enzym xylanase trong công nghệ thực phẩm

Enzyme trong công nghệ thực phẩm
Nhóm 1 – 49k hoá thực phẩm gồm các thành viên :

1. Hoàng Thị Phương Anh 0852049105
2. Nguyễn Thị Bảy 0852040449
3. Đinh Thị Quỳnh Bé 0852045283
4. Nguyễn Thị Chung 0852045298
5. Lê Thị Dung 0852040456
6. Nguyễn Thị Dung 0852040434
7. Nguyễn Cảnh Dũng 0852049081
8. Trần Anh Dũng 0852040452
9. Lê Thị Duyên 0852040429
Mở đầu
Từ trước thế kỉ 17, loài người chưa biết gì về enzyme, người ta đã biết sử dụng
rộng rãi các quy trình enzyme trong thực tế như làm bánh mì, bia, rượu, muối dưa…
Việc sử dụng enzyme trong giai đoạn này mang tính chất kinh nghiệm thuần túy và
sử dụng enzyme thông qua hoạt động sống.
Ngày nay cùng với sự phát triển mạnh mẽ của Công nghệ sinh học, các chế phẩm
enzyme được sản xuất càng nhiều và được sử dụng trong hầu hết các lĩnh vực như:
chế biến thực phẩm,nông nghiệp,chăn nuôi,y tế… Hàng năm luợng enzyme được sản
xuất trên thế giới đạt khoảng trên 300.000 tấn với trên 500 triệu USD,được phân phối
trong các lĩnh vực khác nhau.
Phần lớn enzyme được sản xuất ở quy mô công nghiệp đều thuộc loại enzyme đơn
cấu tử, xúc tác cho phản ứng phân hủy.Khoảng 75% chế phẩm là enzyme thủy phân
được sử dụng cho việc thủy phân cơ chất tự nhiên.
Enzyme pectinase là enzyme xúc tác sự thủy phân pectin. Nó được sản xuất chủ yếu
bởi nấm mốc Aspergillus sp., Botrytis cinerea, Fusarium moniliforme,
Rhizopus stolonifer, Trichoderma sp., Neurospora crassa…
Enzyme pectinase thường được dùng trong công nghiệp thực phẩm và dược phẩm
đặc biệt được sử dụng nhiều nhất trong sản xuất nước quả , sản xuất rượu vang, trích
ly đông dược ( sắc thuốc ), và trong chăn nuôi...

Chương 1 : Tổng quan về enzyme pectinase
1.1 Giới thiệu chung về enzyme pectinase
Enzyme pectinase là enzyme xúc tác thủy phân liên kết ester hoặc liên kết glucoside
có trong mạch polyme của pectin.
1.1.1 Cơ chất pectin
Hình 1: phân tử pectin
+ Pectin là hợp chất cao phân tử mạch thẳng có cấu tạo từ sự kết hợp của acid
galacturonic qua các liên kết α-1,4-glucoside. Tùy thuộc vào nguồn pectin mà pectin
có khối lượng phân tử từ 80000-200000. Pectin không hòa tan trong rượu và các
dung môi hữu cơ khác. Pectin hoà tan trong nước, amoniac, dung dịch kiềm,
carbonate natri và trong glycerine nóng. Độ hòa tan của pectin trong nước tăng lên
khi mức độ ester hóa trong phân tử tăng và khi khối lượng phân tử pectin giảm.
+ Pectin là tên chung được gọi cho những hỗn hợp chứa các thành phần rất khác
nhau, trong đó pectinic acid là thành phần chủ yếu. Các pectin tự nhiên định vị trong
thành tế bào có thể liên kết với các cấu trúc polysaccaride và protein để tạo thành các
proto pectin không hòa tan. Có thể phân hủy để làm cho pectin tan trong nước bằng
cách đun nóng pectin trong môi trường acid. Vì thế, các pectin tan thu nhận được là
kết quả của sự phân hủy phân tử pectin không tan và chúng không đồng dạng với
nhau.
+ Trong thực vật, pectin tồn tại dưới 3 dạng: pectin hòa tan, pectinic acid và
protopectin.
- Pectin hòa tan là ester methylic của acid polygalacturonic pectin, trong tự nhiên có
khoảng 2/3 số nhóm carboxyl của polygalacturonic acid được ester hóa bằng
methanol. Pectin được ester hóa cao sẽ tạo gel đặc trong dung dịch acid và trong
dung dịch đường có nồng độ 65%. Enzyme pectinase tác động lên pectin có khối
lượng phân tử khác nhau và cấu trúc hóa học không đồng dạng. Cấu trúc hóa học cơ
bản của pectin là α-D-galacturonan hay α-D-galacturonoglycan, mạch thẳng có cấu
tạo từ các đơn vị D-galactopyranosyluronic acid (liên kết theo kiểu α-1,4). Mặt khác,

