Sàng lọc và biểu hiện gen mã hóa protein ức chế protease của vi sinh vật liên kết hải miên spheciospongia vesparium thu nhận tại vùng biển miền trung, việt nam (tt)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC
VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
-----------------------------

Trần Thị Hồng
SÀNG LỌC VÀ BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA PROTEIN ỨC
CHẾ PROTEASE CỦA VI SINH VẬT LIÊN KẾT HẢI MIÊN
Spheciospongia vesparium THU NHẬN TẠI VÙNG BIỂN MIỀN
TRUNG, VIỆT NAM

Chuyên ngành: Công nghệ sinh học
Mã số: 9420201

TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Hà Nội - 2020


Công trình được hoàn thành tại: Học viện Khoa học và Công nghệ Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

Người hướng dẫn khoa học 1: PGS.TS.Phạm Việt Cường
Người hướng dẫn khoa học 2: PGS.TS.Nguyễn Thị Kim Cúc

Phản biện 1: …
Phản biện 2: …
Phản biện 3: …

Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng đánh giá luận án tiến sĩ cấp
Học viện, họp tại Học viện Khoa học và Công nghệ - Viện Hàn lâm
Khoa học và Công nghệ Việt Nam vào hồi … giờ ..’, ngày … tháng
… năm 2019

Có thể tìm hiểu luận án tại:
- Thư viện Học viện Khoa học và Công nghệ
- Thư viện Quốc gia Việt Nam


DANH MỤC CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ
1.

2.

3.

4.

5.

Nguyen Thi Kim Cuc, Ton That Huu Dat, Tran Thi Hong, Pham
Viet Cuong, Phylogenetic diversity of microorganisms asscociated
with three marine sponges from Mien Trung sea of Viet Nam.
Journal of Science and Technology, 2017, 55(2), 168-177.
Tran Thi Hong, Ton That Huu Dat, Pham Viet Cuong, Nguyen
Thi Kim Cuc, Protease inhibitors from marine sponge and spongeassociated microorganisms. Journal of Science and Technology
(VAST), 2018, 56(4), 405-423.
Trần Thị Hồng, Nguyễn Thị Kim Cúc, Tôn Thất Hữu Đạt, Phạm
Việt Cường, Sàng lọc các vi khuẩn ức chế protease liên kết với hải

miên Đà Nẵng, Việt Nam. Tuyển tập báo cáo hội nghị khoa học
công nghệ sinh học toàn quốc, 2018, 743-748. Nhà xuất bản Khoa
học tự nhiên và Công nghệ. ISBN: 978-604-913-759-4.
Trần Thị Hồng, Phạm Việt Cường, Nguyễn Thị Kim Cúc, Sàng
lọc gen ức chế protease từ metagenomics của vi sinh vật liên kết
với hải miên biển Quảng Trị (Việt Nam). Academia Journal of
Biology, 2019, 41(2), 49-60.
Tran Thi Hong, Ton That Huu Dat, Nguyen Phuong Hoa, Tran
Thi Kim Dung, Vu Thi Thu Huyen, Le Minh Bui, Nguyen Thi Kim
Cuc, Pham Viet Cuong, Expression and characterization of a new
serine protease inhibitory protein in Escherichia coli. Biomedical
research and therapy, 2020, 7(2): 3633-3644.


1
MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết của luận án
Chất ức chế protease (PI), một tác nhân có thể làm cho protease
mất khả năng thủy phân protein thành peptide được ứng dụng trong
nhiều lĩnh vực đặc biệt là trong y dược như: điều trị kháng phân hủy sợi
huyết (antifibrinolytic); ức chế angiotensin trong điều trị tăng huyết áp;
ngăn chặn sự nhân lên của một số virus (HIV, viêm gan C…. Ví dụ về
các thuốc ức chế protease là saquinavir (tên thương hiệu: Invirase) và
ritonavir (tên thương hiệu: Novir) được sử dụng chủ yếu trong điều trị
HIV/AIDS. Chúng được dùng như một phần của một loại cocktail đa
thuốc và đã được chứng minh là có khả năng làm giảm đáng kể mức độ
virus HIV trong máu.
Vì vậy, việc sàng lọc và phát hiện các phân tử protein mới có
hoạt tính ức chế đặc hiệu các protease đích khác nhau, liên quan đến
các loại bệnh là một hướng nghiên cứu được quan tâm hiện nay. Hải

miên và các vi sinh vật liên kết với hải miên được xem là một nguồn để
phát hiện và khai thác các hợp chất có hoạt tính sinh học mới phục vụ
chế tạo thuốc, các peptide có hoạt tính ức chế protease là một trong số
đó. Tuy nhiên, phần lớn các vi sinh vật liên kết hải miên thuộc loại
không nuôi cấy được nên hạn chế khả năng khai thác chúng. Nhờ kỹ
thuật metagenomic, với sự hỗ trợ của thiết bị giải trình tự gen hiệu năng
cao và công cụ tin sinh cho phép phát hiện các gen, cụm gen có chức
năng mã hóa cho các PI, cho phép khai thác được các PI từ các vi sinh
vật chưa nuôi cấy được.
Đến nay tại Việt Nam cũng đã có nhiều nghiên cứu về hải
miên, từ việc phân lập vi sinh vật trên hải miên, đến tách chiết các chất
có hoạt tính sinh học từ nhóm vi sinh vật này. Tuy nhiên, vẫn còn chưa
có nghiên cứu nào sử dụng công cụ metagenomics và công nghệ giải
trình tự gen thế hệ mới để phát hiện, sàng lọc các gen có hoạt tính sinh
học, trong đó có hoạt tính ức chế protease và biểu hiện các gen này
trong hệ Escherichia coli và nấm men Pichia pastoris.


