CAMPYLOBACTER

Môn: Kỹ thuật phân tích Vi sinh – nấm thực phẩm II ATTP 4
CAMPYLOBACTER
PHÂN LOẠI
- Thuộc họ Campylobacteriaceae
- Có 5 loài Campylobacter thường gặp.
C. sputorum, biovar sputorum – là một phần của hệ VSV miệng ở người
C. fetus, ssp. fetus
C. fetus, ssp. venerealis
C. jejuni
C. coli
Kích thước quá nhỏ nên có thể đi qua lọc vi khuẩn
Là nguyên nhân phổ biến gây viêm dạ dày ruột do vi khuẩn ở các
nước phát triển
Riêng ở Mỹ:~2.5 million cas mắc/năm
Các vụ ngộ độc thực phẩm thường liên quan với tiêu thụ gia cầm,
thịt và sữa không thanh trùng
• 1998–2002: 61 vụ với 1,440 người mắc
• Vụ lớn nhất do nguồn nước ô nhiễm ~3,000 cas
• Vụ lớn nhất do sữa ô nhiễm ~1,600 cas ở California 2006
ĐẶC ĐIỂM
• Hình dấu phảy, chữ S hoặc hình cánh chim, Gram âm.
• Di động bằng roi ở một đầu
• Không có vỏ và bào tử
• Phát triển trong điều kiện vi hiếu khí
NƠI CƯ TRÚ
• 3 loài Campylobacter C. jejuni, C. coli,và C. lari chiếm 99% nguyên
nhân gây bênh ở người
• Campylobacter thường cư trú ở đường ruột, ống mật của động vật nuôi,
đặc biệt là gà, trâu bò, và lợn (nhiễm trùng không triệu chứng)
ĐƯỜNG LÂY TRUYỀN
• Phân

• Thực phẩm nguy cơ cao: thịt, sữa
NUÔI CẤY
• Điều kiện vi hiếu khí (5% O
2
) và (10% CO
2
)
• Nhiệt độ 42℃
• Trên các môi trường chọn lọc
1
1
Môn: Kỹ thuật phân tích Vi sinh – nấm thực phẩm II ATTP 4
• Hai dạng khuẩn lạc
Ướt, lan
Khô và lồi
• Sau 48 giờ nuôi cấy có thể xuất hiện khuẩn lạc nhỏ, trong mờ
ĐỘC TỐ - TRIỆU CHỨNG
• Hai loại độc tố:
- Enterotoxin
- Endotoxin
• Triệu chứng:
- Viêm dạ dày ruột: C.jejuni, C.coli
- Nhiễm trùng: C.fetus
KHẢ NĂNG GÂY BỆNH Ở NGƯỜI
• Thường gây tiêu chảy ở trẻ em
• 90% do C.jejuni và C.coli
• Liều gây bệnh thấp
• Thời gian ủ bệnh: 2 – 5 ngày, đôi khi có thể tới 10 ngày
KHẢ NĂNG PHÁT TRIỂN
• Dễ chết ở điều kiện khô, lạnh và trên 48

o
C
• Phát triển được ở pH 4,9
• Phát triển tốt ở pH 5,5 – 8,0
• Phát triển tối ưu ở pH 6,5 – 7,5
PHÂN LẬP VÀ XÁC ĐỊNH CAMPYLOBACTER
Nguyên lý phương pháp
• Phân lập và xác định Campylobacter nuôi cấy trên môi trường chọn lọc
trong khí trường vi hiếu khí ở 420C bằng các thử nghiệm sinh hoá học
đặc trưng.
Phạm vi áp dụng
• Thực phẩm và các sản phẩm thực phẩm.
Tài liệu viện dẫn
52 TCN – TQTP 0014 : 2005
2
2
Môn: Kỹ thuật phân tích Vi sinh – nấm thực phẩm II ATTP 4
THIẾT BỊ-DỤNG CỤ
- Máy đồng nhất mẫu, 10.000 – 20.000 vòng/phút
- Tủ sấy 180 – 200
o
C
- Nồi hấp áp lực
- Tủ ấm 42 ±1
o
C
- Đĩa petri đường kính 90 – 100ml
- Bình nuôi cấy kị khí và túi tạo khí trường vi hiếu khí
- Bình thuỷ tinh vô trùng, dung tích 250 – 500ml
- Ống nghiệm vô trùng 16 – 18 mm