mức độ oxy hóa trong các phân tử polymer này cũng khác nhau, trong đó một số nhất
định các nhóm carboxyl bị ester hóa bởi các nhóm methoxyl. Trong một số trường
hợp, chẳng hạn trong pectin củ cải đường, có sự ester hóa giữa các nhóm carboxyl và
các nhóm acetyl.
- Pectinic acid là polygalacturonic acid có một phần nhỏ các nhóm carboxyl được
ester hóa bằng methanol. Pectinate là muối của pectinic acid. Pectic acid là
polygalacturonic đã hoàn toàn giải phóng khỏi nhóm methoxy, tức là trong đó có
chứa một nhóm carboxyl tự do trên một đơn vị polygalacturonic acid. Pectate là muối
của pectic acid.
- Protopectin tạo độ cứng cho quả xanh, không tan trong nước và có cấu tạo hóa học
phức tạp. Trong thành phần pectin có các phân tử pectin, các phân tử cellulose và các
ion Ca
2+
, Mg
2+
, các gốc phosphoric acid, acetic acid và đường. Protopectin khi bị thủy
phân bằng acid thì giải phóng pectin hòa tan.
Protopectin (Insoluble ) + H
2
O
⇒
Pectin (Soluble )
1.1.2 Enzyme pectinase:
Hình 2 : cấu trúc phân tử pectinase
Enzyme pectinase là enzyme xúc tác sự phân hủy các polymer pectin. Sự phân hủy
pectin trong tự nhiên thường xảy ra khi trái cây chín. Những enzyme này vì vậy có
một vai trò hết sức quan trọng trong quá trình bảo quản trái cây và rau quả.
1.2 Phân loại enzyme pectinase
Hiện nay hệ thống enzyme pectinase được chia làm 2 nhóm chính : hydrolase,
transeliminase với đặc điểm chung nhất là làm giảm độ nhớt của dung dịch pectin và

làm giảm phân tử lượng của các sản phẩm tạo thành.
1.2.1 Enzyme hydrolase
Thuộc nhóm này có 2 enzyme chủ yếu là : pectinesterase và polygalacturonase.
- Pectinesterase - gọi tắt là PE : enzyme xúc tác thủy phân liên kết este trong phân tử
pectin hóa axit pectinic để giải phóng sản phẩm là methanol và axit polygalacturonic.
PE chỉ phân cắt các nhóm metoxyl đứng cạnh nhóm –COOH tự do. Pectinesterase
thu được từ các nguồn khác nhau có giá trị pH tối ưu khác nhau. Nếu thu từ nguồn
VSV thì pH tối ưu từ 4.5-5.5, còn nếu từ nguồn thực vật thì có pH tối ưu từ 5.0-8.5.
Pectinesterase từ nấm mốc có nhiệt độ tối ưu là 30-45
0
C và bị vô hoạt ở 55-62
0
C.
Pectinesterase thường được hoạt hóa bởi các ion Ca
2+
và Mg
2+
.
- Polygalacturonase - gọi tắt là PG : ( poly
α
1-4
- galacturonit glucanhydronase ). xúc
tác sự phân cắt các mối liên kết α-1,4-glycosid. Các exo-PG (exo-poly (1,4-α-D-
galacturonide) galacturonohydrolase, EC 3.2.1.67), phân cắt từ các đầu không khử,
và endo-PG (endo-poly (1,4-α-D-galacturonide) glycanohydrolase, EC 3.2.1.15) tấn
công ngẫu nhiên vào giữa mạch cơ chất
Enzyme này ít gặp trong thực vật, chủ yếu gặp trong vi khuẩn và nấm mốc. Đây là
một phức hệ enzyme và thường có tính đặc hiệu cao đối với cơ chất. Dựa vào đó
người ta chia ra 4 kiểu sau :
+ Polymetyl – galacturonase ( PMG – Poly -

α
1-4
– galacturozit – metyl este
glucanhydrolase ). PMG được phân thành 2 nhóm nhỏ phụ thuộc vào vị trí phân cắt
liên kết
α
1,4
ở trong hay ở cuối và đầu mạch.
•
Endo glucozidase polymetyl galactunase kiểu I ( endo- PMG – I ). Đây là enzyme
có tính chất dịch hóa , pectin có mức độ metyl hóa càng cao ( nhiều gốc metoxy –
OCH
3
) thì bị thủy phân càng nhanh và triệt để. Trong môi trường khi có mặt
pectinesterase ( PE ) thì enzyme này càng bị giảm hoạt lực.
Endo – PMG – I rất phổ biến trong các nấm mốc : Asp , Niger , Asp.Awamori,
Botrytis cinezea , Neurispora crassa.
Cơ chế tác dụng như hình vẽ :
•
Exo - glucozidase polymetyl galacturonase kiểu III ( exo- PMG – III ). Đây là
enzyme có tính chất đường hóa, có khả năng cắt từng gốc monome axit galacturonic
ra khỏi mạch bắt đầu từ đầu không khử có nhóm metoxy (-OCH
3
)
Cơ chế tác dụng như hình vẽ :
+ Enzyme tác dụng lên axit pectinic hay axit pectit - gọi là polygalacturonase ( PG )
cũng được phân thành 2 nhóm nhỏ :
•
Endo glucozidase polygalacturonase kiểu II ( endo- PG – II ). Đây là enzyme có
tính chất dịch hóa, chỉ thủy phân cơ chất khi có mặt nhóm –COOH tự do. Hoạt độ

của endo – PG- II tăng lên nhiều khi cơ chất được xử lý trước bằng pectinesterase
( dể tạo ra nhiều gốc –COOH tự do ). Nấm mốc và vi khuẩn tổng hợp được enzyme
này.
Cơ chế tác dụng như hình vẽ :
•
Enxo – glucozidase polygalacturonase kiểu IV ( exo- PG- IV )
Thủy phân các liên kết gắn với nhóm –COOH tự do ở đầu hay mối mạch.
1.2.2 Transeliminase ( TE )
Đây là nhóm enzyme được tìm ra cách đây chưa lâu lắm ( khoảng năm 1960-1961)
bao gồm protopectinase xúc tác sự phân cắt araban , galactan khỏi protopectin để tạo
thành pectin hòa tan và enzyme transeliminase phân cắt phi thủy phân ( không có sự
tham gia của phân tử nước ) pectin để tạo ra các gốc galacturonic có nối kép giữa C
4
,
và C
5
. Phản ứng xảy ra dễ dàng ở môi trường trung tính hay kiềm yếu.


