Vì sao có thể nuôi cấy mô phân sinh (meristem) để tạo ra cây sạch virus

Vì sao có thể nuôi cấy mô phân sinh meristem để tạo ra cây sạch virus?
Các bước và điều kiện cần thiết của một hệ thống sản xuất giống sạch bệnh?
------------- o 0 o -------------
* Tác hại của virus:
Trong thế giới các loài sinh vật thì thế giới của các loài vi sinh vật vô cùng đa dạng và phức tạp
mà đến nay vẫn còn rất nhiều loài mà con người vẫn chưa biết đến. Người ta thường phân vi sinh
vật thành 2 loại là vi sinh vật có tác dụng tốt cho con người và vi sinh vật có hại cho con người.
Trong thế giới vi sinh vật ấy thì virus là một loại rất nguy hiểm. Đối với cả con người và các loài
động thực vật khác khi đã nhiễm bệnh virus thì không có một loại thuốc nào có thể chữa được, mà
chỉ phụ thuộc vào khả năng đề kháng của cơ thể. Vì vậy, để đề phòng và chống lại tác hại của virus
người ta đã tạo ra các loại vacxin và thuốc kháng sinh nhằm tăng cường sức đề kháng cho cơ thể.
Phổ tác động của virus là rất lớn. Nó không những tác động đến con người, động thực vật, thậm
chí cả những loài vi sinh vật khác. Trong nông học, chúng ta quan tâm chủ yếu đến thực vật vì đây
là đối tượng chủ yếu trong sản xuất nông nghiệp.
Theo thống kê, có khoảng 600 loài virus trên thực vật mà con người đã biết đến, trong đó có ít
nhất 80 loại có thể truyền qua hạt giống. Bệnh virus hại thực vật là một loại bệnh nguy hiểm, dễ lan
truyền qua nhân giống vô tính (do tồn tại trong các mô sống), qua mô giới truyền bệnh (các loại
côn trùng như rệp, bọ phấn, nhện, v.v.), qua tiếp xúc cơ giới (vết cắt, xây xát, v.v.).
Tác hại của virus là vô cùng lớn. Nó ảnh hưởng trực tiếp tới năng suất và phẩm chất của nông
sản.

Côn trùng Biểu hiện một số bệnh virus
truyền bệnh * Cơ sở lý luận của phương pháp:
Virus tồn tại ở mọi cơ thể sống. Theo White (1934), Limasset & Cornuet (1950), Morel & Martin
(1952): nồng độ virus ở mô phân sinh đỉnh rễ, đỉnh chồi và lá bao thứ nhất là bằng không sau đó
tăng dần ở các lá xa với mô phân sinh ở phía dưới. Như vậy, có thể sử dụng mô phân sinh đỉnh để
tạo ra cây sạch virus hoàn toàn từ cây đã nhiễm bệnh.
Gần đây, vào năm 1987 bằng những nghiên cứu của mình, ông Meyer cho thấy phương pháp
nuôi cấy meristem để loại virus là hoàn toàn đúng đắn. Sự loại virus phụ thuộc rất nhiều sự có mặt
của một hay nhiều loại virus xâm nhiễm. Ví dụ có thể sử dụng đỉnh sinh trưởng với kích thước 1-
2mm để loại virus chủ yếu hại khoai tây (trừ virus X đòi hỏi kích thước 0,2mm).

