kỹ thuật Multiplex Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction để nghiên cứu quy trình phát hiện virus H5N1

MỞ ĐẦU
Trong những năm gần đây, dịch cúm gia cầm do virus A/H5N1 là vấn đề quan
tâm đối với cả thế giới, đặc biệt là đối với các nước châu Á như Việt Nam,
Indonesia, Thái Lan, Trung Quốc... Kể từ cuối năm 2003 đến nay, dịch cúm
A/H5N1 đã gây thiệt hại rất lớn cho ngành chăn nuôi gia cầm và gây tử vong cho
hàng trăm người. Cả thế giới đang lo sợ trước nguy cơ có thể xảy ra một đại dịch
cúm trên người do virus A/H5N1 giống như các vụ đại dịch cúm đã xảy ra trong thế
kỷ 20. Các nước trên thế giới đã tiêu tốn hàng tỷ đô la cho việc chuẩn bị chống lại
một đại dịch cúm H5N1 có thể xảy ra trong tương lai như mua thuốc và các thiết bị
y tế, nghiên cứu sản xuất vaccine, thực hành các phương án phòng chống dịch, thực
hiện các chiến lược nhằm kiểm soát chặt chẽ đường biên giới...
Ở Việt Nam, kể từ năm 2003 đến nay, dịch cúm gia cầm liên tục xảy ra ở hầu
hết các tỉnh thành trên toàn quốc. Mỗi năm có hàng triệu gia cầm bị chết và tiêu
hủy. Theo thống kê của Tổ chức Y tế Thế giới, Việt Nam đang đứng thứ 2 trên thế
giới (sau Indonesia) về số người nhiễm và tử vong do virus A/H5N1.
Virus cúm A/H5N1 là virus có khả năng biến đổi gen nhanh chóng và hình
thành nên các chủng virus mới nên việc sử dụng vaccine để dự phòng thường không
đạt được hiệu quả cao. Ở Việt Nam hiện nay, dịch cúm A/H5N1 vẫn liên tục xảy ra
trên gia cầm và người, mặc dù mức độ không trầm trọng như giai đoạn trước đây
nhưng nếu không được phát hiện và có các biện pháp dập dịch kịp thời thì dịch có
thể trở nên bùng phát.
Khi có dịch cúm gia cầm, một phương pháp chẩn đoán nhanh, nhạy và chính
xác là cần thiết cho việc điều trị, kiểm soát và ngăn chặn kịp thời tránh lây lan rộng
ra cộng đồng. Để phát hiện virus cúm A/H5N1 trong các mẫu bệnh phẩm ở người
và gia cầm, hiện nay hầu hết các phòng xét nghiệm đều áp dụng kỹ thuật RT-PCR
(Reverse Transcription - Polymerase Chain Reaction). Đây là kỹ thuật sinh học
phân tử, cho phép phát hiện virus với độ chính xác cao, thời gian làm xét nghiệm
khoảng 4-6 giờ nếu thực hiện Realtime RT-PCR và 12-24 giờ nếu thực hiện RT-

1

PCR và điện di trên gel agarose. Với RT-PCR thông thường, người ta phải thực hiện
ba phản ứng để chẩn đoán xác định virus cúm A/H5N1, bao gồm: một phản ứng để
xác định virus cúm A, một phản ứng xác định subtype H5 và một phản ứng xác định
subtype N1. Để đơn giản hóa quá trình xét nghiệm, rút ngắn thời gian xét nghiệm và
tiết kiệm chi phí người ta có thể ứng dụng kỹ thuật multiplex RT-PCR, cho phép
chẩn đoán xác định cúm A/H5N1 chỉ với một phản ứng RT-PCR thay vì phải làm ba
phản ứng RT-PCR. Tuy nhiên, việc nghiên cứu thiết kế và xây dựng quy trình thực
hiện kỹ thuật multiplex RT-PCR khá phức tạp nên hiện nay hầu hết các phòng xét
nghiệm trong nước chưa áp dụng kỹ thuật này trong chẩn đoán cúm A/H5N1. Chính
vì vậy, chúng tôi thực hiện ”Nghiên cứu xây dựng quy trình phát hiện nhanh
virus cúm gia cầm A/H5N1 trong mẫu bệnh phẩm bằng kỹ thuật Multiplex
Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction” tại Labo Trường Đại học Y
Thái Bình với mục tiêu:
1. Thiết kế và lựa chọn được các mồi phù hợp để thực hiện phản ứng multiplex
RT-PCR phát hiện virus cúm A/H5N1.
2. Nghiên cứu tối ưu hóa được các điều kiện của phản ứng multiplex RT-PCR:
nhiệt độ và thời gian gắn mồi, nồng độ mồi,...
3. Thử nghiệm được phản ứng multiplex RT-PCR phát hiện A/H5N1 trên một
số mẫu bệnh phẩm thu thập từ người và gia cầm.