1.3 Các nguồn thu nhận enzyme pectinase
1.3.1 Sơ lược chung
Có hai loại enzyme là: nội bào và ngoại bào, mỗi enzyme đòi hỏi phải có phương
pháp tách và thu nhận riêng:
• Enzyme ngoại bào: (gồm pectinase) do vi sinh vật tiết ra trong môi trường
nuôi cấy ngoài tế bào, thường hòa tan trong nước do đó dễ trích ly và tinh
sạch.
• Enzyme nội bào: là enzyme được sản xuất ra bên trong tế bào vi sinh vật
và không được tiết ra môi trường bên ngoài. Những tế bào vi sinh vật sau
khi được nuôi cấy sẽ được tách ra và phá vỡ tế bào. Mục đích của việc này
là giải phóng toàn bộ các chất có trong tế bào gồm cả enzyme nội bào Hỗn

hợp thu được sẽ đem ly tâm tách tạp chất và những chất có phân tử lượng
lớn; còn enzyme sẽ được kết tủa bằng cồn hay muối. Enzyme sau đó sẽ
được đem tinh sạch.
Bảng 1 : So sánh enzyme nội bào và enzyme ngoại bào
Enzyme nội bào Enzyme ngoại bào
Khó tách Dễ tách
Phải phá vỡ thành tế bào Không cần phá vỡ thành tế bào
Thường lẫn chung với các chất khác
của tế bào sau khi bị phá vỡ (acid
nucleic, chất nguyên sinh, lipid….)
Không lẫn chung với các thành phần
nội bào, nếu có chỉ là một vài
enzyme ngoại bào khác.
Chỉ bền vững ở trong môi trường nội
bào.
Bền vững hơn
Phương pháp tinh sạch khó thực
hiện, quy trình công nghệ phức tạp,
giá thành đắt
Phương pháp tinh sạch dễ và rẻ hơn.
1.3.2 Thu nhận enzyme pectinase
Hiện nay người ta thu nhận pectinase chủ yếu từ VSV. Có 2 phương pháp sản xuất
pectinase :
+ Thu nhận chế phẩm enzyme pectinase theo phương pháp bề mặt
+ Thu nhận chế phẩm enzyme pectinase theo phương pháp bề sâu
1.3.2.1 Thu nhận chế phẩm enzyme pectinase theo phương pháp bề mặt
Môi trường sử dụng để nuôi cấy VSV để thu nhận pectinase thường là cám gạo hay
cám mì, bã củ cải hay thóc mầm. Nguồn dinh dưỡng bổ sung thường là amonium,
photphoric. Độ ẩm môi trường phải nằm trong khoảng 60% .
Nấm mốc A.awamori thường được nuôi cấy ở 30

0
C trong thời gian 40giờ, sau đó
giảm xuống 24
0
C và nuôi cấy trong thời gian 48-52 giờ. Sản phẩm lên men được sấy
khô thành chế phẩm enzyme thô và đem tinh chế.
Để thu được chế phẩm pectinase tinh khiết thì chế phẩm enzyme thô phải được trích
ly bằng phương pháp kết tủa nhờ dung môi hữu cơ hay muối amoni sunfat. Dung môi
hữu cơ dùng để kết tủa enzyme pectinase có thể là rượu etanol ( 72.5-75% ) hoặc
isopropanol ( 55-57%). Muối amonium sunfat sử dụng có độ bão hòa 0.79. Khi kết
tủa bằng rượu ethanol chế phẩm enzyme thu được có độ tinh khiết 90%, còn nếu
bằng muối thì có độ tinh khiết 75%. Nhiệt độ kết tủa tối ưu với rượu là 2-5
0
C, thời
gian tiếp xúc với rượu càng ngắn càng tốt. Sau đó ly tâm để tách kết tủa khỏi dung
dịch, sấy kết tủa trong thiết bị sấy chân không hay sấy thăng hoa rồi nghiền nhỏ và
đem bảo quản.
1.3.2.2 Thu nhận chế phẩm enzyme pectinase theo phương pháp bề sâu
- Phương pháp hiếu khí :
Sự tích tụ enzyme trong môi trường được bắt đầu khi sự phát triển của VSV gần đạt
đến pha ổn định, khi môi trường bị axit hóa mạnh và khi lượng phốt pho vô cơ được
sử dụng hoàn toàn. pH của môi trường nuôi cấy thường đạt từ 6-7.2 là thích hợp. Đối
với nấm mốc pH kiềm kìm hãm sự tổng hợp sinh khối và sự tích lũy enzyme
pectinase. pH =4 ức chế hoàn toàn sự tích lũy enzyme pectinase. Khi pH dịch về phía
axit, ngay cả khi pH nằm trong khoảng 4.5-5.0, tuy sự tạo thành sinh khối không bị
ảnh hưởng nhưng sự tạo thành enzyme pectinase bị kìm hãm. Tuy nhiên pH môi
trường nuôi cấy của các A.niger và A.awamori 16 có thể dịch về 3.5-3.8 và 2.9-3.2
theo thứ tự.
Vật liệu gieo cấy có thể là sợi nấm 24, 32, và 48 giờ tuổi và với hàm lượng từ
2-10%. Đối với A.niger và A.awamori, vật liệu gieo là sợi nấm được ủ sơ bộ trong

