Phát hiện người lành mang gen bệnh và chẩn đoán trước làm tổ bệnh hemophilia a bằng kỹ thuật microsatellite DNA

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƢỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI

BÙI THỊ MINH PHƢỢNG

PHÁT HIỆN NGƢỜI LÀNH MANG GEN BỆNH VÀ
CHẨN ĐOÁN TRƢỚC LÀM TỔ BỆNH HEMOPHILIA A
BẰNG KỸ THUẬT MICROSATELLITE DNA

LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC

HÀ NỘI - 2019


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƢỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI

BÙI THỊ MINH PHƢỢNG

PHÁT HIỆN NGƢỜI LÀNH MANG GEN BỆNH VÀ
CHẨN ĐOÁN TRƢỚC LÀM TỔ BỆNH HEMOPHILIA A
BẰNG KỸ THUẬT MICROSATELLITE DNA
Chuyên ngành: Hóa sinh
M số: 62720112
LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC

Ngƣời hƣớng dẫn khoa học:
1. GS.TS. Tạ Thành Văn
2. PGS.TS. Trần Vân Khánh

HÀ NỘI - 2019


LỜI CẢM ƠN
Lời đầu tiên tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới GS.TS. Tạ Thành Văn,
PGS.TS Trần Vân Khánh, là cán bộ hƣớng dẫn, đ tận tình chỉ bảo và truyền
đạt những kiến thức, kinh nghiệm quý báu, tạo mọi điều kiện tốt nhất cho tôi
trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu để tôi có thể hoàn thành luận án này.
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến:
Các cán bộ viên chức Trung tâm nghiên cứu Gen-Protein trƣờng Đại học
Y Hà Nội đ giúp đỡ, tạo điều kiện cho tôi thực hiện các kỹ thuật nghiên cứu.
Tôi xin trân trọng cảm ơn:
Đảng ủy, Ban Giám hiệu, Phòng Đào tạo Sau Đại học, Bộ môn Hóa sinh
Trƣờng Đại học Y Hà Nội.
Đảng ủy, Ban Giám hiệu, các Phòng chức năng, Bộ môn-khoa Hóa sinh,
Trƣờng Đại học Y Dƣợc Thái Bình đ tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá
trình học tập và nghiên cứu.
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới các Nhà khoa học trong hội đồng đánh giá
luận án tiến sỹ cấp cơ sở, cấp trƣờng đ đóng góp cho tôi nhiều ý kiến quý
báu để tôi hoàn thiện luận án đƣợc tốt hơn.
Cuối cùng, tôi xin ghi nhớ công ơn sinh thành, nuôi dƣỡng và tình yêu
thƣơng của cha mẹ tôi, cha mẹ chồng cùng sự ủng hộ, giúp đỡ, động viên của
chồng và hai con, ngƣời thân trong gia đình, bạn bè, đồng nghiệp đ luôn
động viên giúp đỡ tôi cả về tinh thần, vật chất để tôi có thể hoàn thành đƣợc
nhiệm vụ học tập, nghiên cứu của mình.
Trân trọng cám ơn!

Hà Nội, tháng 11 năm 2019
Tác giả
Bùi Thị Minh Phƣợng


LỜI CAM ĐOAN

Tôi là Bùi Thị Minh Phƣợng, nghiên cứu sinh khóa 34, Trƣờng Đại học
Y Hà Nội, chuyên ngành Hóa sinh, xin cam đoan:
1. Đây là luận án do bản thân tôi trực tiếp thực hiện dƣới sự hƣớng dẫn
của Thầy GS.TS. Tạ Thành Văn và Cô PGS.TS. Trần Vân Khánh.
2. Công trình này không trùng lặp với bất kỳ nghiên cứu nào khác đ
đƣợc công bố tại Việt Nam.
3. Các số liệu và thông tin trong nghiên cứu là hoàn toàn chính xác,
trung thực và khách quan, đ đƣợc xác nhận và chấp thuận của cơ sở nơi
nghiên cứu.
Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm trƣớc pháp luật về những cam kết này./.
Hà Nội, ngày tháng năm 2019
NGƢỜI VIẾT CAM ĐOAN

Bùi Thị Minh Phƣợng


DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
BVSKTE

Bảo vệ sức khoẻ trẻ em

CK

Creatine Kinase

DMD

Duchenne Muscular Dystrophy (Bệnh Duchene)

DNA

Deoxyribo Nucleic Acid

FISH

Fluorescent In Situ Hybridization ( Lai huỳnh quang)

ICSI

Intracytoplasmic Sperm Injection

IVF

In Vitro Fertilization ( Thụ tinh trong ống nghiệm)

