Nghiên cứu các đặc tính quang của hạt nano vàng được chức năng hóa để ứng dụng trong phát hiện vi khuẩn gây bệnh bằng phép đo màu

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

LUẬN VĂN THẠC SĨ

NGHIÊN CỨU CÁC ĐẶC TÍNH QUANG CỦA HẠT NANO
VÀNG ĐƯỢC CHỨC NĂNG HÓA ĐỂ ỨNG DỤNG TRONG
PHÁT HIỆN VI KHUẨN GÂY BỆNH BẰNG PHÉP ĐO MÀU

Chuyên ngành: Quang học
Mã số: 8.44.01.10

Học viên: Vũ Thị Lanh
Hướng dẫn khoa học: TS. Trần Quang Huy

THÁI NGUYÊN - 2019


LỜI CẢM ƠN

Trong quá trình học tập và nghiên cứu tại Khoa Vật lý và Công nghệ Trường Đại học Khoa học – Đại học Thái Nguyên, tôi đã nhận được sự quan
tâm và sự giúp đỡ tận tình của các thầy cô và anh chị trong Khoa cũng như
trong Trường. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn với những giúp đỡ đó.
Đặc biệt, tôi xin chân thành cám ơn TS. Trần Quang Huy, người thầy đã
trực tiếp hướng dẫn tôi thực hiện luận văn này.
Tôi xin chân thành cám ơn Ban giám hiệu, và các thầy cô trong bộ môn
Trường Trung học phổ thông Quế Võ số 3, Bắc Ninh đã tạo điều kiện cho tôi
theo học chương trình này.
Tôi cũng xin chân thành cám ơn các thầy cô trong Viện Vệ sinh Dịch tễ
Trung ương, Viện Nghiên cứu Nano – Trường Đại học Phenikaa đã tạo mọi
điều kiện về máy móc, trang thiết bị và phòng thí nghiệm để tôi có thể hoàn

thành luận văn này.
Cuối cùng tôi xin cám ơn gia đình, bạn bè và đồng nghiệp đã luôn ủng hộ
tôi trong suốt quá trình học tập tại Thái Nguyên cũng như đi làm thí nghiệm.
Thái Nguyên, ngày 6 tháng 11 năm 2019
Học viên

Vũ Thị Lanh

I


II


LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan rằng đây là công trình nghiên cứu của tôi dưới sự giúp
đỡ về mặt chuyên môn và hướng dẫn khoa học của TS. Trần Quang Huy. Đề
tài nghiên cứu được sự hỗ trợ của dự án Nghị định thư mã số:
NĐT.05.ITA/15. Kết quả khóa luận là trung thực và không sao chép từ bất cứ
tài liệu nào. Những nội dung khóa luận có tham khảo và sử dụng các tài liệu
đã công bố của nhóm nghiên cứu và trên các tạp chí và các trang web uy tín
đều được trích dẫn và liệt kê trong danh mục tài liệu tham khảo của luận văn.
Hà Nội, ngày 6 tháng 11 năm 2019
Tác giả luận văn

Vũ Thị Lanh
Xác nhận

Xác nhận

của Trưởng Khoa chuyên môn

của cán bộ hướng dẫn khoa học

TS. Trần Quang Huy

II


MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN…………………………………………………………………..I
LỜI CAM ĐOAN …………………………………………………………….II
MỤC LỤC…………………………………………………………………….III
DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT …………………………IV
DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH, ĐỒ THỊ …………………………………..VI
DANH MỤC BẢNG BIỂU ………………………………………………..VIII
MỞ ĐẦU...............................................................................................................1
CHƯƠNG 1. CƠ SỞ LÝ THUYẾT .....................................................................4
1.1. Tổng quan về nano vàng ................................................................................4
1.1.1. Tính chất của nano vàng .............................................................................5
1.1.2. Chế tạo nano vàng.......................................................................................8
1.2 Chức năng hóa hạt nano vàng .........................................................................9
1.3 Ứng dụng của nano vàng trong y sinh ..........................................................13
CHƯƠNG 2. PHƯƠNG PHÁP THỰC NGHIỆM.............................................16
2.1 Vật liệu, hóa chất và trang thiết bị ................................................................16
2.1.1. Vật liệu, sinh phẩm ...................................................................................16
2.1.2. Thiết bị phân tích ......................................................................................16
2.2. Chế tạo nano vàng bằng phương pháp điện hóa ..........................................16
2.3 Chức năng hóa hạt nano vàng với kháng thể ................................................17
2.4. Tạo que thử để phát hiện vi khuẩn tụ cầu vàng bằng phép đo màu.............19

2.5.1 Nồng độ nano vàng ....................................................................................21
2.5.2 Nồng độ kháng thể .....................................................................................21
2.5.3 Độ pH.........................................................................................................22
2.5.4 Thời gian tạo phức hợp ..............................................................................22
2.5.5. Nhiệt độ tạo phức hợp...............................................................................22
2.6 Thử nghiệm khả năng phát hiện vi khuẩn tụ cầu vàng .................................22
2.7. Khảo sát các đặc trưng của nano vàng trước và sau khi chức năng hóa .....23

