Sàng lọc và biểu hiện gen mã hóa protein ức chế protease của vi sinh vật liên kết hải miên Spheciospongia vesparium thu nhận tại vùng biển Miền Trung, Việt Nam (Luận án tiến sĩ)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC
VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
-----------------------------

TRẦN THỊ HỒNG

SÀNG LỌC VÀ BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA PROTEIN ỨC CHẾ
PROTEASE CỦA VI SINH VẬT LIÊN KẾT HẢI MIÊN Spheciospongia
vesparium THU NHẬN TẠI VÙNG BIỂN MIỀN TRUNG, VIỆT NAM

LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

HÀ NỘI, 2020


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC
VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
-----------------------------

TRẦN THỊ HỒNG

SÀNG LỌC VÀ BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA PROTEIN ỨC CHẾ
PROTEASE CỦA VI SINH VẬT LIÊN KẾT HẢI MIÊN Spheciospongia

vesparium QT2 THU NHẬN TẠI VÙNG BIỂN MIỀN TRUNG, VIỆT
NAM

Chuyên ngành: Công nghệ sinh học
Mã số: 9420201

LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:
1. PGS.TS.NCVCC Phạm Việt Cường
2. PGS.TS Nguyễn Thị Kim Cúc

Hà Nội, 2020


LỜI CÁM ƠN
Lời đầu tiên, tôi xin được bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc nhất tới
PGS.TS.NCVCC Phạm Việt Cường, nguyên Viện trưởng Viện Nghiên cứu Khoa
học Miền Trung, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam- Nhà Khoa học
mẫn cán, người thầy mẫu mực- người đã giúp tôi định hướng nội dung, giúp đỡ về
tinh thần, kiến thức chuyên môn, cơ sở vật chất và chỉ bảo tận tình giúp tôi vượt qua
rất nhiều khó khăn để hoàn thành Luận án trong suốt những năm qua.
Tôi cũng xin chân thành cảm ơn sâu sắc tới PGS.TS Nguyễn Thị Kim Cúc,
Chủ nhiệm đề tài ĐTĐLCN.17/14 “Nghiên cứu metagenome của vi sinh vật liên kết
hải miên tại biển miền Trung Việt Nam nhằm phát hiện và sàng lọc các chất hoạt
tính sinh học mới” đã định hướng cho luận án của tôi và quan tâm, giúp đỡ tôi trong
suốt thời gian thực hiện luận án.
Tôi xin cảm ơn Ban lãnh đạo Viện Nghiên cứu Khoa học Miền Trung đã cử
tôi đi học, tập thể Trung tâm sinh học Phân tử Nghĩa Đô, Ths.NCS Tôn Thất Hữu
Đạt, phòng quản lý tổng hợp Viện Nghiên cứu Khoa học Miền Trung đã tạo điều

kiện cho tôi làm việc, hoàn thành các thủ tục giấy tờ và hoàn thiện các nội dung
trong nghiên cứu này.
Tôi trân trọng cảm ơn Học viện Khoa học và Công nghệ, Viện Công nghệ
Sinh học đã tạo điều kiện thuận lợi về cơ sở vật chất và giúp đỡ tôi hoàn thành mọi
thủ tục cần thiết trong quá trình học tập.
Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè và người thân đã luôn
bên cạnh động viên, giúp đỡ, chia sẻ và tạo điều kiện tốt nhất cho tôi học tập,
nghiên cứu và hoàn thiện luận án của mình.
Hà Nội, ngày tháng năm 2019

Tác giả

NCS. Trần Thị Hồng

i


LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan:
Đây là công trình nghiên cứu của tôi và một số kết quả cùng cộng tác với các
cộng sự khác;
Các số liệu và kết quả trình bày trong luận án là trung thực, một số kết quả
lần đầu tiên được công bố trên tạp chí khoa học chuyên ngành có uy tín với sự đồng
ý và cho phép của các đồng tác giả.
Phần còn lại chưa được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác.
Hà Nội, ngày

tháng

năm 2019

Tác giả

NCS. Trần Thị Hồng

ii


MỤC LỤC
Lời cảm ơn ...................................................................................................................i
Lời cam đoan ...............................................................................................................ii
MỤC LỤC ....................................................................................................................
iii
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT............................................
vi
DANH MỤC CÁC BẢNG ..........................................................................................
viii
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ ....................................................................
ix
MỞ ĐẦU ......................................................................................................................1
CHƯƠNG I. TỔNG QUAN .......................................................................................3
1.1.

Hải miên và vi sinh vật liên kết hải miên ..................................................................
3

1.1.1.

Giới thiệu về hải miên...................................................................................................
3

1.1.2.

Vi sinh vật liên kết hải miên .........................................................................................
6

1.2.

Sơ lược về metagenomics ...........................................................................................
14

1.3.

Chất ức chế protease (PIs) .........................................................................................
19

1.3.1.

Sơ lược protease ............................................................................................................
19

1.3.2.

Chất ức chế protease và phân loại ................................................................................
20

1.3.3.

Cơ chế hoạt động của PIs..............................................................................................
25

1.3.4.

Ứng dụng của chất ức chế protease ..............................................................................
28

1.3.5.

Tình hình nghiên cứu PIs từ vi sịnh vật liên kết với hải miên trong và
ngoài nước.....................................................................................................................
31

1.4.

Hệ biểu hiện gen ngoại lai Escherichia coli và Pichia pastoris ................................
35

CHƯƠNG II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..........................
37
2.1.

Vật liệu nghiên cứu .....................................................................................................
37

2.1.1

Vật liệu….. ....................................................................................................................
37

2.1.2.

Đối tượng nghiên cứu….. .............................................................................................
39

2.1.3.

Hóa chất…. ...................................................................................................................
39

2.1.4.

Máy móc thiết bị ...........................................................................................................
39

2.1.5.

Dung dịch và môi trường sử dụng ................................................................................
40

2.2.

Phương pháp nghiên cứu ...........................................................................................
42

2.2.1.

Phương pháp tách DNA metagenome của VSV liên kết hải miên ...............................
43

iii

2.2.2.

Định danh hải miên bằng sinh học phân tử ..................................................................
43

2.2.3.

Phân tích dữ liệu metagenomics ...................................................................................
43

2.2.4.