2


Chương 1. TỔNG QUAN
1.1. ĐẠI CƯƠNG VỀ VIRUS CÚM A/H5N1
1.1.1. Phân loại học và danh pháp
1.1.1.1. Phân loại virus cúm
Theo ủy ban Quốc tế về phân loại virus (ICTV - International Committee on
Taxonomy of Viruses), virus cúm thuộc nhóm V, họ Orthormyxoviridae, gồm 3 type

là A, B và C. Chúng là các virus có vật liệu di truyền là RNA sợi đơn âm [32].
Sự phân biệt virus cúm A, B và C dựa trên sự khác nhau về đặc tính kháng
nguyên của nucleoprotein (NP) và protein nền M1 (matrix protein). Ngoài ra, hệ
gen của virus cúm A và B đều có 8 đoạn RNA còn virus cúm C chỉ có 7 đoạn RNA
[36].
Trong 3 type thì type A là virus có giới hạn vật chủ rất rộng, lưu hành phổ biến
trên gia cầm và một số động vật có vú như lợn, ngựa, chó, mèo, hải cẩu,… và cả
con người [32]. Virus cúm A là loại có độc lực mạnh nhất, có khả năng biến đổi gen
rất lớn và nguyên nhân chủ yếu gây ra các vụ đại dịch cúm trong thế kỷ qua. Dựa
vào sự khác biệt về đặc tính kháng nguyên của hai glycoprotein là haemagglutinin
(HA) và neuraminidase (NA), virus cúm A còn được chia thành 16 subtype HA
(H1-H16) và 9 subtype NA (N1-N9). Sự tái tổ hợp giữa các subtype HA và NA, về
mặt lý thuyết sẽ tạo ra nhiều subtype khác nhau về độc tính và khả năng gây bệnh
[2]. Tất cả các subtype HA và NA đều hiện diện trên các chủng virus lưu hành ở các
loài thủy cầm hoang dã. Tuy nhiên, chỉ có một số subtype nhất định thường xuyên
lưu hành trên người như H1N1, H1N2, H2N2, H3N2 [11]. Cúm A/H5N1 là một
subtype có khả năng gây nhiễm cao của virus cúm. Các chủng của virus cúm gia
cầm có thể xâm nhiễm vào nhiều loại động vật khác nhau như chim, lợn, ngựa, hải
cẩu, cá voi và con người.
Virus cúm B và virus cúm C lưu hành chủ yếu trên người và chỉ gây ra các vụ
dịch ở mức độ vừa và nhỏ.

