KẾT QUẢ kỹ THUẬT GIẢI TRÌNH tự GEN THẾ hệ mới TRONG SÀNG lọc rối LOẠN 24 NHIỄM sắc THỂ TRƯỚC CHUYỂN PHÔI

1

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI

BỘ Y TẾ

Nhóm 10 - Lớp 2 NCKH

KẾT QUẢ KỸ THUẬT
GIẢI TRÌNH TỰ GEN THẾ HỆ MỚI TRONG SÀNG LỌC
RỐI LOẠN 24 NHIỄM SẮC THỂ TRƯỚC CHUYỂN PHÔI

ĐỀ CƯƠNG LUẬN VĂN THẠC SĨ Y HỌC

Hà Nội – 2016


2

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI

BỘ Y TẾ

Nhóm 10 - Lớp 2 NCKH

KẾT QUẢ KỸ THUẬT
GIẢI TRÌNH TỰ GEN THẾ HỆ MỚI TRONG SÀNG LỌC
RỐI LOẠN 24 NHIỄM SẮC THỂ TRƯỚC CHUYỂN PHÔI

Chuyên ngành : Y sinh học- Di truyền
Mã số

: 62720111

ĐỀ CƯƠNG LUẬN VĂN THẠC SĨ Y HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC

Hà Nội – 2016


3

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

a-CGH

Phương pháp lai so sánh bộ gen dùng chíp DNA

BOBs

Phương pháp sử dụng hạt Bead

CGH

Phương pháp lai so sánh bộ gen

FISH

Phương pháp lai huỳnh quang tại chỗ

NGS

Phương pháp giải trình tự gen thế hệ mới

NST

Nhiễm sắc thể

PGS

Sàng lọc trước chuyển phôi

PGD

Chẩn đoán trước chuyển phôi

PCR

Phương pháp phản ứng chuỗi Polymerase

PGS - NGS

Sàng lọc phôi bằng kỹ thuật giải trình tự gen thế hệ mới


4

MỤC LỤC

DANH MỤC BẢNG


5

DANH MỤC BIỂU ĐỒ


6

ĐẶT VẤN ĐỀ
Vô sinh đang là vấn đề được cả thế giới quan tâm, tỷ lệ vô sinh có xu hướng
ngày càng tăng. Theo thống kê của Tổ chức Y tế Thế giới, tỷ lệ vô sinh là 6÷12%.
Tỷ lệ vô sinh ở Việt Nam là 7,7%. Hiện nay ở Việt Nam cũng như trên thế giới,
phương pháp thụ tinh trong ống nghiệm đã được ứng dụng rộng rãi tuy nhiên tỉ lệ
thành công còn chưa cao, chỉ dừng ở mức 35%, mà nguyên nhân chính là do rối
loạn nhiễm sắc thể ở phôi.
Đã có nhiều kỹ thuật được ứng dụng trong sàng lọc rối loạn di truyền trước
chuyển phôi như FISH, Array-CGH, QF- PCR, Karyolite BoBs và mới đây nhất là
kỹ thuật NGS (Next Generation Sequencing).
NGS ra đời đã tạo ra cuộc cách mạng trong công nghệ di truyền phân tử. Sàng
lọc di truyền trước chuyển phôi dựa trên kỹ thuật NGS (PGS-NGS) có nhiều điểm
khác so với các kỹ thuật ra đời trước, kỹ thuật NGS thực hiện chỉ trên một vài tế
bào phôi, dữ liệu chính xác, kỹ thuật phân tích đơn giản, các thiết bị đáng tin cậy và
có giá thành hợp lý, có thể sàng lọc được dị bội 24 NST; phát hiện được hầu hết các
bệnh lý liên quan đến chuyển đoạn và mất đoạn nhỏ, giảm chi phí giải trình tự, khả
năng tự động hóa cao giúp giảm thiểu những sai sót trong quá trình thực hiện.
NGS đã được ứng dụng ở Châu Âu từ năm 2014, ở Việt Nam đã bắt đầu ứng
dụng ở một số đơn vị tư nhân trong sàng lọc rối loạn di truyền trước chuyển phôi.