Tổng hợp gen PIs từ CSDL metagenomics hải miên và thiết kế
plasmid mang gen PIs ...................................................................................................
47

2.2.5.

Các phương pháp sử dụng để thu hồi protein PIs tái tổ hợp trong hệ
biểu hiện E. coli (DE3) ................................................................................................
48

2.2.6.

Các phương pháp sử dụng để thu hồi protein PIs tái tổ hợp trong hệ
biểu hiện nấm men Pichia pastoris ..............................................................................
49

2.2.7.

Phương pháp xác định hoạt tính ức chế protease .........................................................
50

2.2.8.

Phương pháp xác định ảnh hưởng của một số yếu tố đến protein PIs
tái tổ hợp .......................................................................................................................
52

2.2.9.

Phân tích thống kê.........................................................................................................
52

CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .............................................................
53
3.1.

Thu thập mẫu hải miên ..............................................................................................
53

3.2.

Kết quả tách chiết DNA metagenome .......................................................................
54

3.2.1.

Tách chiết DNA metagenome của vi sinh vật liên kết hải miên biển
Quảng Trị ......................................................................................................................
54

3.2.2.

Định danh hải miên QT2 bằng sinh học phân tử ..........................................................
55

3.3.

Xây dựng cơ sở dữ liệu DNA metagenome của vi sinh vật liên kết
hải miên Spheciospongia vesparium QT2 biển Quảng Trị, Việt
Nam bằng tin sinh học ................................................................................................
56

3.3.1.

Lắp ráp reads của DNA metagenome ...........................................................................
56

3.3.2.

Kết quả dự đoán gen .....................................................................................................
58

3.3.3.

Kết quả chú giải và phân loại chức năng gen ...............................................................
60

3.3.4.

Đa dạng sinh học vi sinh vật liên kết hải miên Spheciospongia
vesparium QT2 biển Quảng Trị ...................................................................................
64

3.3.5.

Khai thác gen có hoạt tính ức chế protease (PIs) dựa trên cơ sở dữ
liệu (CSDL) metagenomics .........................................................................................
71

3.4.

Nghiên cứu biển hiện ức chế protease (PIs) trong hệ Escherichia
coli.................................................................................................................................
75

3.4.1.

Phân tích trình tự a xít amin và cây phân loại của protein PI-QT ................................
76

iv


3.4.2.

Thiết kế vectơ biểu hiện pET-32a(+) mang gen PIs .....................................................

78

3.4.3.

Biểu hiện gen PIs trong E. coli chủng BL21(DE3) ......................................................
79

3.4.4.

Nghiên cứu điều kiện thích hợp nhất để thu protein tái tổ hợp PI-QT
ở trạng thái tan cao nhất ................................................................................................
81

3.4.5.

Tinh sạch protein tái tổ hợp PI-QT trong E. coli và nhận diện bằng
khối phổ ........................................................................................................................
87

3.4.6

Thử hoạt tính ức chế của protein tái tổ hợp PI-QT với protease ..................................
89

3.5.

Nghiên cứu biển hiện ức chế protease (PIs) trong hệ nấm men
Pichia pastoris ..............................................................................................................
91

3.5.1.

Tạo plasmid pPIC9 mang gen PI-QT ...........................................................................
91

3.5.2.

Tạo dòng tế bào Pichia pastoris SMD1168 mang gen PI-QT .....................................
92

3.5.3.

Biểu hiện gen PI-QT trong nấm men P. pastoris SMD1168........................................
93

3.5.4.

Kết quả thử hoạt tính ức chế của protein PI-QT biểu hiện trong nấm
men ................................................................................................................................
96

3.5.5.

Kết quả phát hiện chất ức chế protease bằng điện di trên gel SDSPAGE có bổ sung cơ chất casein 0,1 % ........................................................................
97

3.5.6.

Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến sự biểu hiện P. pastoris SMD
1168 [pPIC9/PI-QT] .....................................................................................................

98

3.5.7.

Tinh sạch protein PI-QT tái tổ hợp biểu hiện trong nấm men P.
pastoris qua cột sắc ký ái lực Trypsin-Sepharore 4B ..................................................
104

3.5.8.

Ảnh hưởng của một số yếu tố đến protein PI-QT.........................................................
106

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ...................................................................................
112
DANH MỤC CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ..........................................................
113
TÀI LIỆU THAM KHẢO .........................................................................................
114

v


DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
ACN

Acetonitrile

Amp

Ampicillin

BLAST
bp, kb, kDa
CFU

Basic Local Alignment Search Tool
Base pair, Kilo base, Kilo dalton
Colony forming units

CSDL

Cơ sở dữ liệu

CTAB

Cetyl trimêtylamôni brômua

ĐC

Đối chứng

DN

Đà Nẵng

DNA

Deoxyribonucleic Acid

dNTP

Deoxyribonucleotide triphosphate

đtg

Đồng tác giả

DTT

Dithiothreitol

E. coli

Escherichia coli

EDTA

Ethylenediaminetetraacetic acid

EtBr
FA

Ethidium bromide
AntiFoam

HMA

High microbial abundance

IAA

3-Indolebutyric acid

IPTG

Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside

KH&CN
LB:
LMA

Khoa học và Công nghệ
Luria-Bertani
Low microbial abundance

mRNA

Messenger RNA

NCBI

National Center for Biotechnology Information

P. pastoris
PCR

Pichia pastoris
Polymerase Chain Reaction

PIs

Protein inhibitors

QT

Quảng Trị

vi


RNA

Ribonucleic acid

RNase

Ribonuclease

SCUBA

Self contained underwater breathing apparatus

SDS

Sodium dodecyl sulphate

TAE

Tris-Acetic-EDTA

Taq polymerase
TBS
TE

Polymerase Thermus aquarius
Tris-buffered saline
Tris- EDTA

TFA

Axit trifluoroacetic

TQ

Trung Quốc

VSV

Vi sinh vật

vii


DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.2.

Chất ức chế protease từ vi sinh vật liên kết hải miên……………

Bảng 2.1.

Thành phần của bản gel polyacryamide ....................................................................
42

Bảng 3.1.

Chất lượng của DNA tổng số tách từ các mẫu hải miên biển

32

Quảng trị ....................................................................................................................
54
Bảng 3.2.

