác đ ộn g th eo k iểu chủ vận (a g o n ist, gây đáp ứng tế bào)
hay th eo k iểu đ ố i vận (antagonist; liên kết v ó i thụ thể như ng khơng g â y đáp
ứ ng tế bào, v ì v ậ y ức ch ế chất chủ v ận /ch ẹn thụ thể). T ron g khi đó, các phép
thử ch ứ c năng tế bào là sự bổ sung ch o các phép thử liên kết thụ thể. M ặc dù
các ph ép thử th eo cách tiếp cận thứ hai k h ôn g giú p x á c định được các th ôn g
số đ ộn g học tư ơ n g tác giữ a m ột phối tử và thụ thể nhất định, nhưng thay v à o
đó ch ú n g ch o p h ép xác định được sau khi phối tử liên kết vớ i thụ thể, phức hệ
phối từ - thụ thể c ó gây đáp ứng tế bào hay k h ôn g (v í dụ: sự tăng sinh tế bào
hay tăng tiết cá c chất truyền tin thứ hai, như C a2+, IP3, cá c cy to k in e ...) . N hư
vậy, trong n g h iên cứu tương tác thuốc - thụ thể các p h ép thử liên kết thụ thể phối tử và b iểu h iện ch ứ c năng thụ thể có g iá trị bổ su n g ch o nhau (D e Jong
và c s, 2 0 0 5 ).
v ề ph ư ơng d iện kỹ thuật, các ph ư ơ ng pháp đánh g iá tư ơ ng tác thụ thể phối tử cần địn h lư ợ n g được lư ợng phổi tử liên kết v ớ i thụ thể ở các n ồ n g độ
khác nhau củ a p h ối tử và thụ thể; trong khí đó, các ph ép thử chức n ăn g thụ
thể thường y ê u cầu xác định được sự xuất hiện sản phẩm của quá trình truyên

tin sau khi p h ổi tử được ủ với tế bào số n g m ang cá c thụ thể được quan tâm
n g h iên cứu (V o lg e l và cs, 2 0 0 2 ).
N hằm m ụ c đích định lư ợng được phối tử liên kết thụ thê, trong các
p h ư ơ n g pháp đánh g iá tương tác thụ thể - phối tử kinh điển, các phối tử
th ư ờn g được đánh dấu p h ón g xạ (ch ẳn g hạn bàng 3H, 125I, . ..) . Ưu đ iểm của
n hữ ng phương pháp này là tốc độ nhanh, độ nhạy ca o , dễ thực hiện và khả
năng lặp lại ca o . T uy vậy, nhược điểm của những p h ư ơ ng pháp sử dụng phôi

11


tử đánh dấu p h ó n g xạ là nguy c ơ an toàn sứ c khỏe v ớ i ngư ời nghiên cứu và
m ôi trường, yêu cầu đặc biệt về phịng thí n g h iệm , hệ th ốn g xử lý rác thải
p h ó n g xạ và g iá thành rất cao khi thực hiện ở quy m ô lớn. Đ ây là lý do các
p h ư ơng pháp đánh g iá tương tác thuốc - thụ thể k h ô n g sử dụng phối tử đánh
dâu p h ón g x ạ đ ư ợ c quan tâm ngh iên cứu phát triển trong nhữ ng năm gần đây.
C ác phép thử k h ô n g dù ng đ ồn g vị ph óng xạ đến nay đư ợc phát triển chủ yếu
dựa trên các p h ư ơ n g pháp quang h ọc theo n g u y ên lý phân cự c huỳnh quang FP (flu o r e sc e n c e p olarization ), truyền năng lư ợ ng c ộ n g h ư ở n g huỳnh quang F R E T (flu o r e sc e n c e resonan ce energy transfer) v à c ộ n g hư ởn g plasm on bề
m ặt - SP R (su rface plasm on resonan ce), hoặc dựa trên m ột số phư ơng pháp
khác như đếm tế bào qua d òn g chảy (flo w cytom etry) hay sắc ký kết hợp khối
p h ô định lư ợ n g (quantitative H P L C /M S). T rong phạm v i báo cáo này, chúng
tôi chỉ đ ề cập tóm tắt v ề m ột sổ phương pháp đánh g iá tư ơng tác thụ thể - phổi
tử dùng phối tử đánh dấu huỳnh quang vốn c ó ưu đ iểm rẻ tiền hơn so với các
ph ư ơ ng pháp dù n g đ ồn g vị p h ón g xạ, tư ơng đối d ễ thực h iện, kh ông yêu cầu
cao v ê trang th iết bị p h ịn g thí ngh iệm (ch ỉ cần m áy đ ọ c E L IS A bên cạnh các
thiết bị n g h iên cứu th ơn g thường); và v ì vậy, đây là cá ch tiếp cận được chúng
tôi lựa ch ọn ch o đ ề tài này. C ác ngu yên lý v ề c ô n g n g h ệ phát hiện và định
lư ợ n g đư ợc nêu trong phần tổn g quan này chủ y ếu đ ề cập đến các phép đo
liên kêt thụ thể, so n g cũ n g có thể áp dụng ch o các phép đo chứ c năng thụ thể.