KB

Kilo Base

MLPA

Multiplex Ligation Probe Amplification

NST X

Nhiễm sắc thể X

NST Y

Nhiễm sắc thể Y

PCR

Polymerase Chain Reaction

PGD

Preimplantation Genetic Diagnosis

PGT

Preimplantation genetic testing

RNA

Ribo Nucleic Acid

RT – RCR

Reverse Transcription PCR

STR

Short Tandem Repeat


MỤC LỤC
ĐẶT VẤN ĐỀ .................................................................................................. 1
CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU........................................................ 4
1.1. ĐẶC ĐIỂM CHUNG BỆNH HEMOPHILIA A .................................... 4
1.1.1. Định nghĩa ......................................................................................... 4
1.1.2. Lịch sử nghiên cứu ............................................................................ 4
1.1.3. Dịch tễ bệnh học ................................................................................ 4
1.1.4. Đặc điểm lâm sàng và chẩn đoán bệnh hemophilia A ...................... 5
1.2. ĐẶC ĐIỂM DI TRUYỀN VÀ CƠ SỞ PHÂN TỬ HEMOPHILIA A ... 8
1.2.1. Cơ chế di truyền bệnh hemophilia A................................................. 8
1.2.2. Cơ sở phân tử bệnh hemophilia A .................................................... 9
1.3. NGƢỜI LÀNH MANG GEN BỆNH HEMOPHILIA A ..................... 14
1.3.1. Đặc điểm chung ngƣời mang gen bệnh ........................................... 14
1.3.2. Cơ chế di truyền của ngƣời mang gen bệnh hemophilia A ............. 14
1.3.3. Triệu chứng của ngƣời mang gen .................................................... 16
1.3.4. Các phƣơng pháp phát hiện ngƣời lành mang gen bệnh ................. 17
1.4. CHẨN ĐOÁN TRƢỚC SINH BỆNH HEMOPHILIA A .................... 23
1.4.1. Sàng lọc thai phụ có nguy cơ cao sinh con bị bệnh hemophilia A . 23
1.4.2. Xét nghiệm chẩn đoán trƣớc sinh.................................................... 24
1.5. PHƢƠNG PHÁP THỤ TINH TRONG ỐNG NGHIỆM (IVF) VÀ
QUY TRÌNH CHẨN ĐOÁN TRƢỚC LÀM TỔ (PGD) ..................... 25
1.5.1. Phƣơng pháp thụ tinh trong ống nghiệm (IVF)............................... 25
1.5.2. Quy trình chẩn đoán gen trƣớc làm tổ (PGD) ................................. 27
1.5.3. Các phƣơng pháp và kỹ thuật sinh học phân tử mới nhất áp dụng
trong việc chẩn đoán trƣớc làm tổ ...................................................... 32

1.6. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG NƢỚC VÀ TRÊN THẾ GIỚI
VỀ CHẨN ĐOÁN TRƢỚC LÀM TỔ ................................................. 40
1.6.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới và tại Việt Nam ....................... 40
1.6.2. Tình hình nghiên cứu chẩn đoán trƣớc làm tổ bệnh hemophilia A 43
CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU......... 47
2.1. ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU .............................................................. 47
2.2. DỤNG CỤ, TRANG THIẾT BỊ VÀ HÓA CHẤT NGHIÊN CỨU ..... 48
2.2.1. Dụng cụ và trang thiết bị ................................................................. 48
2.2.2. Hoá chất ........................................................................................... 49
2.2.3. Trình tự mồi cho phản ứng .............................................................. 51
2.3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ......................................................... 52
2.3.1. Thiết kế nghiên cứu ......................................................................... 52
2.3.2. Địa điểm nghiên cứu ....................................................................... 54
2.3.3. Quy trình và các kỹ thuật sử dụng trong nghiên cứu ...................... 54
2.3.4. Quy trình xác định ngƣời lành mang gen bệnh hemophilia A bằng
kỹ thuật microsatellite DNA ............................................................... 58
2.3.5. Quy trình chẩn đoán trƣớc làm tổ ................................................... 61
2.4. ĐẠO ĐỨC NGHIÊN CỨU TRONG Y HỌC ...................................... 64
CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ................................................... 65
3.1. KẾT QUẢ PHÁT HIỆN NGƢỜI LÀNH MANG GEN F8 BỊ ĐỘT
BIẾN BẰNG KỸ THUẬT MICROSATELLITE DNA ...................... 65
3.1.1. Kết quả xác định marker dị hợp tử gen F8 trên bệnh nhân và ngƣời
lành mang gen bệnh bằng kỹ thuật microsatellite DNA ..................... 65
3.1.2. Kết quả phát hiện ngƣời lành mang gen bệnh hemophilia A bằng kỹ
thuật microsatellite DNA .................................................................... 69
3.2. KẾT QUẢ CHẨN ĐOÁN TRƢỚC LÀM TỔ BỆNH HEMOPHILIA
BẰNG KỸ THUẬT MICROSATTELITE DNA ................................. 91


3.2.1. Kết quả kích thích buồng trứng và thực hiện ICSI ......................... 91

3.2.2. Kết quả chẩn đoán tiền làm tổ của các gia đình hemophilia A ....... 93
CHƢƠNG 4: BÀN LUẬN .......................................................................... 109
KẾT LUẬN .................................................................................................. 139
KHUYẾN NGHỊ.......................................................................................... 140
CÁC DANH MỤC CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU CÓ LIÊN QUAN
ĐẾN LUẬN ÁN
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC


DANH MỤC BẢNG
Bảng 2.1:

Trình tự mồi khuếch đại các STRs sử dụng trong nghiên cứu ... 51

Bảng 2.2:

Thành phần phản ứng master mix .............................................. 56

Bảng 2.3:

Chu trình nhiệt phản ứng PCR sequencing ................................ 56

Bảng 2.4:

Thành phần và điều kiện của phản ứng single-PCR khuếch đại
các STR đặc hiệu trên gen F8. .................................................... 59

Bảng 2.5:

Chu trình nhiệt phản ứng single-PCR......................................... 59

Bảng 2.6:

Thành phần và điều kiện phản ứng multiplex-PCR khuếch đại
các STR đặc hiệu trên gen F8 và vùng gen đặc hiệu trên NST
giới tính. ...................................................................................... 62

Bảng 2.7:

Chu trình nhiệt phản ứng multiplex-PCR ................................... 62

Bảng 2.8:

Thành phần hóa chất sử dụng cho điện di mao quản ................. 63

Bảng 3.1:

So sánh kết quả phát hiện ngƣời lành mang gen bệnh bằng 2
phƣơng pháp ............................................................................... 88

Bảng 3.2:

Tỷ lệ phát hiện ngƣời lành mang gen bệnh bằng kỹ thuật
microsatellite DNA ..................................................................... 89

Bảng 3.3:

Kết quả đánh giá về tỷ lệ phôi phát triển sau khi thụ tinh .......... 91

Bảng 3.4:

Kết quả đánh giá sự phát triển của các phôi thu đƣợc ngày 3 .... 92

Bảng 3.5:

Kết quả sinh thiết phôi chẩn đoán gen và đánh giá sự phát triển
phôi sau sinh thiết 3 ngày ........................................................... 93


DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1.