3


1.1.1.2. Phân loại virus cúm A/H5N1
Virus cúm A/H5N1 được phân biệt với các subtype virus cúm A khác dựa trên
sự khác biệt về đặc tính kháng nguyên HA và NA. Do có khả năng biến đổi di
truyền nhanh chóng nên các chủng virus cúm A/H5N1 đang lưu hành còn được
phân chia thành nhiều clade/subclade (nhóm/phân nhóm), mỗi clade/subclade có

các đặc điểm di truyền đặc trưng [2].
Các genotype của virus cúm A/H5N1
Trong những năm gần đây virus cúm A/H5N1 đã có những biến đổi di truyền
và được phân chia thành nhiều nhóm dựa vào sự khác biệt về kiểu gen (genotype).
Kiểu gen của virus cúm A/H5N1 thể hiện đặc điểm di truyền của virus được hình
thành do sự kết hợp của 8 phân đoạn gen. Trên cơ sở gen H5 và N1 của chủng gốc
Goose/Guangdong/1/96, virus A/H5N1 được phân chia thành các kiểu gen khác
nhau với các đặc điểm di truyền được hình thành do sự tái tổ hợp 6 gen còn lại từ
các nguồn khác nhau. Các kiểu gen khác nhau của virus cúm A/H5N1 đã được xác
định bao gồm A, B, C, D, E, G, V, W, X 0, X1, X2, X3, Y, Z và Z+ [26]. Trong số các
kiểu gen này, chỉ có một số kiểu gen (B, Z, Z+, V, G, W, và X0) lưu hành được trên
2 năm, chứng tỏ chúng đã thích nghi để có thể tồn tại [22]. Kiểu gen Z là kiểu gen
lưu hành phổ biến ở Indonesia, Thái Lan, Việt Nam và phía nam Trung Quốc từ
năm 2003 đến nay [14].
Các clade của virus cúm A/H5N1
Các tổ chức WHO (World Health Organization), OIE (Organisation for
Animal Health) và FAO (Food and Agriculture Organization) đã cùng nhau xây
dựng một hệ thống danh pháp thống nhất để có thể xác định các clade A/H5N1 [50].
Hiện nay, hệ thống danh pháp này chia virus A/H5N1 thành 10 clade khác nhau,
mỗi clade còn có thể phân thành các subclade (phân dòng) [5, 46]. Hiện tại chỉ có
các virus thuộc clade 0, 1, 2 và 7 là lây nhiễm cho người. Clade 2 gồm một số
subclade khác nhau vẫn đang lưu hành và tiếp tục hình thành các subclade mới [5].
Kể từ 2008, các clade A/H5N1 hiện đang lưu hành và gây bệnh ở người gồm có

4


clade 2.3.2 (Trung Quốc), 2.3.4 (Trung Quốc và Việt Nam) 2.2 (Ai Cập), 2.1
(Indonesia), 1 (Campuchia) và 7 (Trung Quốc) [51].
1.1.1.3. Danh pháp virus cúm

Tổ chức Y tế thế giới (WHO) đã quy định thống nhất danh pháp của virus cúm
theo thứ tự kí hiệu: type virus (A, B hoặc C), vật chủ (có thể bỏ qua nếu vật chủ là
người), địa điểm phân lập virus, mã số chủng virus và năm phân lập. Nếu là virus
cúm A thì phải thêm kí hiệu của kháng nguyên HA và kháng nguyên NA đặt trong
dấu ngoặc đơn.
Ví dụ: A/Hong Kong/156/1997 (H5N1) là chủng virus cúm A ở người, phân
lập ở Hong Kong, mã số chủng là 156, phân lập năm 1997, có kháng nguyên HA là
H5 và kháng nguyên NA là N1.
A/Chicken/Vietnam/G62/2005 (H5N1) là chủng virus cúm A phân lập ở gà tại
Việt Nam năm 2005, mã số chủng là G62, kháng nguyên HA là H5 và kháng
nguyên NA là N1.
1.1.2. Hình thái và cấu trúc virus cúm A/H5N1
Virus cúm H5N1 là một subtype của virus cúm A, thuộc họ Orthomyxoviridea.
Virus cúm A/H5N1 mang các đặc điểm của virus cúm A (hình 1.1).