1.3.2.1. Các p h ép thử liên kết thụ thể - p h ổ i tử dừng đồng vị phóng xạ
C ác phép thử liên kết thụ thể - phối tử phổ biến đến nay đều dùng phối
tử đánh dấu p h ó n g xạ liên kết vớ i thụ thể m àn g tế bào. Phép thử th eo nguyên
lý này đư ợc phát triển lần đầu tiên bởi L efk o w itz v à c ộ n g sự (1 9 7 0 ). N g u y ên
lý củ a ph ư ơng pháp dựa trên tương tác cạnh tranh g iữ a m ột phối tử đánh dấu
và m ột “thuốc thử” c ó cù n g v ị trí liên kết thụ thể. N g u y ê n lý của các phép thử
theo k iểu đẩy phối tử đư ợc m inh họa trên H ìn h 5.
V iệ c ch ọn m ột phối tử đánh dấu p h ón g xạ phù hợp cần đáp ứ ng m ột sổ
tiêu chí: i) p h ối tử đánh dấu phải có tính ch ọn lọ c v à c ó ái lực cao vớ i thụ thể
tư ơng ứng, ii) có tính đặc hiệu cao và thuần khiết v ề hóa p h ón g xạ, và iii)
phổi tử đánh dấu phải bền v ề mặt hóa h ọ c và k h ơn g bị b iến tính bởi enzym .
Ư u điểm lớn nhất của phép thử liên kết thụ thể - phối tử dùng phổi tử
đánh dấu p h ón g x ạ là độ nhạy cao, tính đặc hiệu cao và phép phân tích nhanh.
Phép thử chì cần m ột chất đánh dấu duy nhất là phối tử và phối tử đánh dấu
này k h ô n g làm thay đổi ái tính của thụ thể. Sự sẵn có củ a nhiều phổi tử đánh
dấu p h ó n g xạ trên thị trường ngày cà n g trở nên phổ b iến giú p v iệc thiêt lập
phép thử được dễ dàng. Đ en nay có thể nói: ngoại trừ các thụ thể cơ độc
(orphan receptor; là những thụ thể chưa xác định đư ợc phối tử đặc hiệu),
p h ư ơng pháp đánh tương tác thụ thể - phối tử sử dụng p h ổi tử đánh dâu phóng

12


xạ đã được thiết lập c h o hầu hết m ọi thụ thể cứ m ỗi khi x á c định được phối tử
đặc hiệu cửa nó (V o g e l và cs, 2002 ).