Hình ảnh chảy máu khớp gối ở bệnh nhân hemophilia A ............ 5

Hình 1.2.

Hình ảnh chảy máu trong cơ ở bệnh nhân hemophilia A ............. 6

Hình 1.3.

Kiểu gen và kiểu hình của bố mẹ và thế hệ sau ............................ 8

Hình 1.4.

Vai trò của yếu tố VIII trong quá trình đông máu huyết tƣơng.. 10

Hình 1.5.

Vị trí của gen mã hóa yếu tố VIII trên NST X ........................... 10

Hình 1.6.

Cấu trúc gen và protein FVIII ..................................................... 11

Hình 1.7.

Protein yếu tố VIII với các vùng chức năng ............................... 12

Hình 1.8.

Sơ đồ di truyền của ngƣời mẹ mang gen kết hôn với bố bình thƣờng15

Hình 1.9.

Sơ đồ di truyền của ngƣời mẹ bình thƣờng kết hôn với bố bị bệnh .15

Hình 1.10.

Sơ đồ phả hệ của ngƣời mẹ mang gen kết hôn với bố bình thƣờng 18

Hình 1.11.

Sơ đồ di truyền của ngƣời mẹ mang gen kết hôn với bố bị bệnh .... 19

Hình 1.12. Quy trình thực hiện thụ tinh trong ống nghiệm .......................... 27
Hình 1.13. Sinh thiết phôi bào giai đoạn blastomere cho chẩn đoán PGD...... 30
Hình 1.14. Ứng dụng của kỹ thuật FISH trong chẩn đoán xác định giới tính
và số lƣợng nhiễm sắc thể ........................................................... 34

Hình 1.15. Sơ đồ phả hệ của một gia đình mang gen đột biến đảo đoạn
intron 22 gây bệnh hemophilia A ............................................... 44
Hình 1.16. Hình ảnh các marker dị hợp tử xác định đột biến gen F8 gây
bệnh hemophilia A ...................................................................... 45
Hình 1.17. Kết quả multiplex PCR sử dụng marker amel, SRY, FXS1108,
DXS9798, trên phôi bào sinh thiết ............................................. 46
Hình 2.1.

Kết quả STR lựa chọn marker dị hợp tử ..................................... 59

Hình 2.2.

Kỹ thuật Microsatellite DNA trong chẩn đoán đột biến gen gây
bệnh di truyền lặn liên kết nhiễm sắc thể giới tính X ................. 60

Hình 2.3.

Kết quả STR xác định giới tính .................................................. 63

Hình 3.1.

Kết quả đồng hợp tử và đồng hợp tử của STR ........................... 65


Hình 3.2.

Kết quả khuếch đại các marker DXS9901, FXS1108, F8int22 và
DXS9897..................................................................................... 66

Hình 3.3.

Tần suất alen của marker FXS 1108 ........................................... 67

Hình 3.4.

Tần suất alen của marker DXS9897 ........................................... 67

Hình 3.5.

Tần suất alen của marker F8int22 ............................................... 68

Hình 3.6.

Tần suất alen của marker DXS9901 ........................................... 68

Hình 3.7.

Sơ đồ phả hệ gia đình HA 61 ...................................................... 69

Hình 3.8.

Hình ảnh giải trình tự gen của gia đình m số HA61 ................. 70

Hình 3.9.

Hình ảnh điện di vùng trình tự lặp lại sử dụng marker FXS1108,
DXS9897 và F8int22 của gia đình HA61 ..................................... 71

Hình 3.10. Sơ đồ phả hệ gia đình HA37 sau khi phân tích bằng hai phƣơng
pháp ............................................................................................. 73

Hình 3.11. Ảnh giải trình tự gen của gia đình m số HA37 ......................... 74
Hình 3.12. Ảnh điện di vùng trình tự lặp lại sử dụng marker DXS9901 và
DXS9897 của gia đình m số HA37........................................... 75
Hình 3.13. Sơ đồ phả hệ gia đình HA50 sau khi phân tích bằng hai phƣơng
pháp ............................................................................................. 76
Hình 3.14. Hình ảnh giải trình tự gen gia đình HA50 .................................. 77
Hình 3.15. Ảnh điện di vùng trình tự lặp lại sử dụng marker DXS9901,
DXS9897 và FXS1108, của gia đình bệnh nhân hemophilia A mã
số HA50 ...................................................................................... 78
Hình 3.16. Sơ đồ phả hệ gia đình HA16 ....................................................... 80
Hình 3.17. Hình ảnh giải trình tự gen của gia đình m số HA16 ................. 81
Hình 3.18. Ảnh điện di vùng trình tự lặp lại sử dụng marker DXS9901 và
DXS9897 của gia đình HA16 ..................................................... 82
Hình 3.19. Sơ đồ phả hệ gia đình HA30 sau khi phân tích .......................... 84
Hình 3.20. Hình ảnh giải trình tự gen của gia đình bệnh nhân mã số HA30 85