Kết quả lắp ráp DNA metagenome của mẫu QT2 .....................................................
57

Bảng 3.3.

Kết quả dự đoán, cluster genes và kiểm tra tính toàn vẹn của gen

(mẫu QT2) .................................................................................................................
59
Bảng 3.4.

Tổng hợp kết quả chú giải chức năng gen (QT2) ......................................................
60

Bảng 3.5.

Phân loại các reads 16S rRNA của hải miên Spheciospongia

vesparium QT2 theo giới và ngành............................................................................
65
Bảng 3.6.

Phân loại các reads 16S rRNA của hải miên Spheciospongia

vesparium QT2 đến lớp và bộ....................................................................................
66
Bảng 3.7.

Phân loại các reads 16S rRNA của hải miên Spheciospongia

vesparium QT2 đến họ; chi........................................................................................
68
Bảng 3.8.

Kết quả sàng lọc các gen có hoạt tính protease inhibitor từ

CSDL metagenomics QT2 .........................................................................................
71
Bảng 3.9

Gen có hoạt tính sinh học mới (so với ở Việt Nam) .................................................
73

Bảng 3.10

So sánh hoạt tính ức chế protease của protein PI-QT tinh sạch

thu hồi biểu hiện trong P. pastoris SMD1168 và E. coli

BL21(DE3) ...............................................................................................................
106

viii


DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1.

Cấu trúc cơ thể hải miên và các mô .........................................................................
4

Hình 1.2.

Sơ đồ đại diện cho hải miên asconoid .....................................................................
4

Hình 1.3.

Vai trò của vi sinh vật với hải miên .........................................................................
8

Hình 1.4.

Ba trạng thái liên kết chung củ VSV và hải miên ...................................................
10

Hình 1.5.

Ba cách truyền và thu nhận VSV để thiết lập và duy trì các

cộng đồng VSV liên kết hải miên ............................................................................
11
Hình 1.6.

Ba chất ức chế protease có sẵn trên thị trường ........................................................
20

Hình 1.7.

Một vài họ PPI quan trọng .......................................................................................
23

Hình 1.8.

Ức chế cạnh tranh (Competitive inhibitor) ..............................................................
26

Hình 1.9.

Cơ chế ức chế không cạnh tranh kiểu thứ II ............................................................
27

Hình 1.10.

Serpin ức chế protease .............................................................................................
28

Hình 2.1.

Cấu trúc vectơ pET-32a(+) ......................................................................................
38

Hình 2.2.

Cấu trúc vectơ pPIC9...............................................................................................
39

Hình 3.1.

Điện di đồ sản phẩm tách DNA của vi sinh vật liên kết hải

miên biển Quảng Trị ................................................................................................
54
Hình 3.2.

Điện di đồ trên gel agarose 1 % ...............................................................................
56

Hình 3.3.

Kết quả tinh sạch dữ liệu QT2 .................................................................................
57

Hình 3.4.

Phân bố độ dài contig sau lắp ráp ............................................................................
58

Hình 3.5.

Phân bố độ dài gen...................................................................................................
59

Hình 3.6.

Phân loại chức năng gen trên cơ sở dữ liệu COG ...................................................
61

Hình 3.7.

Phân nhóm chức năng của enzyme trên cơ sở dữ liệu CAZy..................................
62

Hình 3.8.

Kết quả phân loại trên cơ sở dữ liệu KEGG ............................................................
63

Hình 3.9.

Điện di đồ sản phẩm PCR trên gel agarose 1,8 % ...................................................
64

Hình 3.10.

Phân loại vi sinh vật liên kết hải miên Spheciospongia

vesparium QT2 theo giới và ngành .........................................................................
66
Hình 3.11.

Phân loại vi sinh vật liên kết hải miên Spheciospongia

vesparium QT2 biển Quảng Trị theo chi .................................................................
69
Hình 3.12.

So sánh trình tự axít amin của protein PI-QT với các trình tự

tương đồng trên cơ sở dữ liệu NCBI .......................................................................
76
Hình 3.13.

Mối phát sinh quan hệ gen của protein PI-QT với các serpin

ix


khác. (B) Cấu trúc protein của PI-QT đã được dự đoán bằng
SWISS-MODEL. (C) Cấu trúc protein của PI-QT đã được dự

đoán bằng (PS)2-v2 .................................................................................................
77
Hình 3.14.

(A) –Gel agarose của vectơ cắt bằng EcoRI/NotI, (B) – Gel
agarose của plasmid tái tổ hợp ([pET-32a(+)/PI-QT]) được cắt

bằng enzyme EcoRI/ NotI........................................................................................
78
Hình 3.15.

A- Kết quả điện di PAGE 12,6 % kiểm tra E. coli

BL21(DE3)/[pET-32a(+)/PI-QT] biểu hiện ở 37 oC ...............................................
80
Hình 3.16.

Kiểm tra trạng thái của protein PI-QT biểu hiện .....................................................
80

Hình 3.17.

Protein PI-QT biểu hiện trong E. coli dưới các nồng độ IPTG

khác nhau .................................................................................................................
81
Hình 3.18.

Ảnh hưởng của nhiệt độ lên khả năng tạo protein PI-QT tan..................................
83

Hình 3.19.

(A)- Điện di SDS- PAGE 12,6 % kiểm tra khả năng tan của
protein ở OD600= 0,6 trước khi cảm ứng; (B)- Trạng thái
protein PI-QT (% tan) và hàm lượng protein tạo ra khi OD600

trước cảm ứng khác nhau.........................................................................................
84
Hình 3.20.

Sử dụng đệm đẩy cột imidazole 100 mM, 250 mM, 300 mM,

500 mM ....................................................................................................................
86
Hình 3.21.

Kết quả Western blot và kết quả loại bỏ đuôi dung hợp TRxHis-tag ra khỏi protein PI-QT bằng thrombin trên gel SDS-

PAGE 12.6 % ..........................................................................................................
88
Hình 3.22.

Thử nghiệm hoạt tính ức chế protein tái tổ hợp PI-QT đối với

Trypsin và Elastase trên đĩa thạch ...........................................................................
90
Hình 3.23.