môi trường dinh dưỡng cho đến khi bắt đầu sinh bào tử. Thời gian ủ sơ bộ thường là
38-42 giờ. Lượng sợi nấm đem gieo cấy thường là 2%. Trong quá trình nuôi cấy, hàm
lượng chất hòa tan trong môi trường thường giảm từ 6% xuống còn 1.5-1.8%
Để thu chế phẩm khô, cần tách sợi nấm ra khỏi canh trưòng lỏng. Cô đặc chân không
canh trường lỏng đến khi hàm lượng chất khô đạt từ 5-8% rồi sấy khô trên thiết bị sấy
phun , điều kiện sấy phun là nhiệt độ chất tải nhiệt đi vào phải đạt từ 165-180
0
C và đi
ra đạt 60-70
0
C. Thời gian lưu của chế phẩm enzyme trong thiết bị sấy phun không
quá 7 giây và nhiệt độ chế phẩm sau khi sấy không quá 40
0
C. Chế phẩm thu được cần
phải được đóng gói kín để tránh hút ẩm. Có thể thu được chế phẩm enzyme pectinase
tinh khiết bằng cách kết tủa enzyme trong dịch lọc canh trường với ethanol theo tỉ lệ
4:1, với axeton theo tỉ lệ 2:1, với isopropan theo tỉ lệ 1.3:1, hoặc với muối amoni
sunfat ( 50-80% ) trong muối kết. Nếu kết tủa bằng ethanol, hoạt độ pectin trong kết
tủa sẽ vào khoảng 88-90% so với hoạt độ của dịch canh trường ban đầu. Nếu kết tủa
bằng muối amoni sunfat. Cần tách muối ra khỏi enzyme bằng phương pháp thẩm tích
(với nước hoặc dung dịch đệm ), sau đó sấy khô. Khi độ bão hòa của (NH
4
)
2
SO
4
=0.5
thì sẽ kết tủa được đoạn có hoạt độ pectinase thấp( đoạn này chiếm 0.25% trọng
lượng khô ). Nhưng nếu kết tủa bằng (NH
4

)
2
SO
4
có độ bão hòa 1.0 thì sẽ kết tủa
được đoạn chỉ chiếm 0.11% nhưng lại có hoạt độ pectinase cao.
- Phương pháp yếm khí
Môi trường :
+ Bã củ cải 2%
+ (NH
4
)
2
HPO
4
0.75%
+ KH
2
PO
4
0.1%
+ CaCO
3
0.3%
+ Nước chiết ngô 0.5%
Clostridium pectinopermentants 15 có khả năng tổng hợp pectinnase một cách mạnh
mẽ ở pha tăng trưởng của quá trình sinh trưởng và tăng đồng thời với sự tích lũy
enzyme sẽ tối đa tương ứng với pha ổn định của sự sinh trưởng qua 55-60 giờ. pH
ban đầu của môi trường dung dịch là 6.5-7.0. Vật liệu gieo cấy ban đầu được chuẩn bị
ở dạng canh trường chứa bào tử và được cấy với lượng 4% theo thể tích. Quá trình

nuôi cấy được tiến hành ở nhiệt độ 35
0
C.
Cl. Felsineum cũng có thể được nuôi cấy yếm khí để thu pectinase.
Thành phần môi trường gồm có : (NH
4
)
2
HPO
4
0.4% , KH
2
PO
4
0.3%, K
2
HPO
4
0.7%
, NaCl 0.1% , MgSO
4
0.025% , FeSO
4
dạng vết, CaCO
3
0.5%, dịch nấm men tự phân
0.05%, ascorbic axit 0.5% .
Có thể tiến hành thu phế phẩm từ dịch lọc canh trường bằng cách kết tủa enzyme với
dung môi hữu cơ hoặc với muối amoni sunfat. Nếu kết tủa bằng dung môi hữu cơ, pH
của dung dịch đã xử lý là 6.5-6.8. Nếu kết tủa bằng 2-2.5 thể tích axeton thì hoạt độ

của enzyme trong kết tủa đạt 93-95% so với hoạt độ ban ban đầu.
Khi kết tủa bằng amoni sunfat có độ bão hòa bằng 0.2 thì sẽ thu được chế phẩm chỉ
chứa pectinesterase và pectintranseliminase và exopolygalacturonase.
Phương pháp hiện đại trong chuẩn bị chế phẩm enzyme pectinase thường theo các
bước cơ bản sau đây :
•
Khử muối bằng phương pháp lọc gel ( Biogel P100)
•
Tách protein bằng phương pháp trao đổi ion ( DEAE Biogel A ) hay trao đổi cation
( CM Biogel A)
•
Tách enzyme pectinase bằng alginate liên kết ngang
•
Tinh sạch FPLC
Alginate liên kết ngang hoạt động bằng cách kết hợp ái lực, ảnh hưởng tĩnh điện và
thay thế pectate liên kết ngang.
Chương 2 : Công nghệ sản xuất enzyme từ vi sinh vật
2.1 Nguyên liệu sản xuất
2.1.1 Thực vật
Pectinase có nhiều trong lá, củ khoai tây, trong chanh, cà chua, cỏ ba lá, trong một số
loại quả. Thường là có nhiều enzyme pectinesterase.
Đặc điểm của pectinesterase thực vật :
Bên cạnh pectinesterase ( PE ) vi sinh vật, hầu hết các loại cây cho trái đều chứa
enzyme PE. Enzyme này thường tồn tại dưới nhiều hình thức khác nhau, nằm trong
phần vỏ tế bào. PE ở thực vật nói chung có hoạt độ tối ưu trong khoảng pH hơi kiềm.
Các cation kim loại ở nồng độ thấp như Ca
2+
có khuynh hướng làm tăng nồng độ hoạt
động của enzyme.
- Cà chua chứa ít nhất hai loại PE. Cả PE1 và PE2 đều tăng trong giai đoạn đầu của