3


2.7.1. Phương pháp đo phổ hấp thụ UV-vis. ......................................................23
2.7.2. Hiển vi điện tử truyền qua (TEM). ...........................................................24
2.7.3. Hển vi điện tử quét ( SEM )......................................................................25
2.7.4. Phân tích thành phần (EDX). ....................................................................26
2.8. Kết luận ........................................................................................................27
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN......................................................28
3.1. Nano vàng chế tạo bằng phương pháp điện hóa ..........................................28
3.2. Phức hợp nano vàng – kháng thể và đặc tính quang ...................................32
3.2.1 Nồng độ kháng thể gắn với nano vàng và các đặc tính quang ..................32
3.2.2 Xác định độ pH dung dịch nano vàng để tạo phức hợp.............................35
3.2.3.Xác định thời gian tạo phức hợp nano vàng – kháng thể ..........................36
3.2.4.Nhiệt độ tạo phức hợp................................................................................37
3.3. Tạo que thử trên cơ sở phức hợp nano vàng -kháng thể để phát hiện vi
khuẩn tụ cầu vàng ...............................................................................................37
3.4 Khả năng phát hiện vi khuẩn tụ cầu vàng sử dụng phức hợp nano vàng –
kháng thể tích hợp trên que thử nhanh................................................................39
3.5 Kết luận .........................................................................................................41
KẾT LUẬN CHUNG..........................................................................................42
KIẾN NGHỊ ........................................................................................................43

TÀI LIỆU THAM KHẢO ..................................................................................44
CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ .................................................................................49

4


DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT
TT

Viết tắt

1.

Au

2.

AuNPs

Nano vàng

3.

CTAB

Tetradodecylammonium bromide

4.

DNA

Deoxyribonucleic Acid

5.

DLS

Tán xạ ánh sáng động học (Dynamic Light Scattering)

6.

E. coli

Escherichia coli

7.

EDX

Tán xạ năng lượng tia X

8.

PEG

Polyethylene glycol

9

PBS

Dung dịch đệm (Phosphate buffered saline)

10.

PSMA

11.

S. aureus

12.

SEM

13.

ssDNA

14.

TEM

Hiển vi điện tử truyền qua

15.

XRD

Nhiễu xạ tia X

16.

UV-vis

Giải nghĩa
Vàng

Kháng nguyên màng tế bào tuyến tiền liệt
Tụ cầu (Staphyloccocus aureus)
Hiển vi điện tử quét
DNA sợi đơn (Single strain DNA)

Tử ngoại khả kiến

5


DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH, ĐỒ THỊ
Hình 1.1. Cấu trúc lập phương tâm mặt tinh thể Au

4

Hình 1.2. Tương tác của sóng điện từ với hạt nano vàng tạo ra hiện tượng

5

cộng hưởng bề mặt (a) và đỉnh phổ hấp thụ theo kích thước hạt nano vàng (b)
Hình 1.3. Sự thay đổi màu sắc của dung dịch nano vàng theo kích thước

6

Hình 1 .4. Ứng dụng của nano vàng trong y sinh

13

Hình 2.1. Mô hình chế tạo dung dịch nano vàng

17

Hình 2.2 Quy trình gắn kháng thể với hạt nano vàng

18

Hình 2.3. Máy phun vạch kháng thể lên màng nitrocellulose tại Viện Công nghệ

20

sinh học và Công nghệ thực phẩm, Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội
Hình 2.4 Nguyên lý tạo que thử sắc ký miễn dịch

21

Hình 2.5. Máy quang phổ UV-vis

23

(Dynamica, Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương)
Hình 2.6. Học viên làm việc trên kính hiển vi điện tử truyền qua (JEM 1010,

25

JEOL).
Hình 2.7. Học viên làm việc trên kính hiển vi điện tử quét (S-4800, Hitachi).

26

Hình 2.8. Thiết bị phân tích EDX (EMAX-Horiba) gắn trên SEM tại Viện Vệ

27

sinh Dịch tễ Trung ương
Hình 3.1. Nano vàng chế tạo từ thanh vàng bằng phương pháp điện hóa

28

Hình 3.2. Phổ UV-vis (a) và ảnh TEM hạt nano vàng (b) chế tạo bằng phương

29

pháp điện hóa
Hình 3.3. Ảnh SEM của nano vàng chế tạo bằng phương pháp điện hóa

VI

30


Hình 3.4. Phổ EDX của nano vàng chế tạo bằng phương pháp điện hóa. Ảnh

31

góc trên phải là hình ảnh SEM của vùng phân tích thành phần.
Hình 3.5. Phức hợp nano vàng-kháng thể (a) và tạo tấm cộng hợp (b)

32

Hình 3.6. Phổ UV-vis của nano vàng (a), và phức hợp nano vàng – kháng thể

33

tương ứng với nồng độ 0,5 µg/mL(b); 1 µg/mL (c) và 1,5 µg/mL (d)
Hình 3.7. Sự hình thành vạch màu phụ thuộc nồng độ kháng thể gắn với nano

34

vàng
Hình 3.8. Sự hình thành vạch màu phụ thuộc độ pH dung dịch nano vàng

35

Hình 3.9. Sự hình thành vạch màu phụ thuộc thời gian ủ giữa nano vàng –

36

kháng thể
Hình 3.10. Sự hình thành vạch màu phụ thuộc nhiệt độ ủ giữa nano vàng –

37

kháng thể
Hình 3.11. Quá trình tạo que thử nhanh để phát hiện tụ cầu vàng. Chuẩn bị tấm

38

cộng hợp nano vàng – kháng thể (a); gắn tấm cộng hợp lên trên que thử có gắn
màng nitrocellulose (b); gắn miếng thấm giữ và hút mẫu (c); và đóng gói thành
que thử hoàn chỉnh (d).
Hình 3.12. Ảnh SEM của vi khuẩn tụ cầu vàng (a) và vi khuẩn E.coli O157 (b)

39

Hình 3.13. Vạch màu xác nhận khả năng phát hiện vi khuẩn tụ cầu vàng (S.