Thử nghiệm hoạt tính ức chế protein tái tổ hợp PI-QT đối với

ɑ-Chymotrypsin trên đĩa thạch ................................................................................
90
Hình 3.24.

Điện di đồ trên gel agarose 1 % sản phẩm cắt mở vòng vectơ

pPIC9 (a) và cắt kiểm tra plasmid [pPIC9/PI-QT] ..................................................
91
Hình 3.25.

Điện di đồ trên gel agarose 1% sản phẩm cắt kiểm tra plasmid

pPIC9/PI-QT và sản phẩm PCR bằng cặp mồi AOX1 ............................................
92
Hình 3.26.

Kết quả kiểm tra kiểu hình và kiểu gen nấm men mang gen PI-

QT ............................................................................................................................
92

x


Hình 3.27.

Đường cong sinh trưởng của các dòng P. pastoris tái tổ hợp

theo thời gian ...........................................................................................................
94
Hình 3.28.

Điện di đồ protein PI-QT biểu hiện trong P. pastoris

SMD1168 [pPIC9/PI-QT] .......................................................................................

95
Hình 3.29.

Đồ thị tương quan giữa hàm lượng protein ngoại lai tạo ra với

mật độ tế bào nấm men tái tổ hợp............................................................................
95
Hình 3.30.

Định tính khả năng ức chế protease của protein biểu hiện ......................................
96

Hình 3.31.

Kết quả thử hoạt tính ức chế protease của dịch chiết thô

P. pastoris SMD1168 không mang gen PI-QT .......................................................
97
Hình 3.32.

Điện di SDS-PAGE 12,6 % đồng trùng hợp với cơ chất casein

0.1 % và xử lý bằng enzyme trypsin .......................................................................
98
Hình 3.33.

Khảo sát ảnh hưởng của môi trường đến khả năng tạo protein

PI-QT (mg/L) trong nấm men P. pastoris ...............................................................
99

Hình 3.34.

Khảo sát nhiệt độ biểu hiện của P. pastoris SMD 1168

[pPIC9/PI-QT] .........................................................................................................
100
Hình 3.35.

Khảo sát pH trong quá trình biểu hiện P. pastoris SMD

1168[pPIC9/PI-QT] .................................................................................................
102
Hình 3.36.

Nồng độ methanol cảm ứng trong biểu hiện P. pastoris tái tổ

hợp ...........................................................................................................................
103
Hình 3.37.

Điện di SDS – PAGE 12,6 % protein PI-QT qua màng cut off

30 kDa và qua cột sắc ký ái lực Trypsin-Sepharose 4B ..........................................
105
Hình 3.38.

Hoạt tính ức chế protease của protein PI-QT tinh sạch biểu

hiện trong nấm men P. pastoris SMD1168 .............................................................
105

Hình 3.39.

Biểu đồ ảnh hưởng của nhiệt độ đến hợp chất PI-QT .............................................
106

Hình 3.40.

Biểu đồ ảnh hưởng của pH đến hợp chất PI-QT .....................................................
107

xi


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC
VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
-----------------------------

TRẦN THỊ HỒNG

SÀNG LỌC VÀ BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA PROTEIN ỨC CHẾ
PROTEASE CỦA VI SINH VẬT LIÊN KẾT HẢI MIÊN Spheciospongia
vesparium THU NHẬN TẠI VÙNG BIỂN MIỀN TRUNG , VIỆT NAM

LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

HÀ NỘI, 2020

1
MỞ ĐẦU
Chất ức chế protease (PI), một tác nhân có thể làm cho protease mất khả
năng thủy phân protein thành peptide được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực đặc biệt
là trong y dược như: điều trị kháng phân hủy sợi huyết (antifibrinolytic); ức chế
angiotensin trong điều trị tăng huyết áp; ngăn chặn sự nhân lên của một số virus
(HIV, viêm gan C…. Ví dụ về các thuốc ức chế protease là saquinavir (tên thương
hiệu: Invirase) và ritonavir (tên thương hiệu: Novir) được sử dụng chủ yếu trong
điều trị HIV/AIDS. Chúng được dùng như một phần của một loại cocktail đa thuốc
và đã được chứng minh là có khả năng làm giảm đáng kể mức độ virus HIV trong
máu.
Vì vậy, việc sàng lọc và phát hiện các phân tử protein mới có hoạt tính ức
chế đặc hiệu các protease đích khác nhau, liên quan đến các loại bệnh là một hướng
nghiên cứu được quan tâm hiện nay. Hải miên và các vi sinh vật liên kết với hải
miên được xem là một nguồn để phát hiện và khai thác các hợp chất có hoạt tính
sinh học mới phục vụ chế tạo thuốc, các peptide có hoạt tính ức chế protease là một
trong số đó. Tuy nhiên, phần lớn các vi sinh vật liên kết hải miên thuộc loại không
nuôi cấy được nên hạn chế khả năng khai thác chúng. Nhờ kỹ thuật metagenomic,
với sự hỗ trợ của thiết bị giải trình tự gen hiệu năng cao và công cụ tin sinh cho
phép phát hiện các gen, cụm gen có chức năng mã hóa cho các PI, cho phép khai
thác được các PI từ các vi sinh vật chưa nuôi cấy được.
Đến nay tại Việt Nam cũng đã có nhiều nghiên cứu về hải miên, từ việc phân
lập vi sinh vật trên hải miên, đến tách chiết các chất có hoạt tính sinh học từ nhóm
vi sinh vật này. Tuy nhiên, vẫn còn chưa có nghiên cứu nào sử dụng công cụ
metagenomics và công nghệ giải trình tự gen thế hệ mới để phát hiện, sàng lọc các
gen có hoạt tính sinh học, trong đó có hoạt tính ức chế protease và biểu hiện các gen
này trong hệ Escherichia coli và nấm men Pichia pastoris.
Chính vì vậy, chúng tôi thực hiện luận án với tên đề tài: “Sàng lọc và biểu

hiện gen mã hóa protein ức chế protease của vi sinh vật liên kết hải miên
Spheciospongia vesparium thu nhận tại vùng biển Miền Trung, Việt Nam”.