Hình 3.21. Ảnh điện di vùng trình tự lặp lại sử dụng marker DXS9901 và
FXS1108, của gia đình bệnh nhân hemophilia A mã số HA30 . 86
Hình 3.22. Ảnh điện di vùng trình tự lặp lại sử dụng marker F8int22,
DXS9897 và DXS9901 của gia đình m số HA09..................... 90
Hình 3.23. Kết quả khuếch đại các marker FXS1108, F8int22, và DXS9897 .. 95
Hình 3.24. Kết quả multiplex PCR khuếch đại 3 marker dị hợp tử FXS1108,
DXS9897 và F8int22 và 2 marker giới tính Amel và SRY trên
mẫu bệnh nhân HA61 ................................................................. 96
Hình 3.25. Ảnh điện di vùng trình tự lặp lại sử dụng marker FXS 1108,
F8int22, DXS 9897 xác định phôi nam bình thƣờng của gia đình
HA61 ........................................................................................... 97
Hình 3.26. Ảnh điện di vùng trình tự lặp lại sử dụng marker FXS 1108,
F8int22, DXS9897 xác định phôi nam bệnh lý gia đình HA61 . 98

Hình 3.27. Sơ đồ phả hệ phôi gia đình HA61............................................... 99
Hình 3.28. Kết quả khuếch đại các marker FXS1108 và DXS9897 ......... 100
Hình 3.29. Ảnh điện di vùng trình tự lặp lại sử dụng marker FXS1108 và
DXS9897 của ngƣời mẹ so sánh với bệnh nhân HA28 ............ 101
Hình 3.30. Ảnh điện di vùng trình tự lặp lại sử dụng marker FXS1108,
DXS9897 xác định phôi nam bình thƣờng gia đình HA28 ...... 103
Hình 3.31. Ảnh điện di vùng trình tự lặp lại sử dụng marker FXS1108,
DXS9897 xác định phôi nam bệnh lý gia đình HA28 .............. 104
Hình 3.32. Ảnh điện di vùng trình tự lặp lại sử dụng marker FXS1108,
DXS9897 xác định phôi nữ mang gen gia đình HA28 ............. 105
Hình 3.33. Ảnh điện di vùng trình tự lặp lại sử dụng marker FXS1108,
DXS9897 xác định phôi nữ không mang gen gia đình HA28 .. 106
Hình 3.34. Sơ đồ phả hệ gia đình HA28 ..................................................... 107
Hình 3.35. Tỷ lệ phôi bất thƣờng và không bất thƣờng về gen .................. 108


1

ĐẶT VẤN ĐỀ

Cùng với sự phát triển của nền kinh tế xã hội, tỷ lệ vô sinh ngày càng gia
tăng và là nỗi lo cho nhiều cặp vợ chồng. Ra đời vào những năm 1970 của thế
kỷ trƣớc, có thể nói phƣơng pháp thụ tinh trong ống nghiệm “in vitro
fertilization - IVF” đ trở thành cứu cánh cho nhiều cặp vợ chồng vô sinh
mong muốn có đứa con [1]. Vào năm 2010 bác sỹ Robert G.Edwards đ vinh
dự trao giải thƣởng Nobel về sinh lý và Y khoa cho những cống hiến to lớn và
hiệu quả mà phƣơng pháp này mang lại [2]. Phƣơng pháp này đ mang lại niềm
vui, niềm hạnh phúc cho bao cặp vợ chồng khắp nơi trên thế giới, tuy nhiên
không phải cặp vợ chồng nào cũng may mắn sinh đƣợc những đứa con mong
muốn bằng phƣơng pháp này. Tỷ lệ thành công của phƣơng pháp này chỉ đạt

hơn 35% tùy theo từng quốc gia [3]. Có rất nhiều yếu tố ảnh hƣởng đến sự
thành công của phƣơng pháp này nhƣ: tuổi bố mẹ, tình trạng sức khỏe, tinh
thần tâm lý, chất lƣợng tinh trùng và trứng… và đặc biệt chất lƣợng phôi sau
khi thụ tinh. Các phôi có thể bất thƣờng nhiễm sắc thể (NST) thƣờng hay NST
giới tính đều làm giảm khả năng mang thai sau khi cấy phôi vào buồng tử cung,
có thể gây sảy thai hoặc sinh ra những đứa con không khỏe mạnh [4],[5],
[6],[7]. Để làm giảm tỷ lệ sinh ra những đứa con không khỏe mạnh và làm tăng
tỷ lệ thành công của phƣơng pháp thụ tinh trong ống nghiệm, thời gian gần đây
các nhà khoa học đ áp dụng quy trình chẩn đoán phôi “Pre-Implantion Genetic
Diagnosis, PGD” còn gọi là “chẩn đoán di truyền trƣớc làm tổ” nhằm có đƣợc
những phôi tốt nhất cho quá trình chuyển phôi [8],[9],[10].
Cùng với sự phát triển của kỹ thuật chọc hút phôi và ứng dụng những
tiến bộ mới nhất của sinh học phân tử vào chẩn đoán, cho đến nay có rất
nhiều bệnh lý di truyền và hầu hết các bất thƣờng trên NST, cả các đột biến
gen quan trọng gây ung thƣ đều có thể đƣợc sàng lọc bằng kỹ thuật PGD [11],


2

[12],[13],[14-15]. Trong số đó, bệnh hemophilia A (bệnh ƣa chảy máu) là loại
bệnh có tỷ lệ mắc cao, bệnh cảnh lâm sàng nặng nề và thƣờng gây ra những
sang chấn lớn về tâm lý cho gia đình và cho ngƣời bệnh. Vì vậy vấn đề đặt ra
là chúng ta phải làm sao giúp cho các cặp vợ chồng mang gen bệnh
hemophilia A sinh đƣợc những đứa con hoàn toàn khỏe mạnh.
Hemophilia A là bệnh di truyền do thiếu hụt hoặc bất thƣờng chức năng
của các yếu tố đông máu VIII [16],[17]. Hemophilia A là bệnh di truyền alen
lặn trên NST X không có alen trên NST Y, nên ngƣời mẹ mang gen bệnh sẽ di
truyền cho con trai và biểu hiện bệnh trên lâm sàng [18]. Theo thống kê của tổ
chức hemophilia A thế giới, hiện nay có khoảng 250.000 bệnh nhân mắc bệnh
hemophilia A và chỉ có khoảng 50.000 đƣợc điều trị đặc hiệu [19]. Tại Việt

