Nghiên cứu đặc điểm hình thái, giải phẫu và trình tự đoạn gen MATK, ITS của cây bảy lá một hoa thu tại huyện bắc sơn, tỉnh lạng sơn
Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (1.99 MB, 54 trang )
ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM
–––––––––––––––––––
TRƯƠNG MẠNH TIẾN
NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI, GIẢI PHẪU VÀ TRÌNH TỰ
ĐOẠN GEN MATK, ITS CỦA CÂY BẢY LÁ MỘT HOA THU TẠI
HUYỆN BẮC SƠN, TỈNH LẠNG SƠN
LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC
THÁI NGUYÊN - 2019
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN
ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM
–––––––––––––––––––
TRƯƠNG MẠNH TIẾN
NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI, GIẢI PHẪU VÀ TRÌNH TỰ
ĐOẠN GEN MATK, ITS CỦA CÂY BẢY LÁ MỘT HOA THU TẠI
HUYỆN BẮC SƠN, TỈNH LẠNG SƠN
Ngành: Sinh học thực nghiệm
Mã số: 8 42 01 14
LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC
Cán bộ hướng dẫn khoa học: PGS.TS. Vũ Thị Thu Thủy
THÁI NGUYÊN - 2019
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN
LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi dưới sự
hướng dẫn của PGS.TS Vũ Thị Thu Thủy. Các kết quả nghiên cứu là trung
thực, một phần đã được công bố trên Tạp chí Khoa học và công nghệ - Đại học
Thái Nguyên với sự đồng ý và cho phép của các đồng tác giả. Phần còn lại
chưa được ai công bố ở bất cứ công trình nào khác.
Thái Nguyên, tháng 9 năm 2019
Tác giả
Trương Mạnh Tiến
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN
LỜI CẢM ƠN
Đầu tiên, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới PGS.TS. Vũ Thị Thu Thủy,
khoa Sinh học trường Đại học sư phạm Thái Nguyên là người đã chỉ bảo,
hướng dẫn em suốt quá trình nghiên cứu và hoàn thành luận văn này.
Em cũng xin gửi lời cảm ơn cảm ơn sâu sắc tới các thầy cô khoa Sinh
học, Trường Đại học Sư Phạm - ĐH Thái Nguyên đã tận tình hướng dẫn,
truyền dạy kiến thức cho em trong suốt khóa học.
Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến các thầy giáo, cô giáo trong Ban
giám hiệu trường Đại học Sư phạm - ĐH Thái Nguyên, thầy, cô các phòng ban
chức năng đã tạo điều kiện và giúp đỡ em trong thời gian học tập tại trường.
Em xin chân thành cảm ơn đồng nghiệp và ban giám hiệu trường THPT
Số 3 Bảo Thắng đã tạo điều kiện giúp đỡ tôi trong thời gian học tập.
Cuối cùng, xin được gửi lời cảm ơn chân thành tới bạn bè và gia đình đã
luôn quan tâm, động viên, ủng hộ và giúp đỡ em.
Luận văn là sản phẩm của Nhiệm vụ quỹ GEN cấp Bộ có mã số B2018TNA-04-GEN do PGS.TS Vũ Thị Thu Thủy Bộ môn Sinh học hiện đại và Giáo
dục sinh học làm chủ nhiệm.
Thái Nguyên, tháng 9 năm 2019
Tác giả
Trương Mạnh Tiến
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN
MỤC LỤC
Lời cam đoan ........................................................................................................ i
Lời cảm ơn ........................................................................................................... ii
Mục lục ............................................................................................................... iii
Danh mục chữ viết tắt ......................................................................................... iv
Danh mục các bảng.............................................................................................. v
Danh mục các hình ............................................................................................. vi
MỞ ĐẦU ............................................................................................................. 1
1. Lý do chọn đề tài ............................................................................................. 1
2. Mục tiêu nghiên cứu ........................................................................................ 2
Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU............................................................... 3
1.1. Cây Bảy lá một hoa ...................................................................................... 3
1.1.1. Vị trí của cây Bảy lá một hoa trong hệ thống phân loại ............................ 3
1.1.2. Đặc điểm thực vật học của cây Bảy lá một hoa ........................................ 4
1.1.3. Giá trị y học của cây Bảy lá một hoa......................................................... 5
1.1.4. Vấn đề bảo tồn cây Bảy lá một hoa ........................................................... 6
1.2. Một số phương pháp định danh thực vật ...................................................... 9
1.2.1. Phương pháp so sánh hình thái, giải phẫu ................................................. 9
1.2.2. Phương pháp phân loại học phân tử ........................................................ 12
Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................... 22
2.1. Vật liệu........................................................................................................ 22
2.1.1. Vật liệu thực vật....................................................................................... 22
2.1.2. Vật liệu nhân gen matK, ITS.................................................................... 22
2.1.3. Hóa chất và thiết bị .................................................................................. 23
2.1.4. Địa điểm và thời gian nghiên cứu ........................................................... 23
2.2. Phương pháp nghiên cứu ............................................................................ 23
2.2.1. Nhóm phương pháp nghiên cứu hình thái, giải phẫu cây Bảy lá một hoa.... 23
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN
2.2.2. Phương pháp phân lập và xác định trình tự nucleotide của gen.............. 24
2.2.3. Phương pháp xử lý số liệu ....................................................................... 25
Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN .......................... 26
3.1. Kết quả nghiên cứu về đặc điểm hình thái, giải phẫu cây Bảy lá một hoa ....... 26
3.1.1. Kết quả nghiên cứu về đặc điểm hình thái .............................................. 26
3.1.2. Kết quả nghiên cứu về đặc điểm giải phẫu.............................................. 27
3.2. Đặc điểm đoạn gen matK và vùng gen ITS của mẫu cây Bảy lá một hoa........ 30
3.2.1. Đặc điểm đoạn gen matK ........................................................................ 31
3.2.2. Đặc điểm vùng gen ITS ........................................................................... 34
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ......................................................................... 37
TÀI LIỆU THAM KHẢO............................................................................... 39
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
BLAST
:
Basic Local Aligment Search Tool
DNA
:
Deoxyribose nucleic acid
đtg
:
Đồng tác giả
ITS
:
Internal Transcribed Spacer
kb
:
Kilobase
matK
:
Maturase K
NCBI
:
The National Center for Biotechnology Information
PCR
:
Polymerase Chain Reaction
rpoC1
:
RNA polymerase beta' subunit
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN
DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1. Bảng danh lục đỏ cây thuốc thuộc chi Paris Việt Nam ..................... 8
Bảng 1.2. Một số thông tin về gen matK của chi Paris .................................... 14
Bảng 1.3. Một số thông tin về vùng ITS của chi Paris ..................................... 16
Bảng 1.4. Một số nghiên cứu trên thế giới sử dụng vùng gen ITS trong
phân loại thực vật............................................................................. 17
Bảng 1.5. Mã vạch DNA trong định danh cây Bảy lá một hoa tại Thái Nguyên .. 20
Bảng 2.1. Trình tự nucleotide mồi matK, ITS sử dụng trong kỹ thuật PCR ..... 22
Bảng 3.1. Độ tương đồng và phân ly của mẫu cây Bảy lá một hoa thu thập
tại Bắc Sơn- Lạng Sơn dựa trên trình tự đoạn gen matK ................ 33
Bảng 3.2. Độ tương đồng và phân ly của mẫu cây Bảy lá một hoa thu thập
tại Bắc Sơn - Lạng Sơn dựa trên trình tự vùng gen ITS .................. 35
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN
DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1. Hình ảnh các cơ quan chính của cây Bảy lá một hoa ........................ 4
Hình 1.2. Một số hình thái cây Bảy lá một hoa ở Việt Nam ............................. 8
Hình 1.3. Cấu trúc đoạn DNA mang vùng gen ITS ......................................... 15
Hình 2.1. Mẫu cây Bảy lá một hoa thu thập tại Bắc Sơn- Lạng Sơn .............. 22
Hình 3.1. Hình thái mẫu cây Bảy lá một hoa thu thập tại Bắc Sơn- Lạng
Sơn trồng trong vườn trường Đại học Sư phạm .............................. 26
Hình 3.2. Hình ảnh giải phẫu cuống lá mẫu cây Bảy lá một hoa .................... 28
Hình 3.3. Hình ảnh giải phẫu thân cây Bảy lá một hoa ................................... 29
Hình 3.4. Hình ảnh giải phẫu rễ cây Bảy lá một hoa....................................... 30
Hình 3.5. Hình ảnh kết quả tách chiết DNA tổng số trên gel agarose 1% ...... 31
Hình 3.6. Hình ảnh điện di kiểm tra sản phẩm PCR nhân đoạn gen matK
từ mẫu cây Bảy lá một hoa thu thập tại Bắc Sơn, Lạng Sơn ........... 31
Hình 3.7. Kết quả phân tích gen matK bằng BLAST trong NCBI ................. 32
Hình 3.8. Trình tự đoạn gen matK của mẫu thu thập tại Bắc Sơn, Lạng Sơn ...... 32
Hình 3.9. Cây phát sinh chủng loại được xây dựng dựa trên đoạn gen matK
của mẫu cây Bảy lá một hoa thu thập tại Bắc Sơn - Lạng Sơn ............ 33
Hình 3.10. Hình ảnh điện di kiểm tra sản phẩm PCR nhân đoạn gen ITS từ
mẫu cây Bảy lá một hoa thu thập tại Bắc Sơn, Lạng Sơn ............... 34
Hình 3.11. Kết quả phân tích bằng BLAST trình tự nucleotide vùng gen
ITS trong NCBI ................................................................................ 34
Hình 3.12. Trình tự vùng gen ITS của mẫu thu thập tại Bắc Sơn, Lạng Sơn ... 35
Hình 3.13. Cây phát sinh chủng loại được xây dựng dựa trên vùng gen ITS
của các mẫu nghiên cứu ................................................................... 36
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN
MỞ ĐẦU
1. Lý do chọn đề tài
Bảy lá một hoa là tên gọi chung thông dụng ở Việt Nam của nhiều loài
thuộc chi Paris. Bảy lá một hoa còn gọi là củ rắn cắn, hưu túc nhiều lá, hưu túc
vân nam, trọng lâu hải nam … thuộc loại dược liệu quý hiếm có nguy cơ tuyệt
chủng cần bảo vệ ở Việt Nam. Theo Nguyễn Tâp (2004, 2007), nhiều loài
thuộc chi Paris nằm trong sách đỏ Việt Nam ở cấp độ đánh giá theo IUCN
(International Union for Conservation of Nature) ở mức nguy cấp (tiếng
Anh: Endangered, viết tắt EN) hoặc sắp nguy cấp (tiếng Anh: Vulnerable, viết
tắt VU) [20], [21]. Cây Bảy lá một hoa có khả năng chữa trị nhiều bệnh từ các
bệnh thông thường như sốt nóng, sốt rét, mụn nhọt, chữa ho…đến các bệnh nan
y như: rắn độc cắn, ung thư… Vì vậy, Bảy lá một hoa là đối tượng nghiên cứu
của nhiều nhà khoa học.
Trên thế giới, chi Paris có 22 loài và nhiều thứ [56]. Ở Việt Nam cây được
tìm thấy chủ yếu ở các vùng núi phía Bắc, như một số tỉnh: Lào Cai, Hà Giang,
Lai Châu, Cao Bằng, Hòa Bình... Cây sống trong điều kiện núi cao, nhiệt độ
lạnh, sống dưới tán rừng. Mỗi năm cây chỉ ra hoa 1 lần vào khoảng tháng 4 -6,
tạo quả vào khoảng tháng 7-11 sau đó lụi đi, thời gian ủ đông của cây khá lâu.