2
Mục tiêu của đề tài luận án
Phát hiện và sàng lọc gen liên quan đến sinh tổng hợp các chất có hoạt tính ức
chế protease từ vi sinh vật liên kết hải miên thu nhận từ biển Miền Trung, Việt Nam
bằng phương pháp metagenomics. Sau đó biểu hiện gen chọn lọc in vitro và xác
định hoạt tính.
Nội dung nghiên cứu
1. Tách DNA của vi sinh vật liên kết với hải miên, xác định nồng độ DNA và độ
tinh sạch, lựa chọn mẫu giải trình tự metagenomics.
2. Phân tích dữ liệu metagenomics mẫu đã giải trình tự bằng các công cụ tin sinh
học. Đánh giá đa dạng sinh học của vi sinh vật liên kết với hải miên. Từ CSDL
metagenomics khai thác gen liên quan đến sinh tổng hợp các chất có hoạt tính ức
chế protease.
3. Nghiên cứu biểu hiện gen mã hóa protein ức chế protease trong hệ biểu hiện
Escherichia coli và hệ biểu hiện nấm men Pichia pasroris.
4. Đánh giá hoạt tính ức chế protease của protein tái tổ hợp.
Những đóng góp mới của luận án
1. Đã xây dựng được cơ sở dữ liệu DNA metagenome của vi sinh vật liên kết hải
miên của mẫu hải miên QT2 thu nhận tại vùng biển Quảng Trị (Miền Trung),
Việt Nam. Cơ sở dữ liệu thu được có ý nghĩa về mặt khoa học góp phần bảo tồn
nguồn gen vi sinh vật biển Việt Nam và có tiềm năng khai thác nguồn gen trên để
ứng dụng vào thực tiễn.
2. Thu nhận được gen mới PI-QT mã hóa cho PIs và biểu hiện thành công ở E. coli
và P. pastoris. Hoạt tính ức chế protease của protein biểu hiện đã được đánh giá
và kết quả thu được cho thấy protein PI-QT tái tổ hợp từ E. coli có hoạt tính ức
chế trypsin, ức chế ɑ-chymotrypsin và protein từ P. pastoris thể hiện hoạt tính ức

chế trypsin, ɑ-chymotrypsin và thermolysin.


3

CHƯƠNG I. TỔNG QUAN
1.1. Hải miên và vi sinh vật liên kết hải miên
1.1.1. Giới thiệu về hải miên
Hải miên là một ngành động vật đa bào nguyên thủy, có cấu trúc tế bào tách
biệt và là nhóm động vật sống bám, tuy nhiên một số loài có khả năng vận động nhờ
vào tế bào chất hay roi. Hải miên có thể sống trong các loại môi trường khác nhau ở
biển và trong tất cả các vùng khí hậu. Từ các vùng cực và ôn đới, đến hệ sinh thái
rạn san hô nhiệt đới và cận nhiệt đới. Tính đến năm 2019, khoảng 9.125 loài hải
miên nói chung được chấp nhận có trong danh sách của Cơ sở dữ liệu hải miên thế
giới (Http://www.marinespecies.org). Vì vậy, các quần thể hải miên có sự khác biệt
về sự đa dạng, sự phong phú và mật độ. Các loài hải miên được chia thành 4 lớp:
Calcarea (hải miên đá vôi), Demospongia (demosponges), Hexactinellida (hải miên
thủy tinh), và Homoscleromorpha. Lớp lớn nhất là Demospongia, gồm khoảng 83,4
% tất cả các loài được biết. Trong số các loài hải miên được biết đến, chỉ có khoảng
250 loài là sống trong nước ngọt (van Soest et al., 2012).
Hải miên có các hình dạng khác nhau, từ hình cầu, hình ống, hình bình hoặc
phân nhánh và kích thước cũng khác nhau, từ một vài milimet (hải miên Cliona
celata), đến vài mét (hải miên Xestospongia muta). Phần lớn hải miên là động vật
ăn lọc, trừ các loài ăn thịt cư trú ở môi trường biển sâu nghèo dinh dưỡng (Lee et
al., 2012). Hình dáng cơ thể chung của loài ăn lọc được chuyên môn hóa cho lọc
nước để lấy dinh dưỡng, hô hấp và bài tiết. Phụ thuộc vào thiết kế của hệ thống lọc
nước, hải miên được chia thành: (1) Asconoid, khi cơ thể hải miên có hình trụ rỗng,
bề mặt có các lỗ nhỏ; (2) Syconoid, khi bề mặt cơ thể hải miên có xen kẽ các túi
chui vào trong và lồi ra ngoài, làm tăng tỉ lệ giữa diện tích và thể tích; hoặc (3)
Leuconoid, khi cơ thể hải miên được tạo thành bởi các kênh dẫn nước bao gồm rất

nhiều các khoang hình cầu nối với nhau bởi các ống giống như mao mạch (Hình 1.1
và 1.2) (Cavalcanti & Klautau., 2011; Webster & Thomas., 2016).


4

Hình 1.1. Cấu trúc cơ thể hải miên và các mô.
(Nguồn: Cavalcanti & Klautau., 2011).
(A): Asconoid; (B): Syconoid; (C): Leuconoid. Mô liên kết: mesophyl (màu xám),
lớp bề mặt (pinacoderm) và một lớp tế bào bên trong hình thành bởi các tế bào hình
roi (choanoderm: màu đen).

Hình 1.2. Sơ đồ đại diện cho hải miên Asconoid.
(Nguồn: Webster &Thomas., 2016).
Nước biển đi vào hải miên thông qua các lỗ nhỏ (ostia) vào lớp bề mặt
(pinacoderm). Các tế bào roi choanocyte được sắp xếp thành vòng tròn lót hệ
chuyển nước của hải miên và chịu trách nhiệm di chuyển nước qua hải miên cho
đến khi thải ra qua các lỗ thoát nước (osculum). Vi sinh vật môi trường là các tế bào
màu xanh, trong khi mật độ cộng đồng vi sinh vật liên kết có trong mô liên kết màu
đỏ.