Nam, ƣớc tính có khoảng 6000 ngƣời bị bệnh hemophilia A và khoảng 30.000
ngƣời mang gen bệnh hemophilia A [20]. Biểu hiện lâm sàng chủ yếu là chảy
máu ở bất kỳ nơi nào trên cơ thể, và chảy máu kéo dài: chảy máu khớp, chảy
máu trong cơ, chảy máu não, chảy máu trong cổ và ngực… Mức độ biểu hiện
trên lâm sàng liên quan trực tiếp nồng độ yếu tố VIII trong huyết tƣơng.
Việc tầm soát trƣớc sinh bệnh hemophilia A là việc làm hết sức quan
trọng giúp cho việc sinh ra những đứa trẻ hoàn toàn khỏe mạnh. Việc xác
định đột biến gen gây bệnh, sàng lọc ngƣời lành mang gen bệnh và chẩn đoán
trƣớc sinh bệnh hemophilia A đ đƣợc nghiên cứu khá nhiều ở Việt Nam.
Việc quản lý bệnh nhân và ngƣời mang gen của bệnh lý này là tiền đề vững
chắc để triển khai thành công quy trình chẩn đoán trƣớc làm tổ trong sàng lọc
phôi. Phƣơng pháp này sẽ giúp giảm biến chứng và di chứng cho ngƣời mẹ
khi mang thai bệnh lý, giảm chấm dứt thai kỳ do phát hiện bệnh ở thai nhi khi
chẩn đoán tiền sản, mang lại niềm vui hạnh phúc cho các cặp vợ chồng mang
gen bệnh, đồng thời giảm tỷ lệ mắc bệnh ở cộng đồng. Cùng với sự phát triển
của sinh học phân tử phát hiện các đột biến gây bệnh hemophilia A, kỹ thuật


3

microsatellite DNA là kỹ thuật sử dụng các primer gắn huỳnh quang để
khuếch đại vùng trình tự lặp lại ngắn (short tandem repeat-STR) và phân tích
kích thƣớc của chúng thông qua điện di mao quản trên máy giải trình tự gen
để xác định các alen đột biến. Kỹ thuật này có nhiều ƣu điểm là dễ dàng phát
hiện alen đột biến mà không cần xác định các đột biến trực tiếp, vì vậy sẽ
giảm đƣợc chi phí cho gia đình bệnh nhân. Hiện nay kỹ thuật này còn khá
mới mẻ ở Việt Nam ứng dụng trong chẩn đoán các bệnh lý di truyền. Xuất
phát từ thực tế đó đề tài: “Phát hiện ngƣời lành mang gen bệnh và chẩn
đoán trƣớc làm tổ bệnh hemophilia A bằng kỹ thuật microsatellite DNA”
đƣợc đƣa vào nghiên cứu với mục tiêu:

1. Xác định người lành mang gen bệnh hemophilia A bằng kỹ thuật
microsatellite DNA.
2. Chẩn đoán trước làm tổ cho những người mẹ mang gen bệnh
hemophilia A bằng kỹ thuật microsatellite DNA.


4

CHƢƠNG 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. ĐẶC ĐIỂM CHUNG BỆNH HEMOPHILIA A
1.1.1. Định nghĩa
Bệnh hemophilia A là một bệnh di truyền do thiếu hụt hoặc bất thƣờng
chức năng của các yếu tố đông máu trong huyết tƣơng - thiếu hụt yếu tố VIII
gây bệnh hemophilia A, thiếu hụt yếu tố IX gây bệnh hemophilia B, thiếu hụt
yếu tố XI gây bệnh hemophilia C. Bệnh hemophilia A là bệnh rối loạn đông
máu di truyền hay gặp nhất [21], [22].
1.1.2. Lịch sử nghiên cứu
Sự di truyền của bệnh máu khó đông liên kết với giới tính đƣợc phát
hiện từ những năm 80 của thế kỷ 19. Vào thời điểm này, các nhà khoa học
nhận thấy chỉ có nam giới mắc bệnh và không có khả năng truyền bệnh cho
con trai nhƣng truyền gen bệnh cho con gái và ngƣời con gái này có thể
truyền gen bệnh cho con trai mình. Bệnh hemophilia A còn đƣợc biết đến nhƣ
căn bệnh của Hoàng Gia vì nữ hoàng Anh Victoria 1838-1901 mang gen bệnh
này và truyền nó cho nhiều thế hệ sau.
1.1.3. Dịch tễ bệnh học
Theo thống kê của tổ chức hemophilia thế giới (World Federation
of Hemophilia - WFH), hiện nay có khoảng 500.000 bệnh nhân mắc bệnh
hemophilia và chỉ có khoảng 1/3 đƣợc chẩn đoán [23]. Tỷ lệ mắc bệnh
hemophilia A gần giống nhau ở các vùng địa lý, các nƣớc, các chủng tộc, tần

suất mắc bệnh chung khoảng 30-100/1.000.000 dân. Tần suất mắc bệnh
hemophilia A là 1/4000  1/5.000 trẻ trai [24]. Tại Việt Nam, theo những
thống kê không đầy đủ hiện tại có khoảng 6000 bệnh nhân hemophilia. Số
liệu điều tra những năm 1994  1996 về tình hình bệnh hemophilia ở miền