Các loài trong chi Paris khá đa dạng và có sự tương đồng cao về hình thái.
Năm 2016, Nguyen Quynh Nga và đtg đã được thiết lập khóa phân loại bằng
việc mô tả hình thái, giải phẫu của 8 loài (species) và 2 thứ (varieties) ở Việt
Nam [43].
Có thể nhận diện thực vật bằng nhiều phương pháp khác nhau. Các
phương pháp thường dùng như nghiên cứu và so sánh các đặc điểm về hình
thái, giải phẫu, sinh lý, hóa sinh... hướng nghiên cứu này đã thành công trên
một số đối tượng cây trồng như Hà thủ ô đỏ [9], Sóng rắn [28], Phong lữ thảo
[6]… Tuy nhiên, phương pháp nhận diện này sẽ kém hiệu quả nếu như cây
không còn nguyên vẹn.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN
Công nghệ sinh học hiện đại phát triển đã bổ sung vào hệ thống phân loại
phương pháp nhận diện dựa vào các chỉ thị phân tử. Trong đó, mã vạch DNA
được lựa chọn là một trong các phương tiện nhận biết mới. Một số mã vạch
DNA được nghiên cứu và ứng dụng có hiệu quả trong phân loại các cây dược
liệu như matK, rpoC1, trnH-psbA, ITS, rbcL… Theo đó, gen matK nằm trong
lục lạp được xác định mang lại những thành tựu nhất định trong nhận diện cây
trồng [37],… Vùng gen ITS nằm trong nhân tế bào, bao gồm trình tự ITS15.8S-ITS2 cũng là đối tượng được nghiên cứu nhiều trong định danh thực vật.
Các nghiên cứu xác định mối quan hệ của các loài thực vật dựa trên trình tự
vùng gen ITS ở cây gỗ Sưa, gỗ Trắc, gỗ Cẩm lai [18], hay các các chi Erica
[45], Scrophularia [48], Potamogeto [55] và nhiều thực vật khác là minh chứng
cho vai trò của vùng gen ITS trong nhận diện cây trồng [34], [53]…
Huyện Bắc Sơn là huyện miền núi của tỉnh Lạng Sơn, thuộc vùng Đông
Bắc Việt Nam. Phía Tây của huyện Bắc Sơn giáp huyện Võ Nhai của tỉnh Thái
Nguyên. Ở đây có nhiều núi cao từ 500 m đến hơn 1000 m so với mặt nước
biển, được phát hiện có sự có mặt của cây Bảy lá một hoa [57], [59]. Xuất phát
từ những lý do trên, chúng tôi lựa chọn đề tài: “Nghiên cứu đặc điểm hình
thái, giải phẫu và trình tự đoạn gen matK, ITS của cây Bảy lá một hoa thu
tại huyện Bắc Sơn, tỉnh Lạng Sơn”.
2. Mục tiêu nghiên cứu
Mô tả được đặc điểm hình thái, giải phẫu và trình tự đoạn gen matK, ITS
của cây Bảy lá một hoa thu tại huyện Bắc Sơn, tỉnh Lạng Sơn.
3. Nội dung nghiên cứu
3.1. Nghiên cứu đặc điểm hình thái và giải phẫu cây Bảy lá một hoa thu
thập được ở Bắc Sơn - Lạng Sơn
3.2. Nghiên cứu đặc điểm trình tự vùng ITS, đoạn gen matK từ mẫu cây
Bảy lá một hoa thu thập tại Bắc Sơn - Lạng Sơn.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN
Chương 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Cây Bảy lá một hoa
1.1.1. Vị trí của cây Bảy lá một hoa trong hệ thống phân loại
Paris là tên gọi chung của một chi của thực vật có hoa, được mô tả bởi
Linnaeus từ năm 1753 [12]. Đến nay, việc phân loại chi Paris vẫn chưa có sự
thống nhất. Dưới dây là 3 cách phân loại đang được sử dụng:
(1) Theo hệ thống phân loại của Takhtajan (1987), vị trí phân loại của chi
Paris thuộc phân giới thực vật bậc cao; ngành Ngọc lan (Magnoliophyta); lớp
Hành (Liliopsida); phân lớp Loa kèn (Lilidae); bộ Củ nâu (Dioscoreales); họ Bảy
lá một hoa (Trọng lâu) (Trilliaceae), chi Bảy lá một hoa, Tảo hưu (Paris) [4].
(2) Thực vật chí Trung Quốc (năm 2000) đã mô tả hình thái và xếp chi
Paris vào họ Loa kèn (Liliaceae) với 22 loài (species) và 16 thứ (variety-var.)
trong đó có 12 loài đặc hữu [40].
(3) Theo hệ thống phân loại mới nhất APG III - Angiosperm Phylogeny
Group - (năm 2009) dựa trên những dẫn liệu về sinh học phân tử, chi Paris (chi
Trọng lâu) được xếp vào họ Hắc dược hoa (Melanthiaceae) với tổng số 26 loài
và 13 thứ [56].
Chi Paris phân bố chủ yếu ở châu Âu và châu Á, đặc biệt tập trung nhiều
ở Trung Quốc. Theo tạp chí “Flora of China” (2000), chi Paris được mô tả gồm
22 loài với nhiều thứ khác nhau.
Trong chi Paris, Paris polyphylla Smith là loài được tìm thấy sớm nhất
(năm 1813). Loài này hiện được công bố chi tiết có tới 10 thứ [40].
Mười thứ (variety) thuộc chi Paris gồm:
1) Paris polyphylla var polyphylla (tên tương ứng Daiwa polyphylla Sm.);
2) Paris polyphylla var yunanensis;
3) Paris polyphylla var chinensis;
4) Paris polyphylla var nana;
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN
5) Paris polyphylla var alba;
6) Paris polyphylla var stenophylla;
7) Paris polyphylla var minor;
8) Paris polyphylla var latifolia;
9) Paris polyphylla var pseudothibetica;
10) Paris polyphylla var kwantungensis
1.1.2. Đặc điểm thực vật học của cây Bảy lá một hoa
Bảy lá một hoa là cây thân cỏ một năm. Một cây Bảy lá một hoa hoàn
chỉnh sẽ gồm các phần: rễ, thân củ, thân thảo, lá, hoa/quả [12], [21], [40], [43].