quá trình chín. Khi bước vào giai đoạn chín, nồng độ enzyme PE1 giảm xuống,
nhưng PE2 tích lũy dần cho trái cây có màu đặc trưng của trái chín. PE2 có khối
lượng phân tử 23kD, pH tối ưu 7.6. Enzyme này bị bất hoạt 50% sau 5 phút đun ở
67
0
C. Các ion Ca
2+
và Na
+
làm tăng hoạt độ của enzyme lên tối đa ở các nồng độ
0.005M và 0.05M theo thứ tự. PE của đậu nành là protein có khối lượng phân tử
33kD, hoạt động tối ưu tại pH gần bằng 8. Polygacturonic acid, sản phẩm hình thành
do quá trình đề methyl hóa, là một chất ức chế cạnh tranh.
- Trong thịt quả chuối có 2 isoenzyme PE. Cả hai có cùng khối lượng phân tử là
30kD, nhưng có điểm đẳng điện khác nhau : 8.8 và 9.3. Các enzyme này hoạt động ở
pH tối ưu là 7.5. Hoạt độ enzyme tăng lên khi thêm vào dung dịch NaCl ở nồng độ
0.2M và đưa pH của dung dịch về 6.0. Các enzyme này bị ức chế bởi nhiều loại
polyol có khối lượng phân tử thấp như glycerol, sucrose, glucose, maltose và
galactose.
PE trong quả cam có hai loại : Đó là 2 enzyme PE1 và PE2 có khối lượng phân tử
36kD, nhưng có điểm đẳng điện khác nhau là 10.05 và
≥
11.0 theo thứ tự. pH tối ưu
của PE1 là 7.6 , còn của PE2 là 8.0.
- Thịt quả cũng chứa 2 isoenzyme, một trong hai enzyme này có tính bền nhiệt hơn,
còn enzyme kia thì ít mẫn cảm hơn khi tác động của protease. Độ ổn định của
enzyme có thể liên quan đến mức độ của glucosyl hóa của các phân tử enzyme.
Enzyme bền nhiệt hơn và enzyme kia có khối lượng là 51kD và 36kD theo thứ tự.
- Cả táo và kiwi cũng chứa 2 isoenzyme. Các isoenzyme của kiwi có cùng khối
lượng phân tử là 57kD và cùng điểm đẳng điện là 7.3. Tuy nhiên chúng khác nhau về

mức độ bền nhệt. Một điểm đáng lưu ý là tất cả enzyme vi sinh vật đều không phải là
protein kiềm. PE của Trichoderma reerei có điểm đẳng điện nằm trong khoảng
8.3-9.5 và pH tối ưu là 7.6. Tuy nhiên PE của Aspergillus có điểm đẳng điện và pH
tối ưu trong khoảng acid. Hoạt động của enzyme sinh ra bởi A.niger đạt tối đa ở pH
4.5 ở 40
0
C. Các PE acid và kiềm có thể đề methyl hóa cơ chất pectin theo cùng một
kiểu. PE kiềm làm hình thành các pectin được đề ester hóa và pectin này có thể tạo
gel yếu với ion Ca
2+
, PE acid tạo ra pectin bị đề ester hóa có khả năng tạo gel mạnh
với ion Ca
2+
.
+ Trình tự aminoacid : Cấu trúc bậc một của PE cà chua chứa 305 amino acid với
khối lượng phân tử 33239. Enzim này có chứa 2 cầu nối disulfide (Cys98-Cys125 và
Cys166-Cys200). Cys 166 có mặt trong tất cả các enzyme pectinesterase.Trình tự
amino acid suy luận trên cơ sở các nucleotit cho thấy sự không nhất quán, 18 trong
27 vị trí khác nhau, có thể làm thay đổi điện tích của protein. Mặt khác chỉ có khoảng
94% trình tự amino acid trong một phần chuỗi amino acid có tính đồng dạng với toàn
bộ trình tự của nucleotit. Sự thống nhất quán này có thể phản ánh sự tồn tại của
isoenzyme, mặc dù chỉ có 2 isoenzyme trong cà chua được biết đến. Một số gen mã
hóa cho các enzyme PE đã được tách dòng và nghiên cứu đặc điểm. Gen tách dòng từ
Pseudomonas mã hóa cho PE có chứa 396 amino acid với khối lượng phân tử là
41004.
+ Cơ chế methyl hóa : PE loại bỏ các nhóm methoxyl trong phân tử pectin bằng
tương tác ái nhân của enzyme lên ester, làm hình thành hợp chất trung gian acyl-
enzyme và cacboxylic acid.
Các PE có nguồn gốc thực vật phản ứng theo kiểu làm hình thành các khối pectin
có chứa các nhóm cacboxylate dọc theo mạch pectin. Enzyme của Trichoderma