5
Bắc Việt Nam cho thấy tỷ lệ bệnh hemophilia là 25  60/1.000.000 dân. Tại
mít tinh hƣởng ứng ngày hemophilia thế giới (17-4-2016), hội rối loạn đông
máu Việt Nam và Viện Huyết học - Truyền máu Trung ƣơng đ công bố có
6000 ngƣời bị bệnh chảy máu di truyền [25].
1.1.4. Đặc điểm lâm sàng và chẩn đoán bệnh hemophilia A
1.1.4.1. Đặc điểm chảy máu trong bệnh hemophilia A
Bệnh đặc trƣng bởi thời gian đông máu kéo dài và tăng nguy cơ chảy
máu. Biểu hiện lâm sàng chủ yếu là xuất huyết. Xuất huyết có thể tự nhiên
hoặc sau chấn thƣơng nhẹ. Đặc điểm xuất huyết là các đám bầm máu dƣới da,
tụ máu trong cơ, chảy máu ở các khớp.
Chảy máu khớp thƣờng gặp nhất ở bệnh nhân hemophilia A. Đây là loại
chảy máu nguy hiểm vì khi tái phát nhiều lần gây ra viêm khớp, biến dạng khớp
[26]. Chảy máu khớp có thể xuất hiện tự nhiên hoặc sau chấn thƣơng. Nếu điều
trị muộn sau 4 giờ thì cảm giác đau có thể tăng lên, khớp sẽ sƣng và việc điều trị
bị kéo dài tới vài ngày. Trẻ lớn có thể nhận biết đƣợc chảy máu khớp trƣớc khi
đau và sƣng xảy ra với cảm giác gai châm hoặc kiến bò trong khớp. Điều trị sớm
sẽ dự phòng đƣợc tình trạng đau mạn tính và biến dạng khớp.

Hình 1.1. Hình ảnh chảy máu khớp gối ở bệnh nhân hemophilia A
(Nguồn: )
Chảy máu trong cơ bao gồm 10-25% các trƣờng hợp xuất huyết nặng
trong hemoglobin. Huyết khối cơ đƣợc coi là nguyên nhân chính gây ra tình

6

trạng khuyết tật trong chứng chảy máu. Chảy máu trong cơ cũng thƣờng gặp
và xuất hiện tự nhiên hoặc sau chấn thƣơng. Những cơ hay bị chảy máu là:
cơ cẳng chân, cơ đùi, cơ cánh tay. Chảy máu cơ gây ra sƣng đau trong vài
ngày. Một dấu hiệu quan trọng và kín đáo trong chảy máu cơ là cảm giác
đau, nóng, ngứa ran hoặc tê bì. Nếu không đƣợc điều trị sớm cơ sẽ bị phá
huỷ và có thể gây liệt [23].

Hình 1.2. Hình ảnh chảy máu trong cơ ở bệnh nhân hemophilia A
(Nguồn: )
Ngoài ra bệnh nhân có thể bị chảy máu não, chảy máu ở các vị trí khác
nhƣng hiếm gặp xuất huyết dƣới da. Chảy máu từ vết cắt sâu hoặc xƣớc da có
thể kéo dài và hồi phục sau vài ngày mà không cần điều trị. Chảy máu miệng,
lợi và mũi cũng hay gặp. Có thể xuất huyết tiêu hoá và đái máu.
1.1.4.2. Các xét nghiệm cận lâm sàng để chẩn đoán bệnh
Những thay đổi về huyết học ở bệnh nhân hemophilia A:
- Thời gian máu chảy kéo dài, thời gian đông máu kéo dài có thể hơn 1
giờ; chất lƣợng cục máu đông kém; thời gian Howell kéo dài…
+ Hoạt tính yếu tố VIII huyết tƣơng giảm hoặc không có.
+ Yếu tố Von - Willebrand trong máu bình thƣờng.
+ Số lƣợng tiểu cầu trong máu bình thƣờng.


7

1.1.4.3. Chẩn đoán bệnh
 Chẩn đoán xác định [21]
- Dựa vào lâm sàng: Có vết bầm tím, tụ máu, chảy máu.

- Dựa vào tiền sử gia đình
- Dựa vào xét nghiệm máu:
+ Số lƣợng tiểu cầu bình thƣờng, PT (Prothrombin Time: thời gian
prothrombin) bình thƣờng, fibrinogen bình thƣờng, APTT (Activated Partial
Thromboplastin Time: thời gian thromboplastin một phần hoạt hóa) kéo dài
> 1,5 giá trị bình thƣờng.
+ Hoạt tính yếu tố VIII huyết tƣơng giảm dƣới 40%.
+ Yếu tố Von Willebrand bình thƣờng
+ Các xét nghiệm khác: Mixtest xác định kháng thể kháng yếu tố VIII.
 Chẩn đoán mức độ bệnh
Nồng độ yếu tố VIII
Mức độ

(%) (hoạt tính

Biểu hiện chảy máu

(UI/ml))
Nặng
(Chiếm 70%)

Chảy máu tự nhiên không liên
<1% (<0,01)

quan đến chấn thƣơng, thƣờng
chảy máu ở khớp và cơ.
Chảy máu tự nhiên hoặc liên

Trung bình
(Chiếm 15%)

1-5% (0,01-0,05)

quan đến chấn thƣơng nhỏ.
Chảy máu nặng sau chấn
thƣơng, phẫu thuật.

Nhẹ
(Chiếm 15%)

> 5-40% (0,04-0,4)

Chảy máu sau chấn thƣơng
lớn hoặc phẫu thuật.