pH met hoặc giấy đo pH
- Túi đồng nhất mẫu có rãnh lọc
- Que cấy, đầu niken/crom hoặc platin. Que cấy thuỷ tinh
HÓA CHẤT-MÔI TRƯỜNG
- Canh thang Preston
- Thạch Charcoal cefoperazone desoxycholate
- Thạch 5%máu thỏ (hoặc bò)
- Thành phần bổ sung vào môi trường cơ sở
- Thạch dinh dưỡng
- Dung dịch Oxy già (H
2
O
2
3%)
- Dung dịch Natri hippurat 1%
- Dung dịch Ninhydrin 3,5%
- Dung dịch thử Oxydase
- Bộ thuốc nhuộm Gram
CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH
* Tăng sinh trong canh thang Preston
• Cân 25 g thực phẩm, cắt nhỏ, xay nhuyễn hoặc dập bằng máy dập mẫu
ở điều kiện vô trùng trong canh thang tăng sinh Preston cho tới khi
đươc thể đồng nhất. Sau đó cho vào bình kỵ khí và tạo khí trường vi
hiếu khí bằng túi tạo khí (chuẩn bị theo hướng dẫn trên túi tạo khí), đậy
chặt nắp bình và ủ ấm ở 42
o
C từ 24 – 48
* Cấy chuyển lên môi trường thạch chọn lọc CCD
3
3

Môn: Kỹ thuật phân tích Vi sinh – nấm thực phẩm II ATTP 4
• Cấy lên hai đĩa thạch chọn lọc CCD, mỗi đĩa 1 ăng canh thang tăng
sinh chọn lọc, ủ trong điều kiện vi hiếu khí như bước trên, ủ ấm 42
o
C từ
24 – 48 giờ để nhận dạng khuẩn lạc nghi ngờ.
• Khuẩn lạc nghi ngờ là Campylobacter dẹt, bóng, thường mọc lan, có
màu từ xám kem nhạt đến xám xanh.
* Cấy chuyển lên môi trường thạch máu
• Từ khuẩn lạc nghi ngờ trên môi trường thạch CCD, dùng que cấy ria
sang môi trường thạch 5% máu bò hoặc thỏ. Ủ ấm trong điều kiện vi
hiếu khí ở 42
o
C/24 giờ để thử khẳng định bằng các phản ứng sinh hoá.
* T hử khẳng định:
Bằng khuẩn lạc vi khuẩn nghi ngờ cấy trên môi trường thạch máu
• Hình thể vi khuẩn
- Nhuộm Gram và soi trên kính hiển vi xác định hình thể vi khuẩn.
Campylobacter là vi khuẩn Gram âm (bắt màu đỏ), có hình lượn sóng hoặc
hình cánh chim. Trường hợp vi khuẩn nuôi cấy để quá 48 h và có sự tiếp
xúc với oxy không khí, Campylobacter chuyển sang dạng hình cầu.
• Phản ứng Catalase
- Nhỏ một giọt H
2
O
2
3% lên lam kính, dùng que cấy lấy một khuẩn lạc đặt
vào giữa giọt H
2
O