2
Chính vì vậy, chúng tôi thực hiện luận án với tên đề tài: “Sàng
lọc và biểu hiện gen mã hóa protein ức chế protease của vi sinh vật
liên kết hải miên Spheciospongia vesparium thu nhận tại vùng biển
Miền Trung, Việt Nam”.
2. Mục tiêu nghiên cứu của luận án
Phát hiện và sàng lọc các gen liên quan đến sinh tổng hợp các
chất có hoạt tính ức chế protease từ vi sinh vật liên kết hải miên thu
nhận từ biển Miền Trung, Việt Nam bằng phương pháp metagenomics.
Sau đó biểu hiện gen chọn lọc in vitro và xác định hoạt tính.
2. Các nội dung nghiên cứu chính của luận án
 Tách DNA của vi sinh vật liên kết với một số mẫu hải miên, xác

định nồng độ DNA và độ tinh sạch, lựa chọn mẫu để giải trình tự
metagenomics.
 Phân tích dữ liệu metagenomics mẫu đã giải trình tự bằng các công
cụ tin sinh học. Đánh giá đa dạng sinh học của vi sinh vật liên kết
với hải miên. Từ CSDL metagenomics khai thác gen liên quan đến
sinh tổng hợp các chất có hoạt tính ức chế protease.
 Nghiên cứu biểu hiện gen mã hóa protein ức chế protease trong hệ
biểu hiện Escherichia coli và hệ biểu hiện nấm men Pichia pasroris.
 Đánh giá hoạt tính ức chế protease của protein tái tổ hợp.
4. Những đóng góp mới của luận án
 Đã xây dựng được cơ sở dữ liệu DNA metagenome của vi sinh vật
liên kết hải miên của mẫu hải miên QT2 thu nhận tại vùng biển
Quảng Trị (Miền Trung), Việt Nam. Cơ sở dữ liệu thu được có ý
nghĩa về mặt khoa học góp phần bảo tồn nguồn gen vi sinh vật biển
Việt Nam và có tiềm năng khai thác nguồn gen trên để ứng dụng
vào thực tiễn.
 Thu nhận được gen mới PI-QT mã hóa cho PIs và biểu hiện thành
công ở E. coli và P. pastoris. Hoạt tính ức chế protease của protein


3
biểu hiện đã được đánh giá và kết quả thu được cho thấy protein PIQT tái tổ hợp từ E. coli có hoạt tính ức chế trypsin, ức chế ɑchymotrypsin và protein từ P. pastoris thể hiện hoạt tính ức chế
trypsin, ɑ-chymotrypsin và thermolysin.

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1. Hải miên và vi sinh vật liên kết hải miên
1.1.1. Giới thiệu về hải miên
1.1.2. Vi sinh vật liên kết hải miên
1.2. Sơ lược về metagenomics
1.3. Chất ức chế protease (PIs)

1.3.1. Sơ lược về protease
1.3.2. Chất ức chế protease và phân loại
1.3.3. Cơ chế hoạt động của PIs
1.3.4. Ứng dụng của chất ức chế protease
1.3.5. Tình hình nghiên cứu PIs từ vi sinh vật liên kết hải miên trong và
ngoài nước
1.4. Hệ biểu hiện gen ngoại lai Escherichia coli và Pichia pastoris

CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
2.1. Vật liệu nghiên cứu
2.1.1. Vật liệu
Các mẫu hải miên được thu thập tại biển Quảng Trị, Việt Nam và
một số vật liệu khác sử dụng trong nghiên cứu.
2.1.2. Đối tượng nghiên cứu
Vi sinh vật liên kết với hải miên
2.1.3. Hóa chất


4
Các hóa chất dùng trong nghiên cứu được mua chủ yếu từ các hãng
uy tín như Merck (Đức), Sigma (Mỹ), Himedia (Ấn Độ).
2.1.4. Máy móc thiết bị
Sử dụng máy móc thiết bị của Trung tâm Sinh học phân tử Nghĩa
Đô, Viện NCKH Miền Trung, Viện Hàn lâm KH&CN Việt Nam và
một số máy móc của Viện Hóa Sinh biển, Viện Hàn lâm KH&CN Việt
Nam.
2.1.5. Dung dịch và môi trường sử dụng
Môi trường sử dụng trong nuôi cấy và biểu hiện gen trong E.
coli: Luria-Bertani (LB).
Môi trường sử dụng trong biến nạp và biểu hiện gen ngoại lai ở

nấm men P. pastoris (theohướng dẫn của Pichia Expression Kit).
Dung dịch được sử dụng trong điện di DNA: TAE 1X, loading
dye 6X, ethidium bromide (EtBr) 0,5 µg/ml.
Dung dịch sử dụng trong điện di SDS-PAGE: Bis-acrylamide
30%; Đệm Tris HCl 1,5M pH 8,8; Đệm Tris HCl 1M pH 6,8; Đệm Tris
HCl 0.5M pH 6,8; SDS 10%; APS 10%; TEMED…
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Phương pháp tách DNA metagenome của vi sinh vật liên kết
hải miên
Tách chiết DNA tổng số của VSV liên kết với hải miên theo
phương pháp của Abe và cộng sự (2014) với một số cải tiến nhỏ cho
phù hợp với điều kiện của Việt Nam.
2.2.2. Định danh hải miên bằng sinh học phân tử (Medlin et al.,
1988)
2.2.3. Phân tích dữ liệu metagenomics
Giải trình tự DNA metagenome bằng hệ thống Illumina
HiSeq2500(BaseClear - Hà Lan). Dữ liệu thu được sẽ được phân tích
bằng các phần mềm tin sinh học.


5
2.2.4. Tổng hợp gen PIs từ CSDL metagenomics hải miên và thiết kế
plasmid mang gen PIs
Gen PI-QT tổng hợp dựa trên trình tự gen contig 000046 từ
CSDL metagenomics QT2, và tách dòng vào vectơ pUC57, có thiêt kế
trình tự của enzyme giới hạn EcoRI và NotI ở 2 đầu gen (GenScipt,
Mỹ). Tiếp theo, vectơ pUC57 (Thermo, Mỹ) có chứa gen PI-QT và
vectơ biểu hiện pET-32a (+) (Invitrogen, Mỹ) đã được cắt bằng enzyme
giới hạnEcoRI và NotI (Fermentas, Lithuania). Sau đó, gen PI-QT đã
được tinh sạch và đưa vào vectơ biểu hiện pET-32a(+) (biểu hiện trong