40

aureus) (cột trái) và E. coli O157 (cột phải) sử dụng que thử nhanh tích
hợp

VII


DANH MỤC BẢNG BIỂU
Bảng 1.1 Một số phương pháp chức năng hóa và ứng dụng của nano vàng

VIII

9

MỞ ĐẦU
Trong hơn 20 năm trở lại đây, công nghệ nano luôn là một trong những
công nghệ thu hút được sự quan tâm lớn nhất của các nhà khoa học cũng như
người dân trên toàn thế giới. Hàng loạt phát minh ứng dụng công nghệ nano đã
được thương mại hóa, góp phần đáng kể vào việc cải thiện chất lượng sống
cũng như sự tiến bộ của nhân loại. Nano vàng (AuNPs) là một trong những
nano kim loại điển hình, được các nhà nghiên cứu chú ý ngay từ giai đoạn đầu
khi công nghệ nano phát triển, chúng được khai thác và ứng dụng trong nhiều
lĩnh vực khác nhau, đặc biệt là ngành công nghiệp điện tử và y sinh học [1],
[2]. Nano vàng là vật liệu dễ tổng hợp và chức năng hóa, ít độc tính đối với con
người và hệ sinh thái. Đặc biệt, vật liệu này có những tính chất độc đáo như
hiệu ứng plasmon bề mặt, độ dẫn điện, dẫn nhiệt, độ phản quang cao, và tương
thích với các phần tử sinh học [2]. Chính vì vậy, nano vàng có khả năng ứng
dụng để tiêu diệt tế bào ung thư trên cơ sở hiệu ứng quang nhiệt, dẫn thuốc tới
tế bào đích, tạo ảnh sinh học hay chẩn đoán tác nhân gây bệnh và các ứng dụng
y sinh học khác [3]. Nano vàng có thể được chức năng và gắn với kháng thể
kháng mầm bệnh đặc hiệu, giúp đánh dấu hoặc phát hiện chính xác sự có mặt
của mầm bệnh trong mẫu phân tích. Trong các que thử nhanh chế tạo dựa trên
nguyên lý và kỹ thuật sắc ký miễn dịch, nano vàng được sử dụng như chất chỉ
thị để tạo vạch màu, chúng giúp xác định nhanh kết quả âm hay dương tính
bằng mắt thường đối với bệnh hay triệu chứng nào đó. Theo một phân tích gần
đây từ các công trình công bố liên quan đến kỹ thuật sắc ký miễn dịch trên
Scopus, có hơn 88% công trình liên quan sử dụng chất chỉ thị là nano vàng [4].
Tuy nhiên, một trong những yếu tố quan trọng là làm sao đảm bảo được hoạt
tính và độ ổn định của hệ nano vàng sau khi chức năng hóa; điều kiện gắn kết
có ảnh hưởng như thế nào đến tính chất quang của hệ mẫu trong khi vẫn đảm
bảo khả năng tạo màu để có thể dễ dàng quan sát và nhận biết bằng mắt thường.
Trong một đề tài luận văn nghiên cứu gần đây, dưới sự hướng dẫn của TS.
Trần Quang Huy, học viên Hoàng Long thực hiện thành công nghiên cứu chế
1

tạo nano vàng sạch bằng phương pháp điện hóa [5]. Phương pháp này đã góp
phần đảm bảo được chất lượng của nano vàng do khả năng kiểm soát được độ
sạch của nguyên liệu đầu vào cũng như sản phẩm đầu ra, có thể điều khiển được
kích thước hạt nano và chí phí thấp, đảm bảo được tính chất lí hóa và thân thiện
với môi trường, đặc biệt không có chất tồn dư độc hại trong sản phẩm.
Để hướng tới những ứng dụng cụ thể của nano vàng chế tạo bằng phương pháp
điện hóa trong chẩn đoán nhanh tác nhân gây bệnh, đặc biệt là các tác nhân điển
hình gây nhiễm trùng bệnh viện hay bệnh truyền nhiễm, với điều kiện trang
thiết bị hiện có của phòng thí nghiệm và sự định hướng của Thầy hướng dẫn, tôi
đã lựa chọn chủ đề "Nghiên cứu các đặc tính quang của hạt nano vàng được
chức năng hóa để ứng dụng trong phát hiện vi khuẩn gây bệnh bằng phép đo
màu" làm đề tài của luận văn.
Mục tiêu nghiên cứu bao gồm
- Chế tạo nano vàng sạch bằng phương pháp điện hóa và phân tích các đặc trưng
quang của hạt nano vàng trước và sau khi chức năng hóa với kháng thể ở các
điều kiện khác nhau.
- Thử nghiệm khả năng phát hiện vi khuẩn gây bệnh bằng phép đo màu sử dụng
hạt nano vàng đã chức năng hóa.
Phương pháp nghiên cứu
- Tập hợp tài liệu, tổng quan về khả năng ứng dụng nano vàng trong phát hiện
tác nhân gây bệnh.
- Thiết kế thí nghiệm để chế tạo nano vàng có kích thước thích hợp bằng
phương pháp điện hóa.
- Thực hiện các phép đo hiển vi điện tử truyền qua (TEM), hiển vi điện tử quét
(SEM), phân tích thành phần (EDX) … để khảo sát về hình thái, cấu trúc, thành
phần hóa học của nano vàng chế tạo được.
- Thực hiện các phép đo như như phổ hấp thụ tử ngoại khả kiến (UV-vis) để
khảo sát các đặc trưng quang của hệ vật liệu.