H ỉnh 5. N g u y ê n lý c ủ a p h é p đ o liên k ết th ụ th ể - p h ố i tử . Thụ th ể (R) đ ư ợ c ủ với
phối tử đ ặ c hiệu đánh dấu (L) và th u ốc thử (D), sa u đó phần phổi tử khơng liên kết thụ
th ể (d ạn g tự do) đ ư ợ c tá c h bỏ khỏi phần liên kết với thụ th ể h o ặ c b ằng c á c p h ư ơ n g
p háp lọc, rửa, thẩm tách hay ly tâm; phần phối tử liên kết thụ th ể sa u đỏ đ ư ợ c định

lư ợ n g n h ờ c á c phối tử n ày đ ư ợ c đánh dấu (h o ặ c với đ ồn g vị p h ón g xạ, n hư 3H, h o ặ c
với g ố c phát huỳnh q u an g, n hư flu orescein).

T uy vậ y , do n h ữ n g hạn ch ế rõ rệt cùa các ph ép đo dù n g ph ối tử đánh dấu
p h ó n g xạ (n hư nêu ở m ụ c 1.3.2), đã có m ột số nỗ lự c phát triển các phép thử
liên kết thụ thể k h ôn g dù n g phối tử đánh dấu p h ó n g xạ (d e Jon g và cs, 2 0 0 5 ).

1.3.2.2. S ơ lược về các phép thử liên kết thụ thể - p h ổ i tử không dùng đồng
vị ph ón g xạ
Phần lớn các ph ép thử này vẫn cần m ột kiểu đánh dấu ch o phép đo được
sự liên kết giữ a phối tử và thụ thể. Đ iều cố t y ếu là cách đánh dấu khơng làm
thay đổi ái tính tư ơ ng tác giữ a phối tử và thụ thể. T ron g trường hợp phối tử
đư ợc đánh dấu, ph ép th ử cần được chứ ng m inh k h ơng làm thay đổi các thuộc
tín h liên kết (như tính đặc hiệu thụ thể, ái lực liên kết) củ a phối tử so vớ i phối
t ử tư ơ n g tự đánh dấu p h ó n g xạ (T akeuchi và cs, 1995).
M ột trong các ph ép thử tư ơng tác phổi tử - thụ thể k h ôn g dùng đ ồn g vị
p h ó n g xạ đầu tiên dù n g phối tử đánh dấu huỳnh quang đư ợc phát triển ch o thụ
chể đ ích là b en zo d ia zep in dùng phối tử d iazep am đánh dấu flu orescein
('M cC abe và cs, 1990). Sau đó, hai nhóm n gh iên cứu của T akeuchi (T akeuchi
v à c s, 1992) và Janssen (Janssen và cs, 2 0 0 1 ) đã phát triển ph ư ơ ng pháp phát
h iệ n lư ợng phối tử đánh dấu huỳnh quang liên kết thụ thể bằng phư ơng pháp
s ắ c ký lỏn g cao áp đảo pha (R P -H P L C ) kết hợp vớ i bộ phát hiện huỳnh quang
( flu o rescen ce d etector). Phương pháp của T akeuchi ch o phép định lư ợng phôi
tử tự do (k h ôn g liên kết thụ thể) trực tiếp sau ly tâm , n h ư ng đòi hỏi lư ợng thụ
th e và phối tử đủ lớn đ ể phương pháp H PLC c ó thể định lư ợ n g được. Phương
p h á p của Jassen sau đ ó được cải tiến bằng cách phân tách phổi tử tự do ra