E. coli) và pPIC9 (biểu hiện trong P. pastoris) bằng cách sử dụng
enzyme T4 ligase (Thermo, Mỹ).
2.2.5. Các phương pháp sử dụng để thu hồi protein PIs tái tổ hợp
trong hệ biểu hiện E. coli BL21(DE3)
Phương pháp biến nạp, biểu hiện và tối ưu hóa quá trình biểu
hiện gen trong tế bào E. coli (Đỗ Thị Huyền et al., 2008; Nguyễn Thị
Quý et al., 2013).
Phản ứng lai kháng thể (Western blot) (theo hướng dẫn của
hãng Invitrogen).
Tinh sạch protein PIs tái tổ hợp: Protein tái tổ hợp PIs được
tinh sạch theo hướng dẫn của Ni-NTA Purification System (Novex by
life technologies) với một số cải biến nhỏ.
Loại bỏ đuôi peptide TRx-His-tag ra khỏi protein tái tổ hợp
(Theo hướng dẫn của Novagen).
Nhận diện và phân tích protein bằng phương pháp proteomics/
tin sinh học.
2.2.6. Các phương pháp sử dụng để thu hồi protein PIs tái tổ hợp
trong hệ biểu hiện nấm men Pichia pastoris
Theo hướng dẫn của Pichia expression kit – Invitrogen với một
số thay đổi nhỏ phù hợp cho quá trình biểu hiện.


6
2.2.7. Phương pháp xác định hoạt tính ức chế protease(Sapna., 2013;
Jiang et al., 2011)
2.2.8. Phương pháp xác định ảnh hưởng của một số yếu tố đến
protein PIs tái tổ hợp(Sapna., 2013).
2.2.9. Phân tích thống kê
Các thí nghiệm được thực hiện ba lần và được biểu thị bằng
trung bình ± sai số chuẩn của giá trị trung bình (SEM). Phân tích thống

kê và phân tích phương sai một chiều được thực hiện bằng phần mềm
ANOVA, sau đó là các thử nghiệm so sánh nhiều lần bằng phần mềm
SPSS v.22 (SPSS Inc, Chicago, IL, USA). Kết quả được coi là có ý
nghĩa tại P <0,05.

CHƯƠNG 3.KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Thu thập mẫu hải miên
Bằng phương pháp SCUBA, đã thu thập được 8 mẫu hải miên
tại biển Quảng Trị. Hải miên được thu thập tại tọa độ là 107°07'06.0"E;
17°04'50.2"N. Các mẫu được lưu trữ trong 30 % glycerol, bảo quản
trong đá, vận chuyển về phòng thí nghiệm và tiến hành tách chiết DNA
của vi sinh vật liên kết hải miên.
3.2.Kết quả tách chiết DNA metagenome
3.2.1.Tách chiết DNA metagenome của vi sinh vật liên kết hải miên
biển Quảng Trị
DNA tổng số của VSV liên kết hải miên đã được tách chiết từ
8 mẫu hải miên thu thập tại biển Quảng Trị, Việt Nam. Kết quả cho
thấy lượng DNA tách được ở mỗi mẫu khác nhau.Mẫu tách được nhiều
DNA nhất là QT2 và độ tinh sạch cao nhất (Hình 3.1, Bảng 3.1).


7
QT9

QT8

QT7

QT6

QT5

QT4

QT2

QT3

M

Hình 3.1. Điện di đồ sản phẩm tách DNA của vi sinh vật liên kết hải miên
biển Quảng Trị (M: Marker 100 bp của hãng Thermo)

Bảng 3.1.Chất lượng của DNA tổng số tách từ các mẫu hải miên biển
Quảng Trị
TT
1
2
3
4
5
6
7
8

Mẫu
QT2
QT3
QT4
QT5

QT6
QT7
QT8
QT9

DNA
(ng/µL)
202,5
165,1
160,9
178,7
39,8
73,5
125,8
36,5

A260/A230
2,0
1,8
1,83
1,82
1,9
1,8
1,77
1,78

A260/A280
1,80
1,71
1,54

1,32
1,62
1,72
1,41
1,70

Đã lựa chọn DNA tổng số của VSV liên kết hải miên QT2 biển
Quảng Trị (nồng độ DNA: 202,5 ng/µl, độ tinh sạch A260/A280=1,80)
để giải trình tự metagenomics.


8
3.1.2. Định danh hải miên QT2 bằng sinh học phân tử
Đoạn gen 18S rRNA dài khoảng 1,9 kb của mẫu hải miên QT2
đã được khuếch đại thành công từ DNA tách chiết. Kết quả giải trình tự
gen bằng máy ABI PRISM 3100 và so sánh trình tự nhận được bằng
chương trình BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) với các
trình tự gen 18S rRNA khác trên NCBI (National Center for
Biotechnology Information) cho thấy đoạn gen 18S rRNA của hải miên
QT2 tương đồng 99,9 % với trình tự gen tương ứng của hải miên
Spheciospongia vesparium có mã số AY734440. Vì vậy, chúng tôi đặt
tên cho mẫu QT2 là Spheciospongia vesparium QT2.
3.3. Xây dựng cơ sở dữ liệu DNA metagenome của vi sinh vật liên
kết hải miên Spheciospongia vesparium QT2 bằng tin sinh học
3.3.1. Lắp ráp reads của DNA metagenome
Sau khi giải trình tự shortgun metagenome toàn bộ của mẫu QT2
(Base Clear, Hà Lan) và tinh sạch dữ liệu bằng phần mềm
Trimmomatic, thu được hơn 44 triệu đoạn trình tự paired reads. Dữ liệu
tinh sạch được sử dụng lắp ráp de novo metagenome sử dụng phần
mềm SPAdes. Tổng kích thước hệ lắp ráp thu được là khoảng 418 Mb

bao gồm 102.236 contigs. Contig có kích thước dài nhất là hơn 855 kb,
contigs nhỏ nhất là 1.000 bp, độ dài trung bình là 4.089 bp. Gần 90 %
số đoạn trình tự có thể ánh xạ ngược lại với hệ gen lắp ráp. Kết quả
nhận được cho thấy các contigs chủ yếu phân bố trong khoảng từ 1.000
đến 100.000 bp. Tỷ lệ GC % trong hệ gen của mẫu QT2 là 61,82 %.
3.3.2. Kết quả dự đoán gen
Kết quả dự đoán gen bằng phần mềm Prodigal và MetageneMark
nhận được lần lượt là khoảng 366 Mb (386.416 ORFs) và 361 Mb
(380.886 ORFs). Kết quả dự đoán gen của hai phần mềm khá tương
đồng nhau, với gen lớn nhất có kích thước là 66.639 bp, độ dài trung
bình là 864 bp và tỷ lệ GC là khoảng hơn 62 %. Sau khi loại bỏ tất cả