2


- Thiết kế và chế tạo que thử sử dụng kỹ thuật sắc ký miễn dịch để đánh giá
khả năng gắn kết nano vàng - kháng thể và khả năng phát hiện vi khuẩn tụ cầu
vàng.
- Phân tích đánh giá các kết quả thí nghiệm và viết luận văn
BỐ CỤC LUẬN VĂN GỒM CÁC PHẦN
Mở đầu
Chương 1: Cơ sở lí thuyết
Trình bày tổng quan về công nghệ nano vàng và ứng dụng; quy trình chức năng
hóa nano vàng với kháng thể, đề xuất vấn đề nghiên cứu mà luận văn sẽ giải
quyết.
Chương 2: Phương pháp thực nghiệm
Trình bày về nguyên vật liệu, hóa chất và trang thiết bị thí nghiệm cần thiết;
Quy trình chế tạo nano vàng; Phương pháp khảo sát các trưng lí-hóa của nano
vàng như phổ hấp thụ (UV-Vis), hiển vi điện tử truyền qua (TEM), hiển vi điện
tử quét (SEM) và phổ tán xạ năng lượng tia X (EDX); quy trình chức năng hóa
hạt nano vàng với kháng thể; thiết kế và chế tạo que thử nhanh dựa trên kỹ thuật
sắc ký miễn dịch để phát hiện vi khuẩn tụ cầu vàng dựa trên phép đo màu.
Chương 3: Kết quả và bàn luận
Các kết quả thực nghiệm và bàn luận về những ưu nhược điểm của kết quả đạt
được. Các bảng, biểu đồ, hình về các đặc tính quang học của nano vàng trước và
sau chức năng hóa với kháng thể. Những số liệu thực nghiệm về khả năng phát
hiện vi khuẩn gây bệnh bằng phép đo màu sử dụng hạt nano vàng đã chế tạo và
chức năng hóa.
Kết luận chung và kiến nghị
Tóm tắt những kết quả nổi bật mà luận văn đã đạt được. Những kiến nghị của
luận văn.

3


CHƯƠNG 1. CƠ SỞ LÝ THUYẾT
1.1. Tổng quan về nano vàng
Vàng (Au) là một trong những kim loại quý điển hình, do vậy chúng
không những thể hiện đầy đủ tính chất lý hóa của một kim loại mà còn có thêm
một số tính chất đặc biệt. Trong bảng hệ thống tuần hoàn, Au có số thứ tự 79 và
10

9

2

cấu hình điện tử Xe5d 6s và Xe5d 6s [6]. Nhờ sự linh động của các điện tử
trong nguyên tử nên vàng có tính dẻo dai đặc biệt so với các kim loại khác.
Ở trạng thái khối (bulk), vàng có màu vàng ánh kim, nhiệt độ nóng chảy
o

o

7

lên tới 1.063,4 C, nhiệt độ sôi 2.880 C, dẫn nhiệt 310 W/m.K, dẫn điện: 40.10

Ω/m. Kim loại vàng rất bền dù ở trong điều kiện không khí khô hay có độ ẩm
cao. Tuy nhiên, không giống như ở trạng thái vật liệu khối, vàng ở kích thước
nano có những tính chất rất đặc biệt nhất là hiệu ứng cộng hưởng Plasmon bề
mặt [6], [7]

Au có cấu trúc tinh thể dạng lập phương tâm mặt (Hình 1.1), mỗi
nguyên tử liên kết với 12 nguyên tử xung quanh với hằng số mạng: 4,0786 Å.

Hình 1.1. Cấu trúc lập phương tâm mặt tinh thể Au [8]


1.1.1. Tính chất của nano vàng
a) Tính quang học
Trong khi vàng ở dạng khối có màu vàng thì dung dịch chứa các hạt vàng ở
kích thước nano (1-100 nm) có màu sắc thay đổi từ hồng nhạt đến đỏ tía và tím
than tùy theo kích thước và nồng độ của hạt. Sự thay đổi màu sắc này là do hiệu
ứng cộng hưởng Plasmon bề mặt (surface plasmon resonance - SPR). Khi ánh
sáng tác động lên bề mặt hạt nano, các electron tự do của nguyên tử vàng bị
kích thích và ngay lập tức tạo ra một điện từ trường dao động, chúng bị dồn về
một phía và tạo ra sự phân cực [2]. Sự dao động này được gọi là “plasmon”
(Hình 1.2a).