5
Cấu trúc cơ thể hải miên được giữ vững bởi mô liên kết và các loại tế bào khác
nhau. Các thành phần khung riêng biệt làm cho hải miên có cấu trúc toàn vẹn được
cấu tạo từ các gai (spicules), canxi (calcareous) hoặc silic (siliceous), chitin hoặc sợi
collagen (collagenous spongin) (Hentschel et al., 2012).
Thành phần hóa học, sự khác biệt cấu trúc và kích thước gai là các đặc điểm
hình thái quan trọng để phân loại hải miên. Lớp Demospongia và
Homoscleromorpha

có sợi

collagen hoặc các

gai hoặc

cả

hai.

Lớp

Homoscleromorpha cũng có đại diện không có gai nhưng có sợi collagen. Lớp hải
miên đá vôi và hải miên thủy tinh có canxi hoặc silic, tương ứng (van Soest et al.,
2012).
Là loài ăn lọc, hải miên xử lý hàng trăm lít nước biển một ngày, vì vậy thức
ăn của chúng bao gồm VSV, sinh vật nhân chuẩn nhỏ, các hợp chất hữu cơ nhỏ...
(de Goeij et al., 2013). Thức ăn được tế bào roi và lớp bề mặt của hải miên bắt giữ,
và chuyển đến các tế bào mô liên kết và tiêu hóa bởi tế bào khởi thủy
(archaeocytes). Tiếp theo, các sản phẩm của thức ăn đã được tiêu hóa được phân bố
đến các tế bào mô liên kết khác và cuối cùng các thứ không được tiêu hóa và sản
phẩm bài tiết được trục xuất ra khỏi hải miên thông qua các kênh thở ra (exhalant)
hoặc mặt ngoài qua ngoại tế bào (exocytosis) (Maldonado et al., 2012).
Hải miên có sự đa dạng cao và là một thành phần quan trọng của quần thể
sinh vật đáy biển, từ cửa sông, bờ biển đến biển sâu. Nhóm này là một trong những
nguồn các hợp chất hoạt tính sinh học từ biển nổi bật nhất, với khoảng 4851 hợp
chất (năm 2014), đóng góp gần 30 % tổng số các hợp chất tự nhiên từ biển được
phát hiện. Trong 10 năm từ 2001 đến 2010, hơn 2400 các sản phẩm tự nhiên mới
được phát hiện từ 542 chi và 671 loài hải miên (Mehbub et al., 2014). Rất nhiều hợp

chất nhận được từ hải miên, gồm terpenoids, alkaloids, peptides, và polyketides...
(Tung et al., 2009; Utkina & Denisenko., 2011; Kalinin et al., 2012) và chúng có
nhiều ứng dụng tiềm năng trong công nghệ sinh học, được sử dụng như các chất
kháng sinh, kháng ung thư, kháng virus, chống viêm và chống độc (Hirashima et
al., 2010; Joseph & Sujatha., 2011; Li et al., 2013; Perdicaris et al., 2013). Do sự
tương đồng cao của một số hợp chất nhận được từ hải miên với các chất trao đổi thứ
cấp của VSV đã biết, người ta tin rằng ít nhất một số chất hoạt tính sinh học là do


6
VSV liên kết sản sinh. Việc định vị các chất trao đổi thứ cấp trong các vi sinh vật
cộng sinh đã ủng hộ giả thiết này (Wilson et al., 2014).
1.1.2. Vi sinh vật liên kết hải miên
Vi sinh vật liên kết hải miên được tìm thấy cả trong và ngoài tế bào hải miên,
nằm trong mô liên kết hoặc trong lớp ngoài của hải miên. Các vi khuẩn và cổ khuẩn
gồm ngành Thaumarchaeota và các ngành vi khuẩn Acidobacteria, Actinobacteria,
Bacteroidetes,

Chloroflexi,

Cyanobacteria,

Firmicutes,

Gemmatimonadetes,

Nitrospirae, Proteobacteria (Alpha-, Beta-, Gamma-, và Delta-), Planctomycetes,
Verrucomicrobia, và Poribacteria (Hentschel et al., 2012). Từ nghiên cứu giải trình
tự thông lượng cao về quần xã VSV liên kết hải miên, số lượng ngành VSV trong
một hải miên tăng từ 23 ngành (Webster et al., 2010) lên đến 47 ngành (Reveillaud

et al., 2014). Theo số liệu mới nhất gần đây, hơn 60 ngành VSV đã tìm được từ các
mẫu hải miên biển theo phân loại của Silva và hơn 70 ngành theo phân loại của
Greengenes (Moitinho-Silva et al., 2017). Nhìn chung, VSV liên kết hải miên có
các loại tương tác khác nhau, có lợi hoặc có hại, từ việc là nguồn thức ăn, ký sinh,
gây bệnh, đến hỗ sinh và hội sinh (Hình 1.3) (Taylor et al., 2007; Lafi et al., 2009).
Vi khuẩn liên kết hải miên được chia ra thành các nhóm: vi khuẩn quang
hợp, vi khuẩn dị dưỡng, cổ khuẩn oxi hóa ammonia. Ba loại liên kết rộng rãi của vi
khuẩn với hải miên gồm: (1) Lượng lớn các quần thể vi khuẩn đặc hiệu hải miên
trong mô liên kết hải miên; (2) Các quần thể nhỏ vi khuẩn bên trong tế bào riêng
biệt; (3) Các quần thể vi khuẩn không đặc hiệu giống với các quần thể trong môi
trường nước xung quanh (Mares et al., 2017).
VSV nhân chuẩn là một trong những thành phần quan trọng và đa dạng của
các hệ sinh thái biển; tuy nhiên, chúng được đánh giá thấp so với các VSV khác.
Trong hải miên, chủ yếu là thấy nấm men. Trái ngược với các cộng đồng vi khuẩn
liên kết với hải miên, các nghiên cứu về sự liên kết giữa nấm và hải miên vẫn còn
rất khiêm tốn (Rodríguez-Marconi et al., 2015; Naim et al., 2017). Các sinh vật
nhân chuẩn khác như "SAR" - một nhánh bao gồm Stramenopiles, Alveolates và
Rhizaria cũng đã được phát hiện trong hải miên (Burki el al., 2007; Webster et al.,
2004; Sipkema & Blanch., 2009). Tuy nhiên, cộng đồng các VSV nhân chuẩn