Theo nghiên cứu của Mathews (1970) & Wang et Hu (1980) thì hoàn toàn có cơ sở khẳng định
mô phân sinh đỉnh không có virus. Theo các ông có thể do các lý do sau:
- Virus vận chuyển trong cây nhờ hệ mô dẫn, hệ thống này không có trong mô phân sinh đỉnh.
- Trong sự phân chia, các tế bào mô phân sinh đỉnh không cho phép sao chép các thông tin di
truyền của virus.
- Hệ thống vô hiệu hóa virus ở vùng mô phân sinh đỉnh mạnh hơn các vùng khác trong cây.
- Nồng độ auxin cao ở mô phân sinh đỉnh có thể ngăn cản quá trình sao chép virus.
* Kỹ thuật làm sạch virus in vitro:
- Nuôi cấy mô phân sinh đỉnh: tách chính xác mô phân sinh đỉnh có kích thước <0,3mm, nuôi
cấy chúng trong môi trường dinh dưỡng phù hợp để tái sinh thành cây nguyên vẹn. Sau đó kiểm tra
độ sạch virus ở cây tái sinh bằng các phương pháp khác nhau để thu nhận cây sạch bệnh.
- Nuôi cấy mô phân sinh đỉnh kết hợp xử lý nhiệt độ cao: ở nhiệt độ cao 36-37
0
C thì một số loài
virus không còn khả năng nhân lên. Lợi dụng đặc tính này có thể kết hợp phương pháp nuôi cấy
mô phân sinh đỉnh với xử lý nhiệt để tẩy sạch virus khỏi mẫu. Biện pháp này cho phép có thể tách
meristem ở kích thước lớn hơn (0,5-1,0mm) giúp cho việc tách và tái sinh cây thuận lợi hơn so với
phương pháp tách ở kích thước 0,1-0,2mm.
Có thể xử lý nhiệt độ cao 35-37
0
C một thời gian dài cho cây mẹ trước khi tách mô phân sinh đỉnh
(5-10 tuần). Hoặc có thể xử lý các mẫu sau khi đưa vào nuôi cấy in vitro ở nhiệt độ 39-40
0
C trong
1-2 tuần. Ở nhiệt độ này, thường các mARN của virus sẽ bị phân giải và cây tái sinh sẽ có độ sạch
virus cao.
- Nuôi cấy mô phân sinh đỉnh kết hợp xử lý hóa chất: Khi nuôi cấy mô phân sinh đỉnh có kích
thước 0,5-1,0mm có thể kết hợp bổ sung vào môi trường nuôi cấy các chất kháng virus để tạo cây
sạch bệnh. Các chất kháng virus như 2-thiouracil, ribavirin, vidarabin làm tăng kháng của tế bào,
mô thực vật và ức chế sự nhân bản của virus.

- Vi ghép: Là kỹ thuật ghép các mô phân sinh đỉnh lên gốc cây sạch và kháng bệnh trong điều
kiện in vitro để sản xuất cây sạch virus. Kỹ thuật này thường sử dụng với cây thân gỗ, đặc biệt họ
cam chanh.
Một số ứng dụng kỹ thuật làm sạch virus:
 Kỹ thuật tạo củ khoai tây bằng phương pháp in vitro: Một hiện trạng sản xuất khoai tây là rất
dễ bị nhiễm virus do quá trình nhân giống vô tính. Vì vậy cần tạo ra các giống khoai tây sạch bệnh
virus. Đó là lý do mà ngày nay khoai tây được nhân giống bằng phương pháp in vitro khá phổ biến.
Để nhân giống in vitro khoai tây cần thực hiện các bước sau đây:
+ Bước 1: Chọn cây giống đủ tiêu chuẩn. Cây đủ tiêu chuẩn lấy mẫu cso chiều cao 7-10cm, có
từ 8-10 lá, cây phải sinh trưởng khỏe, thân mập. Thông thường nuôi cấy 8-10 cây trong bình
250ml.
+ Bước 2: Rót môi trường tạo củ vào các bình 250ml đã chọn. Môi trường tạo củ gồm MS và
12% saccarose. Lượng môi trường cho mỗi bình là 50-70ml.
+ Bước 3: Tiến hành nuôi cây giống trong điếu kiện tối hoàn toàn ở nhiệt độ
20-22
0
C.
+ Bước 4: Sau 2 tháng cây đã hình thành củ. Lúc này tiến hành thu hoạch củ in vitrro. Như vậy,
đã tạo được củ sạch bệnh virus.


Cây sau khi nuôi cấy Cây khi hình thành củ

 Nhân giống in vitro hoa đồng tiền: Các bước thực hiện như sau:
+ Bước 1: Khử trùng mẫu. Mẫu lấy là các nụ hoa bình thường. Nụ hoa được lấy về sau đó khử
trùng bằng HgCl
2
nồng độ 0,1% trong 7 phút.
+ Bước 2: Cắt nụ hoa thành các lát mỏng. Dùng các lát mỏng này để tạo thể tiền chồi bằng cách
nuôi cấy trong môi trường nhân tạo (MS, 1ppmBA, 0,2ppm Ki, 0,2pp IAA).

+ Bước 3: Nhân nhanh chồi mầm. Tách thể tiền chồi và nuôi cấy trong môi trường nhân tạo
(MS, 1ppm Ki).
+ Bước 4: Tạo cây hoàn chỉnh. Sau nhân nhanh tách cây và nuôi trong môi trường nhân tạo
(MS, 0,1ppm α-NAA).
+ Bước 5: Sau tạo cây hoàn chỉnh thì đưa cây con ra vườn thích nghi. Cây con được trồng trong
giá thể (1 trấu hun + 1 mùn) và đảm bảo những điều kiện tốt nhất cho cây con phát triển. Sau đó
cây con được đưa ra vườn sản xuất. Tiến hành chăm sóc bình thường.