Một số cơ quan của cây Bảy lá một hoa được mô tả trên hình 1.1.
d.
Quả
và hạt
a. Hoa
b. Lá
e. Thân
củ
f. Rễ
c. Thân
cỏ
Hình 1.1. Hình ảnh các cơ quan chính của cây Bảy lá một hoa
(Hình ảnh là sản phẩm của nhiệm vụ quỹ GEN cấp Bộ GD-ĐT giai đoạn 2016-2019)
Thân cỏ là phần thân nằm trên mặt đất, thường lụi đi vào cuối thu. Kiểu
thân cỏ sẽ không có cấu tạo thứ cấp [17]. Thân cỏ của cây Bảy lá một hoa cao
hàng chục cm đến hàng trăm cm (Paris dunniana cao 1,5-3 m). Thân cỏ thon
dài, trơn nhẵn, mọng nước, không có cành, phía gốc có một số lá thoái hoá
thành vẩy, bao lấy thân. Giữa thân có một tầng lá mọc vòng khoảng 3 đến 12
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN
lá, đa số các loài có từ 4 đến 6 lá. Cuống lá dài 2-3 cm, màu tím. Phiến lá hình
mác, hình trứng, bầu dục… dài 20-23 cm, rộng 6-7 cm. Đầu phiến lá nhọn, mặt
trên màu xanh đậm, mặt dưới màu nhạt hơn [40].
Mỗi cây chỉ có một hoa mọc trên đỉnh cây. Mỗi hoa đều có cuống dài
hàng chục cm. Hoa có đầy đủ các phần đài, tràng, nhị, nhụy.
Quả của cây Bảy lá một hoa là quả đơn, có một mầu duy nhất. Vỏ quả
màu xanh, khi quả chín vỏ có màu xám- đen. Quả chín sẽ tự mở vỏ để cho hạt
thoát ra ngoài. Hạt của cây bảy lá một hoa thuộc kiểu hạt có nội nhũ. Hạt gồm
có vỏ màu đỏ bao bọc phôi và nội nhũ (hình 1.1 d). Về mặt lý thuyết, ở những
hạt kiểu này, phôi thường nhỏ, đôi khi còn chưa có sự phân hóa hoàn toàn [17].
Thân củ là phần nằm dưới mặt đất. Thân củ của cây Bảy lá một hoa có
chứa chất dự trữ để cây sử dụng khi ra hoa, tạo quả, mọc chồi [17]. Thân củ
phình to, thường nằm ngang, cứ mỗi năm có thêm 1 đốt hiện ra rõ ràng, màu
xám đen. Trên thân củ có những mắt mang các sẹo của lá thoái hóa, trong nách
các sẹo đó có các chồi nách.
Cây Bảy lá một hoa có kiểu rễ của “cây có rễ phụ” [17]. Rễ phụ mục ra
từ thân củ. Các rễ tương đối đồng đều về kích thước, thường màu nâu và có
hình trụ.
Cây Bảy lá một hoa thường mọc hoang ở những khe núi ẩm ướt, có độ
cao trên 600m và ưa bóng, hoặc dọc theo các bờ khe suối, trên đất ẩm nhiều
mùn. Trong tự nhiên, thường chỉ những cây lớn có chiều dài thân rễ trên 5cm
mới thấy có hoa, quả [30].
1.1.3. Giá trị y học của cây Bảy lá một hoa
Theo y học cổ truyền, cây Bảy lá một hoa có công dụng trong điều trị một
số bệnh nan y như: bệnh gan, ung thư phổi và thanh quản, ung thư biểu mô.
Thân rễ Bảy lá một hoa có vị đắng, hơi cay, tính hơi lạnh, hơi độc, có tác dụng
lợi tiểu, tiêu đờm, thanh nhiệt, giải độc, chữa sốt nóng, sốt rét, mụn nhọt, chữa
ho… [23], [30].
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN
Ở Ấn Độ và Nê-pan, thân rễ Bảy lá một hoa trị giun sán bằng cách uống
bột thân rễ mỗi lần một thìa cà phê, ngày một lần, liền trong 2 ngày. Để trị mụn
nhọt và nhọt độc, hằng ngày bôi bột nhão chế từ thân rễ Bảy lá một hoa một
cách đều đặn. Ngoài ra, thân rễ Bảy lá một hoa còn được sử dụng để chống co
thắt, dễ tiêu hóa ở dạ dày, dùng làm thuốc long đờm, giải độc rắn cắn và dùng
để làm giảm ảnh hưởng của thuốc mê [12].
Một số bài thuốc quý được tuyên truyền phổ biến trong dân gian để chữa
bệnh bằng cây Bảy lá một hoa [58].
* Chữa rắn độc cắn bằng cách kết hợp thuốc uống và đắp ngoài. Theo đó,
sử dụng thân và rễ cây khoảng 4 - 8 g, Thanh mộc hương 4 g, nhai sống uống
với nước đun sôi để nguội. Đắp ngoài bằng cách dùng thuốc giã với dấm đắp
lên vùng rắn cắn.
* Trị ung nhọt, áp xe vú, quai bị, lao hạch cổ: Dùng thân rễ 8g, Bồ công
anh 40 g sắc lấy nước uống và phần bã đắp bên ngoài vết thương.
* Trị viêm phế quản mạn tính: Dùng thân rễ nghiền thành bột, mỗi lần
uống 3 g với nước, ngày uống 2 lần.