9
những gen có kích nhỏ hơn 250 bp, sử dụng phần mềm CD-HIT với
mức độ tương đồng 90 %, thu được tập gen cuối cùng có tổng kích
thước gần 360 Mb bao gồm 372.732 gen đồng nhất (unified genes),
trong đó có 262.159 gen hoàn chỉnh (chiếm 70,33 %) (gen có đủ mã
mở đầu và mã kết thúc); 53.162 (14,26 %) gen thiếu mã kết thúc 3’;
49.569 (13,3 %) gen thiếu mã mở đầu 5’ và số lượng gen thiếu cả mã
mở đầu và mã kết thúc chỉ có 7.842 gen, chiếm 2,1 %. Phân bố độ dài
cho thấy gen dự đoán chủ yếu có kích thước từ khoảng 250 bp đến
khoảng 2.000 bp.
3.3.3. Kết quả chú giải và phân loại chức năng gen
Kết quả chú giải bằng các cơ sở dữ liệu cho thấy, với tổng số
372.732 trình tự gen (axit amin), có 360.564 (96,74 %) gen được chú
giải trên cở sở dữ liệu NR; 266.553 gen được chú giải trên Swiss-Prot
chiếm 71,51 %; 274.632 gen chiếm 73,68 % được chú giải trên cơ sở
dữ liệu COG; chỉ có 11.974 (3,21 %) gen được chú giải trên cơ sở dữ
liệu CAZy; số gen được chú giải trên cơ sơ dữ liệu GO là 165.552 gen

chiếm 44,42 %, 244.436 gen được chú giải trên cơ sơ dữ liệu KEGG
chiếm 65,58 %; đối với cơ sở dự liệu Pfam, có 273.826 (73,46 %) gen
được chú giải.
3.3.4. Đa dạng sinh học vi sinh vật liên kết hải miên Spheciospongia
vesparium QT2
Đã nhận dạng 10 ngành, 21 lớp, 36 bộ, 22 họ và 16 chi vi
khuẩn liên kết với hải miên Spheciospongia vesparium QT2.
3.3.5. Khai thác gen có hoạt tính ức chế protease (PIs) dựa trên cơ sở
dữ liệu (CSDL) metagenomics
Bằng các công cụ tin sinh học, đã khai thác được 50 gen hoàn chỉnh
liên quan đến chất ức chế protease từ

CSDL metagenomics QT2

(Quảng Trị) (Bảng 3.8). Trong đó có 28 gen, chiếm 56 % được chú giải


10
thuộc họ Serpin (Serine protease inhibitor); còn lại 22 gen (44 %) thuộc
nhóm Inter-alpha-trypsin inhibitor. Gen ngắn nhất là 198 bp, mã hóa
cho 66 axit amin; gen dài nhất là 2406 bp, mã hóa cho 802 axit amin.
Một số gen cũng đã được xác định là gen mới ở Việt Nam
Bảng 3.8. Kết quả sàng lọc các gen có hoạt tính protease inhibitor từ
CSDL metagenomics QT2
TT
1
2
3
4
5

6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30

Contig
00016
000019
000019

000046
000046
000127
000172
000213
000213
000314
000433
000631
000726
000981
001114
001390
001690
001737
001737
001813
002069
002236
002339
002592
002838
003102
003892
004584
005997
006820

Prokka
5808

06418
0645
10704
10705
20087
24210
27784
27785
34813
41698
52340
56621
67673
72799
82416
91580
93032
93033
95168
102253
106102
108516
114432
119867
125566
140659
152589
173538
184178

A.a
442
323
398
429
405
328
400
418
405
736
419
325
398
428
419
386
454
412
223
412
280
324
478
355
334
401
323
631
430

417

Uni_1
Q5RB37
O02668
Q61703
Q9D154
Q5BIR5
Q3T052
Q8BJD1
Q5BIR5
Q99574
A6X935
Q5BIR5
Q3T052
Q61703
Q90935
Q5BIR5
A6X935
Q5BIR5
Q5BIR5
Q99574
Q99574
Q8PTN8
A2VE29
Q14624
Q90935
Q14624
Q8BJD1
Q3T052

Q61703
Q8PTN8
Q5BIR5

UniProtKB_
product
ITIH chain H3
ITIH chain H2
ITIH chain H2
Serpin
Serpin
ITIH chain H4
ITIH chain H5
Serpin B8
Neuroserpin
ITIH
Serpin B8
ITIH chain H4
ITIH chain H2
Neuroserpin
Serpin B8
ITIH
Serpin B8
Serpin B8
Neuroserpin
Neuroserpin
Serpin
ITIH chain H5
ITIH chain H4
Neuroserpin

ITIH chain H4
ITIH chain H5
ITIH chain H4
ITIH chain H2
Serpin
Serpin B8

Uni_
score
89.4
61.2
71.6
184
214
62
71.6
216
209
171
231
58.9
57
214
219
114
152
214
87.8
207
175

64.7
63.5
197
55.5
58.5
67
66.2
206
237

Uni_
evalue
1.00E-17
5.00E-09
4.00E-12
6.00E-52
1.00E-63
3.00E-09
4.00E-12
5.00E-64
2.00E-61
6.00E-43
6.00E-70
3.00E-08
2.00E-07
1.00E-62
4.00E-65
4.00E-26
5.00E-40
1.00E-63

6.00E-19
3.00E-60
7.00E-50
4.00E-10
2.00E-09
3.00E-57
3.00E-07
5.00E-08
7.00E-11
6.00E-10
2.00E-59
5.00E-72


11
31
32
33
34
35
36
37
38
39
40
41
42
43
44
45

46
47
48
49
50

007047
007181
007964
008443
010618
012483
015758
020504
020772
020806
020909
021896
024785
030105
033816
038363
040171
044964
060339
067320