2
. Nếu thấy sủi bọt là phản ứng dương tính.
• Phản ứng Oxydase
- Đặt một tờ giấy lọc nhỏ lên lam kính. Dùng que thuỷ tinh hoặc que gỗ vô
trùng lấy một ít khuẩn lạc phết lên tờ giấy lọc. Nhỏ vài giọt thuốc thử
Oxydase lên, đọc kết quả trong 10 giây đầu.
- Phản ứng thuỷ phân Natri hippurat (phân biệt Campylobacter jejuni với
các loài Campylobacter khác)
- Dùng que cấy lấy một ít khuẩn lạc trên môi trường thạch máu cho vào
ống nhựa 2 ml đã có sẵn dung dịch Natri hippurat 1% và nghiền đều cho
đến khi dung dịch có màu sữa, đem ủ ấm ở 37
o
C/2 giờ. Sau đó lấy ra cho
từ từ 200µl dung dịch Ninhydrin 3,5% bằng cách chạm nhẹ pipet vào
thành ống để lớp dung dịch này nổi ở bên trên. Ủ ấm lần nữa ở 37
o
C trong
10 phút và lấy ra đọc kết quả.
- Phản ứng dương tính: xuất hiện màu tím sẫm hoặc xanh.
- Phản ứng âm tính: không màu hoặc màu xám.
4
4
Môn: Kỹ thuật phân tích Vi sinh – nấm thực phẩm II ATTP 4
TIÊU CHUẨN XÁC ĐỊNH
• Gram âm, hình lượn sóng hoặc hình cánh chim
• Catalase dương
• Oxydase dương
BÁO CÁO KẾT QUẢ
• Nêu rõ phương pháp đã dùng và có hay không có Campylobacter trong
25 gam sản phẩm kiểm nghiệm, các thông tin về mẫu thử cũng như các

điều kiện khác với tiêu chuẩn này.
5
5
Môn: Kỹ thuật phân tích Vi sinh – nấm thực phẩm II ATTP 4
TỔNG KẾT VI SINH THỰC PHẨM II
PHƯƠNG PHÁP NGUYÊN LÝ TIẾN HÀNH
CÁC TÍNHCHẤT
ĐIỂN HÌNH TRÊN
MTCL
NHẬN ĐỊNH KẾT
QUẢ
TÍNH KẾT QỦA
TỔNG SỐ
VKHK
-KT đổ đĩa
-Ủ hiếu khí 37±1
0
C
- 48-72h
Kết quả tính theo số
KL
Pha loãng bằng các
dung dịch pha loãng
thông thường
48 h đếm sơ bộ
72h đếm chính thức
Có hay không các đĩa
thỏa mãn yêu cầu
Chọn đĩa 150 – 300 KL của hai
đậm độ liên tiếp để tính KQ

theo
công thức:
N =
10g(10ml) + 90 ml
dung dịch pha loãng
Mỗi đậm độ cấy 2 đĩa
Mỗi đĩa 1 ml
Tất cả các khuẩn lạc
mọc hiếu khí(kể cả
men, mốc)
Chọn đĩa 15 – 300 KL Giá trị cao/giá trị thấp >2 lấy
đậm độ thấp hơn để tính kết
quả theo trung bình cộng
Nuôi cấy ít nhất 3 đậm
độ
Không có dạng khuẩn
lạc điển hình nhất định
Chọn hai đậm độ liên
tiếp để tính kết quả
Tổng KL ở đậm độ nguyên
hoặc 10
-1
<15: lấy KQ trung
bình cộng các đĩa ở hai đậm độ
được chọn
Lật ngược đĩa
Tất cả các đĩa không có KL
mọc:
< 1VSVHK/ml SP lỏng
<1x1/d VSVHK/g SP dạng

khác
6
dxnn
C
)1,0(
21
+
∑
6
Môn: Kỹ thuật phân tích Vi sinh – nấm thực phẩm II ATTP 4
7
7
Môn: Kỹ thuật phân tích Vi sinh – nấm thực phẩm II ATTP 4
PHƯƠNG PHÁP NGUYÊN LÝ TIẾN HÀNH
CÁC TÍNHCHẤT
ĐIỂN HÌNH TRÊN
MTCL
NHẬN ĐỊNH KẾT
QUẢ
TÍNH KẾT QỦA
TỔNG SỐ BT
MEN MỐC
-KT đổ đĩa
-Ủ hiếu khí 28±1
0
C
5 – 7 ngày
Kết quả tính theo số
khóm nấm
-Nấm men; pha loãng

bằng các dung dịch pha
loãng thông thường
-TSBT NM-NM hoặc
tổng số nấm mốc: sử
dụng nước pha loãng
có thạch
Phát triển hiếu khí
3 ngày đọc kết quả sơ
bộ (72h)
5 ngày đọc chính thức
(120h)
Có hay không các đĩa
thỏa mãn yêu cầu
Giá trị cao/giá trị thấp ≤ 2 tính
theo công thức:
N =
10g(10ml) + 90 ml
dung dịch pha loãng
Mỗi đậm độ cấy 2 đĩa
Mỗi đĩa 1 ml
Nuôi cấy ít nhất 3 đậm
độ
Khóm nấm mốc có
bông khí sinh, màu sắc
và đường kính khác
nhau, viền mép không
đều, tâm thường có
màu đậm
Chọn đĩa có từ 15-150
KL nấm men

Chọn đĩa có 5 – 50 KL
nấm mốc
Giá trị cao/giá trị thấp >2 lấy
đậm độ thấp hơn để tính kết
quả theo trung bình cộng
Không lât ngược đĩa Khuẩn lạc nấm men
thường bóng, lối, viền
mép đều. Dạng bơ
Màu săc đồng đều,
không phân biệt tâm,
có thể kem, hồng hoặc
đỏ
Chọn hai đậm độ liên
tiếp để tính kết quả
Tổng KL ở đậm độ nguyên
hoặc 10
-1
<15: lấy KQ trung
bình cộng các đĩa ở hai đậm độ
được chọn
Tất cả các đĩa không có KL
mọc:
< 1 BTNM NM/ml SP lỏng
<1x1/d BTNM NM/g SP dạng
khác
8
dxnn
C
)1,0(
21

+
∑
8
Môn: Kỹ thuật phân tích Vi sinh – nấm thực phẩm II ATTP 4
9
9
Môn: Kỹ thuật phân tích Vi sinh – nấm thực phẩm II ATTP 4
PHƯƠNG PHÁP NGUYÊN LÝ TIẾN HÀNH
CÁC TÍNHCHẤT
ĐIỂN HÌNH TRÊN
MTCL
NHẬN ĐỊNH KẾT
QUẢ
TÍNH KẾT QỦA
ĐỊNH LƯỢNG
COLIFORM
Kỹ thuật tính số có
xác suất lớn nhất(MPN)
Định lượng VSV lên
men Lactose sinh khí
trong MT tăng sinh
chọn lọc ở 30
0
C và
phú hợp trong phép
thử khẳng định
Pha loãng:
Đệm pep ton, pepton
muối
LST: các ống đục có

sinh khí
Độ pha loãng cuối
cùng phải cho kết quả
âm tính
Chọn tổ hợp 3 ống
theo các trường hợp để
tính kêt quả
Từ tổ hợp được chọn, tra bảng
để ra chỉ số MPN
Đậm độ kép: chia chỉ số MPN
cho 10
Đậm độ đơn: nhân chỉ số MPN
với số đảo của độ pha loãng
10g(10ml) + 90 ml
dung dịch pha loãng
BGBL: các ống đục có
sinh khí
Trường hợp 1: có ít
nhất một đậm độ cho
KQ 3 ống dương tính
Chọn độ pha loãng cao nhất
cho kết quả 3 ống (+) và hai
đậm độ cao hơn liền kề
3 3 2 1 0
LST kép: 3 ống : 10 ml
MT; 10 ml mẫu
Trường hợp 2: không
đậm độ nào cho KQ 3
ống dương tính
Chọn 3 đậm độ cao nhất trong

dãy pha loãng trong đó ít nhất
có 1 kết quả (+)
2 2 1 1 0
LST đơn: 3 đậm độ
3 ống 1 đậmđộ
1ml/ống
Trường hợp đặc biệt :
Trong dãy được chọn
theo (1) có hai đậm độ
không cho kết quả (+)
Chọn độ pha loãng thấp nhất
cho KQ (+) và hai độ pha
loãng cao hơn kế tiếp
3 3 0 0 0
Ủ 30
0
C/24 - 48± 2h Trường hợp đặc biệt :
Trong dãy được chọn
theo (2) có hai đậm độ
không cho kết quả (+)
Chọn độ pha loãng thấp nhất
cho KQ (+) và hai độ pha
loãng cao hơn kế tiếp
2 2 0 1 0
Từ các ống (+) cấy
sang BGBL, 1 ăng/ống
Ủ 30
0
C/24 - 48± 2h
Trường hợp đặc biệt :

các ống (+) chỉ thấy ở
đậm độ pha loãng đầu
Chọn ba độ pha loãng đầu tiên
để tính kết quả
1 0 0 0
2 0 0 0
3 0 0 0
10
10