Tuy nhiên chưa có đánh giá về độ chính xác, độ tin cậy của các quá trình thực hiện
kỹ thuật sàng lọc như khuếch đại gen, kiểm soát nhiễm chéo, phân tích kết quả.
Những vấn đề này bị ảnh hưởng rất lớn khi thao tác thực hiện vì vậy cần phải có
một nghiên cứu toàn diện áp dụng tất cả các khía cạnh của việc áp dụng kĩ thuật
NGS. Do đó nghiên cứu để hoàn thiện quá trình sàng lọc rối loạn 24 nhiễm sắc thể
bằng NGS là cần thiết.
Vì vậy, chúng tôi tiến hành đề tài: “ Kết quả kỹ thuật giải trình tự gen thế
hệ mới trong sàng lọc rối loạn 24 nhiễm sắc thể người trước chuyển phôi”, với
2 mục tiêu sau:

1. Đánh giá tính giá trị của kỹ thuật NGS trong sàng lọc rối loạn 24 nhiễm
sắc thể người trên một tế bào phôi.

2. Phân tích kết quả sàng lọc rối loạn 24 nhiễm sắc thể người bằng kỹ thuật
NGS trên tế bào phôi dư thụ tinh trong ống nghiệm.


7

Chương 1
TỔNG QUAN
1.1. Khái niệm sàng lọc di truyền trước chuyển phôi
Sàng lọc di truyền trước chuyển phôi (PGS/preimplantation genetic screening)
được chỉ định khi phôi tạo ra từ cặp vợ chồng được xem là bình thường về NST
nhằm kiểm tra những bất thường NST của phôi.
1.2. Rối loạn nhiễm sắc thể
1.2.1. Đột biến số lượng NST
1.2.2. Đột biến cấu trúc NST
1.3. Các kỹ thuật đã ứng dụng để sàng lọc rối loạn di truyền trước chuyển phôi
1.3.1. Kỹ thuật FISH

1.3.2. Kỹ thuật QF- PCR
1.3.3. Kỹ thuật Karyolite - BoBs
1.3.4. Kỹ thuật Array- CGH
1.3.5. Kỹ thuật NGS
1.4. Nguyên lý và quy trình của kỹ thuật NGS
1.5. Tình hình ứng dụng kỹ thuật NGS trên thế giới và tại Việt Nam


8

CHƯƠNG 2
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Đối tượng nghiên cứu
Các tế bào phôi dư được lưu trữ và bảo quản tại trung tâm sàng lọc trước sinh
bệnh viện Phụ sản Hà Nội
- Tiêu chuẩn lựa chọn: Tế bào phôi dư ngày thứ 5 của các cặp vợ chồng tình
nguyện tham gia vào nghiên cứu.
- Tiêu chuẩn loại trừ: Các tế bào phôi dư được bảo quản và lưu trữ không đúng
tiêu chuẩn.
2.2. Thiết kế nghiên cứu: Mô tả cắt ngang
2.3. Địa điểm nghiên cứu: Trung tâm sàng lọc trước sinh bệnh viện Phụ sản Hà Nội
2.4. Thời gian nghiên cứu: Từ 11/2016 đến 10/2018
2.5. Cỡ mẫu
Độ chính xác của kỹ thuật NGS được xác định nhờ so sánh với kết quả của kỹ
thuật Array-CGH, được coi là tiêu chuẩn vàng trong sàng lọc rối loạn NST trước
chuyển phôi. Cỡ mẫu được tính dựa vào giả thiết tỷ lệ phát hiện rối loạn NST của
NGS là 50% (p1) và của Array-CGH là 60% (p2) từ các nghiên cứu trước đó với
mức ý nghĩa 95% và lực nghiên cứu là 80%.
Áp dụng công thức:

n = Z2(α,β)

p1(1 − p1) + p2(1 − p2)
(p1 – p2)2

Trong đó: α = 0.05, β = 0.2, p1 = 0.5, p2 = 0.7
 n = 387.1
Như vậy số mẫu cần có cho nghiên cứu là 387.1, làm tròn là 400.