Kết quả nghiên cứu dược lý hiện đại còn cho thấy các thành phần trong
cây Bảy lá một hoa có Saponin được dùng để hỗ trợ điều trị nhiều bệnh ung thư
[38], [41], chống các chất oxy hóa [49]. Cơ chế chống ung thư của các dược
chất trong cây Bảy lá một hoa còn chưa rõ ràng, tuy nhiên theo hướng các
saponin kích thích tế bào chết theo chương trình (apoptosis) [41]. Bên cạnh
saponin là dược chất quan trọng, trong thân rễ của cây Bảy lá một hoa người ta
cũng phát hiện thấy 1 glucoside được gọi là paristaphin. Khi thuỷ phân
paristaphin sẽ cho glucose và một glucoside mới gọi là paridin, thuỷ phân
paridin, ta lại được glucose và một chất nhựa gọi là paridol [12].
1.1.4. Vấn đề bảo tồn cây Bảy lá một hoa
Cây Bảy lá một hoa có những đòi hỏi riêng biệt về điều kiện sống. Theo
đó, kết quả nghiên cứu cho thấy đa số các loài được phát hiện mọc hoang ở
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN
những khe núi ẩm ướt, có độ cao so với mặt nước biển hàng trăm mét và ưa
bóng. Ngoài ra, cây còn mọc dọc theo các bờ khe suối, trên đất ẩm nhiều
mùn, cây không chịu được úng. Phần thân trên mặt đất lụi đi hàng năm,
thường vào cuối thu. Thân rễ mang 1 - 2 chồi ngủ tồn tại qua mùa đông và
mọc lại vào giữa mùa xuân năm sau. Cây chưa được trồng trên quy mô lớn
mà chỉ ở phạm vi các vườn cây thuốc tại một số địa phương theo phương
thức nhân giống bằng hạt hoặc bằng thân rễ. Theo đó, hàng năm vào
khoảng tháng 10 - 11, người ta thu quả chín, đem gieo trong vườn ươm
hoặc phơi khô để đến mùa xuân năm sau mới reo. Mỗi cây chỉ có một hoa,
mỗi hoa chỉ có ít hạt nên hệ số nhân giống bằng hạt không cao, tuy nhiên
đây vẫn là hình thức chính để cây tái sinh trong tự nhiên. Thân rễ Bảy lá
một hoa có nhiều đốt chứa mắt ngủ, có thể tách từng đoạn để trồng. Thời
vụ trồng chủ yếu là mùa xuân và mùa thu [30].
Ở Ấn độ, kế hoạch bảo tồn Paris polyphylla đã được thiết lập. Theo nhóm
nghiên cứu ở Ấn Độ, lượng mưa là yếu tố chi phối khu phân bố của Paris
polyphylla, và nhiệt độ thích hợp với Paris polyphylla là 19OC [42].
Nghiên cứu của Y Teerawatsakul và đtg (2014) việc nuôi cấy chồi đỉnh
của Paris polyphylla chịu ảnh hưởng của nhiệt độ, trong đó nuôi cấy chóp rễ
với nhiệt độ thấp hơn 14OC và cao hơn 18OC đều không làm biến đổi mẫu cấy.
Nhiệt độ thích hợp trong nuôi cấy chồi đỉnh (shoot tip) là 14-160C, trong
khoảng nhiệt độ này sau 45 ngày nuôi cấy mẫu tăng hơn 7,5 cm [54].
Việc đánh giá và phân hạng các cây thuốc thuộc diện quý hiếm có nguy
cơ bị tuyệt chủng, cần bảo vệ ở Việt Nam được Nguyễn Tập đề cập đến trong
các năm 2004, 2007 [20], [21]. Theo đó, ở Việt Nam chi Paris thuộc họ Trọng
lâu (Trilliaceae) có các loài trong danh lục đỏ cần bảo vệ trình bày ở bảng 1.1.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN
Bảng 1.1. Bảng danh lục đỏ cây thuốc thuộc chi Paris Việt Nam
STT
1
2
Tên khoa học
Paris delavayi Franch
Paris fargesii Franch
(Paris petiolata Baker ex Wight
var. ramembnaceae Wight)
Tên Việt Nam
Trọng lâu lá dài
Củ rắn cắn, Bảy
lá một hoa
3
Paris hainanensis Merr
Trọng lâu hải
nam
4
Paris polyphylla Smith
Bảy lá một hoa
5
Paris yunnanensis Franch.
Trọng lâu vân
nam
6
Paris chinensis Franch.
A
Trọng lâu tàu
B
A
P. fargesii [25]EB
E
F
Phân hạng theo
IUCN, 1994
C
EN.A1c,d
EN.A1c,d
VU.B2a,b
(ii,iii,v)
EN.B2a,b
(ii,iii,v)
EN.B2a,b
(ii,iii,v)
VU.B2a,b
(ii,iii,v)
F vietnamensis [52]D
P.
G
Tài liệu
tham
khảo
[20]
[15]
C
G
H
Hình 1.2. Một số hình thái cây Bảy lá một hoa ở Việt Nam
(Hình ảnh thuộc sản phẩm của nhóm nghiên cứu, trong nhiệm vụ quỹ GEN
cấp bộ giai đoạn 2016-2019)
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN
Cây Bảy lá một hoa được tìm thấy ở một số tỉnh thành của Việt Nam như
Sapa- Lào Cai, Cúc Phương- Ninh Bình, Đại Từ- Thái Nguyên, Tam Đảo - Phú
Thọ... và đã được xếp vào Sách Đỏ Việt Nam ở cấp độ đánh giá theo IUCN ở
mức nguy cấp (tiếng Anh: Endangered, viết tắt EN) hoặc sắp nguy cấp (tiếng
Anh: Vulnerable, viết tắt VU) [4], [10], [12], [20], [21]. Hiện nay tại một số địa
phương miền núi phía Bắc như Lào Cai, Hà Giang, Lạng Sơn đã thành lập Ban
chỉ đạo dự án trên cơ sở phân tích các điều kiện khí hậu, đối chiếu với đặc
điểm sinh thái cây trồng nhằm đánh giá mức độ thích nghi của một số cây dược
liệu đối với điều kiện khí hậu. Từ đó kết hợp với đánh giá tác động môi trường
và phân tích chi phí lợi ích để đưa ra những định hướng quy hoạch mở rộng
diện tích một số cây dược liệu trong vùng, trong đó có thảo dược Bảy lá một
hoa [2],[19], [57].