Hình 1.2. Tương tác của sóng điện từ với hạt nano vàng tạo ra hiện tượng cộng
hưởng bề mặt (a) và đỉnh phổ hấp thụ theo kích thước hạt nano vàng (b) [2]


Hay giải thích một cách chi tiết hơn, hiện tượng cộng hưởng plasmon bề mặt là
sự kích thích các electron tự do bên trong vùng dẫn, dẫn tới sự hình thành các
dao động đồng pha. Khi kích thước một tinh thể kim loại nhỏ hơn bước sóng
của bức xạ tới sẽ xuất hiện hiện tượng cộng hưởng plasmon bề mặt. Đối với hạt
nano vàng dao động cộng hưởng plasmon dẫn đến sự hấp thụ mạnh của ánh
sáng vùng khả kiến. Điều này dẫn đến sự đổi thay của màu sắc của dung dịch
nano vàng. Số lượng và vị trí của dải plasmon phụ thuộc chủ yếu vào kích thước
và hình thái của nano vàng.
Đối với tinh thể kim loại, thông thường những dao động này nhanh chóng bị

dập tắt bởi sai hỏng mạng hay bởi chính các nút mạng tinh thể khi quãng đường
tự do trung bình của điện tử nhỏ hơn kích thước. Tuy nhiên, khi kích thước của
kim loại nhỏ hơn quãng đường tự do trung bình của ánh sáng kích thích sẽ
không còn hiện tượng dập tắt mà điện tử sẽ dao động cộng hưởng với ánh sáng
kích thích. Do vậy, tính chất quang của hạt nano là do sự dao động tập thể của
các điện tử trong vùng dẫn khi tương tác với bức xạ sóng điện từ. Quá trình dao
động như vậy sẽ dẫn tới sự phân bố lại các điện tử trong hạt nano làm cho hạt
nano bị phân cực tạo thành một lưỡng cực điện. Chính vì thế, tần số cộng hưởng
xuất hiện phụ thuộc vào nhiều yếu tố đặc biệt là về hình dạng, kích thước và độ
lớn của hạt nano cũng như môi trường xung quanh. Khi kích thước hạt nhỏ ở
dải hẹp, đỉnh hấp thụ ở vùng ánh sáng khả kiến hẹp và chỉ tạo ra một đỉnh duy
nhất, tuy nhiên khi hạt càng lớn thì đỉnh hấp thụ càng bị lệch về phía bước sóng
dài (Hình 1.2b). Bằng mắt thường cũng có thể quan sát thấy rằng, khi hạt ở kích
thước 5 – 50 nm, dung dịch có màu đỏ đậm (như rượu vang đỏ), nhưng khi kích
thước lớn hơn (50-200 nm) màu sẽ chuyển từ đỏ tươi sang màu đỏ đục (Hình
1.3).


Hình 1.3. Sự thay đổi màu sắc của dung dịch nano vàng theo kích thước [9]
b) Tính dẫn điện và nhiệt
Tương tự như các nano kim loại khác, do có mật độ điện tử tự do cao nên
nano vàng có khả năng dẫn điện và nhiệt rất tốt. Hơn nữa, vàng không bị oxy
hóa nên được ứng dụng rộng rãi trong ngành công nghiệp điện tử.
Điện trở suất của vàng là 0,022 µΩ và độ dẫn nhiệt là 310 W/m.K ở 20°C.
Nhiệt độ nóng chảy của nano vàng (Tm) phụ thuộc vào mức độ liên kết giữa các
nguyên tử trong mạng tinh thể. Khi hạt nano tăng kích thước, nhiệt độ nóng
chảy sẽ tăng theo. Ví dụ: AuNPs kích thước 2 nm có Tm = 500°C, với 6 nm có
Tm = 950°C [10], [11].
Đặc biệt, vàng có khả năng chống ăn mòn cao so với các kim loại khác,
chúng chỉ bị ăn mòn bởi hỗn hợp axit nitric và axit clohydric

c) Khả năng tương thích sinh học
Từ xa xưa, vàng đã thể hiện là một trong những vật liệu có khả năng tương
thích sinh học cao, chúng là kim loại quý, được dùng làm đồ trang sức hoặc bọc
răng. Trong y học cổ truyền, vàng có vị cay đắng, tính bình, có công dụng trấn
tâm, an thần và giải độc. Theo Shukla và cs [12] các hạt nano vàng không gây


độc tế bào, làm giảm quá trình sản xuất các loại nitrite, oxy phản ứng và không
làm phát sinh các cytokine tiền viêm TNF-alpha và IL1-beta .
1.1.2. Chế tạo nano vàng
Có nhiều phương pháp chế tạo nano vàng khác nhau như từ trên xuống
(top-down) sử dụng các kỹ thuật vật lý để tách nano vàng từ vàng khối, hoặc
phương pháp từ dưới lên (bottom up) bằng cách khử muối vàng [10]. Mỗi
phương pháp đều có những ưu điểm và nhược điểm riêng liên quan đến chi phí
chế tạo, độ sạch, kích thước hạt và dải phân phân bố kích thước hạt. Trong đó
phương pháp khử hóa học, đặc biệt là phương pháp Turkevich được sử dụng
phổ biến nhất [3]. Hạn chế lớn nhất của các phương pháp này là chi phí cho
muối vàng tinh khiết và kiểm soát chất tồn dư sau quá trình phản ứng. Phương
pháp vật lý cũng có thể chế tạo ra hạt nano vàng từ bia vàng sử dụng bắn phá
chum laser, nhưng chi phí cho các thiết bị này thường đắt và người thí nghiệm
phải được đào tạo một cách cơ bản để vận hành thiết bị [13].
Nano vàng còn được tổng hợp bằng phương pháp điện hóa [14], [15].
Hạt nano thu được bằng phương pháp này có thể kiểm soát được độ tinh khiết
do được chế tạo trong nước cất 2 lần hoặc nước khử ion, kiểm soát được vật liệu
ban đầu, có khả năng điều khiển được kích thước và chí phí thấp. Cũng giống
như các phương pháp điều chế khác, khó khăn lớn nhất của phương pháp này là
tìm được các điều kiện điều chế thích hợp để tạo ra hạt nano vàng và điều khiển
được kích thước nano của chúng theo mục đích sử dụng. Khó khăn thứ 2 liên
quan đến nano vàng đó là việc chức năng hóa chúng với các phần tử sinh học
hướng đích để cho các ứng dụng khác nhau trong y sinh.