186946
188591
197295

202257
222724
237228
258680
283125
284248
284376
284844
288956
300295
318139
328453
339464
346561
352966
377096
385523

497
146
66
443
382
378
430
394
402
802
362
722

303
717
391
376
423
457
149
98

Q61703
Q96P15
Q90935
P50453
Q8BJD1
Q9JK88
Q9S7T8
Q90935
Q90935
Q61703
A6X935
P56652
Q29052
Q9GLY5
B4USX2
Q9CQV3
Q99574
Q5JJ64
Q9UIV8
Q5NBM

ITIH chain H2
Serpin B11
Neuroserpin
Serpin B9
ITIH chain H5
Serpin I2
Serpin-ZX
Neuroserpin
Neuroserpin
ITIH chain H2
ITIH
ITIH chain H3
ITIH chain H1
ITIH chain H3
Serpin B10
Serpin B11
Neuroserpin
Serpin
Serpin B13
Putative serpin

122
105
51.6
213
64.3
57
143
73.2
213

142
104
170
55.5
116
220
82
211
249
66.6
66.2

2.00E-28
5.00E-26
7.00E-08
2.00E-62
8.00E-10
1.00E-07
1.00E-36
8.00E-13
1.00E-62
2.00E-33
6.00E-23
8.00E-43
3.00E-07
2.00E-25
1.00E-65
7.00E-16
1.00E-61
7.00E-76

4.00E-12
1.00E-12

Chú thích: ITIH: Inter-alpha-trypsin inhibitor heavy; Serpin: serine protease
inhibitor; I: Inhibitor;

3.4. Nghiên cứu biểu hiện gen ức chế protease (PIs) trong hệ
Escherichia coli
Dựa vào kết quả khai thác gen PIs từ CSDL metagenomics
QT2, một số cặp mồi để tách dòng các gen ức chế protease thuộc họ
serpin mong muốn đã được thiết kế, sử dụng template là DNA
metagenome mẫu QT2 bằng phương pháp PCR. Tuy nhiên, mặc dù đã
thay đổi rất nhiều thông số trong chu trình PCR nhưng vẫn không tách
được dòng gentheo phương pháp PCR thông thường. Vì vậy, dựa vào
kết quả sàng lọc gen (Bảng 3.8), trình tự gen contig 000046,
contig000433 và contig020504 đã được tổng hợp (GenScript) và đưa
vào vector tách dòng pUC57. Các gen lựa chọn ngoài là gen được chú
giải thuộc họ serpin (ức chế serine protease) còn có một số ưu điểm
hơn các contig khác như: gen mới, trình tự gen hoàn chỉnh (có độ tương


12
đồng dưới 85 % với các gen liên quan đến chất ức chế protease đã được
công bố trên ngân hàng gen NCBI), trọng lượng protein dự đoán
khoảng 30-55 kDa (thuận tiện cho quá trình biểu hiện, tinh sạch và thu
hồi protein tái tổ hợp). Ngoài ra, các contig này đều có giá trị Unievalue cao và tin cậy. Các contig 000046, contig000433 và
contig020504 và được đặt tên là PI-QT, PI-QT1 và PI-QT2, tương ứng.
Trong quá trình nghiên cứu, đã thiết kế thành công các vectơ
biểu hiện pET-32a(+) trong hệ E. coli và vectơ pPIC9 biểu hiện trong
P. pastoris mang 3 gen PI-QT, PI-QT1 và PI-QT2. Tuy nhiên, các gen

PI-QT1 và PI-QT2 biểu hiện protein tái tổ hợp nằm trong cặn tế bào ở
dạng không tan trong hệ E.coli BL21 (DE3) và không biểu hiện được
trong hệ P. pastoris SDM1168 dưới các điều kiện nghiên cứu. Chỉ có
gen PI-QT biểu hiện trong cả hệ E. coli và P. pastoris và protein tái tổ
hợp nhận được ở trạng thái tan. Vì vậy, trong luận án này, chúng tôi chỉ
báo cáo về quá trình biểu hiện gen PI-QT trong 2 hệ biểu hiện trên.
Gen PI-QT đã được đăng ký trên ngân hàng gen NCBI với mã
số MK359987.1.
3.4.1. Phân tích trình tự a xít amin và cây phân loại của protein PIQT
Gen PI-QT có kích thước 1287 bp, mã hóa cho 429 axít amin,
trọng lượng protein dự đoán khoảng 50 kDa, điểm đẳng điện theo lý
thuyết là 4.56. So sánh trình tự axít amin của PI-QT với các trình tự
trong cơ sở dữ liệu NCBI cho thấy protein PI-QT tương đồng với các
serpin khoảng 50 – 55 % và peptide PI-QT có các vùng bảo thủ giống
với các trình tự của protein này trong vi sinh vật.
Cây phân loại protein dựa trên phương pháp neighbor-joining
giữa protein PI-QT với 1 số loại serpin vi khuẩn khác đã được xây
dựng. Dựa trên dữ liệu so sánh cho thấy protein PI-QT là một loại
serpin vi khuẩn mới. Cấu trúc protein của PI-QT được dự đoán theo mô
hình SWISS- MODEL và (PS) 2-v2.


13
Gen PI-QT cũng đã được đăng ký trên ngân hàng gen NCBI
với mã số MK359987.1
3.4.2. Thiết kế vectơ biểu hiện pET-32a(+) mang gen PIs
Đã gắn thành công gen PI-QT vào vectơ biểu hiện pET-32a(+).
3.4.3. Biểu hiện protein tái tổ hợp trong E. coli chủng BL21(DE3)
Vectơ tái tổ hợp pET-32a (+)/PI-QT đã được biến nạp thành
công vào tế bào khả biến E.coli BL21 (DE3) bằng sốc nhiệt và được ủ

trong môi trường LB/amp qua đêm. Sau đó, lựa chọn một vài khuẩn lạc
màu trắng ủ trong môi trường LB/amp cho đến khi OD600 khoảng 0,8 1,0. Tiếp theo, IPTG được thêm vào môi trường nuôi cấy và ủ ở 37 oC
trong 4 h. Phân tích gel SDS-PAGE của protein biểu hiện cho thấy sự
hiện diện của băng protein được biểu hiện quá mức có kích thước
khoảng 64 kDa, tương ứng với kích thước lý thuyết của protein PI-QT
dung hợp với đuôi peptide TRx-his-tag (Hình 3.15, giếng 3, 5, 7).
Trong khi đối chứng âm là dòng chỉ mang vectơ pET-32a(+) (Hình
3.15, giếng 1) và dòng mang vectơ tái tổ hợp nhưng không được cảm
ứng IPTG đều không có băng protein này (Hình 3.15, giếng 2, 4 và 6).