9

2.6. Phương pháp chọn mẫu: Chọn mẫu thuận tiện
2.7. Biến số, chỉ số nghiên cứu và công cụ thu thập thông tin

 Biến số, chỉ số liên quan đến vợ chồng
Phương
Pháp NC

Công cụ

Phỏng vấn

Bệnh án
NC

Phỏng vấn

Bệnh án
NC

Phỏng vấn

Bệnh án
NC

Phỏng vấn

Bệnh án
NC

Phỏng vấn

Bệnh án
NC

Phỏng vấn

Bệnh án
NC

Phỏng vấn

Bệnh án
NC

Có người trong gia đình Phỏng vấn

Bệnh án
NC

Biến số

Loại biến

Chỉ số (cả vợ và chồng)

Tuổi

Định lượng

Định tính
Định tính-

< 35 tuổi

Nghề nghiệp

Trình độ học
vấn

Nơi ở
Vô
sinh

Tiền
sử

Tiền
sử

khác
Phơi
nhiễ
m
Gia
đình

Định tínhĐịnh tính
Định tính

Định tínhĐịnh tính-

> 35 tuổi
Viên chức
Nông dân
Công nhân
Khác
Tốt nghiệp tiểu học
Tốt nghiệp THCS
Tốt nghiệp THPT
Tốt nghiệp Cao đẳng,
Đại học
Thành thị
Nông thôn
Miền núi
Vô sinh 1
Vô sinh 2
Sản,Phụ khoa
+ PARA
+ Viêm tắc vòi trứng

+ GEU, cắt vòi trứng
Nội, ngoại khoa
Rượu bia, thuốc lá
Hóa chất
Phóng xạ
Khỏe mạnh
có dị tật di truyền.


10

 Các biến số và chỉ số liên quan đến phôi
Biến số

Loại biến

Chỉ số

Phương

Công cụ

Định lượng ADN sau Định lượng

> 20ng

Pháp NC
Kỹ thuật

bước khuếch đại gen

≤ 20ng

PCR

(Đơn vị: ng)
Số mẫu nhiễm vi Định lượng-

Nhiễm

Kỹ

sinh vật ngoại bào
Số lượng phôi rối Định lượng

Không nhiễm
+ Bình thường

PCR
Đọc KQ

PCR
Bệnh án NC

loạn
Số lượng nhiễm sắc Định lượng

+ Rối loạn
+ 3 NST 13

Đọc KQ

Bệnh án NC

thể rối loạn trong

+ 3NST 18

một phôi

+3NST 21

Số lượng nhiễm sắc Định lượng

+ Khác
RL cấu trúc

Đọc KQ

Bệnh án NC

thể rối loạn về cấu

RL số lượng

Hệ thống
máy NGS và

Array- CGH
thuật Kỹ

thuật

trúc/ số lượng
2.8. Sai số và cách khống chế
- Sai số của quá trình thu thập thông tin. Khống chế bằng cách lập bệnh án
nghiên cứu chi tiết có giải thích rõ ràng, nghiên cứu viên được đào tạo kỹ năng.
- Sai số hệ thống trong các quá trình hoạt động của hệ thống máy phân tích.
Khống chế bằng cách xây dựng quy trình chuẩn, hệ thống máy được kiểm soát chất
lượng tốt trước khi phân tích mẫu.
2.9. Quản lý và phân tích số liệu
- Lập bệnh án nghiên cứu, nhập và phân tích số liệu trên phần mềm SPSS 16.0
- Các thuật toán thống kê: T-test, Khi bình phương…


11

2.10. Vấn đề đạo đức nghiên cứu
- Đề tài nghiên cứu chỉ tiến hành sau khi được thông qua hội đồng khoa học và
y đức, được sự chấp thuận của lãnh đạo Bệnh viện Phụ sản Hà Nội và Trường Đại
học Y Hà Nội.
- Nghiên cứu này chỉ nhằm phục vụ cho việc nâng cao chất lượng sàng lọc
trước chuyển phôi làm tăng tỉ lệ thành công cho thụ tinh trong ống nghiệm, ngoài ra
không có mục đích nào khác.
- Các số liệu trong nghiên cứu trung thực, chính xác.