Một trong những yêu cầu quan trọng khi gắn kết được với các phần tử
sinh học, đặc biệt là khi đưa vào cơ thể người hay động vật thì các hạt nano
vàng điều chế được phải có độ sạch cao, không lẫn với các tạp chất hay chất tồn
dư có nguy cơ phá hủy các phần tử sinh học hay gây độc cho cơ thể.


Do vậy, nghiên cứu này đề xuất phương pháp điều chế và chức năng hóa
nano vàng sạch điều chế từ lá vàng khối bằng phương pháp điện hóa không chỉ
là việc khám phá ra phương pháp chế tạo mới mà còn chủ động tạo ra nguồn
cung nano vàng ổn định cho những ứng dụng trong điều trị và chẩn đoán mầm
bệnh, đặc biệt là khi đưa những vật liệu này vào trong cơ thể người hay động
vật.
1.2 Chức năng hóa hạt nano vàng
Nano vàng sau khi được chế tạo thường không sử dụng trực tiếp trong các
ứng dụng sinh học mà chúng cần được chức năng hóa với các phần tử thích hợp
nhằm tăng cường sự kết nối của chúng với các phân tử sinh học cũng như dẫn
thuốc vào các tế bào một cách đặc hiệu. Trong một bài tổng quan gần đây,
Tiwari và cộng sự [3] đã tổng hợp từ các công trình nghiên cứu về phương pháp
chức năng hóa nano vàng để tạo ra các nhóm chức khác nhau để ứng dụng trong
y sinh (Bảng 1.1). Quá trình chức năng hóa có thể dựa trên việc sử dụng bất kỳ
một nhóm hoặc kết hợp các nhóm như oligo- hoặc polyethylene glycol (PEG),
albumin huyết thanh bò (BSA), oligo hoặc polypeptide, oligonucleotides,
antisense hoặc phân tử RNA nhạy, kháng thể, thụ thể tế bào và các phân tử.
Bảng 1.1 Một số phương pháp chức năng hóa và ứng dụng của nano vàng
STT Nhóm chức Ligands/phần tử mang

Tính năng chính

Ứng dụng

năng

1

Polyethyl

PEG với các phối tử như Thích ứng với màng tế Nhằm đưa tới tế bào

ene

chất màu gắn với nhóm

Glycol

thiol

bào

nghiên cứu phân phối
sinh học

(PEG)

2

Nhóm
amine

đích di động và nội bào,

SiRNA vận chuyển

Phù hợp với công nghệ
RNAi


3

Nhóm

Proteins

Tùy thuộc vào peotein

carboxyl

4

Peptide

Thụ thể bề mặt tế bào, Chuyển vị tế bào chất

Di động vào nội bào,

peptide ức chế amyloid + và hạt nhân, tá dược, đại thực bào và cytokine
peptide

kháng

thể, hướng tới các tế bào của các tế bào ung thư.

ung thư tương tự của

oceptide peptide

somatostatin

5

DNA

Aptamer,
AuNPs-

6
7

PEGylated Hướng đích các tế bào
poly

(β-amino ung thư tuyến tiền liệt,
liên

Tạo ảnh sinh học, dẫn
truyền gen

ester), đã được xử lý

siRNA,

kết RNAi-quy định biểu

ssDNA của gen RNA I,

vớiRNA

genantisense hiện gen vận chuyển,

antisens DNA

của p53

phát hiện các gen đặc

Oligonucleotides

hiệu

Liên hợp nano vàng –

RNAi

RNA

RNA đa trị

Kháng thể

ScFv

Kích thước nhỏ hơn,

Điều trị và chẩn đoán

Kháng thể kháng lại các tính trung thực của chất miễn dịch, ví dụ: kháng
thể kháng aflatoxin
tác nhân gây bệnh khác gắn
nhau

Phương pháp chức năng hóa nano vàng có thể tóm tắt như sau:
- PEG hóa (PEGylation)
Đây là phương pháp gắn kết một hoặc nhiều phân tử PEG vào một phân tử
khác, được sử dụng phổ biến nhất để chức năng hạt nano vàng.
Do có khả năng liên kết với màng tế bào và có thể hoạt động như một chất
mang thuốc, AuNPs được PEG hóa phù hợp trong việc hướng đích tế bào và
vận chuyển nội bào của vật liệu sinh học. AuNPs có thể được PEG hóa theo
kiểu dị hợp và nhị phân, trong đó AuNPs được chức năng hóa với nhóm thioctic