1.2. Một số phương pháp định danh thực vật
1.2.1. Phương pháp so sánh hình thái, giải phẫu
Trong lịch sử phát triển thực vật học thì hình thái, giải phẫu thực vật phát
triển tương đối sớm. Từ những năm 371-286 TCN, Theophraste được gọi là
người sáng lập môn thực vật học. Ông đã công bố các dẫn liệu hình thái giải
phẫu của cơ thể thực vật trong các tác phẩm “Lịch sử thực vật”, “Nghiên cứu
về cây cỏ” [9].
Phương pháp nghiên cứu chủ yếu nhất về thực vật vẫn là quan sát, so
sánh trên cơ sở các dữ kiện ngoài thiên nhiên, sau đó tiến hành giải phẫu trong
phòng thí nghiệm, so sánh các mẫu thu thập khác đã được lưu giữ, cuối cùng là
phân tích, tổng hợp và rút ra nhận xét. Để phân biệt các loại tế bào hay thành
phần cấu tạo các loại mô trong cơ quan, thường các lát cắt được nhuộm màu và
tùy theo yêu cầu quan sát phần nào mà sẽ nhuộm màu gì cho phù hợp. Trong
phòng thí nghiệm thực vật, để nhận biết tế bào có vách bằng celulose sẽ nhuộm
đỏ bằng carmin, tế bào có vách tẩm mộc tố sẽ được nhuộm xanh với lục iod,
nhân tế bào được nhuộm bằng hematoxylin…[17].
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN
Ở Việt Nam, dưới thời Pháp đô hộ chỉ có công trình nghiên cứu về giải
phẫu gỗ của H Lecomte và sau khi miền Bắc được giải phóng năm 1954 thì
việc nghiên cứu và giảng dạy hình thái giải phẫu được chú ý nhiều ở các trường
phổ thông và đại học. Hiện nay ngày càng có nhiều công trình đi sâu tìm hiểu
về hình thái và giải phẫu của các loài thực vật, nhất là những loài thực vật có
giá trị làm thuốc và những loài suy giảm nghiêm trọng về số lượng, cần được
bảo tồn.
Năm 2015, trong “Nghiên cứu đặc điểm hình thái và giải phẫu loài Hà
thủ ô đỏ (Fallopia multiflora (Thunb.) Haraldson) ở Việt Nam” của Phạm
Thanh Huyền và đtg đã sử dụng phương pháp so sánh hình thái, đối chiếu khóa
phân loại và các bản mô tả trong các thực vật chí để xác định tên khoa học của
các mẫu Hà thủ ô đỏ [9]. Theo đó, nghiên cứu trên 37 mẫu Hà thủ ô đỏ Fallopia multiflora (Thunb.) Haraldson thu tại 10 địa điểm thuộc 8 tỉnh thành,
nhóm nghiên cứu đã xác định được ở Việt Nam hiện có 3 thứ của loài Fallopia
multiflora (Thunb.) Haraldson gồm: F. multiflora var. multiflora (Thunb.)
Haraldson; F. mutiflora var. angulata (S.Y. Liu) H. J. Yan, Z. J. Fang & S. X.
Yu và F. multiflora var. ciliinervis (Nakai) Yonek. & H.Ohashi. Nghiên cứu về
hình thái đã giúp các tác giả xây dựng được khóa phân loại cho các thứ của loài
này ở Việt Nam. Đã mô tả được chi tiết đặc điểm hình thái loài Fallopia
multiflora (Thunb.) Haraldson, cũng như các thứ của loài, cùng với đặc điểm
giải phẫu các bộ phận rễ, thân, lá. Kết quả thu được là những dẫn liệu bổ sung
cho các tài liệu trong nước về loài Fallopia multiflora (Thunb.) Haraldson,
đồng thời đây cũng là dẫn liệu khoa học phục vụ công tác bảo tồn, khai thác và
phát triển loài Hà thủ ô đỏ - Fallopia multiflora (Thunb.) Haraldson để tạo
nguồn nguyên liệu sản xuất thuốc ở Việt Nam [9].
Nghiên cứu đặc điểm thực vật của cây Phong lữ thảo (Pelargonium
hortorum L. H. Bailey) của Tạ Lê Mai Hậu và đtg (2016) lần đầu tiên đã mô tả
đầy đủ các đặc điểm hình thái cấu tạo giải phẫu của loài Phong lữ thảo ở Việt
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN
Nam, góp phần bổ sung thêm bộ cơ sở dữ liệu về lý lịch loài nghiên cứu, làm
cơ sở cho các nghiên cứu ứng dụng từ loài cây này [6].
Sóng rắn là một loài cây thuốc được trồng và mọc hoang dại nhiều nơi ở
tỉnh Thái Nguyên. Loài cây này đã được sử dụng như một vị thuốc y học dân
gian để chữa một số bệnh như zona và các bệnh ngoài da phổ biến. Với mục
đích làm rõ đặc điểm và nâng cao giá trị sử dụng của loài cây này, nhóm nghiên
cứu của Nông Thị Anh Thư và đtg (2017) tại trường Đại học Y dược, Đại học
Thái Nguyên đã thực hiện đề tài “Nghiên cứu đặc điểm thực vật, thành phần
hóa học và tác dụng giảm đau, chống viêm của dược liệu Sóng rắn thu hái tại
Thái Nguyên”. Nhóm nghiên cứu đã thu thập, xác định tên khoa học của cây
Sóng rắn thu ở Thái Nguyên là Albizia myriophylla Benth., thuộc họ Trinh nữ
(Mimosaceae), trên cơ sở phân tích các đặc điểm hình thái, giải phẫu thực vật
của cây Sóng rắn ở Thái Nguyên, giúp tránh được việc nhầm lẫn trong thu hái
loài cây này làm dược liệu [28].