reesei là một protein cơ bản cho kiểu phản ứng tương tự. Enzyme của các loài
Asperillus với pH tối đa trong vùng acid, xúc tác phản ứng từ bên trong.
Ảnh hưởng của các ion kim loại khi kích hoạt enzyme pectinesterase có thể liên
quan đến tương tác của nó với cơ chất. Polygalacturonic acid là một chất ức chế cạnh
tranh trong phản ứng thủy phân nhờ xúc tác của PE. Pectin chứa các nhóm
cacboxylate được sắp xếp như hình khối có thể tác dụng theo cách tương tự. Sự liên
kết của các ion kim loại vào các nhóm cacboxylate trong trường hợp này có khuynh
hướng trung hòa ảnh hưởng ức chế của cơ chất pectin lên enzyme. Tuy nhiên, lượng
dư của các ion này trên thực tế gây ra sự bất hoạt của PE vì các ion kim loại bị vây
quanh bởi các nhóm cacboxylate nằm kế cận với các liên kết ester cần thiết cho phản
ứng thủy phân xảy ra.

2.1.2 Vi sinh vật
Nhiều vi sinh vật sống trong đất, trong nước có khả năng phân giải pectin. Chúng có
ý nghĩa quan trọng không những đối với vòng tuần hoàn 2 cacbon trong tự nhiên mà
còn đối với một số ngành sản xuất trong công nghiệp.
Những vi sinh vật có khả năng phân giải pectin mạnh mẽ nhất :
+ Nấm mốc : Asp. ficuum, Asp.niger, Asp.oryzae, Asp.awamori, Asp.terrus, Asp.saitoi,
Pen.glaucum, Pen.chrlichii, Mucor mucedo, Rhizopus tritici,…
Trong số các biến chứng của nấm mốc đáng chú ý là Asp.niger và Asp.awamori.
+ Nấm men: Sac.fragilis, Sac.ellipsoideus, Sac.ludwigii,…
+ Vi khuẩn : Bac.polymyxa, felseneus, Clostridium roserum, Pseudomonas flurescens..
Tất cả các vi sinh vật dùng để thu enzyme pectinase đều là vi sinh vật hiếu khí.
Đặc điểm phân bố enzyme pectinase ở vi sinh vật :
Sự phân bố các kiểu enzyme pectinase ở vi sinh vật không giống nhau : có cơ thể chỉ
tạo được một enzyme song đa số cơ thể khác lại tạo ra được một phức hệ enzyme
pectinase khác nhau mà tùy theo loài.
- Sac.fragilis : chế tạo ra duy nhất 1 loài enzyme phân giải pectin dải nhất là
endo-polygalacturonase.
- Các nấm mốc Asp.niger, Asp.awamori, Asp.foelidus, Asp.saitoi… thường tạo ra được

một phức hệ enzyme pectinase khác nhau.
- Enzyme pectinesterase: chủ yếu được tạo ra từ Asp.niger. Ngược lại ở
Pencitrimim.Ag.campestris lại không tạo được enzyme này.
- Các enzyme pectin-hydrolase (pectinesterase và polygalacturonase): chủ yếu được
tạo ra từ vi khuẩn Erwinia caralovora, Bac.polymxa, Klebsiella acrogens, Flavobact
pectinovorum, Actinomyces.
- Enzyme pectin-transeliminase: chủ yếu do Bac.species; Asp.fonseanes;
Bac.polymyxa…
- Các enzyme polygalacturonase thường được tạo ra chủ yếu bởi Con.diplodiella,
Ag.campestris, Pen.citrimin…
Các enzyme pectinase ở vi sinh vật có thể là enzyme cảm ứng, hoặc chỉ là enzyme
bản thể. Theo F.Moran và M.P.Starr, các VSV Erwinia eurolovora và Erwinia
aroideae chỉ tạo ra enzyme polygalacturonat-transeliminase bản thể song sẽ tạo ra
enzyme này cảm ứng khi có mặt acid Polygalacturonic hoặc các sản phẩm phân giải
của nó. Ngược lại D.Knosel thì cho rằng các acticomyces chỉ có khả năng sinh tổng
hợp ra enzyme polygalacturonat-transeliminase cảm ứng.
Một điểm khác cũng đáng lưu ý là các enzyme pectinase ở các vi sinh vật không
những khác nhau về đặc điểm phân bố mà còn khác nhau về tính chất.
Điều kiện hình thành enzyme pectinase bởi các vi sinh vật
Sự sinh trưởng tốt của vi sinh vật trên môi trường này hay môi trường khác chưa thể
coi là chỉ tiêu của sự tân tạo tối đa của 1 enzyme cần thiết nào đó. Môi trường mà
trước hết là nguồn C, N, P được chọn một cách đặc hiệu sẽ đảm bảo được sự định
hướng tổng hợp các enzyme, không những vậy môi trường dinh dưỡng sẽ còn tác
động đến các enzyme trong chế phẩm thu được. Theo P. Kontio, với enzyme
pectinase, chế phẩm enzyme thu được khi nuôi cấy Aspergillus niger trên môi trường
dinh dưỡng khác nhau sẽ khác nhau về vị trí số pH tối ưu trên cơ chất.
2.1.2.1 Ảnh hưởng của chất cảm ứng và nguồn cac bon
- Chất cảm ứng pectin bắt buộc.
- Nguồn các bon : polysaccharide, disaccharide, monosaccharide
Nếu sử dụng hỗn hợp gluxit trong đó có pectin để nuôi cấy vi sinh vật thì hoạt lực của