ở một đầu và đầu còn lại chất gắn huỳnh quang. Chính vì thế, AuNPs di chuyển
vào nội bào và có thể dễ dàng quan sát và theo dõi dựa trên hình ảnh huỳnh
quang phát ra bởi chất nhuộm đính kèm [16]. AuNPs được PEG hóa như vậy có
thể được sử dụng để phát hiện các khối u trong cơ thể để loại bỏ chúng. Trên
thực tế, thử nghiệm này đã được thực hiện trên chuột bằng cách sử dụng axit
thioctic gắn với AuNPs sau khi PEG hóa [17]. Sự ổn định và khả năng bảo toàn
hoạt tính của hệ phụ thuộc vào kích thước hạt nano, trọng lượng phân tử PEG
và các phối tử dùng trong quá trình PEG hóa. Ngoài ra, khả năng phân bố của
hạt nano vàng cũng phụ thuộc vào các tế bào khác nhau và bản chất hóa lý của
chúng.
-

Chức năng hóa với peptide/amino acid

Các hạt nano vàng được chức năng với axit amin và peptide là phương thức
hữu hiệu để nâng cao tính đặc hiệu và hiệu quả của hệ dẫn thuốc. Nano vàng
được chức năng với các axit amin như lysine, polylysine và glycine gắn DNA,
có thể cho hiệu quả cao hơn trong quá trình dẫn truyền gen mà không có độc
tính. Nano vàng đã được chức năng với amin mang liên hợp siRNA-PEG chống
lại các tế bào ung thư tuyến tiền liệt đã được chứng minh có hiệu quả trong việc
ức chế các gen ung thư [18].
Nano vàng chức năng với peptide cũng đã được sử dụng như tác nhân hướng
đích tế bào hiệu quả. Sự phân bố nano vàng phụ thuộc vào nồng độ peptide
cũng như kích thước hạt. Do đó, với đường kính hạt nano không đổi và mật độ
peptide tăng lên, chúng chuyển hướng đích từ hạt nhân sang mạng lưới nội chất.
Khả năng tồn tại của tế bào có thể là do bản chất nội tại của nano vàng. Các
peptide hoạt hóa được biết đến khi sử dụng để kích hoạt các đại thực bào, và
cũng có tiềm năng được sử dụng như một chất dẫn. Điều này hoàn toàn có thể
thực hiện được do khả năng liên kết các phân tử sinh học khác nhau và các phân
tử nhỏ hơn được bộc lộ trong hệ thống miễn dịch, mà chúng không thể nhận ra
được bởi các đại thực bào [18].


Tương tự như vậy, nano vàng dạng thanh đã được sử dụng làm đầu dò để tạo
ảnh sinh học. Kháng thể đơn dòng chuột đặc hiệu cho thụ thể gây tăng trưởng
biểu bì của người 2 (HER2) được biểu hiện trong các tế bào ung thư biểu mô
SKBR3, được gắn kết với hạt nano vàng hoặc thanh nano vàng để tạo ảnh sinh
học của các tế bào ung thư biểu mô [19]. Nano vàng cũng có thể được chức
năng với Bombesin peptide sử dụng để tạo ảnh các tế bào ung thư vì Bombesin
có ái lực cao với gastrin giải phóng peptide được biểu hiện quá mức trong các tế
bào ung thư [20]. Nano vàng phủ với polyelectrolytes đã được nghiên cứu để
tái cấu trúc 3D hình thành bởi collagen và nguyên bào sợi tim, giảm co và thay

đổi biểu hiện của actin, actin cơ trơn và collagen loại I. Chúng cũng cho thấy
những ứng dụng tiềm năng đối với liệu pháp chống xơ hóa [21]. Tương tự như
vậy, AuNPs được sử dụng để tăng cường liên kết chéo của các sợi collagen
cũng như các vị trí để cung cấp các hợp chất tạo tín hiệu trực tiếp và giảm viêm
[22].
-

Chức năng hóa với oligonucleotide

Nano vàng được nghiên cứu và chức năng hóa với các oligonucleotides cho
những ứng dụng khác nhau trong y sinh học. Cấu trúc nano liên hợp vàng DNA có thể được tổng hợp một cách có kiểm soát, bằng cách gắn các phân tử
DNA sợi đơn thông qua nhóm chức thiol [23]. Các nghiên cứu động học và
nhiệt động lực học trên DNA lai với nano vàng cho thấy rằng ssDNA trước tiên
gắn với AuNPs và sau đó từ từ khuếch tán trên bề mặt của chúng [24]. Cấu trúc
thứ cấp của DNA dạng kẹp tóc ức chế sự tương tác giữa nano vàng và DNA do
đó làm tăng tính ổn định của DNA gắn kết. Cộng hợp aptamer-AuNPs cũng
được khai thác để hướng đích vào các tế bào ung thư tuyến tiền liệt [25]. Điều
này đạt được bằng cách gắn nano vàng với một oligonucleotide bổ sung vào
trình tự của kháng PSMA (kháng nguyên màng tế bào tuyến tiền liệt), do đó tạo
điều kiện cho việc gắn các PSMA-AuNPs với kháng thể kháng PSMA. Những
kết quả này cho thấy vai trò đầy hứa hẹn của các nano vàng trong việc phát
hiện và tạo hình ảnh của các tế bào ung thư.