8

1.2. ĐẶC ĐIỂM DI TRUYỀN VÀ CƠ SỞ PHÂN TỬ HEMOPHILIA A
1.2.1. Cơ chế di truyền bệnh hemophilia A
Đây là một bệnh di truyền lặn liên kết với NST giới tính X, không có
alen trên NST Y: Ở nam chỉ có một NST giới tính X nên nếu NST giới tính
X mang gen bệnh thì lƣợng yếu tố VIII tạo ra không đủ và ngƣời đó bị bệnh
hemophilia A [27]. Đối với nữ giới nhờ có hai NST giới tính X nên nếu một
NST giới tính X mang gen bệnh thì gen bình thƣờng trên NST còn lại vẫn
tổng hợp yếu tố VIII bình thƣờng. Ngƣời phụ nữ không bị bệnh nhƣng mang
một gen bị bệnh sẽ truyền cho con trai và ngƣời con trai sẽ bị bệnh, nếu
truyền cho con gái thì ngƣời con gái sẽ trở thành ngƣời mang gen bệnh.

Hình 1.3. Kiểu gen và kiểu hình của bố mẹ và thế hệ sau

1/ Bố bị bệnh, mẹ bình thƣờng: 100% con gái là ngƣời mang gen bệnh
(XHXh) và 100% con trai bình thƣờng (XHY).
2/ Mẹ mang gen bệnh, bố bình thƣờng: trong một gia đình có bố bình
thƣờng (XHY), mẹ mang gen bệnh (XHXh) (ngƣời truyền bệnh) thì 50% số con
gái sẽ là ngƣời mang gen bệnh (XHXh), 50% con gái bình thƣờng (XX), 50%
con trai bị bệnh (XhY) và 50% con trai bình thƣờng (XHY).
3/ Bố bị bệnh, mẹ mang gen bệnh: 50% con gái bị bệnh (XhXh) đồng
hợp tử, 50% con gái mang gen bệnh (XHXh), 50% con trai bị bệnh và 50%


9

con trai bình thƣờng (XHY). Nhƣ vậy nữ mắc bệnh khi mang đồng hợp tử gen
bệnh (cả 2 thể nhiễm sắc X bị thƣơng tổn: XhXh), nữ mang gen bệnh khi
mang dị hợp tử gen bệnh (một thể nhiễm sắc X bị thƣơng tổn: XHXh).
4/ Do đột biến mới phát sinh trong quá trình tạo giao tử từ ngƣời bố hoặc
từ ngƣời mẹ: thƣờng chiếm khoảng 1/3 các trƣờng hợp hemophilia A. Tỉ lệ đột
biến gây bệnh hemophilia xảy ra là 3 x 106 trên gen và trên một giao tử trong
một thế hệ [31]. Tỷ lệ đột biến mới xảy ra ở tế bào mầm sinh dục của nam cao
hơn 5 lần so với ở tế bào mầm sinh dục của nữ. Gần đây, ngƣời ta đ chứng
minh rằng tần suất đột biến theo giới tùy thuộc vào loại đột biến. Đột biến đảo
đoạn intron 22 ở tế bào mầm sinh dục nam nhiều hơn 15 lần so với ở tế bào
mầm sinh dục nữ. Hiện tƣợng này giải thích cho sự vắng mặt nhiễm sắc thể
thứ hai tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình đảo đoạn trong giai đoạn phân
bào giảm nhiễm ở nam.
1.2.2. Cơ sở phân tử bệnh hemophilia A
Từ năm 1984, nghiên cứu của Vehar và cộng sự đ cho thấy những
hiểu biết đầy đủ về cấu trúc phân tử gen F8 tổng hợp protein FVIII, mở
đƣờng cho các nghiên cứu về cơ chế phân tử bệnh hemophilia A và các dạng
đột biến gen F8 gây bệnh.

Trong con đƣờng đông máu nội sinh, yếu tố VIII đóng vai trò là đồng
yếu tố với yếu tố IX hoạt hóa (IXa) với sự có mặt của Ca2+ và phospholipid
tiểu cầu hoạt hóa yếu tố X thành Xa, từ đó tác động nên sự hình thành
thrombin từ prothrombin, giúp cho quá trình tạo và cố định fibrin từ
fibrinogen, hoàn thiện quá trình tạo cục máu đông cùng với tiểu cầu và yếu tố
thành mạch. Việc thiếu hụt hoặc bất thƣờng chức năng yếu tố VIII làm ngừng
trệ dòng thác đông máu theo con đƣờng nội sinh, dẫn đến tình trạng chảy máu
kéo dài, không cầm ở bệnh nhân hemophilia A.


10

Yếu tố mô

Fibrinogen

Yếu tố bề mặt

Fibrin

ổn đinh fibrin

Hình 1.4. Vai trò của yếu tố VIII trong quá trình đông máu huyết tương
1.2.2.1. Vị trí và cấu trúc của gen mã hóa yếu tố VIII
Gen F8 quy định tổng hợp yếu tố VIII nằm ở vị trí Xq28 trên NST giới
tính X, là một trong những gen lớn nhất của ngƣời, có kích thƣớc 186 Kb gồm
26 exon, trong đó 24 exon có kích thƣớc từ 62bp đến 262bp và 2 exon lớn
nhất là exon 14 (3106 bp) và exon 26 (1958 bp), m hóa 9 Kb mRNA. Ngƣời
đột biến gen F8 gây thiếu hoặc không tổng hợp đƣợc yếu tố VIII, làm rối
loạn quá trình đông máu biểu hiện thành triệu chứng lâm sàng của bệnh

hemophilia A [28].