pectinase ngoại bào có thể tăng 4 – 6 lần so với khi nuôi cấy không có pectin.
Giống Asp.Niger được nuôi cấy trên môi trường có nhiều nguồn các bon như pectin ,
tinh bột, isulin, lactose, saccarose, mantose, galactose nồng độ 2, 4, 6 % sẽ cho
pectinase có hiệu suất cao. Tuy nhiên nên nuôi cấy trên môi trường chỉ có
monosaccarit và glyxerin thì hoàn toàn không thể sinh tổng hợp này. Đường glucose
có tác dụng kìm hãm sinh tổng hợp enzyme pectinase trên môi trường nuôi cấy là
pectin và lactose đối với loài Asp.Niger , Asp.Awamori
Nguồn cacbon ở
trong môi
trường
pH cuối
Khối lượng sợi
nấm khô(g)
Hoạt độ pectinase đơn vị
Trên 100ml môi
trường
Trên 100g sợi
nấm khô
Pectin 2%
Pectin 4%
Lactose 2%
Lactose 4%
Saccarose 2%
Saccarose 4%
Lactose 2% +
Pectin 2%
Saccarose 2% +
Pectin 2%
5,9
6,0

7,0
7,0
4,2
4,5
3,0
3,5
0,320
0,510
0,020
0,020
0,300
0,500
1,120
1,125
385,9
640,2
00
00
65
20
1894,2
864,3
1206
1250
00
00
21
40
1600
690

Bảng 2 : Ảnh hưởng của nguồn cacbon
2.1.2.2 Ảnh hưởng của nguồn nitơ
Nếu dùng kết hợp nitơ hữu cơ và vô cơ sẽ có tác động tốt đến quá trình sinh tổng hợp
pectinase. Tuy nhiên, muối nitrat kim loại kiềm lại kìm hãm enzyme này.
Ví dụ:
- Đối với Asp.niger thì sử dụng muối photphat diamon ( NH
4
H
2
PO
4
) để sinh tổng
hợp enzyme pectinase tốt nhất.
- Đối với Asp.awamori thì nguồn nitơ thuận lợi nhất là amoni sunphat (NH
4
)
2
SO
4
- Đối với nấm mốc Asp.Foetidus thì (NH
4
)
2
SO
4
, nước chiết nấm men có tác dụng
nâng cao hoạt lực polygalacturonase.
- Khi sử dụng các nguồn nitơ tối ưu này ta nhận thấy dịch canh trường bị acid hoá
đến pH = 2,5-3,0 và có sự tích luỹ enzyme pectinase tốt hơn.
Nói chung, tỉ lệ thích hợp nhất đối với C/N khi tổng hợp pectinase trong khoảng

7/1 – 13/1.
Nguồn nito
(0.15% tính theo
nito)
Lactose 2% + Pectin 2%
Khối
lượng sợi
nấm
khô(gam)
Hđ P
đvị/10ml
Hđ PE Hđ PMG Hđ PG
Đơn vị/g
(NH
4
)
2
HPO
4
NaNO
3
NH
4
NO
3
Pepton
Dịch thuỷ phân
casein
(NH
4

)
2
HPO
4
NaNO
3
NH
4
NO
3
Pepton
Dịch thuỷ phân
casein
1,200
0,890
0,850
1,500
1,550
1820,7
880,6
810,9
1620,0
1350,0
0,491
0,197
0,163
0,418
0,340
0,560
0,310

0,278
0,410
0,450
0,885
0,560
9,560
0,750
0,800
Saccharose 2% + pectin 2%
1,150
0,920
0,890
1,300
1,450
820,2
590,4
94,8
750,7
7,003
0,163
0,083
Vết
0,160
0,120
0,420
0,280
0,060
0,340
0,370
0,580

0,520
0,320
0,500
0,530
Bảng 3 : Ảnh hưởng của nguồn nitơ
2.1.2.3 Ảnh hưởng của các yếu tố khác
Ngoài nguồn C, N, các nguyên tố vô cơ cũng có ảnh hưởng quan trọng đến sự tạo
thành phức hệ enzyme này. Trong số đó P là cấu tử vô cơ cần thiết của môi trường.
Hàm lượng P trong môi trường phải là 8-10%. Khi sử dụng nguồn N của phốtphát
diamon thì nhu cầu về P của nấm mốc hoàn toàn được thỏa mãn. Các yếu tố khác như
pH của môi trường dinh dưỡng, phương pháp nuôi cấy và điều kiện nuôi cấy đều ảnh
hưởng đến sự tạo ra enzyme pectinase.
2.1.3 Môi trường lên men giống
• Nấm mốc Asp.niger được giữ giống trên môi trường Czapek.
• Chuẩn bị bột cà rốt: cà rốt xay nhuyễn, sấy ở nhiệt độ 60
o
C cho đến khi độ ẩm
cà rốt đạt 4% (nguồn pectin – chất cảm ứng)
• Thành phần môi trường nuôi cấy thu nhận enzyme pectinase gồm:
 Cám gạo 65,5%
 Trấu 21,5%
 Bột cà rốt 11%
 (NH
4
)
2
SO
4
2%
 Độ ẩm 55%.