PI-QT

Hình 3.15: Protein tái tổ hợp điện di trên gel SDS-PAGE
Giếng M: Marker protein của hãng Novagen; giếng 1: E. coli BL21
(DE3)/pET-32a(+); giếng 2, 4, 6: E. coli BL21(DE3)/[pET-32a(+) /PI-


14
QT] không cảm ứng IPTG dòng 1, 2, 3, tương ứng; giếng 3, 5, 7: E.
coli BL21(DE3)/[pET-32a(+) /PI-QT] cảm ứng IPTG dòng 1, 2, 3,
tương ứng.
Tuy nhiên protein tái tổ hợp thu được tồn tại chủ yếu ở trạng thái
không tan.
3.4.4. Nghiên cứu điều kiện thích hợp nhất để thu protein tái tổ hợp
PI-QT ở trạng thái tan cao nhất
Xác định nồng độ IPTG phù hợp cho quá trình tạo protein tái tổ hợp:
Khảo sát khả năng biểu hiện của protein PI-QT ở các nồng độ
IPTG cảm ứng 0; 0,5; 1,0; 1,5 mM, mật độ tế bào trước khi cảm ứng
OD600 khoảng 0,8-1; cảm ứng ở 37 oC, thời gian cảm ứng 4 h. Phân tích
gel SDS-PAGE 12,6 % cho thấy protein PI-QT biểu hiện được khi cảm

ứng IPTG 1,0 mM. Ở các nồng độ IPTG khác (0; 0,5 và 1,5 mM)
không thấy sự xuất hiện của băng biểu hiện vượt mức. Nhưng protein
tái tổ hợp thu được vẫn tồn tại chủ yếu ở trạng thái không tan.
Xác định nhiệt độ thích hợp cho sự tạo thành protein tái tổ hợp ở trạng
thái tan
Biểu hiện của protein tái tổ hợp cũng đã được nghiên cứu ở các
nhiệt độ khác nhau (20, 25, 28 và 30 oC), OD600 trước khi cảm ứng
khoảng 0,8-1; nồng độ IPTG cảm ứng 1 mM. Kết quả thu được cho
thấy, lượng protein tái tổ hợp ở trạng thái tan nhiều nhất (khoảng 45 %)
khi protein tái tổ hợp được biểu hiện ở 25 oC, trong khi ở 20 oC không
thấy sự hiện diện của băng protein vượt mức. Ở 28 oC và 30 oC, lượng
protein tái tổ hợp được sản xuất cao hơn so với khi biểu hiện ở 20 và 25
o
C; tuy nhiên, chỉ một lượng nhỏ protein tái tổ hợp được phát hiện ở
phần hòa tan (khoảng 20 % tổng protein).
Ảnh hưởng của mật độ tế bào trước khi cảm ứng đến sự biểu hiện
protein PI-QT dạng tan


15
Sự biểu hiện của protein tái tổ hợp ở các mật độ tế bào cảm
ứng khác nhau (OD600 = 0,4, 0,5, 0,6 và 0,7) đã được nghiên cứu. Kết
quả cho thấy ở OD600 = 0,4 không quan sát thấy băng protein biểu hiện
quá mức. Hàm lượng protein PI-QT tạo ra nhiều nhất và ở trạng thái
tan cao nhât khi OD600 trước cảm ứng khoảng 0,6-0,7 (409 mg/L và tan
khoảng ≥ 90 %) (Hình 3.19).

mg/L

%

Hình 3.19: Ảnh hưởng của mật độ tế bào cảm ứng lên biểu hiện của
protein tái tổ hợp.
(A) Điện di protein trên gel SDS - PAGE, giếng M: thang protein
(Thermo, Mỹ); Giếng 1: protein tổng số của E. coli BL21 (DE3) [pET32a (+)/PI-QT]; giếng 2: protein của E. coli BL21 (DE3) [pET-32a
(+)/PI-QT] ở dạng không hòa tan; giếng 3: protein của E. coli BL21
(DE3) [pET-32a (+)/PI-QT] ở dạng hòa tan. (B) Tổng số protein và tỷ
lệ phần trăm của protein trong phần hòa tan ở mật độ tế bào trước cảm
ứng.
3.4.5.Tinh sạch protein tái tổ hợp PI-QT trong E. coli và nhận diện
bằng khối phổ
Protein tái tổ hợp được tinh sạch bằng cột sắc ký ái lực Ni-NTA
agarose và thu hồi protein ở các nồng độ imidazol 100, 200, 250, 300
và 500 mM. Kết quả điện di SDS-PAGE 12,6 % cho thấy protein quan


16
tâm thu hồi được nhiều nhất ở nồng độ muối 100 và 300 mM
imidazole, tuy nhiên các phân đoạn này còn lẫn nhiều loại protein khác.
Ở phân đoạn protein được thu hồi với đệm đẩy cột chưa imidazole 500
mM thì lượng protein quan tâm ít hơn nhưng lại có độ tinh sạch cao
hơn (Hình 3.20).