7
dường như không cộng sinh chặt chẽ với hải miên (Rodríguez-Marconi et al.,
2015).
Vai trò của vi sinh vật với hải miên
VSV liên kết hải miên có vai trò khác nhau đối với vật chủ (Hentschel et al.,
2012; Taylor et al., 2007). Ví dụ, vật chủ hải miên có thể nhận được lợi ích từ VSV
liên kết ở dạng chất trao đổi thứ cấp, sinh tổng hợp vitamin (Siegl et al., 2011), loại
bỏ chất thải trao đổi chất, ổn định khung hải miên hoặc ngay cả bảo vệ hải miên
khỏi tia UV. Các chất trao đổi thứ cấp của VSV có thể là những nhân tố quan trọng

trong các cơ chế bảo vệ hóa học của hải miên chống lại các loại động vật ăn thịt hải
miên, các nguồn bệnh hoặc động vật không cuống đáy cạnh tranh không gian (ví dụ
san hô) (Pawlik., 2011).
Rất nhiều VSV liên kết hải miên tham gia vào các chu trình dinh dưỡng phức
tạp giữa hải miên và môi trường. Ví dụ, quá trình chuyển hóa quang tự dưỡng
(photoautotrophic) và hóa tự dưỡng (chemoautotrophic) của cacbon vô cơ và hữu
cơ hòa tan như một phần của chu trình cacbon ở hải miên (Hentschel et al., 2012;
Easson & Thacker., 2014; Maldonado et al., 2012). Một số VSV cộng sinh có thể
có chức năng quan trọng trong chu trình nitơ của hải miên, và tham gia vào quá
trình chuyển hóa nitơ như cố định nitơ, nitrit hóa, oxy hóa yếm khí ammonia và
phản nitrit hóa (Maldonado et al., 2012; Fan et al., 2012). Rất nhiều loài hải miên
nhiệt đới có vi khuẩn lam (cyanobacteria) liên kết (ví dụ: chi Synechococcus)
(Bayer et al., 2014a) cố định nitơ thành ammonia cho hải miên. Hải miên cũng
được lợi khi được cung cấp dinh dưỡng như phosphate hữu cơ hay glycerol. Có đến
50 % nhu cầu năng lượng và 80 % quỹ cacbon của hải miên có thể được vi khuẩn
lam liên kết cung cấp (Taylor et al., 2007; Thoms & Schupp., 2007). Hải miên vùng
lạnh, ôn đới và nhiệt đới (ví dụ: Phakellia ventilabrum, Geodia barretti, hoặc
Inflatella pellicula), có các VSV liên kết như cổ khuẩn oxy hóa ammonia (ngành
Thaumarchaeota với chi Nitrosopumilus hoặc Cenarchaeum), vi khuẩn oxy hóa
ammonia (ngành Planctomycetes, bộ Planctomycetales, lớp Betaproteobacteria với
chi Nitrosomonas), và vi khuẩn oxy hóa nitrite (ngành Nitrospirae, chi Nitrospira)
(Radax et al., 2012).


8
Vai trò

VSV nhân sơ
(Prokaryotes)

Liên kết

VSV nhân
chuẩn
(Eukaryotes)

Khử
sulphate

Oxy hóa
nitơ

Vi khuẩn
(Cyanobacteria,
Actinobacteria,
Proteobacteria)

Vận chuyển
dinh dường

Hải
miên
Polychaetes

Tảo đơn bào
2 roi
Dinoflagellat
e)

…

Oxy hóa
ammonia

Tảo (algae)

Cổ khuẩn
(Archae)

Cỏ
(Mangroves)

Vai trò

Cố định
nitơ,
bảo vệ
Nguồn
thức ăn
Tăng
tốc độ
sinh
trưởng
Giảm
nhiễm
bệnh

Hình 1.3.Vai trò của vi sinh vật với hải miên
(Nguồn: Lafi et al., 2009)
Sự phong phú, đa dạng và đặc hiệu của vi sinh vật liên kết hải miên
VSV liên kết hải miên thường cư trú ở vùng ngoại bào, nơi chúng tập trung

xung quanh các tế bào roi, các vòng của các tế bào roi tạo thành hệ thống dẫn nước
của hải miên (Hình 1.2). Dựa vào mật độ VSV liên kết, hải miên được chia thành
loài có mật độ liên kết cao (high microbial abundance: HMA), có tới 109 tế bào/cm3
mô hải miên, và loài có mật độ VSV liên kết thấp (low microbial abundance: LMA)
với 105-106 vi khuẩn/cm3 mô và vùng mô liên kết chỉ có rất ít VSV (Gloeckner et
al., 2014).
Hải miên được biết liên kết với hơn 60 ngành VSV khác nhau (Webster et
al., 2010; Schmitt et al., 2012; Reveillaud et al, 2014; Rodríguez-Marconiet al,
2015; Moitinho-Silva et al, 2017). Mức độ phong phú và đa dạng của các cộng
đồng liên kết khác nhau nhiều giữa các loài hải miên, từ một vài đơn vị phân loại


9
riêng biệt đến hàng trăm VSV cộng sinh khác nhau về mặt di truyền cho một mẫu
hải miên (Webster et al., 2010; Reveillaud et al, 2014; Lee et al., 2011). Những
khảo sát rộng rãi về phát sinh loài cho thấy những VSV liên kết hải miên chiếm ưu
thế nằm trong các đơn vị phân loại Gamma- và Alphaproteobacteria,
Actinobacteria,

Chloroflexi,

Nitrospirae,

Cyanobacteria,Poribacteria

và

Thaumarchaea (Hentschel et al., 2012).
Rất nhiều nghiên cứu cho thấy các cộng đồng VSV hải miên phần lớn đặc
hiệu vật chủ (Webster et al., 2010; Schmitt et al., 2012; Lee et al., 2011; Simister et