12

Chương 3
DỰ KIẾN KẾT QUẢ

3.1. Thông tin chung đối tượng nghiên cứu
3.1.1. Phân bố tuổi của vợ chồng
Biểu đồ 3.1: Phân bố tuổi của vợ/chồng
3.1.2. Phân bố nghề nghiệp của vợ chồng
Biểu đồ 3.2: Phân bố nghề nghiệp của vợ chồng


13

3.1.3. Phân bố nơi ở
Biểu đồ 3.3: Phân bố nơi ở
3.1.4. Trình độ học vấn
Biểu đồ 3.4: Phân bố trình độ học vấn cảu vợ/chồng


14

3.1.5. Tiền sử vô sinh
Biểu đồ 3.5: Phân bố tỷ lệ vô sinh
3.1.6. Các yếu tố phơi nhiễm
Biểu đồ 3.6: Tỷ lệ yếu tố phơi nhiễm của vợ
Biểu đồ 3.7: Yếu tố phơi nhiễm của chồng
3.1.7. Nồng độ DNA sau nhân gen
Bảng 3.1: Tỷ lệ số mẫu đủ/không đủ lượng DNA sau nhân gen
Đủ
(> 20 ng)
n
%

Không đủ

(< 20 ng)
n
%

Tổng

Định lượng DNA
sau nhân gen

n

%

390

100

3.1.8. Tỷ lệ nhiễm vi sinh vật ngoại bào
Biểu đồ 3.8: Tỷ lệ nhiễm vi sinh vật ngoại bào của mẫu
3.2. Dự kiến kết quả mục tiêu 1
3.2.1. Tỷ lệ phôi có rối loạn NST theo 2 phương pháp
Bảng 3.2: Tỷ lệ phôi có rối loạn NST xác định theo 2 phương pháp
Số lượng phôi
Phương pháp

Có rối loạn
NST
n
%

Bình thường
n

%

NGS
Array - CGH

Tổng
n
390
390

%
100
100

3.2.2 Phân bố kiểu rối loạn NST theo 2 phương pháp
Bảng 3.3: Phân bố kiểu rối loạn NST theo 2 phương pháp
Rối loạn cấu trúc
NST
NST

Rối loạn số lượng
NST
NST

Tổng

15

thường

giới tính

thường

giới tính

NGS
ArrayCGH
3.3. Dự kiến kết quả mục tiêu 2
3.3.1. Kết quả phân tích của kỹ thuật NGS
Bảng 3.4: Kết quả phân tích mẫu thep kỹ thuật NGS
Rối loạn cấu trúc
NST
thườn
g
n
%

NST
giới
tính

Bình
thườn
g

Rối loạn số lượng
Trisomy Trisomy Trisomy
18
21
13

Tổng

NST
giới
tính
390
100


16

3.3.2. Phân bố một số kiểu rối loạn hay gặp theo tuổi vợ
Biểu đồ 3.9: Phân bố một số kiểu rối loạn NST hay gặp theo tuổi vợ
3.3.3. Phân bố một số kiểu rối loạn hay gặp theo tuổi vợ
Biểu đồ 3.10: Phân bố một số kiểu rối loạn NST hay gặp theo tuổi vợ