Hình 3.20: Các phân đoạn protein sau khi sắc ký trên cột sắc ký ái lực
Ni-NTA (A): Giếng L: Marker protein của hãng Thermo; Giếng 10,
11, 12 lần lượt là protein được thôi ra khỏi cột khi sử dụng đệm đẩy cột
imidazole 100 mM, 300 mM, 500 mM, tương ứng.
(B): Đồ thị biểu thị độ tinh sạch và hàm lượng protein nhận được
Để khẳng định protein tinh sạch là protein PI-QT, chúng tôi đã
thực hiện phản ứng lai western blot, sử dụng kháng thể anti-TRx. Kết

quả cho thấy, trên màng lai xuất hiện 1 băng protein có kích thước
khoảng 64 kDa, tương ứng với kích thước lý thuyết của PI-QT dung
hợp (Hình 3.21a). Ngoài ra, thrombin được sử dụng để loại bỏ đuôi
dung hợp (TRx-His-tag) ra khỏi protein tái tổ hợp. Điện di đồ SDSPAGE 12,6 % nhận được 2 băng có kích thước khoảng 50 kDa và 14
kDa, tương ứng với kích thước của protein PI-QT và của đuôi peptide
TRx-His-tag (Hình 3.21b). Như vậy, protein PI-QT ở trạng thái sạch
(không liên kết) đã nhận được.


17
(a)

M

(b)

1

1

2

M
85 kDa

85 kDa

64 kDa

PI-QT

50 kDa

50 kDa

20 kDa

Hình 3.21. Kết quả Western blot và loại peptide TRx-His-tag ra
khỏi protein PI-QT bằng thrombin trên gel SDS-PAGE 12,6 %.
(A) M: Marker protein của hãng Bio-Basic; 1: Protein dung hợp PIQT/TRx-His-tag lai với kháng thể anti-TRx; (B) Marker protein của
hãng Bio-Basic; 1: Protein dung hợp PI-QT/TRx-His-tagtrước khi cắt
bằng thrombin; 2: Protein dung hợp PI-QT/TRx-His-tag cắt bằng
thrombin.
Nhận diện protein quan tâm bằng khối phổ MS, cho thấy đây
chính là protein tái tổ hợp đã thiết kế có các trình tự đúng như lý thuyết
dịch mã từ gen.
Trình tự axít amin PI-QT sau khi nhận diện:
MTKQLINATIIACVGLIYLLGCSGEEDVLHEDELLEMSLEEGAPTAPDGCAILAKPAGFTD
NALSEANAKFGFKLLAELYNQKPNKNVFISPLSISIALTMTYNGARGATKQAMAKTLEIE
GMDLGAVNQANAELREILKSADPQIELAIANSIWLRNTFDEVNPDFLDRNDRFFGAEIAS
LDFDDPQTVETINQWVNTNTQGKIKEILGEIEEHEVMFLINAIYFKGGWKGKFDASKTQD
GVFHLLDGGEKQVPMMSHTCNYSYLESGDFRAVGLPYGEGRVSMYIFLPEHSSNLDE
FLADLNAENWENWLSRFWNERDLRFIMPRFRLEYGMLLNDALKA

3.4.6. Hoạt tính của chất ức chế protease tái tổ hợp
Hoạt tính ức chế các protease: trypsin, ɑ-chymotrypsin,
thermolysin (Sigma) của protein PI-QT ở trạng thái không liên kết đã
được xác định bằng phép thử trên đĩa thạch với cơ chất là sữa gầy
(Skimmed milked 1 %), xác định tỷ lệ ức chế bằng cơ chất BAPNA
theo phương pháp mô tả và định lượng hoạt tính ức chế theo phương

pháp của Jiang et al. (2011). Kết quả, protein PI-QT ức chế mạnh


18
trypsin (87 % khi sử dụng 468 µg protein PI-QT; Ki = 1,33 × 10-8 M),
ức chế yếu ɑ-chymotrypsin (51 % khi sử dụng 468 µg protein PI-QT;
Ki = 2,87 × 10-8 M) và không ức chế thermolysin. Phân tích khả năng
ức chế protease cho thấy protein tái tổ hợp thu được ức chế chống lại
trypsin và ɑ-chymotrypsin với các hoạt độđặc hiệu lần lượt là 975 ± 26
U/mg và 417 ± 14 U/mg. Chất ức chế BBI (đối chứng dương) nhận
được ức chế trypsin và a-chymotrypsin tốt hơn so với protein PI-QT,
với các hoạt độ đặc hiệu lần lượt là 3303 ± 66 U/mg và 1340 ± 58
U/mg.
3.5. Nghiên cứu biểu hiện protein tái tổ hợp trong Pichia pastoris
SMD1168
3.5.1. Thiết kế vectơ biểu hiện pPIC9/PI-QT
Gen PI-QT đã được chèn thành công vào vectơ biểu hiện pPC9
để tạo thành vectơ tái tổ hợp pPIC9/PI-QT.
3.5.2. Tạo dòng tế bào Pichia pastoris SMD1168 mang gen PI-QT
Đã tạo thành công dòng tế bào P. pastoris SMD 1168 mang
vectơ tái tổ hợp [pPIC9/PI-QT]. Kết quả kiểm tra trên môi trường MD,
MM và PCR khuẩn lạc bằng cặp mồi AOX1 (Pichia expression Kit,
Invitrogen) cho thấy các dòng P. pastoris tái tổ hợp mang kiểu hình
Muts.
3.5.3. Biểu hiện gen PI-QT trong nấm men P. pastoris SMD1168
Biểu hiện các dòng P. pastoris SMD 1168 [pPIC9-PI-QT] theo
hướng dẫn của nhà sản xuất (Pichia expression kit, Invitrogen) đối với
chủng có kiểu hình Muts, cảm ứng methanol 0,5 %, lắc 200 vòng/phút
ở 28 oC. Kết quả điện di trên gel SDS-PAGE 12,6 % và nhuộm
coomassie cho thấy protein PI-QT đã được biểu hiện có kích thước

khoảng 50 kDa tương ứng với kích thước lý thuyết protein PI-QT ở các
thời điểm 24, 48, 72, 96 và 120 h nuôi cấy. Hàm lượng protein biểu


19
hiện thu được nhiều nhất ở 72 h sau cảm ứng và giảm đi sau 96h cảm
ứng (Hình 3.28).