13

khỏi phối tử liên kết thụ thể, rồi thu hồi lại phổi tử liên kết thụ thể bằng cách
gây biến tinh thụ thể và định lư ợng phối tử liên kết thụ thể bằng phư ơng pháp
R P -H P L C . P h ư ơ ng pháp định lư ợng phối tử liên kết này của Jassen được
đánh g iá ưa v iệ t hơn ph ư ơng pháp định lư ợng phối tử tự d o nhờ độ nhạy và
tính đặc hiệu cao hơn, đ ồ n g thời không cần lư ợ n g lớn thụ thể và phổi tử đánh
dâu. M ột cải tiến khác sau đó được nhóm T akeuchi (1 9 9 5 ) phát triển dựa trên
n g u y ên lý huỳnh quang phân giải thời gian - T R F (tim e-resolved
flu o rescen ce). T h eo ph ư ơ ng pháp này, phối tử của thụ thể b enzodiazepin
(d ia zep a m ) đ ư ợc đánh dấu bằng 3Eu. Sau khi ly tâm , d ịch nổi được chuyển
sa n g đĩa 96 g iế n g rồi bổ sung chất tăng cư ờ n g phát qu ang trước khi đo tín
h iệu quang bằng m áy đ ọc E L ISA .
M ột số p h ư ơ n g pháp đánh g iá tương tác vớ i protein thụ thể không dùng
đ ôn g vị p h ón g xạ dựa trên ngu yên tắc “đánh dấu bang e n z y m ” . Trong các
ph ư ơ ng pháp này, hoặc phối tử được kết cặp v ớ i m ột en zy m (H am er và
S am u el, 1989) hoặc phức hệ phối tử - thụ thể đư ợc định lư ợ n g gián tiếp qua
hoạt tính en zy m (Garrett và cs, 1999; M ah on ey và c s, 1999; S eifert và cs,
1 9 9 9 ). V í dụ như trong np hiên cứu của M ah on ey v à cs (1 9 9 9 ) trên thụ thể yếu
tố tăng sinh c ó n gu ồn g ơ c tiểu cầu (P D G F -R ), p h ối tử đư ợc đánh dấu bằng
biotin rồi đư ợc ủ v ớ i thụ thể đã được gắn sẵn trên đ ĩa 9 6 g iế n g . L ư ợ ng phối tử
gắn biotin liên kết thụ thể sau đó được định lư ợ n g bằng v iệ c bổ sung
horseradish p ero x id a se (H R P ) được gắn vớ i neutravidin. L ư ợ ng neutravidinH R P dư thừa đư ợc rửa trôi qua m áy thu tế bào rồi sau đ ó định lư ợng phối tử
liên kết bằng bổ su n g c ơ chất ch o phản ứng en zy m H R P.

1.3.2.3. Sử dụng p h ố i tử đánh dấu huỳnh quang flu orescein trong các phép
thử thương tác thụ thể - ph ổ i tử
F lu orescein (39,69-d ih yd ro sp iro [iso b en zo fu ra n - 1(3 H ),9 9 -[9 H ]x a n th en ]3- N a ) là m ột chất hữu c ơ tổ n g hợp có tính lực huỳnh quang cao vớ i bước
só n g kích thích cự c đại trong vù n g 4 8 0 - 5 0 0 nm và phát x ạ cự c đại vù n g 5 2 0
- 5 3 0 nm . C hất huỳnh quang này hiện được dùng phổ b iến làm phân tử đánh
dấu trong các n gh iên cứu tư ơ ng tác sinh học của các đại phân tử. N ó có thê
được gắn vào các phân tử protein (v í dụ như kháng thể . . . ) để ngh iên cứu về

cấu trúc, sự phân bố và biểu hiện chứ c năng của các protein trong tế bào và cơ
thể, h oặc cũ n g c ó thể đư ợc gắn v à o các n u cleo tit để tạo m ẫu dò trong lai các
axit n u cle ic (N o g a và cs, 2 0 0 2 ). N g o à i ra, flu o rescein cũ n g được dùng ngày
càng rộng rãi trong chẩn đoán y h ọc (K w an và cs, 2 0 0 6 ).
T ron g các phép đo liên kết thụ thể - phối tử, flu o rescein cũ n g là phân tử
đánh dấu gần đây đư ợc sử dụng phổ biến để thay thế các phối tử đánh dâu
p h ón g xạ. N h ờ tính lực huỳnh quang m ạnh, flu o rescein c ó thể giúp phát hiện
và định lư ợ n g các loại phối tử khác nhau như các cy to k in e, các dược chât, các

14