al., 2012) và trong cùng loài, các cộng đồng VSV có xu hướng ổn định cao không
phụ thuộc vào địa sinh học và các điều kiện môi trường khác nhau (Webster &
Taylor., 2012; Erwin et al., 2012). Những cụm trình tự đặc hiệu hải miên này là các
nhánh đơn phát sinh (monophyletic clades), chứa ít nhất 3 trình tự có nguồn gốc từ
hải miên (Hentschel et al., 2002). Đáng chú ý là gần đây việc lập bản đồ phả hệ của
12 triệu trình tự 16S rRNA ngắn từ Dự án giải trình tự thông lượng cao của Tổng
cục điều tra Quốc tế về VSV biển (International Census of Marine Microbes ICoMM; Http://icomm.mbl.edu/) đối với 173 cụm trình tự đặc hiệu hải miên của
Simisterel al. (2012) cho thấy, rất nhiều VSV đặc hiệu hải miên cũng có mặt trong
các hệ sinh thái biển khác, nhưng với số lượng cực ít. Webster et al. (2010) sử dụng
giải trình tự thông lượng cao 16S rRNA để nghiên cứu đa dạng và sự phong phú của
quần xã VSV liên kết 3 loài hải miên (Ianthella basta, Ircinia ramosa và
Rhopaloeides odorabile) từ biển Đông Bắc, Australia. Kết quả nhận được cho thấy
đơn vị phân loại vi khuẩn có đa dạng ngành cao (n=23) trong 3 loài hải miên nghiên
cứu. Các trình tự nhận được rơi vào 33 cụm đặc hiệu hải miên, với hầu như một nửa
số cụm chỉ liên quan đến vật chủ. Bằng cách ứng dụng 16S rRNA giải trình tự
thông lượng cao cho 32 loài hải miên (˃ 90 mẫu vật) từ 8 địa điểm của vùng nhiệt
đới và ôn đới phân bố trên toàn cầu, Schmitt el al. (2012) mô tả 3 trạng thái chung
của các cộng đồng VSV liên kết hải miên: (1) cộng đồng lõi nhỏ; (2) cộng đồng bất
định và (3) nhóm lớn đặc hiệu hải miên (Hình 1.4).
Các cộng đồng VSV liên kết hải miên dường như tương đối ổn định và có
thay đổi theo vật chủ hoặc đặc hiệu loài theo không gian, thời gian. Những nghiên
cứu luân chuyển loài của các cộng đồng VSV liên kết hải miên theo thời gian


10
(Hardoim & Costa., 2014), không gian (Reveillaud et al., 2014) cũng như các môi
trường khác nhau (Cardenas et al., 2014) nhấn mạnh rằng các cấu trúc cộng đồng
VSV nói chung là đặc hiệu loài. Ngược lại, sự khác biệt theo chiều dọc (độ sâu) và
chiều ngang (địa sinh học) có vẻ chỉ có ảnh hưởng nhỏ lên các kiểu cộng đồng.
Nhưng ảnh hưởng của gradients môi trường tự nhiên cục bộ (ví dụ, độ sâu, mật độ

dinh dưỡng, độ mặn hoặc gradients ánh sáng) hoặc tổ hợp các nhân tố lên quần xã
VSV hải miên được nghiên cứu ít toàn diện hơn, chỉ có một vài nghiên cứu đặc biệt
tập trung vào các ảnh hưởng cụ thể này (Cardenas et al., 2014).

Hình 1.4. Ba trạng thái liên kết chung của VSV và hải miên
(Nguồn: Schmitt et al., 2012).
Quá trình thu nhận vi sinh vật của hải miên
Hải miên có thể sinh sản hữu tính (sản sinh chồi mầm) hoặc vô tính (bằng
cách phân đoạn, mọc chồi), tất cả đều có thể truyền VSV cộng sinh hiệu quả từ hải
miên bố mẹ cho thế hệ sau (Webster & Thomas., 2016). Việc truyền VSV từ thế hệ
này sang thế hệ khác được gọi là “sự truyền dọc” và được cho là một cơ chế tiến
hóa cổ đại để duy trì VSV cộng sinh trong hải miên HMA. Kịch bản tiến hóa này
được củng cố khi các cụm phát sinh loài VSV đặc hiệu hải miên được tìm thấy
trong các loài hải miên có quan hệ họ hàng xa và cách xa về mặt địa lý. Ngoài ra,
nhiều loài VSV đặc hiệu hải miên không tìm được trong nước biển (Hentschel et
al., 2012; Simister et al., 2012).


11
Một phương thức khác để thu nhận vi sinh vật vào hải miên thông qua việc
làm giàu đặc hiệu hoặc không đặc hiệu từ môi trường. Phương thức này còn được
gọi là “truyền ngang”. Bằng cách “truyền ngang” quần xã VSV đặc hiệu hải miên
được làm giàu một cách không đặc hiệu, ví dụ qua dinh dưỡng như thức ăn vi khuẩn
từ nước biển, hoặc ngẫu nhiên hấp thu qua vết thương vào biểu bì hải miên. Về mặt
lý thuyết, làm giàu đặc hiệu VSV trong truyền ngang gồm một vài cơ chế: (1) hấp
thụ chủ động VSV đặc hiệu thông qua việc nhận biết VSV cụ thể bởi hệ miễn dịch
của hải miên; (2) làm giàu loại trừ (subtractive enrichment), là tích lũy VSV kháng
được sự thực bào (Taylor et al., 2007). Trong những trường hợp này, VSV môi
trường mà hải miên thu được cần phải cạnh tranh thắng các loài định cư tiềm năng
để tạo ra các cộng đồng liên kết hải miên ưu thế.

Có khả năng nhất là cả 2 phương thức “truyền dọc” và “truyền ngang” đồng
thời có trong hải miên. Mỗi chiến lược đều có lợi ích và phí tổn nhất định. Ví dụ,
trong trường hợp “truyền dọc”, thế hệ con cháu chắc chắn nhận được VSV cộng
sinh cần thiết cho vật chủ trực tiếp từ bố mẹ, nhưng cũng có thể làm giảm genome
cộng sinh hoặc đánh mất khả năng trao đổi chất ở thế hệ tiếp theo, và điều này có
thể có hại trong trường hợp hải miên bị phân tán đến môi trường không thuận lợi
cho VSV liên kết. Trong khi chọn lọc tự nhiên dường như có lợi cho vật chủ khi có
được VSV cộng sinh từ môi trường tự nhiên, nhưng cũng đồng thời có hại bởi có
thể các nguồn bệnh có cơ hội nhiễm vào hải miên (Hentschel et al., 2012).

Hình 1.5. Ba cách truyền và thu nhận VSV để thiết lập và duy trì các cộng
đồng VSV liên kết hải miên
(Nguồn: Hentschel et al., 2012).