Protein PI-QT

Hình 3.28. Điện di đồ protein PI-QT biểu hiện trong P. pastoris
SMD1168.
M: Marker protein (Affymetric)
1: Mẫu không cảm ứng. 2: 0 h sau cảm ứng. 3-8: Có cảm ứng (3:
24 h; 4: 48 h; 5:120 h; 6:72 h;7, 8: 96 h sau cảm ứng)
3.5.4. Kết quả thử hoạt tính ức chế protease của protein PI-QT biểu
hiện trong nấm men
Protein ngoại bào của nấm men P. pastoris SMD1168 mang
gen PI-QT và không mang gen PI-QT sau cảm ứng methanol 72 giờ đã
được thử hoạt tính ức chế proteases (trypsin, ɑ-chymotrypsin và
thermolysin).


20

Hình 3.30. Định tính khả năng ức chế proteases của protein biểu hiện
a, b, c tương ứng với thử nghiệm ức chế với trypsin (Try), ɑ-chymotrypsin
(ɑ-chy) và thermolysin (Ther). Nồng độ protease ở mỗi giếng là
0,01 mg);
PI: protein tái tổ hợp PI-QT (PI 1: 0,4 mg protein PI-QT; PI 2: 1,0

mg protein PI-QT; PI 3: 2,0 mg protein PI-QT)
d, Kết quả thử hoạt tính ức chế proteases của dịch tiết thô P. pastoris
SMD1168 không mang gen PI-QT (N: Nước; 1: Trypsin; 2: ɑchymotrypsin, 3: Thermolysin; P: Dịch tiết P. pastoris SMD1168
không mang gen PI-QT)
Kết quả thu được cho thấy, dịch tiết thô của dòng nấm men không
mang gen PI-QT đều không có hoạt tính ức chế với cả 3 protease thử
nghiệm. Trong khi đó, dịch tiết ngoại bào của P. pastoris SMD1168 mang
gen PI-QT thì có hoạt tính ức chế với cả 3 protease trên. Trong đó, ức chế
trypsin mạnh nhất, yếu hơn với ɑ-chymotrypsin và rất yếu với thermolysin
(Hình 3.30).
3.5.5. Kết quả phát hiện chất ức chế protease bằng điện di trên gel SDS –
PAGE có bổ sung cơ chất casein 0,1 %
Sử dụng phương pháp điện di dịch chiết thô nấm men tái tổ hợp
trên gel SDS – PAGE có bổ sung cơ chất casein 0,1 % (Hoàng Thu Hà et
al., 2008). Kết quả nhận được cho thấy dịch tiết ngoại bào của P. pastoris
SMD1168 mang vectơ pPIC9 không có gen PI-QT không xuất hiện băng
nào trên gel SDS – PAE. Trong khi dịch tiết ngoại bào của P. pastoris
SMD1168 mang vectơ tái tổ hợp [pPIC9/PI-QT] lại có 1 băng khá đậm có


21
kích thước khoảng 50 kDa, tương ứng với kích thước của gen PI-QT theo
lý thuyết. Như vậy có thể khẳng định, protein biểu hiện có hoạt tính chính
là protein PI-QT.
3.5.6. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến sự biểu hiện P. pastoris SMD
1168 [pPIC9/PI-QT]
Sau khi đã khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến sự biểu hiện protein
như môi trường nuôi cấy, nhiệt độ cảm ứng, pH và nồng độ methanol cảm
ứng, đã tìm được điều kiện biểu hiện thích hợp nhằm thu được lượng
protein PI-QT nhiều nhất như sau: Môi trường thích hợp nhất dùng cho

biểu hiện là BMGY (cao nấm men (1 %); petone (2 %); potassium
phosphate (100 mM, pH 6); YNB (1.34 %); biotin (4 x 10-5 %); glycerol (2
%); Nhiệt độ cảm ứng thích hợp nhất là 23 oC và 28 oC; pH trong quá trình
biểu hiện duy trì ở pH 3 và cảm ứng methanol ở nồng độ 1 % là tối ưu cho
sự phát triển của nấm men P. pastoris và sự tạo thành protein PI-QT.
3.5.7. Tinh sạch protein PI-QT tái tổ hợp biểu hiện trong P. pastoris qua
cột sắc ký ái lực Trypsin-Sepharore 4B
Sử dụng cột sắc ký ái lực Trypsin-Sepharore 4B đã thu được 1 băng
duy nhất có kích thước khoảng 50 kDa, tương ứng với kích thước của
protein PI-QT theo lý thuyết (Hình 3.37).

Hình 3.37: Điện di SDS – PAGE 12,6 % protein PI-QT qua màng cut off
30 kDa và qua cột sắc ký ái lực Trypsin-sepharose 4B.


22

% ức chế

M: Marker protein của hãng Bio-basic
Giếng 1: Protein PI-QT tái tổ hợp phân đoạn >30 kDa
Giếng 2: Protein PI-QT tái tổ hợp qua cột sắc ký ái lực TrypsinSepharose 4B.
Protein sau tinh sạch cũng đã được xác định hoạt tính ức chế với 3
protease là trypsin, ɑ-chymotrypsin và thermolysin. Kết quả nhận được
cho thấy protein sau tinh sạch có hoạt tính ức chế mạnh với trypsin và yếu
hơn với ɑ-chymotrypsin, rất yếu với thermolysin. Hằng số Ki lần lượt là
1,12 × 10-7 M, 1,45 × 10-8 M và 2,34 × 10-9 M, tương ứng. Như vậy, có thể
khẳng định protein PI-QT biểu hiện trong nấm men P. pastoris SMD1168
đã được tinh sạch.
3.5.8. Ảnh hưởng của một số yếu tố đến protein PI-QT

Ảnh hưởng của nhiệt độ
Protein PI-QT ổn định trong dải nhiệt độ 30 oC đến 70 oC và bất
hoạt khi bị xử lý ở 100 oC. Hoạt tính ức chế protease mạnh nhất khi được
giữ ở 4 oC (Hình 3.39).
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0

% ức chế Trypsin
% ức chế ɑ-chymo
% ức chế thermo

4

20

30

40

50

60

Nhiệt độ

70

80

90 100

(oC)

Hình 3.39. Biểu đồ ảnh hưởng của nhiệt độ đến hợp chất PI-QT (thu hồi
trong P. pastoris)