2.2 Sơ đồ công nghệ

Nguyên liệu

Trộn

Làm ẩm

Thanh trùng bằng nhiệt

Làm nguội, làm tơi

Gieo giống vi sinh vật Nuôi cấy giống

Chuyển vào dụng cụ nuôi cấy

Thu nhận phế phẩm enzyme thô Chế phẩm enzyme thô đem đi sử dụng

Chế phẩm enzyme thô đem tinh chế

Nghiền mịn

Trích ly

Lọc Bã

Kết tủa enzyme

Thu nhận kết tủa

Sấy kết tủa

Tinh chế kết tủa

Thu nhận chế phẩm enzyme tinh khiết

Enzyme kết tinh
Thuyết minh quy trình :
+ Nguyên liệu được trộn với nhau.
+ Làm ẩm : có ý nghĩa quan trọng trong điều kiện sản xuất lớn, hàm ẩm tối ưu của
môi trường cám là 58-60%. Khi nuôi cấy trong điều kiện tiệt trùng nghiêm ngặt thì
đạt hoạt độ enzyme cao nhất khi làm ẩm 65-68%. Tuy nhiên nếu môi trường quá ẩm
thì sẽ bị dính bết ( khi hấp thanh trùng, làm tơi, khi nuôi cấy ), dễ bị nhiễm vi sinh vật
tạp ( bị lên men rượu, lên men giấm…) Để làm ẩm có thể dùng nước trộn với nguyên
liệu rồi thanh trùng hoặc làm ẩm sơ bộ rồi thanh trùng sau đó dùng nước vô trùng
( nước ngưng tụ, nước đun sôi để nguội ) để điều chỉnh lại độ ẩm của khối nguyên
liệu. Cách sau có thể rút ngắn thời gian làm nguội, khống chế được độ ẩm chính xác
hơn nhưng đòi hỏi phải thanh trùng ở nhiệt độ và áp suất cao hơn.
+ Thanh trùng bằng hơi nhiệt :
Làm cho môi trường được tinh khiết hơn về phương diện vi sinh vật và làm cho chín
( biến hình ) môi trường ( tinh bột, protein ). Thông thường người ta thanh trùng bằng
hơi nước trực tiếp ở nhiệt độ 120-130
0
C trong 2-3 giờ.
+ Làm nguội và làm tơi môi trường để gieo giống :
Khối môi trường vừa hấp xong còn nóng và dính bết. Vì vậy phải làm nguội và làm
tơi để thuận tiện cho việc gieo giống và phân phối vào các dụng cụ nuôi cấy. Yêu cầu
thời gian này phải ngắn để hạn chế nhiễm khuẩn từ bên ngoài. Nhiệt độ yêu cầu đạt
được để gieo giống là 35-39
0

C.
+ Nuôi cấy nấm mốc :
Nhằm đủ lượng bào tử giống cho toàn bộ môi trường nuôi cấy. Quy trình công nghệ
thực hiện tương tự như trong sản xuất lớn nhưng phải thực hiện các điều kiện kỹ
thuật đặc biệt và khắt khe hơn như : nguyên liệu phải tốt, giàu chất dinh dưỡng hơn,
điều kiện nuôi cấy khống chế nghiêm ngặt hơn, thời gian nuôi cấy dài hơn ( gần gấp
đôi ) để nấm mốc hình thành nhiều bào tử và đều.
+ Tiến hành quá trình nuôi cấy
Sau khi gieo giống và phân phối vào các dụng cụ nuôi ( mành hay khay đục lỗ ) rồi
chuyển vào phòng nuôi có điều chỉnh nhiệt độ và độ ẩm tương đối của không khí (
ϕ
)
cũng như mức độ thông khí. Quá trình nuôi cấy nấm mốc kéo dài 33-48 giờ/mẻ được
trải qua 3 giai đoạn :
- Giai đoạn 1 : Từ khi nôi cấy nấm mốc giống đến giờ nuôi cấy thứ 10-12. Xảy ra sự
trương nở bào tử và xuất hiện cuống nấm. Để đảm bảo sự nảy mầm nhanh và hạn chế
nhiễm tạp, cần giữ độ ẩm nguyên liệu 55-60%,
ϕ
= 96-100%, T= 30-32
0
C.
- Giai đoạn 2 : Kéo dài trong 10-18 giờ. Nấm mốc phát triển mạnh, lan khắp bề mặt
và trong toàn khối môi trường ( khuẩn ti ăn sâu vào cơ chất) dẫn đến hiện tượng kết
bánh. Quá trình hô hấp và tỏa nhiệt mạnh làm môi trường bị khô xốp, tăng hàm lượng
CO
2
, nhiệt độ phòng nuôi tăng lên
38-40
0
C. Để khống chế nhiệt độ thích hợp 28-30

0
C cần thông gió ( quạt ) và bão hòa
ẩm không khí phòng nuôi.
- Giai đoạn 3 : Kéo dài trong 10-20 giờ và đặc trưng nhất vì tạo ra enzyme nhiều
nhất. Cường độ trao đổi chất giảm đi chút ít, nhiệt tỏa ra ít hơn nên tốc độ bốc hơi
nước của môi trường nuôi cấy cũng giảm theo. Quá trình nuôi cấy được chấm dứt khi
mấm mốc đạt độ già chín sinh lý và bắt đầu tạo thành bào tử.