17

3.3.4. Liên quan giữa rối loạn NST với nghề nghiệp
Bảng 3.5: Liên quan giữa rối loạn NST với nghề nghiệp
Viên chức

Công nhân

Nông dân

Tổng

Rối loạn số lượng
NST
Rối loạn cấu trúc
NST
Bình thường
Tổng

390

3.3.5. Liên quan giữa rối loạn NST với nơi ở
Bảng 3.6: Liên quan giứa rối loạn NST với nơi ở
Thành thị

Nông thôn

Rối loạn số lượng NST
Rối loạn cấu trúc NST
Bình thường
Tổng

Tổng

390

3.3.6. Liên quan giữa rối loạn NST với tiển sử vô sinh

Bảng 3.7: Liên quan giữa rối loạn NST với tiển sử vô sinh
Vô sinh 1

Vô sinh 2

Rối loạn số lượng NST
Rối loạn cấu trúc NST
Bình thường
Tổng

Tổng

390

3.3.4. Phân bố rối loạn NST theo tiền sử phơi nhiễm
Biểu đồ 3.10: Phân bố rối loạn NST theo tiền sử phơi nhiễm.


18


19

CHƯƠNG 4
DỰ KIẾN BÀN LUẬN
4.1. Bàn luận về một số đặc điểm của đối tượng nghiên cứu
4.2. Bàn luận về độ chính xác của kỹ thuật NGS trong sàng lọc 24 NST.
4.3. Bàn luận về ứng dụng kỹ thuật giải trình tự gen thế hệ mới trong phân tích
24 NST trên các tế bào phôi dư.

20

DỰ KIẾN KẾT LUẬN
1. Đánh giá tính giá trị của kỹ thuật NGS trong sàng lọc rối loạn 24 nhiễm sắc
thể người trên một tế bào phôi.
2. Phân tích kết quả sàng lọc rối loạn 24 nhiễm sắc thể người bằng kỹ thuật
NGS trên tế bào phôi dư thụ tinh trong ống nghiệm


TÀI LIỆU THAM KHẢO
1.

Al-Asmar N., Peinado V., Vera M. et al (2012), Chromosomal abnormalities in
embryos from couples with a previous aneuploid miscarriage. Fertil Steril,
98(1), 145-150.

2.

Baart E. B., Martini E., Eijkemans M. J. et al (2007), Milder ovarian
stimulation for in-vitro fertilization reduces aneuploidy in the human
preimplantation embryo: a randomized controlled trial. Hum Reprod, 22(4),
980-988.

3.

Balaban B., Yakin K., Urman B. et al (2004), Pronuclear morphology predicts
embryo development and chromosome constitution. Reprod Biomed Online,
8(6), 695-700.

4.

Bormann C. L., Racowsky C (2013), Is universal application of blastocyst
biopsy with comprehensive chromosome screening for embryo selection ready
for prime time. Fertil Steril, 100(2), 5-6.

5.

Chen C. K., Shen G. Y., Horng S. G. et al (2003), The relationship of
pronuclear stage morphology and chromosome status at cleavage stage. J
Assist Reprod Genet, 20(10), 413-420.

6.

Colls P., Escudero T., Cekleniak N. et al (2007), Increased efficiency of
preimplantation genetic diagnosis for infertility using "no result rescue". Fertil
Steril, 88(1), 53-61.

7.

Delhanty J. D., Griffin D. K., Handyside A. H. et al (1993), Detection of
aneuploidy and chromosomal mosaicism in human embryos during
preimplantation sex determination by fluorescent in situ hybridisation, (FISH).
Hum Mol Genet, 2(8), 1183-1185.

8.

Egozcue S., Blanco J., Vidal F. et al (2002), Diploid sperm and the origin of
triploidy. Hum Reprod, 17(1), 5-7.

9.

Fiorentino F., Bono S., Biricik A. et al (2014), Application of next-generation
sequencing technology for comprehensive aneuploidy screening of blastocysts


in clinical preimplantation genetic screening cycles. Hum Reprod, 29(12),
2802-2813.

10. Fragouli E., Katz-Jaffe M., Alfarawati S. et al (2010), Comprehensive
chromosome screening of polar bodies and blastocysts from couples
experiencing repeated implantation failure. Fertil Steril, 94(3), 875-887.