Việc sử dụng phương pháp so sánh hình thái đã hỗ trợ trong các nghiên
cứu để định loài. Trong nghiên cứu của Đỗ Văn Hài và đtg (2017) về chi Bạch
hạc (Rhinacanthus Nees) ở Việt Nam đã mô tả đặc điểm nhận biết chi, xây
dựng khóa định loại 2 loài là Rh. calcaratus - Kiến cò móc và Rh. nastusus Kiến. Nghiên cứu cũng đã cung cấp các thông tin tóm tắt về phân bố, sinh học
và sinh thái, mẫu nghiên cứu và hình vẽ của các loài thuộc chi này ở Việt Nam
[5]. Hay với nghiên cứu của Bùi Hồng Quang và đtg (2017) đã bổ sung thêm
một loài vào khóa phân loại các loài thuộc chi Ngân hoa (Silvianthus) ở Việt
Nam. Theo Phạm Hoàng Hộ (2000), Nguyễn Tiến Bân (2005), ở Việt Nam chi
Silvianthus có 1 loài là Silvianthus tonkinensis (Gagnep.) Ridsdale. Trong quá
trình nghiên cứu các mẫu vật của chi này ở Việt Nam, loài Silvianthus
bracteatus Hook. f. trước đây được ghi nhận có ở Ấn Độ, Mianma, Trung Quốc
(Vân Nam), nay được nhóm nghiên cứu phát hiện có phân bố Thanh Hóa (Khu
BTTN Pù Hu), Nghệ An (VQG Pù Mát), Việt Nam. Kết quả nghiên cứu đã xác
định được 1 loài bổ sung thêm vào hệ thực vật Việt Nam [16].
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN
Bảy lá một hoa (Paris) cũng là loài được các nhà nghiên cứu quan tâm
và có các công trình nghiên cứu về đặc điểm hình thái giải phẫu, giúp bước đầu
phân biệt các loài trong chi Paris. Phải kể đến đầu tiên là bộ sách “Cây cỏ Việt
Nam” năm 1999 của Phạm Hoàng Hộ đã có những mô tả sơ bộ về hình thái của
một số loài thuộc chi Paris ở Việt Nam bằng hình vẽ [7]. Đến năm 2016, với đề
tài “Nghiên cứu đặc điểm thực vật và vi học của cây Bảy lá một hoa ở Việt
Nam” đã mô tả chi tiết đặc điểm cấu tạo giải phẫu của các bộ phận thân khí
sinh, lá, thân rễ, rễ, và bột của thân rễ bảy lá một hoa. Đây là báo cáo lần đầu
tiên về cấu tạo giải phẫu của cây Bảy lá một hoa - Paris chinensis Franch [22].
Nghiên cứu của Nguyễn Tiến Dũng và đtg (2018) về loài Bảy lá một hoa Việt
Nam - Paris vietnamensis (Takht.) H.Li đã xác định được điểm đặc trưng giúp
phân biệt với các loài khác thuộc chi Paris là nhị có trung đới kéo dài hình trụ
ngắn 1 - 1,5mm; cánh hoa dài hơn đài 1,2 - 2 lần; lát cắt ngang qua bầu hình
sao, cánh bầu lõm sâu, nhụy có vòi nhụy (phần hợp) rất ngắn; hạt có áo hạt màu
đỏ [3]. Đặc biệt trong nghiên cứu của Nguyen Quynh Nga và đtg (2016) đã mô
tả đặc điểm hình thái và xây dựng khóa định loại cho 8 loài và 2 thứ thuộc chi
Paris ở Việt Nam [43].
1.2.2. Phương pháp phân loại học phân tử
Từ giữa những năm 1990, với sự phát triển mạnh mẽ của sinh học phân tử,
một phương pháp nghiên cứu mới trong lĩnh vực phân loại học đã hình thành
và được gọi là phương pháp phân loại học phân tử. Phương pháp này dựa trên
các dữ liệu thông tin về hệ gen trong và ngoài nhân hoặc các sản phẩm của
chúng (protein). Tùy mục đích hoặc đối tượng nghiên cứu, người ta có thể lựa
chọn các gen khác nhau hoặc các sản phẩm khác nhau của hệ gen để làm căn
cứ phân loại sinh vật [35].
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN
1.2.2.1. Mã vạch DNA
Khái niệm mã vạch DNA được biết đến rộng rãi từ những năm đầu thế kỉ
XXI. Năm 2003, nhóm nghiên cứu của Paul Hebert tại Đại học Guelph đề xuất
"mã vạch DNA" (DNA barcode) như là một cách để xác định loài, giống như
cách máy quét trong các siêu thị sử dụng các sọc đen của mã vạch UPC
(Universal Product Code) để xác định các giao dịch mua hàng [44]. Năm 2005,
Savolainen và đtg cho rằng mã vạch DNA bao gồm một chuỗi DNA ngắn (400,
800 bp) được chuẩn hóa về nguyên tắc nên dễ dàng tạo ra và đặc trưng cho tất
cả các loài trên hành tinh [46].
Đối với thực vật việc lựa chọn mã vạch DNA cần phải quan tâm đến các
yếu tố như: (i) khuếch đại PCR mang tính tổng thể, thành công trên nhiều loại
cây, (ii ) phạm vi đa dạng phân loại, sử dụng được cho nhiều loài khác nhau,
(iii) có sự sai khác, đặc trưng phân loại các loài, (iv) sử dụng công cụ tin sinh
học trong phân tích và ứng dụng [35]. Sau khi kiểm tra rộng rãi các vùng gen
trong hệ gen của ty thể, lục lạp và nhân thì bốn đoạn gen/vùng gen chính là
rbcL , matK, trnH - psbA và ITS thường được thống nhất là mã vạch DNA tiêu
chuẩn được lựa chọn cho thực vật [31], [36], [37], [39], [47], [51].