Nhiễm sắc thể X

Hình 1.5. Vị trí của gen mã hóa yếu tố VIII trên NST X
(Nguồn: www.hemophilia.com)


11

Gen mã hóa yếu tố VIII có chuỗi nặng với đầu cuối là N, gồm các
domain A1-A2-B, chuỗi nhẹ có đầu cuối là C, gồm các domain A3-C1-C2 và
vùng B. Khi thủy phân hoàn toàn domain B tạo thành asparagin, serin và
threonin. Vùng B không cần cho chức năng của yếu tố VIII và sau quá trình
dịch m , domain B bị cắt khỏi chuỗi nặng của yếu tố VIII.
1.2.2.2. Protein yếu tố VIII

Hình 1.6. Cấu trúc gen và protein FVIII [29]
Bản chất yếu tố VIII là polypeptid có cấu trúc A1-A2-B-A3-Cl-C2,
gồm hai chuỗi: chuỗi nặng là đoạn A1-A2-B có kích thƣớc 200 kD, chuỗi nhẹ
là đoạn A3-C1-C2 có kích thƣớc 80 kD. Cấu trúc của phức hợp này đƣợc giữ
ổn định nhờ sự tƣơng tác giữa các liên kết ƣa nƣớc và kỵ nƣớc với yếu tố von
Willebrand (vWF - là một kháng nguyên liên quan đến yếu tố VIII) và Ca2+.
Chuỗi nặng có đầu cuối là N, gồm các vùng A1-A2-B, chuỗi nhẹ có đầu cuối
là C, gồm các vùng A3-C1-C2. Vùng B đƣợc mã hóa bởi một exon lớn và


12

không có sự tƣơng đồng với bất kỳ gen nào đ biết. Khi thủy phân hoàn toàn

domain B tạo thành asparagin, serin và threonin. Vùng B không cần cho chức
năng của yếu tố VIII và sau quá trình dịch mã, domain B bị cắt khỏi chuỗi
nặng của yếu tố VIII.
Nơi bám c a các
ion Ca2+, Cu2+ và
A2 các yếu t IX, X

A1

A3
ị tr bám cho
yếu t vWF, X

C2

C1

Hình 1.7. Protein yếu tố VIII với các vùng chức năng
(Nguồn w.w.w. nature.com/revieus/genetics)
ng

( 1

2

3) là nơi bám c a các ion Ca2+, Cu2+ và các yếu t I

trong quá tr nh đ ng máu.

ng C (C1 C2) là vị tr bám cho yếu t v

và c a các phân t phospholipid một hi

III đư c ho t h a.

vị tr cắt c a thrombin đ đư c lo i bỏ trong phân t

ng

chứa

III trong quá tr nh

ho t h a FVIII
1.2.2.3. Các dạng đột biến gen F8 gây bệnh hemophilia A
Có nhiều dạng đột biến gen F8 gây bệnh hemophilia A. Nghiên cứu
của Oldenburg và cộng sự đ chỉ ra rằng các dạng đột biến điểm (thay thế
nucleotid gây đột biến sai nghĩa hoặc vô nghĩa) chiếm tỷ lệ cao nhất (47,5%)
tiếp đến là dạng đột biến đảo đoạn gồm đảo đoạn intron 1 và intron 22
(36,7%), còn lại là đột biến xóa đoạn gen chiếm khoảng 10 – 15%. Tùy
thuộc vào kiểu và vị trí đột biến trên gen F8 mà gây ra các thể bệnh nặng
nhẹ khác nhau nhau[16].


13

Đột biến điểm
Đột biến điểm gen F8 khi có sự thay đổi nucleotid trên gen. Nghiên
cứu của Shima và cộng sự chỉ ra rằng đột biến thay thế arginin thành histidin
tại vị trí 372 gây biến đổi vị trí cắt của thrombin và làm quá trình hoạt hóa

yếu tố VIII bị rối loạn, hoạt tính yếu tố VIII giảm mạnh còn 3  5% [30].
Năm 2000, Jacquemin và cộng sự đ chứng minh đột biến thay thế Serin
thành Tyrosin tại vị trí 2119 (vùng C 2) làm giảm đột ngột khả năng tƣơng
tác giữa yếu tố VIII và yếu tố vWF, dạng đột biến này thƣờng gặp ở thể nhẹ
và trung bình [31].
Theo thống kê, khoảng gần 60% các đột biến điểm ảnh hƣởng tới acid
amin arginin, phần lớn các bệnh nhân mang đột biến này đều ở thể nặng [16-19].
Đột biến đảo đoạn
Mặc dù không có vai trò trong việc mã hóa hay tham gia vào quá trình
hoạt hóa yếu tố VIII nhƣng các vùng intron của gen F8 lại là tác nhân chính gây
ra các dạng đột biến đảo đoạn ở bệnh nhân hemophilia A thể nặng [32].
Dạng đột biến đảo đoạn phổ biến nhất là đảo đoạn intron 22, chiếm hơn
50% các thể bệnh nặng. Cách gen F8 một đoạn 500kb về phía đầu mút
telomere, NST X tồn tại hai vùng int22h2 và int22h3 có trình tự tƣơng đồng
đến 99,9% với một đoạn thuộc intron 22 gen F8 (vùng int22h1). Quá trình tái
tổ hợp tƣơng đồng giữa vùng int22h1 và một trong hai vùng int22h2 và
int22h3 chia cắt gen F8 thành 2 đoạn (exon 1-22 và exon 23-26) cách nhau
400kb gây bất hoạt hoàn toàn gen mã hóa yếu tố VIII [32].
Đột biến mất đoạn và thêm đoạn của gen yếu tố VIII
Đột biến mất đoạn lớn chiếm 2-5% bệnh nhân hemophilia A thể nặng.
Có thể mất 1 exon hoặc mất toàn bộ gen. Cơ chế phân tử của dạng đột biến
này đ đƣợc kết luận là do quá trình tái tổ hợp dẫn đến hiện tƣợng lặp lại alu
[17]. Đột biến chèn đoạn lớn và hiện tƣợng alu làm đứt g y gen F8 và gây