11. Gianaroli L., Magli M. C., Ferraretti A. P. et al. (2003), Pronuclear
morphology and chromosomal abnormalities as scoring criteria for embryo
selection. Fertil Steril, 80(2), 341-349.

12. Griffin D. K., Wilton L. J., Handyside A. H. et al (1992), Dual fluorescent in
situ hybridisation for simultaneous detection of X and Y chromosome-specific
probes for the sexing of human preimplantation embryonic nucleic. Hum
Genet, 89(1), 18-22.

13. Grochowski D., Wolczynski S., Kuczynski W. et al (1999), Good results of
milder form of ovarian stimulation in an in vitro fertilization/intracytoplasmic
sperm injection program. Gynecol Endocrinol, 13(5), 297-304.

14. Gutierrez-Mateo C., Colls P., Sanchez-Garcia J. et al (2011), Validation of
microarray

comparative

genomic

hybridization

for

comprehensive

chromosome analysis of embryos. Fertil Steril, 95(3), 953-958.

15. Hoàng Thị Hương N. V. T. v. Đ. T. H (2014), Ứng dụng kỹ thuật FISH trong
sàng lọc một số lệch bội nhiễm sắc thể cho chẩn đoán di truyền tiền làm tổ.
Tạp chí phụ sản, 12.


PHỤ LỤC 1
Bệnh án nghiên cứu

1.

•
•
•
•
•

•
•
•

•
•
2.

•
•
•
•



Hành chính
Thông tin vợ
Họ tên:
Tuổi:
Nghề nghiệp:
1. Viên chức
Nơi ở:
1. Nông thôn
Trình độ văn hóa: 1. Tiểu học
Thông tin chồng
Họ tên:
Tuổi:
Nghề nghiệp:
1.Viên chức
Nơi ở:
1. Nông thôn
Trình độ văn hóa: 1. Tiểu học
Tiền sử
Sản khoa

PARA:
Kinh nguyệt:
1. Đều
Vô sinh:
1. Vô sinh 1
Bệnh phụ khoa:
Bệnh nội/ngoại khoa kèm theo
Tiền sử phơi nhiễm:

2. Công nhân 3. Nông dân
2. Thành thị
2. THCS
3. THPT 4.ĐH, CĐ

2. Công nhân 3. Nông dân
2. Thành thị
2. THCS
3. THPT 4. ĐH, CĐ

2. Không đều
2. Vô sinh 2

Chồng

Vợ

Hút thuốc lá
Rượu/bia
Tiếp xúc hóa chất độc
Tiếp xúc phóng xạ

 Tiền sử gia đình: Có hay không tiền sử rối loạn di truyền, đẻ con dị tật.

3. Kết quả sàng lọc
3.1. Lượng DNA sau nhân gen của mẫu ( Đơn vị: ng)
1. > 20ng 2. <20ng
3.2. Có nhiễm chéo vi sinh vật ngoại hay không:
3.3. Có rối loạn NST hay không
3.4. Kiểu rối loạn NST
1. Rối loạn số lượng 2. Rối loạn cấu trúc
3.5. NST bị rối loạn

1. Có
1. Có

2.Không
2. Không


1. NST 13 2. NST 18 3. NST 21 4. NST X 5. NST Y 6. NST khác


PHỤ LỤC 2
KẾ HOẠCH NGHIÊN CỨU
Công việc
Hoàn thiện đề cương
Thu thập thông tin
Phân tích và xử lý số
liệu
Hoàn thiện luận văn và
bảo vệ

Thời gian
11/210612/2106
01/201706/2018
07/201609/2018

Địa điểm

Kinh phí

Đại học Y Hà Nội

5000.000 vnd

Bệnh viện Phụ sản
Hà Nội
Bệnh viện Phụ sản
Hà Nội

10/2018

Đại học Y Hà Nội

200.000.000 vnd
10.000.000 vnd
10.000.000 vnd