1.3 Ứng dụng của nano vàng trong y sinh
Nano vàng được chứng minh là một trong những vật liệu nano kim loại
có tiềm năng ứng dụng trong lĩnh vực y sinh, đặc biệt là trong truyền dẫn thuốc
hướng đích để điều trị bệnh, tạo ảnh sinh học, đánh dấu sinh học, nhạy sinh học
và chuẩn đoán, tiêu diệt tế bào ung thư (Hình 1.7) [9, 13]. Nano vàng có thể
chức năng với kháng thể kháng mầm bệnh nhằm đánh dấu hoặc phát hiện chính

xác sự có mặt của mầm bệnh trong mẫu phân tích bằng phương pháp tạo ảnh
sinh học [27]. Trong thiết kế các que thử nhanh, nano vàng được sử dụng làm
chất chỉ thị, chúng hoạt động dựa trên nguyên lí miễn dịch học và tạo màu khi
kết tụ lại với nhau tại các vạch đối chứng và/hoặc vạch kiểm tra [28].
Nano vàng được nghiên cứu và ứng dụng để phát triển một số loại cảm biến
sinh học nhằm tăng cường tín hiệu, đánh dấu nhằm phát hiện nhanh và chính
xác các phân tử sinh học và tác nhân gây bệnh như vi khuẩn, vi rút…


Hình 1 .4. Ứng dụng của nano vàng trong y sinh [3].
Trong khuân khổ đề tài luận văn này, chúng tôi chế tạo hạt nano vàng
sạch và chức năng với kháng thể để phát hiện vi khuẩn tụ cầu vàng
(Staphylococcus aureus – S. aureus) dựa trên phép đo màu. Tụ cầu vàng là một
trong những tác nhân chính gây nhiễm trùng bệnh viện, đặc biệt là tụ cầu kháng
đa thuốc. Tụ cầu thường được tìm thấy trên da hoặc trong mũi bệnh nhân.
Nhiễm tụ cầu vàng từ những vết thương nhỏ trên da có thể dẫn đến viêm nội
tâm mạc, nhiễm trùng đến màng trong tim đe dọa tính mạng.
Theo trang thông tin điện tử của Trung tâm kiểm soát bệnh tật Hoa Kỳ (CDC),
hàng năm Hoa Kỳ có 1,7 triệu người nhiễm trùng bệnh viện và có tới 99 nghìn
người tử vong. Nhiễm trùng bệnh viện không chỉ ảnh hưởng nghiêm trọng tới


sức khỏe người dân mà còn gây thiệt hại nặng nề về kinh tế xã hội. Mặc dù vậy,
việc chẩn đoán bệnh và phát hiện tác nhân vi khuẩn gây nhiễm trùng bệnh viện
chủ yếu vẫn dựa theo phương pháp truyền thống, thông thường qua bốn bước:
(i) làm giàu sơ bộ (tất cả các chủng vi khuẩn đều mọc); (ii) làm giàu có chọn lọc
(vi khuẩn mọc có kiểm soát và tăng nồng độ vi khuẩn); (iii) phân lập (sử dụng
các loại môi trường nuôi cấy khác nhau để chọn lọc); (iv) xác định chủng vi
khuẩn bằng các kỹ thuật sinh hóa, huyết thanh hoặc sinh học phân tử. Nhược
điểm chính của các kỹ thuật chẩn đoán truyền thống là phải thực hiện nhiều

bước và mất thời gian, trong khi bệnh nhân bị nhiễm vi khuẩn nhiễm từ bệnh
viện thường là các chủng kháng kháng sinh hoặc kháng đa thuốc, do vậy cần
điều trị đúng liệu pháp và kịp thời. Thông thường, với các phương pháp chẩn
đoán truyền thống, thời gian nhận được kết quả chính xác chủng vi khuẩn nào
gây bệnh nào phải mất 8 đến 48 giờ, giới hạn phát hiện tới 10 5- 106 cfu/mL nếu
không làm giàu sơ bộ. Trong khi đó, một số kỹ thuật chẩn đoán sinh học phân
tử có độ nhạy cao, có thể cho kết quả sau vài giờ. Tuy nhiên, kỹ thuật này phải
được thực hiện ở phòng xét nghiệm an toàn sinh học bậc 2 trở lên, sinh phẩm
cũng như thiết bị chẩn đoán đắt tiền. Để giảm chi phí cho bệnh nhân, thường
phải kết hợp làm nhiều mẫu bệnh phẩm một lúc, gây khó khăn trong việc chẩn
đoán đối với các những trường hợp mắc bệnh đơn lẻ, hoặc kiểm soát thường
xuyên môi trường bệnh viện để có những biện pháp khử trùng thích hợp. Đặc
biệt, môi trường bệnh viện là nơi chứa rất nhiều các mầm bệnh truyền nhiễm
tiềm ẩn, nhất là sự xuất hiện ngày càng nhiều chủng vi khuẩn và nấm kháng đa
kháng sinh, dễ dàng lây nhiễm cho bệnh nhân, người nhà chăm sóc bệnh nhân
và nhân viên y tế, điều này làm tăng gánh nặng bệnh tật và kinh phí điều trị. Do
vậy, việc phát triển những kỹ thuật chẩn đoán đơn giản và hiệu quả luôn động
lực để các nhà khoa học nghiên cứu và phát triển.