Quá trình tạo và áp dụng mã vạch DNA thực vật cho mục đích nhận dạng
đòi hỏi hai bước cơ bản: (1) xây dựng thư viện mã vạch DNA của các loài đã biết
và (2) so sánh mã vạch DNA của một mẫu chưa biết với thư viện mã vạch DNA.
1.2.2.2. Nghiên cứu trên thế giới sử dụng mã vạch DNA
Các mã vạch DNA đã được phát triển, thử nghiệm và sử dụng để giải
quyết các câu hỏi cơ bản về hệ thống, sinh thái, sinh học tiến hóa và bảo tồn,
bao gồm lắp ráp cộng đồng, mạng lưới tương tác loài, khám phá phân loại và
đánh giá các lĩnh vực ưu tiên bảo vệ môi trường.
Gen matK nằm trong hệ gen lục lạp, có chiều dài hơn 150000 bp, mã hóa
cho maturase K- là những enzyme có kích thước khoảng 498-515 amino acid
(bảng 1.2) [60].
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN
Bảng 1.2. Một số thông tin về gen matK của chi Paris
Mã số trên
GENBANK
MK488085
Loài, thứ
Paris nitida
Năm
công
bố
Kích thước
đoạn mã
hóa MatK
(bp)
Mã số protein và
số amino acid
2019
1497
QBF52262, 498
(1683..3230)
MF495705
Paris marmorata
2018
AXY95438, 515
1548
MF417768
Paris luquanensis
2018
1548
AXY95352, 515
(1677..3224)
KX784050
Paris vietnamensis
2017
APS88082, 515
1548
(1646..3193)
KX784046
Paris mairei
2017
APS87746, 515
1548
(1651..3198)
KX784045
Paris luquanensis
2017
APS87662, 515
1548
(1651..3198)
KX784041
Paris cronquistii
2017
APS87326, 515
1548
KR233272
KM242788
KM242787
KM242778
KM242785
Paris_fargesii
Paris polyphylla var.
yunnanensis
Paris polyphylla var.
stenophylla
Paris delavayi
Paris polyphylla var.
chinensis (Korea)
2015
1497
498
2015
1497
498
2015
1497
498
2015
1497
498
2015
1497
AIW53094, 498
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN
Gen matK thường được sử dụng trong việc định danh, phân loại ở các
loài thực vật hạt kín, là loài chiếm đa số trong các hệ sinh thái hiện nay.
Layhaye và đtg (2008) đã lựa chọn gen matK là một mã vạch ưa thích trong
phân loại thực vật. Nghiên cứu của Lahaye và đtg (2008) chỉ ra rằng mã vạch
DNA thực vật có thể được sử dụng để đánh giá nhận dạng loài trong các điểm
nóng đa dạng sinh học giúp bảo tồn cũng như áp dụng giả thuyết để giám sát
thương mại quốc tế trong các loài Lan đang bị đe dọa [37].
Nhóm nghiên cứu do Savolainen và đtg (2005) sử dụng gen matK để
nhận dạng 1600 loài Lan. Trong quá trình thực hiện, họ phát hiện một loại
trước đây được cho là Lan thực ra lại là hai loài tách biệt. Loài này sống trên
những dốc khác nhau trên núi và có hoa hình dạng khác nhau để thích nghi với
những loài côn trùng thụ phấn khác nhau [50].
ITS (internal transcribed spacer) là một đoạn đệm nằm giữa gen của tiểu
phần nhỏ và tiểu phần lớn của ribosome (vùng gồm các đoạn ITS1-5,8S-ITS2,
hình 1.3).
Hình 1.3. Cấu trúc đoạn DNA mang vùng gen ITS
Vùng ITS nằm trong nhân tế bào được phiên mã trong quá trình tổng hợp
rRNA. Tuy nhiên, trong quá trình trưởng thành của rRNA, phần ITS bị cắt và
nhanh chóng phân hủy. Một lợi thế của vùng ITS là nó bao gồm 2 locut riêng
biệt (ITS1 và ITS2) được nối với nhau qua locut 5.8S. Một số thông tin về vùng
ITS của chi Paris được trình bày trên bảng 1.3.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN
Bảng 1.3. Một số thông tin về vùng ITS của chi Paris [60]
Mã số trên
Loài, thứ
GENBANK
Năm
ITS1-5,8S-ITS2
công bố
(bp)
KX146531
Paris polyphylla var. chinensis
2016
661
KX146530
Paris polyphylla var. chinensis
2016
661
KX146539
Paris polyphylla var. polyphylla
2016
661
MK350326 Paris polyphylla var. pseudothibetica
2019
758
AY192025
2003
674
MK309858 Paris nitida
2018
705
DQ663678
Paris axialis
2009
659
MK350325 Paris delavayi var. delavayi
2019
712
MH711038 Paris fargesii
2019
744
MK346921 Paris fargesii var. brevipetalata
2019
747
Paris cronquistii
Vùng ITS có nhiều ưu thế trong nghiên cứu phát sinh và đánh giá sự đa
dạng di truyền của các loài như trình tự nucleotide vùng gen ITS mang các đặc
tính di truyền của cả bố và mẹ, số lượng trình tự DNA lặp lại thích hợp cho
việc khuếch đại và xác định trình tự DNA ribosome. Trình tự nucleotide vùng
gen ITS đã được nghiên cứu và công bố trong ngân hàng gen thế giới khá
phong phú và đa dạng, thuận lợi cho việc phân tích so sánh.
Vùng gen ITS được chứng minh đặc biệt hữu ích trong việc làm sáng tỏ
mối quan hệ ở các loài trong bảng 1.4 dưới đây:
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN
