Nghiên cứu hiệu quả hai phương pháp đông phôi chậm và đông phôi thủy tinh hóa

1

TV N
ThƠnh công c a m t quy trình th tinh trong ng nghi m đ c th hi n
qua t l mang thai. Hi n nay, xu h ng gi m s l ng phôi chuy n nh ng
không lƠm gi m t l mang thai. Vi c l a ch n phôi có ch t l ng t t nh t đ
chuy n, k t h p v i ch ng trình tr l nh s giúp ng i b nh ti t ki m chi
phí đáng k , đ ng th i góp ph n c i thi n t l thai c ng d n trên m t chu k
có kích thích bu ng tr ng vƠ t ng tính an toƠn c a k thu t đi u tr . Theo
th ng kê c a Van Voorhis (1995), tr l nh phôi có kh n ng lƠm t ng t l
mang thai lên kho ng 6,6%, tính trên m i noưn thu đ c sau ch c hút vƠ chi
phí đi u tr s gi m 25-45% so v i chu kì chuy n phôi t i, bên c nh đó k t
qu s n khoa l i cao h n h n[1],[2],[3],[4].
ư có 2 ph ng pháp tr l nh đ c áp d ng lƠ: H nhi t đ ch m vƠ
th y tinh hóa. S khác bi t chính c a 2 ph ng pháp nƠy lƠ t c đ h nhi t vƠ
n ng đ ch t b o qu n.
H nhi t đ ch m đ c Whittingham gi i thi u l n đ u tiên vƠo nh ng
n m đ u th p niên 70 trên mô hình phôi chu t. Em bé đ u tiên t phôi ng i
đông l nh trên th gi i ra đ i b ng ph ng pháp nƠy đ c ghi nh n vƠo n m
1983 [5].
Trong ph ng pháp h nhi t đ ch m, m u t bƠo đ c lƠm l nh v i t c
đ h nhi t ch m (1-30C/1 phút) t nhi t đ sinh lỦ xu ng nhi t đ r t th p
(kho ng - 800C) tr c khi đ a m u vƠo l u tr trong ni - t l ng. NgoƠi ra, t c
đ rư đông c ng di n ra ch m, quá trình xơm nh p vƠ lo i b các ch t b o v
đông l nh (CPA) đ c di n ra qua nhi u b c nh . Do n ng đ các CPA s
d ng th p vƠ tr i qua nhi u b c, t bƠo tránh đ c s c th m th u gơy ra b i
n ng đ CPA, đ ng th i kh n ng gơy đ c cho t bƠo th p.
VƠo n m 1985, Rall vƠ Fahy đư ch ng minh đ c phôi chu t có th
đ c đông l nh thƠnh công b ng m t ph ng pháp m i, đ c g i lƠ th y tinh
hóa(non - equylibrium cryopreservation method) [6]. Em bé đ u tiên trên th
gi i ra đ i b ng k thu t nƠy đ c báo cáo vƠo n m 2002 (Liebermann vƠ

cs.,2002; Shaw và Jones,2003) [7], [8].
Trong k thu t th y tinh hóa, ba y u t quan tr ng góp ph n vƠo s thƠnh
công c a k thu t lƠ n ng đ c a các CPA s d ng, t c đ h nhi t/lƠm m vƠ


2

th tích m u tr l nh (Vajta vƠ Nagy, 2006), (Yahin vƠ Arav, 2007) [9],[10].
có th chuy n m t l ng môi tr ng có ch a phôi t d ng l ng thƠnh d ng
"kính", các CPA c n ph i đ c s d ng n ng đ r t cao.
Trong m t th i gian khá dƠi, dù có nh ng h n ch v m t hi u qu
nh ng h nhi t đ ch m đư đ c xem lƠ m t ph ng pháp tr l nh chu n
m c trong ngƠnh công nghi p ch n nuôi c ng nh trong IVF trên ng i.
Trái l i, m t kho ng th i gian dƠi sau khi đ c gi i thi u, th y tinh hóa
v n đ c xem lƠ m t k thu t mang tính th nghi m vì nhi u lỦ do. Trong đó,
lo ng i v các đ c tính có th có c a vi c s d ng ch t b o qu n n ng đ cao
trên phôi vƠ khó kh n trong vi c thi t l p m t h th ng lƠm l nh v i t c đ cao
lƠ nh ng tr ng i chính. Vì v y, cho đ n nay, các nhƠ khoa h c trên th gi i
v n liên t c th c hi n các nghiên c u so sánh u nh c đi m c a 2 ph ng
pháp, c ng nh theo d̃i s c kh e, b nh t t c a nh ng tr sinh ra t 2 ph ng
pháp tr l nh đ đ a ra l a ch n t i u an toƠn.
T i trung tơm h tr sinh s n Qu c Gia, k thu t đông l nh ch m đ c
th c hi n thƠnh công n m 2002, th y tinh hóa b t đ u tri n khai n m 2006, v i
phôi giai đo n phơn chia (phôi ngƠy 2 vƠ phôi ngƠy 3). T i th i đi m nghiên
c u (2012- 2013), h u h t các trung tơm h tr sinh s n Vi t Nam, đ u đư
th c hi n th y tinh hóa phôi m i vƠ ti p t c rư đông nh ng phôi đư đông l nh
ch m. Tuy nhiên, ch a có m t nghiên c u theo d̃i d c nƠo t i Vi t Nam,
đánh giá hi u qu các quy trình tr l nh thông qua các tiêu chí:t l phôi s ng,
t l có thai, t l sinh s ng, c ng nh các y u t liên quan, tiên l ng k t qu
có thai, theo d̃i s hình thƠnh phát tri n chi u cao, cơn n ng, th ch t, trí tu ,

tơm v n đ ng, b nh t t t khi sinh ra cho đ n khi 4 tu i đ đ a ra tiên l ng
cho s phát tri n ti p theo cho nh ng tr sinh ra t 2 ph ng pháp nƠy.
Do đó chúng tôi th c hi n đ tƠi: “Nghiên c u hi u qu hai ph ng
ph́p đông phôi ch m v̀ đông phôi th y tinh h́a"v i 2 m c tiêu:
1. ́nh gí đ c đi m phôi sau rư đông c a hai ph ng ph́p đông
phôi ch m vƠ đông phôi th y tinh hóa.
2. ́nh gí m t s y u t liên quan vƠ tiên l ng c a hai 2 ph ng
ph́p đông phôi ch m vƠ đông phôi th y tinh hóa.
Formatted: bd, Justified, Indent: Left: 0 cm, First line: 1
cm, Line spacing: Multiple 1.25 li


3

Ch

ng 1

T NG QUAN
1.1. Nh ng thay đ i bên trong t bƠo trong qú tr̀nh tr l nh.

Hình 1.1. Ph n ng c a phôi khi cho v̀o môi tr

ng ć ch a CPA [9]

(CPA: ch t b o v l nh)
A: Phôi 4 phôi bƠo
B: Các phôi bƠo b m t n
ti p xúc môi tr

c lƠm cho kích th

c phôi co nh (khi v a

ng tr l nh).

C: Khi CPA đi vƠo bên trong phôi bƠo vƠ thay th l
m t đi, lúc nƠy kích th

c c a phôi đ

c t bƠo đư

c ph c h i.

Nguyên lỦ c a tr l nh lƠ gi m nhi t đ c a môi tr
hay m u mô xu ng nhi t đ r t th p, th
l ng).

ng n

ng ch a m u t bƠo

ng lƠ 196ºC (nhi t đ sôi c a ni-t

nhi t đ th p nƠy, h u h t các ho t đ ng sinh h c bên trong t bƠo bao

g m các ph n ng sinh hoá vƠ các ho t đ ng trao đ i ch t b ng ng l i.
Nh đó, t bƠo s ng

d ng ti m sinh (hybernate) vƠ có th b o qu n

trong m t th i gian r t dƠi. V i đi u ki n nhi t đ th p, các phơn t n
ch t hoƠ tan trong môi tr
bƠo t n t i d

c, các

ng xung quanh c ng nh các v t ch t bên trong t

i d ng k t h p (d ng tinh th vƠ d ng kính), do đó, không có

b t k y u t nƠo t môi tr

ng bên trong c ng nh bên ngoƠi có th tác đ ng

đ n t bƠo trong giai đo n nƠy. Tuy nhiên, nhi t đ c th c a đa s các loƠi
đ

c ki m soát ch t ch , nh t lƠ

các đ ng v t có vú. Do đó, trong quá trình


4

tr l nh, vi c h nhi t đ c a t bƠo v m c d
m t môi tr

i 0ºC có th đ a t bƠo vƠo

ng không sinh lỦ. H u qu lƠ các t n th

ng có th x y ra trong

t t c các giai đo n c a quá trình h nhi t đ .
Trong quá trình lƠm l nh vƠ rư đông, m t s thay đ i trong môi tr
ch a t bƠo vƠ c trong b n thơn t bƠo có th

nh h

ng

ng đ n c u trúc, ch c

n ng, s toƠn v n vƠ kh n ng s ng c a t bƠo sau khi rư đông.
M t chu k tr l nh th
ông l nh:

(1)

ng tr i qua ba giai đo n quan tr ng lƠ

a t bƠo t nhi t đ sinh lỦ 37ºC xu ng nhi t đ r t

th p -196ºC.
(2) L u tr : M u t bƠo đ
(3) Rư đông:

c b o qu n trong ni-t l ng.

a t bƠo t nhi t đ th p c a ni-t l ng v nhi t đ sinh lỦ

khi c n đ t bƠo ti p t c phát tri n.
Trong quá trình lƠm l nh, tu theo t ng giai đo n h nhi t mƠ các t n
th

ng trên t bƠo có th khác nhau. Trong giai đo n h nhi t t 15ºC đ n

-5ºC, các h t lipid, các mƠng giƠu lipid vƠ các s i vi ng bên trong t bƠo có
th b t n th

ng [10]. ơy lƠ nh ng t n th

ng không th ph c h i khi đông

l nh noưn. So v i nh ng loƠi khác, các gi t lipid ch a trong t bƠo noưn
ng

it

ng đ i th p h n. Nh ng đi u nƠy c ng không lo i tr kh n ng t n

th

ng

t bƠo noưn ng

i trong quá trình đông l nh. M t khác, kho ng

nhi t đ nƠy có th gơy t n th

ng mƠng vƠ polymer hoá các vi ng, do đó s

lƠm r i lo n kh n ng s p x p c a các nhi m s c th trên m t ph ng xích đ o
khi t bƠo phơn chia vƠ k t qu lƠ gơy hi n t

ng l ch b i trong quá trình

phơn chia c a t bƠo [12].
M t s
th

ng đ

nh h

ng khác mƠ kho ng nhi t đ nƠy gơy ra cho t bƠo

c nh c đ n nh vi c gi m t c đ ho t đ ng c a các men (enzyme)

s d ng các quá trình chuy n hoá c a t bƠo. Nghiên c u cho th y khi nhi t
đ gi m t 37ºC xu ng 7ºC ho t đ ng c a các men gi m 8 l n. Tuy nhiên,
nh h

ng c a vi c gi m ho t đ ng các men lên kh n ng phát tri n c a t

bào sau nƠy v n ch a đ
tr

ng nuôi c y t bƠo th

c lƠm sáng t [13]. Bên c nh các khí hoà tan, môi
ng dùng khí CO2 lƠm h đ m đ cơn b ng pH


5

trong môi tr

ng. Khi nhi t đ h xu ng th p, các khí nƠy không còn

hoƠ tan trong môi tr
kích th

ng n a mƠ tách ra t o thƠnh các b t khí. S l

c c a các b t khí cƠng l n thì vi c chèn ép lƠm t n th

d ng
ng vƠ

ng đ n c u

trúc trong t bƠo cƠng nghiêm tr ng [14].
Khi t bƠo đ

c lƠm l nh t -5ºC đ n -15ºC hi n t

th đá t các phơn t n
(môi tr

c tinh khi t trong môi tr

ng sát bên ngoƠi t bƠo

ng ngo i bƠo) vƠ ngay bên trong t bƠo (môi tr

hi n. S hình thƠnh các tinh th đá có th gơy t n th
bƠo vƠ các bƠo quan bên trong.

ng hình thƠnh tinh
ng n i bƠo) s xu t

ng c h c lên mƠng t

ơy lƠ giai đo n gơy t n th

ng l n nh t vƠ

quan tr ng nh t mƠ t bƠo ph i tr i qua trong quá trình lƠm l nh vƠ rư đông
[11]. N
môi tr
n

c lƠ thƠnh ph n chi m th tích l n nh t bên trong t bƠo c ng nh
ng bên ngoƠi t bƠo. Khi nhi t đ cƠng gi m, s l

c chuy n thƠnh tinh th đá cƠng t ng, l

h u qu lƠ n ng đ ch t tan trong môi tr

ng n

bƠo b co nh quá m c, s t n th

th l ng gi m d n,

ng ngo i bƠo t ng gơy m t cơn

b ng v áp l c th m th u gi a t bƠo v i môi tr
trong t bƠo ch t b rút ra ngoƠi vƠ kích th

c

ng phơn t

ng. H u qu lƠ n

c t bên

c t bƠo tr nên co nh . N u t

ng mƠng lipoprotein c a t bƠo x y ra

không th ph c h i [15].
T ng nhi t đ ti m tƠng c ng lƠ m t h u qu c a s hình thƠnh các tinh
th đá. Các phơn t n

c khi chuy n sang th r n s gi i thoát ra m t l

nhi t. N u cùng m t lúc có nhi u phơn t n
l

ng

c chuy n sang th r n thì nhi t

ng thoát ra đ l n đ lƠm thay đ i nhi t đ đang t vƠi đ ơm lên 0ºC. S

thay đ i nhi t đ đ t ng t nƠy có th lƠm nh h

ng đ n c u trúc vƠ ch c

n ng c a t bƠo sau khi rư đông hay th m chí lƠm t bƠo ch t ngay trong quá
trình lƠm l nh. Do đó, trong quá trình h nhi t đ ch m, vi c h n ch các
phơn t n

c chuy n tr ng thái cùng lúc lƠ t i quan tr ng.

T -50ºC đ n -150ºC, t n th

ng trên mƠng trong su t nh ng đ t gưy

mƠng trong su t nƠy không gi ng nh s đ t gưy mƠng trong su t x y ra do
hi n t

ng s c th m th u.

6

nhi t đ l u tr m u (d
l ng -196ºC), t bƠo ít b

nh h

i -150ºC th

ng lƠ nhi t đ c a ni-t

ng b t l i nh t trong toƠn b quy trình tr

l nh. Tuy nhiên, nh ng ph n ng t o thƠnh các g c t do vƠ nh ng s n ph m
đ t gưy c a các đ i phơn t b i các b c x ion hoá hay các s n ph m không
mong mu n nƠy, c ng nh s tác đ ng c a b c x có kh n ng gơy đ t gưy
ho c gơy ra nh ng t n th

ng khác cho ADN. M c dù v y, cho đ n nay, v n

ch a có m t b ng ch ng nƠo r̃ rƠng v

nh h

ng c a b c x lên m u t bƠo

l u tr trong ni-t l ng.
1.2. Ćc bi n ph́p h n ch t n th

ng t bƠo trong tr l nh.

1.2.1. S d ng ch t b o qu n l nh (CPA)
S hình thƠnh tinh th đá trong quá trình h nhi t đ lƠ y u t

nh h

ng

quan tr ng nh t đ n kh n ng s ng c a t bƠo sau m t chu trình lƠm l nh - rã
đông [14]. Tinh th đá đ

c hình thƠnh ng u nhiên

b t k v trí nƠo bên trong

vƠ bên ngoƠi t bƠo. Do đó, vi c h n ch hình thƠnh các tinh th đá lƠ đi u ki n
tiên quy t đ m t ch

ng trình tr l nh đ t t l thƠnh công cao. Vi c phát hi n

ra vai trò c a glycerol trong tr l nh đ

c xem lƠ m t phát ki n quan tr ng,

góp ph n thúc đ y k thu t tr l nh phát tri n [16]. Nhi u th nghi m khác đư
đ

c th c hi n v i m c đích tìm ra nh ng ch t m i v i kh n ng b o v t bƠo

s ng trong su t quá trình đông l nh vƠ rư đông t
nƠy đ

ng t glycerol. Nh ng ch t

c g i m t tên chung lƠ các ch t b o v đông l nh (CPA).

CPA lƠ nh ng ch t có kh n ng gi ng nhau lƠ hoƠ tan đ
vƠ gơy c n tr s chuy n tr ng thái gi a n

c vƠ đá. Chúng t

nh ng phơn t sinh h c v i vai trò “thay th n
ch đ

c trong n

c

ng tác v i

c” trong t bƠo, nh đó h n

c s hình thƠnh các tinh th đá n i bƠo khi nhi t đ h th p [17]. M t

vai trò khác c a CPA c ng không kém ph n quan tr ng lƠ t bƠo b o v khi
nhi t đ th p [11]. Do không t o thƠnh tinh th , các CPA h n ch s gia t ng
n ng đ c a các ch t hoƠ tan. Nó còn g n k t lên mƠng bƠo t
t bƠo khi các phơn t n

ng đ b o v

c ngo i bƠo b t đ u chuy n sang d ng tinh th . Tuy

nhiên, nh ng ghi nh n v hi u qu c a t ng lo i CPA lên các t bƠo khác


7

nhau ch d a trên quan sát th c t , ch a đ
d ng CPA th

ng đ

c ch ng minh v c ch [12]. Hai

c s d ng trong đông l nh lƠ CPA có kh n ng th m

th u vƠ CPA không có kh n ng th m th u qua mƠng t bƠo. Hai lo i CPA
nƠy có tính ch t vƠ cách th c ho t đ ng khác nhau, nh ng h tr cho nhau
trong vai trò lƠ tác nhơn kh n

c bên trong t bƠo, giúp h n ch s t o thƠnh

tinh th đá n i bƠo. M t đi m c n l u Ủ lƠ bên c nh nh ng l i đi m đư nêu,
h u h t các CPA đ u có kh n ng gơy đ c tính.
v i n ng đ vƠ th i gian ti p xúc, nh t lƠ khi

c tính c a CPA t l thu n

nhi t đ sinh lỦ [11].

CPA có kh n ng th m th u lƠ nh ng ph c h p oligohydoxy (nh
ethanol ho c các ph c h p c a ethanol), hoƠ tan đ

c trong n

c, kh n ng

gơy đ c cho t bƠo th p vƠ có th xơm nh p vƠo t bƠo qua mƠng bƠo t
nh kh i l

ng

ng phơn t nh . V i nh ng tính ch t nƠy, CPA có th xơm nh p

vƠo bên trong vƠ th ch các phơn t n
đá n i bƠo vƠ do đó gi m t n th
c a các CPA nƠy trong môi tr
trong môi tr

c, giúp gi m s hình thƠnh tinh th

ng c a các t bƠo. NgoƠi ra, s hi n di n

ng đông l nh, lƠm cho n ng đ ch t hoƠ tan

ng ngo i bƠo, t ng lên đáng k so v i môi tr

ng trong t bƠo.

i u nƠy gơy ra s m t cơn b ng v áp su t th m th u gi a bên trong vƠ bên
ngoƠi t bƠo.

ng th i, vai trò thay th các phơn t n

c a CPA, giúp cho kích th

c c a t bƠo nhanh chóng h i ph c, sau khi đ

rút kh i t bƠo, nh đó gi m đ
tr ng thái co bƠo t

c bên trong t bƠo

c hi n t

ng t n th

c

ng mƠng n u t bƠo

ng quá lơu.

Các lo i CPA có kh n ng th m th u th

ng đ

c s d ng trong IVF

bao g m 1,2-propanediol (PROH) (hay propylene glycol), dimethylsulfoxide
(DMSO), glycerol, hay 1,2-ethanediol (hay ethylene glycol - EG). Các CPA
nƠy th

ng ho t đ ng

pha đ u tiên c a quá trình kh n

c.

pha đ u tiên

này, khi t bƠo ti p xúc v i m t dung d ch có ch a CPA có kh n ng th m
th u, s hi n di n c a nh ng ch t nƠy
chênh l ch v áp su t th m th u, giúp rút n

môi tr

ng ngo i bƠo t o ra m t

c ra kh i t bƠo.

CPA s t t đi vƠo bên trong t bƠo, thay th các phơn t n
th m th u c a mƠng bƠo t

ng đ i v i n

ng th i, các
c. Vì kh n ng

c l n h n đ i v i các CPA, do đó,


8

quá trình m t n

c trong t bƠo di n ra nhanh h n so v i l

ngoƠi đi vƠo bên trong t bƠo, thay th các phơn t n

c. H u qu lƠ th tích

t bƠo gi m nhanh trong th i gian đ u ti p xúc v i môi tr
đó, khi CPA đư thay th hoƠn toƠn l

ng n

ng CPA t bên
ng tr l nh. Sau

c m t, t bƠo s khôi ph c hình

d ng v th tích ban đ u.
Nh đư trình bƠy, có b n lo i CPA th

ng đ

c s d ng lƠ glycerol,

DMSO, EG vƠ PROH. Các lo i CPA trên có th đ

c s d ng đ n l hay

ph i h p. Nhìn chung vi c l a ch n lo i CPA nƠo s ph thu c vƠo tính th m
th u c a mƠng t bƠo vƠ kh n ng gơy đ c c a lo i CPA đó. Glycerol hay còn
g i lƠ glycerine, lƠ m t h p ch t đ

ng c a r

u. Glycerol có m t nhi u trong

t bƠo gan c a nh ng loƠi đ ng v t có kh n ng s ng trong đi u ki n nhi t đ
r t th p ( các vùng c c) giúp cho máu c a nh ng đ ng v t nƠy không b
đông, do đó nó t

ng thích v i nh ng v t ch t sinh hoá trong t bƠo s ng.

Chính vì th , kh n ng gơy đ c c a glycerol đ i v i t bƠo đ
th p nh t vƠ đ
t n th

c x p vƠo lo i

c s d ng nhi u trong vi c b o v t bƠo b ng cách lƠm gi m

ng gơy ra do s hình thƠnh tinh th đá. Tuy nhiên, nh

glycerol l i n m

c đi m c a

kh n ng th m qua mƠng t bƠo ch m.

Dimethyl sulfoxide (DMSO) có kh n ng hoƠ tan nhi u lo i ch t h u c
khác nhau nh carbonhydrate, polymer vƠ peptit, c ng nh các mu i vô c vƠ
khí. Trong tr l nh, DMSO đ

c s d ng khá r ng rưi đ b o v các bƠo

quan, mô vƠ t bƠo. Kh n ng th m nhanh qua mƠng t bƠo c a DMSO đư
kh c ph c đ

c nh

c đi m c a glycerol, do đó có th rút ng n đ

gian ti p xúc c a t bƠo v i môi tr

c th i

ng CPA nh m h n ch nh ng tác đ ng

b t l i không mong mu n c a CPA lên t bƠo. Tuy nhiên, m t nh

c đi m

c a DMSO lƠ kh n ng gơy đ c cho t bƠo cao, đ c bi t khi ti p xúc v i t
bƠo

nhi t đ cao hay th i gian ti p xúc dƠi. S li u cho th y noưn khi ti p

xúc v i dung d ch ch a DMSO trong th i gian dƠi s không b nh h
kh n ng th tinh vƠ phát tri n thƠnh phôi, nh ng t l l ch b i

ng đ n

các noưn nƠy

l i t ng lên đáng k so v i noưn không ti p xúc v i DMSO [18]. Do đó, khi
s d ng DMSO trong tr l nh, ng

i ta th

ng đ t bƠo ti p xúc môi tr

ng


9

có ch a DMSO

nhi t đ th p (0-4ºC) nh m lƠm gi m đ c tính c a DMSO

đ i v i t bƠo.
Ethylene Glycol (EG) đ

c bi t đ n trong tr

monoethylene glycol hay 1,2-ethanediol. EG th

l nh th

ng đ

ng

d ng

c s d ng r ng rưi

trong tr l nh v i vai trò lƠ ch t b o v cho các bƠo quan c a t bƠo nh tính
th m qua mƠng nhanh do tr ng l

ng phơn t th p. Kh n ng gơy đ c c a EG

lên t bƠo, ph thu c vƠo n ng đ , nhi t đ vƠ th i gian ti p xúc.
DMSO có tính th m nhanh nh t, PROH có tính th m qua mƠng nhanh
h n glycerol. ThƠnh ph n nƠy c ng đ
v i t bƠo vƠ đ

c xem lƠ có kh n ng gơy đ c th p đ i

c s d ng nhi u đ lƠm dung d ch hoƠ tan trong d

c ph m.

Tuy nhiên, m t s nghiên c u ch ng minh r ng PROH có kh n ng lƠm t ng

t l t phơn chia (pathenogenetic activation) c a noưn chu t sau tr l nh vƠ rư
đông khi s d ng

n ng đ cao (1,5 mol/l) [18].

Vi c s d ng k t h p 2 hay nhi u CPA trong m t dung d ch đông l nh,
nh m lƠm t ng kh n ng kh n

c t bƠo vƠ lƠm gi m đ c tính c a t ng

thƠnh ph n riêng l lên t bƠo, lƠ mô hình th

ng g p các ch

ng trình tr

l nh hi n nay trong l nh v c IVF [19].
Khi s d ng các lo i CPA có kh n ng th m qua mƠng t bƠo, trong quá
trình lƠm l nh, do đ c tính phơn t l
nhanh h n so v i l
rư đông, n

ng l n, nên n

c s b kéo ra ngoƠi

ng CPA xơm nh p vƠo bên trong t bƠo. Ng

c t môi tr

ng bên ngoƠi có khuynh h

c l i, khi

ng đi vƠo trong t bƠo

v i t c đ nhanh h n. Tình tr ng nƠy lƠm cho t bƠo b thay đ i hình d ng, co
nh trong quá trình m t n

c hay phình to khi n

c đi vƠo tr l i t bƠo trong

quá trình rư đông. Ng

i ta th y n u s thay đ i v th tích v

v i ban đ u thì có th

nh h

t quá 40% so

ng đ n c u trúc bên trong c a t bƠo [20].

h n ch s thay đ i th tích quá m c c a t bƠo, trong các môi tr
l nh, rư đông, các CPA không có tinh th m qua mƠng t bƠo th
sung.

ơy lƠ nh ng ch t có kh i l

xơm nh p vƠo t bƠo qua mƠng bƠo t

ng đ

ng tr
cb

ng phơn t l n nên không có kh n ng
ng.


10

Các CPA ngo i bƠo đ
oligosaccharide khác. Chúng

c s

d ng th

ng lƠ sucrose hay các

bên ngoƠi t bƠo, h tr các CPA có kh n ng

th m th u duy trì s chênh l ch th m th u trong pha kh n
CPA không có kh n ng th m th u, th
trình kh n

c.

ng ho t đ ng

pha th hai c a quá

pha nƠy, t bƠo trong tr ng thái ti p xúc v i m t dung d ch

ch a h n h p g m CPA n i bƠo (ph n CPA đ
th m vƠo bên trong t bƠo, thay th n

b

c đ u tiên đư

c) vƠ CPA ngo i bƠo.

i u nƠy giúp

tái l p s m t c n b ng vƠ t o ra pha kh n
n

c t bƠo. Các

c s d ng

c ti p theo, giúp cho s kh

c c a t bƠo x y ra tri t đ .

1.2.2. Ki m sót t c đ l̀m l nh v̀ rã đông

1.2.2.1. T c đ làm l nh (cooling rate)
Khi nhi t đ h xu ng th p, ch có các phơn t n
sang d ng tinh th đá. Nhi t đ cƠng gi m th p, s l

c tinh khi t chuy n
ng phơn t n

c tinh

khi t t o thƠnh đá cƠng nhi u. H n h p các mu i vƠ nh ng ch t hoƠ tan khác
có trong môi tr

ng đông l nh v n gi nguyên tr ng thái vƠ t o thƠnh ph n

không đông (unfrozen fraction).
d n khi s l
môi tr

th m th u c a ph n không đông nƠy t ng

ng tinh th đá cƠng t ng.

tr ng thái nƠy, đ th m th u c a

ng ngo i bƠo gia t ng do s m t n

c, đòi h i t bƠo ph i có nh ng

ph n ng cơn b ng th m th u v i n ng đ môi tr
bƠo b kh n

c. VƠ quá trình kh n

ng ngo i bƠo. K t qu lƠ t

c nƠy ch d ng l i khi toƠn b v t ch t

bên trong vƠ bên ngoƠi t bƠo chuy n sang d ng tinh th . Do đó, t c đ lƠm
l nh s

nh h

ng r t l n đ n kh n ng kh n

c vƠ đ c bi t lƠ kh n ng

s ng c a t bƠo sau rư đông. Th t v y, n u t c đ lƠm l nh quá nhanh, các
phơn t n

c nhanh chóng chuy n sang d ng tinh th đá, t bƠo không có đ

th i gian đ quá trình kh các phơn t n

c n i bƠo di n ra tri t đ , n

cv n

còn l i nhi u bên trong t bƠo vƠ chuy n sang d ng tinh th đá n i bƠo khi
nhi t đ h xu ng h p, k t qu lƠ t bƠo b t n th

ng. T c đ lƠm l nh

nhanh, c ng có th t o ra m t chênh l ch v áp su t th m th u l n gi a hai
bên mƠng bƠo t

ng, lƠm t n th

ng đ đƠn h i c a mƠng. N u t c đ lƠm


11

l nh quá ch m, t bƠo có nhi u th i gian đ kh n
m t quá nhi u n

c, có th d n đ n t n th

c, tuy nhiên, t bƠo s b

ng mƠng. Bên c nh đó, t bƠo

không nh ng ti p xúc v i áp su t th m th u cao c a môi tr

ng ngo i bƠo,

trong th i gian dƠi, mƠ còn ph i ti p xúc quá lơu v i các mu i, các ch t hoƠ
tan khác vƠ ch t CPA trong môi tr

ng ngo i bƠo.

i u nƠy có th gơy đ c

cho t bƠo. NgoƠi ra, tính đƠn h i c a mƠng t bƠo c ng b
bƠo
tr

nh h

ng vì t

tr ng thái co nguyên sinh quá lơu, do s ph n ng cơn b ng v i môi
ng ngo i bƠo có áp su t th m th u cao.
Tu theo th tích vƠ di n tích mƠng bƠo t

đ lƠm l nh ph i đ
bƠo đ

ng c a t ng lo i t bƠo, t c

c đi u ch nh phù h p. T c đ lƠm l nh c a t ng lo i t

c tính toán d a trên b n y u t sau: (1) thƠnh ph n c u t o vƠ th m

c a mƠng t bƠo, (2) t l gi a di n tích b m t vƠ th tích c a t bƠo (S/V),
(3) nhi t đ , (4) kh n ng th m c a mƠng t bƠo (Lp). T c đ lƠm l nh nh
h

ng tr c ti p đ n t c đ m t n

t bƠo noưn vƠ phôi ng

c c a t bƠo trong quá trình kh n

i t c đ

lƠm l nh t i

0,3ºC/phút. T c đ nƠy cho phép s trao đ i n
di n ra t

ng đ i tri t đ tr

c. V i

u theo nghiên c u lƠ

c qua mƠng t bƠo có th

c khi toƠn b v t ch t bên trong vƠ bên ngoƠi

mƠng t bƠo hoƠn toƠn chuy n sang th r n [10].
1.2.2.2. T c đ rã đông
Quy trình rư đông có liên h ch t ch v i quy trình lƠm l nh, hay c th
h n lƠ ph thu c vƠo l

ng tinh th đá còn l i bên trong t bƠo. Hi n t

tái k t tinh x y ra, trên nh ng phơn t n
nhi t đ rư đông còn d
t gơy t n th

rư đông ph i đ nhanh đ v
bƠo do hi n t

c còn l i bên trong t bƠo nƠy, khi

i 0ºC, có kh n ng lƠm t n th

ng t bƠo quan tr ng nh t

ng

ng t bƠo. ơy lƠ y u

giai đo n rư đông. Do v y, t c đ

t qua giai đo n nƠy đ h n ch s t n th

ng tái k t tinh gơy ra. Tuy nhiên, n u t c đ rư nhanh, n

ng t
c có

th không đ th i gian đ tr l i bên trong t bƠo, vƠ k t qu lƠ mƠng t bƠo b
co mƠ không th ph c h i. Nh ng n u t c đ rư đông quá ch m, t bƠo có th i
gian bù n

c nh ng th i gian ti p xúc v i môi tr

ng ngo i bƠo có tính u

12

tr

ng quá lơu, vì lúc nƠy các tinh th đá tan ch m, lƠm cho kh n ng hoƠ tan

các mu i vƠ ch t hoƠ tan khác x y ra ch m. K t qu lƠ t bƠo có th b đ c vƠ
gi m kh n ng phát tri n ti p t c sau rư đông [21].
1.2.3. Trang thi t b v̀ d ng c
Quá trình tr l nh c n đ

c h tr c a ni-t l ng. NgoƠi ra, ni-t l ng

còn c n thi t cho quá trình l u tr m u, đ m b o m u đ
đ ơm sơu t -150ºC đ n -196ºC. Trong đi u ki n lỦ t

c b o qu n

nhi t

ng, nên s d ng ni-t

l ng đư qua x lỦ đ s d ng trong y t . Trong quá trình thao tác tr vƠ rư, c n
có d ng c ch a ni-t l ng đ ch a m u t m th i. Các d ng c ch a nƠy nên
có mi ng r ng đ d thao tác vƠ có th b ng x p hay các lo i thùng
polystyrene có thƠnh dƠy. NgoƠi ra, thùng l u tr nên l a ch n lo i có mi ng
r ng đ d dƠng c t vƠ l y m u. Tuy nhiên, t c đ bay h i c a ni-t l ng c ng
s nhanh h n, do đó, c n có k ho ch thêm ni-t l ng đ nh k đ đ m b o t t

đi u ki n l u m u.

Hình 1.2. Bình ch a ni t l ng tr phôi
Tu theo ph

ng pháp tr l nh s d ng, h i ni-t l ng hay dung d ch ni-

t tr c ti p mƠ có th ph i trang b thêm máy h nhi t đ .

ơy lƠ lo i máy

dùng đ b m h i ni-t l ng vƠo bu ng tr đông nh m h nhi t đ c a m u tr
theo ch

ng trình đ

trong IVF trên ng

c cƠi đ t s n. Hai lo i máy th
i lƠ Cryologic vƠ Planner.

ng đ

c s d ng nh t


13

Hình 1.3. Máy Cryologic

Hình 1.4. Máy Planner

D ng c đ ch a m u v t trong quá trình tr l nh s ph thu c vƠo
ph

ng pháp tr l nh s d ng vƠ lo i t bƠo đ

c tr , có th lƠ các ng nh a

b ng platic (straw) hay có th tích 0,25-0,5 µl, cryotube hay các d ng c đ c
ch đ có đ

c t c đ lƠm l nh cao nh cryotop, cryoleaf, cryopette… NgoƠi

ra, c n trang b thêm các tube nh a (cryovial), thanh nhôm (aluminium cane)
hay các cassette đ đ t các d ng c ch a m u tr vƠo thùng l u tr .
Môi tr

ng tr l nh vƠ rư đông lƠ m t ph n quan tr ng, góp ph n không

nh vƠo thƠnh công c a ch
tr

ng nƠy th

ph

ng trình. NgoƠi thƠnh ph n c b n, các môi

ng ch a nhi u lo i CPA v i n ng đ khác nhau tu theo

ng pháp tr l nh. M t s trung tơm t pha môi tr

đa s hi n nay đ u s d ng các lo i môi tr
trình ki m soát ch t l
1.3. Ćc ph

ng đ

ng đ s d ng nh ng

ng s n có trên th tr

ng do quy

c th c hi n nghiêm ng t h n.

ng ph́p tr l nh.

M t chu trình tr l nh rư đông th

ng bao g m các giai đo n nh :

(1) Ti p xúc v i ch t b o qu n (CPA) vƠ kh n

c, (2) H nhi t đ , (3)

L u tr m u, (4) Rư đông, (5) Lo i b CPA ra kh i t bƠo vƠ (6) đ a t bƠo
v ho t đ ng sinh lỦ ban đ u.
Hi n nay có 2 ph

ng pháp tr l nh đang đ

c áp d ng lƠ: H nhi t

đ ch m vƠ th y tinh hóa. S khác bi t chính c a 2 ph

ng pháp nƠy n m

t c đ h nhi t có hay không s hình thƠnh tinh th đá n i bƠo c ng nh
ngo i bƠo.


14

1.3.1. H nhi t đ ch m (Slow - freezing)
H nhi t đ ch m còn đ c g i lƠ ph ng pháp tr l nh có ki m soát t c
đ lƠm l nh (Controlled - rate freezing) ph ng pháp nƠy đ c Whittingham
gi i thi u l n đ u tiên vƠo nh ng n m đ u th p niên 70 trên mô hình phôi
chu t. Em bé đ u tiên t phôi ng i đông l nh trên th gi i ra đ i b ng
ph ng pháp nƠy đ c ghi nh n vƠo n m 1983 [5].
Trong ph ng pháp h nhi t đ ch m, m u t bƠo đ c lƠm l nh v i t c
đ h nhi t ch m (1-30C/1 phút) t nhi t đ sinh lỦ xu ng nhi t đ r t th p
(kho ng - 800C) tr c khi đ a m u vƠo l u tr trong ni-t l ng. NgoƠi ra, t c
đ rư đông c ng di n ra ch m, quá trình xơm nh p vƠ lo i b các ch t b o v
l nh đ c di n ra qua nhi u b c nh . CPA th m qua mƠng t bƠo th ng
đ c s d ng lƠ 1,2 - propanediol (PROH) ho c dimethylsulfoxide (DMSO)
ho c glycerol (tùy thu c vƠo đ i t ng t bƠo vƠ giai đo n phát tri n c a t
bƠo). Tr c khi h nhi t đ , t bƠo đ c cho ti p xúc v i các lo i môi tr ng
có CPA v i n ng đ t ng d n (t 0,5 - 1,5mol/l). Do n ng đ các CPA s

d ng th p vƠ tr i qua nhi u b c, t bƠo tránh đ c s c th m th u gơy ra b i
n ng đ CPA, đ ng th i kh n ng gơy đ c cho t bƠo th p. Tuy nhiên, th i
gian đ t bƠo ti p xúc v i môi tr ng có CPA dƠi, đ quá trình kh n c t
bƠo x y ra hoƠn toƠn tr c khi h nhi t đ . Sucrose lƠ thƠnh ph n th ng
đ c thêm vƠo môi tr ng đông l nh, rư đông đ lƠm t ng kh n ng kh n c
t bƠo vƠ gi m s c th m th u. N ng đ sucrose s d ng th ng kho ng 1 1,5mol/l (Fabbri và cs., 2001) [6].
1.3.1.1. Quy trình đông l nh và rã đông trong h nhi t đ ch m.
i v i ph ng pháp h nhi t đ ch m, t bƠo đ c ti p xúc v i môi
tr ng lƠm l nh có ch a CPA v i n ng đ t ng d n. Trong kho ng th i gian
t 15-30 phút. Trong quá trình nƠy, m t l ng l n n c trong t bƠo s b m t
ra ngoƠi. Sau đó, t bƠo tr đ c cho vƠo d ng c tr phôi, thông th ng lƠ
ng nh a b ng plastic (straw). Các straw nƠy s đ c đ t vƠo bu ng h nhi t
đ c a máy h nhi t đ b c vƠo giai đo n lƠm l nh.
Quá trình kh n c c a t bƠo ti p t c x y ra giai đo n đ u c a pha
lƠm l nh. Khi các ph n t n c tinh khi t chuy n thƠnh đá, n ng đ ch t hòa


15

tan t ng s t o s chênh l ch áp su t th m th u, giúp n c đ c rút ra kh i t
bƠo. Tuy nhiên, s hi n di n c a các ch t b o v đông l nh trong môi tr ng
đông l nh đư lƠm cho đi m đông l nh c a dung d ch th p h n so v i bình
th ng. Do đó, dung d ch v n có th
tr ng thái ch a đông vƠ tinh th đá
0
ngo i bƠo v n ch a hình thƠnh -10 C đ n -150C. Hi n t ng nƠy g i lƠ s
ch m đông.
tránh s ch m đông, khi nhi t đ đ t -50C đ n -70C (ch a đ n
đi m đông c a h n h p môi tr ng), nhơn đá đ c t o ra m t cách nhơn t o
g i lƠ s t o m m tinh th đá (seeding). M c đích c a công vi c nƠy lƠ t o

nh ng tinh th đá đ u tiên v trí cách xa v trí c a t bƠo m t cách c Ủ đ
không lƠm t n th ng t bƠo vƠ kh i đ ng quá trình t o thƠnh tinh th đá,
giúp vi c kh n c c a t bƠo ti p t c x y ra. Ngay sau khi t o m m tinh th
đá, n c ngo i bƠo d n d n chuy n tr ng thái t th l ng sang th r n vƠ
m u t bƠo đ c lƠm l nh ti p t c v i nhi t đ lƠm l nh r t ch m (-30C/phút).
Khi nhi t đ m u đ t -300C đ n -400C, ph n l n n c ngo i bƠo chuy n thƠnh
d ng tinh th đá. D i đi u ki n nƠy, nhi t đ c a m u t bƠo có th gi m m t
cách nhanh chóng đ đ t đ n nhi t đ c a ni-t l ng [6].
Khi có nhu c u s d ng, t bƠo có th đ c l y ra kh i thùng l u tr m u
đ rư đông. Quá trình rư đông đ c th c hi n ph thu c vƠo đi u ki n lƠm
l nh. N u m u t bƠo đ c lƠm l nh xu ng -200C đ n -300C tr c khi nhúng
vào ni-t l ng, thì nhơn đá n i bƠo có th hình thƠnh do s kh n c không
hoƠn toƠn. V i đi u ki n nƠy, quá trình rư đông nên đ c th c hi n nhanh đ
tránh s phát tri n c a các tinh th đá n i bƠo đ n m c có th gơy h i cho các
bƠo quan vƠ các t ch c bên trong t bƠo. Ng c l i, n u m u t bƠo đ c cho
vào ni-t l ng t giai đo n h nhi t đ th p h n (d i -800C) thì quá trình rã
đông s đ c th c hi n v i t c đ rư đông ch m, do t bƠo có th i gian dƠi
h n cho pha kh n c trong quá trình đông l nh.
Thông th

ng, quá trình rư đông có th đ

tr c ti p straw ch a t bƠo tr vƠo b n

c b t đ u b ng cách nhúng

c m 370C trong th i gian kho ng

30 giơy đ đ a nhi t đ m u tr nhanh chóng v nhi t đ phòng thí nghi m.
Sau đó, t bƠo tr đ

c l y ra kh i straw vƠ cho ti p xúc tr c ti p v i môi


16

tr

ng rư đông. Các môi tr

quá trình bù n

ng rư đông s có n ng đ CPA gi m d n, giúp

c (rehydration) đ

trong t bƠo vƠ cung c p n

c th c hi n nh m lo i b các CPA bên

c l i cho t bƠo. ToƠn b quá trình rư đông di n

ra trong th i gian kho ng 30 phút. K t thúc quá trình nƠy, t bƠo đ

c đ t vƠo

đi u ki n nuôi c y chu n đ ti p t c phát tri n (Borini vƠ cs.,2009) [22].
1.3.1.2. u và nh

c đi m c a h nhi t đ ch m.

u đi m c a ph

ng pháp h nhi t đ ch m lƠ tính an toƠn cao do đ

c

thi t l p d a trên s cơn b ng v t c đ lƠm l nh vƠ n ng đ CPA. Trong h
nhi t đ ch m, n ng đ CPA đ

c s d ng th p (1-1,5mol/l) vƠ ch k t h p

m t ch t có kh n ng vƠ m t ch t không có kh n ng th m qua mƠng t bƠo
nên tính đ c đ i v i t bƠo th p. NgoƠi ra ph

ng pháp đông ch m còn có u

đi m lƠ khi đông nhi u m u s ti t ki m th i gian vƠ thao tác d h n. V i u
đi m nƠy, trong th i gian qua nhi u trung tơm th tinh trong ng nghi m đư
áp d ng ph

ng pháp nƠy r ng rưi trong tr l nh giao t vƠ phôi.

Tuy nhiên, u đi m c a ph

ng pháp nƠy c ng chính lƠ nh

c đi m c a

nó. Do n ng đ CPA s d ng không cao, nên dung d ch đông l nh không có

kh n ng t o chênh l ch áp su t th m th u đ l n đ kh n
bƠo m t cách tri t đ . Tinh th đá n i bƠo v n có th đ

c bên trong t

c t o ra trong quá

trình h nhi t đ . ơy lƠ nguyên nhơn chính lƠm cho t l s ng c a giao t vƠ
phôi sau rư đông b ng ph
đ

c ph

ng pháp nƠy không cao. NgoƠi ra, đ th c hi n

ng pháp đông l nh ch m, m t trung tơm IVF c n ph i trang b h

th ng máy h nhi t đ theo ch

ng trình, đ

c đi u khi n m t cách chính xác

t c đ lƠm l nh. Chi phí đ trang b m t h th ng nƠy khá cao vƠ c n ph i có
chi phí cho vi c b o trì hƠng n m. Th i gian th c hi n cho m t l n đông l nh
noưn vƠ phôi trên th c t khá dƠi (trung bình 1,5 -2 gi ) c ng lƠ nh
không nh v i ph

ng pháp này.

c đi m


17

Hình 1.5. S đ h nhi t đ trong h nhi t đ ch m
1.3.2. Th y tinh h́a (vitrification)
VƠo n m 1985, Rall vƠ Fahy đư ch ng minh đ
đ

c đông l nh thƠnh công b ng m t ph

hóa [6]. Th y tinh hóa lƠ m t ph

c phôi chu t có th

ng pháp m i, đ

c g i lƠ th y tinh

ng pháp tr l nh không cơn b ng (non -

equylibrium cryopreservation method) đ

c thi t l p d a trên nguyên lỦ c

b n lƠ không có s hình thƠnh c a tinh th đá bên trong l n bên ngoƠi t bƠo.
i u nƠy có th đ t đ

c b ng cách t ng t c đ lƠm l nh hay t ng n ng đ

CPA (ch t b o v đông l nh) vƠ trong m t s tr
t trên. Trong ph

ng h p, ph i h p c hai y u

ng pháp th y tinh hóa, m u t bƠo đ

vào ni-t l ng ngay sau khi đ

c nhúng tr c ti p

c cho trao đ i v i CPA mƠ không qua giai

đo n h nhi t đ t t . ToƠn b v t ch t (bao g m c các phơn t n
trong t bƠo vƠ môi tr

c) bên

ng bên ngoƠi t bƠo s chuy n thƠnh th r n d ng

"kính" (glass -like solidification) vƠ hoƠn thƠnh không có s hình thƠnh tinh
th đá. Do đó, ph
ph

ng pháp tr

ng pháp th y tinh hóa còn đ

c g i v i m t tên khác lƠ

l nh không t o đá (ice crystal - free cryopreservation

method). Em bé đ u tiên trên th gi i ra đ i b ng k thu t nƠy đ

c báo cáo

vƠo n m 2002 (Liebermann vƠ cs., 2002; Shaw và Jones, 2003) [8], [9].
Trong k thu t th y tinh hóa, ba y u t quan tr ng góp ph n vƠo s
thƠnh công c a k thu t lƠ n ng đ c a các CPA s d ng, t c đ h nhi t/lƠm
m vƠ th tích m u tr l nh (Vajta vƠ Nagy, 2006), (Yahin vƠ Arav, 2007)


18

[10],[11].
có th chuy n m t l ng môi tr ng có ch a noưn/ phôi t d ng
l ng thƠnh d ng "kính", các CPA c n ph i đ c s d ng n ng đ r t cao.
Trong m t kho ng th i gian dƠi sau khi đ c gi i thi u, th y tinh hóa v n
đ c xem lƠ m t k thu t mang tính th nghi m vì nhi u lỦ do. Trong đó, lo
ng i v các đ c tính có th có c a vi c s d ng CPA n ng đ cao trên phôi vƠ
khó kh n trong vi c thi t l p m t h th ng lƠm l nh v i t c đ cao lƠ nh ng
tr ng i chính.
1.3.2.2.Các lo i CPA (ch t b o v l nh) s d ng trong tr l nh th y tinh hóa.
T ng t h nhi t đ ch m, CPA lƠ ch t không th thi u trong thƠnh
ph n các môi tr ng tr l nh/ rư đông v i th y tinh hóa. Ng i ta c ng s
d ng k t h p các CPA có tính th m vƠ không có tính th m qua mƠng t bƠo.
Tuy nhiên, nh đư trình bƠy, đ h n ch s hình thƠnh tinh th đá n i bƠo
trong th y tinh hóa, n ng đ các ch t CPA s d ng ph i r t cao, g p 4-5 l n
so v i h nhi t đ ch m. Trong khi đó, đ c tính c a CPA trên t bƠo l i t l

thu n v i n ng đ vƠ th i gian ti p xúc. Do đó, đ kh c ph c tình tr ng nƠy,
ng i ta th ng ph i h p s d ng nhi u CPA khác nhau trong th y tinh hóa,
trong đó, th ng có hai lo i CPA có kh n ng th m th u qua mƠng t bƠo.
Các nghiên c u cho th y khi k t h p hai lo i CPA khác nhau, kh n ng th m
vƠo mƠng t bƠo s cao h n vƠ kh n ng gơy đ c s gi m so v i khi s d ng
t ng lo i CPA riêng l (Vajta vƠ Nagy, 2006) [10].
Hi n nay, hai CPA có kh n ng th m th u th ng đ c s d ng nhi u
nh t trong môi tr

ng th y tinh hóa lƠ ethylene glycol (EG) vƠ dimethylsul

foxide (DMSO). Bên c nh đó, sucrose vƠ trehalose lƠ m t l a ch n u tiên
trong các lo i CPA không có kh n ng th m qua mƠng t bƠo.
CPA n i bƠo, hay còn g i lƠ CPA th m th u
Ethylene glycol (EG) th ng đ c s d ng trong môi tr ng đông l nh
do có đ c tính th p, đ th m th u cao. Tuy nhiên, đ h n ch t i đa đ c tính
th ng s d ng k t h p EG vƠ dimethyl sulfoxide (DMSO) ho c propanediol
(PrOH). H n h p EG vƠ DMSO đ c s d ng th ng xuyên h n do tính
th m c a h n h p nƠy cao h n so v i các CPA khác. M t s CPA n i bƠo
th ng đ c s d ng nh :


19

- BG: butylene glycol.
- PrOH: propanediol.
- PG: propylene glycol.
- DMSO: dimethyl sulfoxide.
- Gly: Glycerol.
- EG: ethylene glycol.

- Met: methanol.
CPA ngo i bƠo (CPA không xuyên mƠng)
Ch t b o qu n ngo i bƠo có hi u qu trong vi c b o t n ch c n ng c a
mƠng, h n ch s kh n c quá nhanh lƠm ch t t bƠo. M t s CPA ngo i
bƠo nh :
- Sucrose.
- Trehalose
- PVP: polyvilylpyrrolidone.
- Fic: Ficoll.
- Dex: dextran.
- PEG: polyethylene glycol.
Vai trò chính c a m t s ch t b o qu n l nh tiêu bi u trong môi tr ng
tr -rã phôi.
Trehalose và ficoll
Trehalose có nh ng đ c tính v t tr i h n so v i sucrose vƠ ficoll. Ficoll
có th gia t ng đ c tính cho môi tr ng đông l nh khi s d ng k t h p v i
EG, đ gi m đ c tính c n s d ng k t h p v i sucrose (Kasai M và cs., 1990)
[26]. Khi so sánh đ c tính c a các ch t b o qu n l nh khi tr l nh tr ng
tr ng thƠnh b ng vi c đánh giá kh n ng th tinh c a chúng sau khi rư đông,
Cean A vƠ c ng s (2013) [24] k t lu n:
- Ficoll có đ c tính cao nh t cho tr ng ti p xúc trong 10 phút, s th tinh
c a tr ng không x y ra.
i v i sucrose, khi cho tr ng ti p xúc trong 10 phút thì t l th tinh lƠ
24% (sucrose 10%) và 22,67% (sucrose 20%).


20

- Trehalose có đ c tính th p nh t, n ng đ 10% vƠ 15%, t l th tinh
c a tr ng không gi m vƠ không ph thu c vƠo th i gian ti p xúc.

Ficoll có áp su t th m th u th p, do đó, kh n ng t o cơn b ng gi a
l ng n c di chuy n ra ngoƠi t bƠo vƠ CPA vƠo trong t bƠo b h n ch h n
so v i trehalose. Trehalose lƠ ch t kh n c m nh nh t, nó lƠm gi m s di
chuy n c a các phơn t n c b ng cách liên k t hydro-trehalose còn g n v i
mƠng t bƠo b ng các liên k t hydro nh m gi s n đ nh c a mƠng cho các
CPA n i bƠo ho t đ ng. Kh n ng kh n c c a trahalose g p 2,5 l n các lo i
đ ng khác (SolaPenna và cs., 1998) [25].
nh t c a trehalose cao h n c a sucrose (hình 1) và ficoll (Yavin và cs.,
2007) [10].
nh t cao giúp tách các phơn t n c xa nhau, m ng l i n c
không hình thƠnh đ c, do đó lƠm gi m s hình thƠnh tinh th đá trong môi
tr ng vƠ kích th c c a tinh th đá nh (Tsutomu Uchida vƠ cs., 2012) [26].
Surcrose
LƠ m t disaccharide t o thƠnh t glucose vƠ fructose, trong khi đó
trahalose đ c c u t o t 2 phơn t đ ng glucose. Vai trò c a sucrose
trong môi tr ng tr l nh lƠ b o t n ch c n ng c a mƠng t bƠo trong
đi u ki n ít n c.
HPC (hydroxypropyl cellulose)
HPC đ c s d ng nh m thay th cho huy t thanh t ng h p nh m gi m
nguy c nhi m khu n và virus (Goral và cs., 2015) [27]. HPC d c b sung
vƠo môi tr ng thu tinh hóa Kitazato có b sung 20% SSS (serum substitute
supplement – huy t thanh t ng h p), trong quá trình rư đông tr ng/ phôi khó
r i ra kh i cryotop, do đó c n ph i s d ng pipette đ tách ra, vi c nƠy lƠm
t ng nguy c t n th ng cho tr ng/ phôi. Khi b sung 5% HPC vƠo môi
tr ng tr l nh, th i gian bám dính ch còn kho ng 11 giơy, trong khi b sung
5% ho c 20% SSS th i gian bám dính lên đ n 60 giơy.
EG
LƠ CPA hi u qu nh t trong nhóm ch t có ngu n g c t Gly, ít đ c tính
h n h n Gly vƠ PrOH. Tuy nhiên nhi t đ cao (37ºC), EG b chuy n hoá

21

thƠnh oxalic gơy đ c cho t bƠo, chính vì v y, không nên ti n hƠnh tr l nh
phôi khi b nóng.
Khi xét v đ nh t c a các CPA: Glycerol có đ nh t cao nh t vƠ c p đ
gi m d n t PG> EG> DMSO. Theo nghiên c u c a J Ali (1993) thì đ c ch t
c a EG lƠ th p nh t so v i Met < DMSO< Gly < PG < BG [28]. Nh v y,
m i ch t đ u có nh ng u đi m khuy t đi m riêng, vƠ th ng s gơy đ c
m t n ng đ nƠo đó. Môi tr ng tr l nh th ng có 2 ch t b o qu n l nh,
m c đích c a vi c nƠy lƠ gi m n ng đ mol t ng c a môi tr ng thu tinh
hoá, nh m gi m đ c tính vƠ n đ nh mƠng t bƠo.
Chính vì v y, m c tiêu c a nhƠ s n xu t môi tr ng vitrification lƠ t o ra
đ c dòng môi tr ng tr l nh có kh n ng thu tinh hoá cao nh t, ít đ c t
nh t nh m thu n ti n h n trong thao tác.
đ t đ c đi u nƠy c n hoƠ tr n
các thƠnh ph n trên theo m t t l nh t đ nh.
1.3.2.3. T c đ h nhi t.
Ng i ta nh n th y v i t c đ lƠm l nh 107 0C/giơy, n c trong tr ng
thái tinh khi t có th chuy n thƠnh d ng "kính", tuy nhiên, đ i v i các lo i
môi tr ng ch a h n h p nhi u ch t thì t c đ lƠm l nh ph i cao h n nhi u
l n (Rall,1987) [7]. T c đ lƠm l nh vƠ rư đông c a ph ng pháp tr l nh
th y tinh hóa r t cao, kho ng 20.000 - 100.0000C/phút, trong khi đ i v i
ph ng pháp tr l nh ch m c n 3-4 phút đ h 10C ( m t s giai đo n c
th c a quy trình).
Trong giai đo n đ u phát tri n, các d ng c ch a phôi/noưn đ
d ng lƠ các straw hay các tube tr l nh (cryovial) th

ng đ

c dùng trong h

nhi t đ ch m. Các lo i d ng c nƠy có thƠnh dƠy vƠ ch a m t l
môi tr

c s

ng th tích

ng khá l n. Do đó, v i các lo i d ng c nƠy, t c đ h nhi t th

ng

r t gi i h n, kho ng 4.460 C/phút đ i v i straw (Kuwayama và cs., 2005a)
0

[29]. Trong th i gian qua, hai h
gi m l

ng th tích môi tr

ng ti p c n đ

c xem lƠ có hi u qu nh t lƠ

ng xung quanh noưn/phôi vƠ thi t l p m t h

th ng trong đó, m u tr có th ti p xúc tr c ti p v i ni-t l ng. R t nhi u

22

nghiên c u đư đ
ph

c th c hi n theo h

ng nƠy, nh ng ch đ n n m 2005,

ng pháp cryotop ra đ i đư nhanh chóng góp ph n đ a k thu t th y tinh

hóa tr nên ph bi n nh hi n nay. V i cryotop, t c đ lƠm l nh vƠ rư đông có
th đ t v i 22.8000C/phút và 42.1000C/phút (Kuwayama và cs., 2005a) [29].
1.3.2.4. Các d ng c s d ng cho th y tinh hóa.
Cho đ n nay, nhi u d ng c đ

c phát tri n nh m t i u hoá hi u qu

tr l nh. Có hai h th ng tr l nh g m: h th ng h vƠ h th ng kín. Các m u
tr l nh đ

c ti p xúc tr c ti p ho c gián ti p v i ni-t l ng, tuy nhiên, ph i

đ m b o t c đ đông l nh vƠ rư đông nh m h n ch nh ng t n th

ng l nh

cho t bƠo.
B ng 1.1: M t s d ng c đ c s d ng ph bi n t i các trung tâm
TTON trên th gi i

LO I D NG C

DUNG T́CH

T C

H NHI T

CRYOLOOP

>1 µl

20.000ºC/min

HEMI-SATRAW

>1 µl

>20.000ºC/min

CRYOLEAF

>1 µl

23.000ºC/min

VITRI-INGA

1 µl

20.000ºC/min

CVM-RING

>1 µl

10.000ºC/min

VITRISAFE

>1 µl

1.300ºC/min

HSS

0,5µl

2.000ºC/min

0,25 ML STRAW

25µl

2.500ºC/min

OPS

1 µl

16.700ºC/min

CRYOTOP

0,1 µl

23.000ºC/min

CRYOTIP

1 µl

12.000ºC/min

RAPID-I

0,5 µl

1.200ºC/min

CRYOPETTE

1,2 µl

23.700ºC/min

ULTRAVIT

0,2 µl

250.000ºC/min


23

H th ng m
1. C ng r h (open pulled straw)
C ng r h
0,25mL đ

đ

c lƠm nóng vƠ kéo dƠi đ gi m đ dƠy vƠ đ

so v i ban đ u vƠ đ
kích th

c thi t k b i G Vajta (1998) [30]. C ng r chu n
c c t t i đi m h p nh t ho c đ

ng tr l nh, m u tr l nh đ

ng nh (kho ng 1 µL). Ng

c đ t vƠo m t gi t

i th c hi n ch m đ u nh c a c ng r

vƠo nit l ng đ đông l nh. Khi rư đông, c ng r đ
môi tr

c s d ng c ng r v i

c nh s n có. Ti t trùng có th th c hi n b ng khí ho c chi u x .

Sau khi cơn b ng v i môi tr
môi tr

ng kính kho ng ½

c nhúng tr c ti p vƠo

ng 37ºC. Do không khí bên trong giưn n , m u tr l nh đ

xu ng môi tr

cđ y

ng.

C ng r h đ m b o quá trình đông l nh di n ra c c nhanh, không làm
hình thƠnh tinh th đá. Th tích môi tr

ng thu tinh hoá gi m đáng k so v i

vi c s d ng c ng r tiêu chu n. T c đ lƠm l nh vƠ rư đông r t nhanh, đ t
đ n 20.000ºC/phút. Th i gian ti p xúc v i ch t b o v l nh c a t bƠo r t
ng n (ng n h n 30 giơy). S d ng c ng r h lƠm gi m kh n ng t n th

ng

l nh do đ c tính c a CPA vƠ s thay đ i c a áp su t th m th u. C ng r h có
th tích 0,25 µL v i m t đ u đ

c kéo l ng b ng nhi t. Thi t k lƠm t ng t l

S/V (di n tích b m t/ th tích), đ y nhanh t c đ lƠm l nh c a gi t môi
tr

ng ch a phôi.
Cryoloop
D ng c cryloop g m m t vòng nylon nh (đ

ng kính 0,5-0,7mm) g n

m t que thép c đ nh v i n p c a m t cryovial. Khi m u tr l nh đ
b ng v i môi tr

ng, các cryloop đ

m t mƠng m ng môi tr
lên mƠng m ng sau đó đ

ng đ

c nhúng vƠo môi tr

ng thu tinh hoá,

c t o thƠnh trên vòng nylon. M u đ

c nhúng vƠo nit l ng Vì th tích môi tr

l i xung quanh tr ng/phôi r t ít vƠ nó đ

c cơn
cđ t
ng còn

c ti p xúc tr c ti p v i nit l ng

nên t c đ lƠm l nh có th đ t đ n 700.000ºC. Khi rư đông, cryoloop đ

c


24

nhúng tr c ti p vƠo môi tr
trong môi tr

ng rư đông. Tr ng/phôi d dƠng r i ngay vƠo

ng.

Hình 1.6. Cryoloop

Cryotop
Cryotop đ

c sáng ch n m 1999 (Kitazato Supply Co, F inomiya, Nh t

B n), b i Massashigue Kuwayama [31]. LƠ m t h th ng m , tr ng/phôi
đ

c đ t trong m t th tích r t nh v i môi tr

ng (<0,1 µL) vƠ đ

c đ t lên

đ nh c a m t d i polypropylene (0,4 × 20 × 0,1mm) g n li n v i m t tay c m
nh a. Tr ng /phôi đ

c nhúng tr c ti p vƠo ni-t l ng ngay sau khi đ

lên cryotop. T c đ lƠm l nh đ t đ n 23.000ºC/phút. Cryotop đ
m t n p nh a dƠi 3cm đ b o v trong quá trình tr

c đóng b ng

l nh. Khi rư đông,

cryotop tháo n p trong nit l ng, nhúng tr c ti p cryotop vƠo môi tr
T c đ đông có th đ t đ n 42.100ºC/phút. Ph

cđ t

ng rư.

ng pháp nƠy cho th y t l

s ng trên 88% sau khi rư đông.
Ph

ng pháp cryotop đư đ

c ch ng minh lƠ hi u qu cao khi tr l nh

tr ng so v i c ng r h OPS, t l th tinh vƠ phát tri n thƠnh phôi nang đ
c i thi n h n h n (Morato và cs., 2008) [32].

c


25

Hình 1.7. Cryotop
Cryotec
Cryotec lƠ ph

ng pháp thu

tinh hoá m i, đ

c Dr. Masashige

Kuwayama gi i thi u n m 2012 [33]. V i nhi u c i ti n trong qui trình, thƠnh
ph n môi tr
phôi

ng, d ng c tr l nh, cho hi u qu tr l nh cao đ i v i tr ng vƠ

b t kì giai đo n phát tri n nƠo. D ng c đ

cryotec, t

c s d ng đ

c s d ng lƠ

ng t nh cryotop, cryotec lƠ m t d i nh a m ng đ

c g n tr c

ti p v i m t tay c m, có n p b o v trong quá trình tr l nh đ đ m b o an
toƠn.

a tr l nh c ng đ

c s d ng riêng, không có đi m mù trong các

gi ng, h n ch nguy c m t m u trong khi tr l nh. T c đ lƠm l nh c a
cryotec đ t đ n 23.000ºC/phút; đ đ m b o t c đ nƠy, cryotec đ
vào ni-t l ng vƠ di chuy n liên t c theo chi u th ng đ ng.
trong ni-t l ng. Khi rư đông, n p b o v đ
vƠo môi tr

c nhúng

óng n p b o v

c g b vƠ nhúng đ u cryotec

ng 37ºC. T c đ rư đông đ t đ n đ n 42.000ºC/phút.