Hình 1.1. Cấu trúc của virus cúm A. />human-antibodies-neutralize-avian-flu.html

5


Virus cúm A là virus có vỏ bọc, cấu trúc dạng hình cầu với đường kính từ 80120 nm (nanomet) hoặc hình sợi dài 200-300 nm, đường kính 20 nm. Vỏ bọc của
virus là lớp màng lipid kép có nguồn gốc từ tế bào vật chủ, trên màng có khoảng 500
cấu trúc hình gai nhô ra. Các cấu trúc này chính là các kháng nguyên bề mặt của
virus, dài khoảng 10-14 nm, đường kính 4-6 nm, bản chất là các glycoprotein HA,
NA và M2 nằm xen kẽ với nhau. Sự phân bố của các kháng nguyên trên bề mặt của
hạt virus không đồng đều, tỉ lệ HA/NA khoảng 4-5/1. Bên trong màng lipid được lót
bởi một lớp protein nền M1 (khoảng 3000 phân tử M1) [36].
Vật chất di truyền (hệ gen) của virus cúm A là RNA sợi đơn âm (-)ssRNA,
gồm 8 phân đoạn riêng biệt mã hóa cho 10 hoặc 11 protein virus (tùy theo từng
chủng virus mà có thể có hoặc không có protein PB1-F2). Bên trong hạt virus, mỗi

phân đoạn đều liên kết với nucleoprotein (NP) và 3 tiểu đơn vị của enzyme
polymerase (bao gồm PB1, PB2, và PA) hình thành nên các phức hợp
ribonucleoprotein (viral ribonucleoprotein - vRNP) [37].
1.1.3. Hệ gen và các protein của virus A/H5N1
H5N1 có hệ gen là RNA sợi đơn âm bao gồm 8 phân đoạn gen mang tên từ
1-8 với kích thước phân tử giảm dần hoặc gọi theo tên protein mà chúng mã hóa
tổng hợp là PB2, PB1, PB1-F2, PA, HA, NP, NA, M (M1 và M2) và NS (NS1 và
NEP) (hình 1.2).

Hình 1.2. Các phân đoạn gen và các protein của virus cúm A/H5N1

6


Đặc điểm các phân đoạn gen của virus cúm A/H5N1 như sau:
Các phân đoạn mã hóa cho các kháng nguyên bề mặt của virus (đặc trưng
theo từng chủng virus):
- Phân đoạn 4 (gen HA): Có kích thước khoảng 1704-1707 bases, mang gen
mã hóa tổng hợp protein HA, là một kháng nguyên bề mặt của virus cúm có bản
chất là glycoprotein. Kháng nguyên này có vai trò trong việc giúp cho virus gắn với
tế bào vật chủ và vận chuyển vật liệu di truyền của nó vào bên trong tế bào vật chủ.
Quá trình này có thể bị chặn lại nếu có các kháng thể đặc hiệu gắn kết với các
kháng nguyên trên bề mặt của virus. Protein HA còn là kháng nguyên bề mặt quan
trọng của virus cúm A, kích thích cơ thể sinh ra đáp ứng miễn dịch dịch thể đặc hiệu
với từng subtype HA, và tham gia vào phản ứng trung hòa virus. HA là protein vừa
quyết định tính kháng nguyên, vừa quyết định độc lực của virus, là đích của bảo vệ
miễn dịch nhằm ngăn chặn sự xâm nhiễm của virus ở cơ thể nhiễm, là cơ sở điều
chế các vaccine phòng cúm hiện nay. Một đặc điểm di truyền để phân biệt giữa
virus cúm gia cầm và virus cúm người là: virus cúm gia cầm chỉ gắn với thụ thể
alpha 2-3 sialic acid còn virus cúm người chỉ gắn với thụ thể alpha 2-6 sialic acid

trên tế bào chủ. Ở một số động vật (lợn, gà...) có cả 2 loại thụ thể nên có thể bị
nhiễm cả virus cúm gia cầm và cúm người [24]. Người ta đã phát hiện ra sự đột
biến ở một số vị trí trên gen HA làm cho virus cúm gia cầm có thể gắn với tế bào
người và gây bệnh cho người [11]. Một số nghiên cứu trong thời gian gần đây đã
cho thấy ở người cũng có các thụ thể alpha 2-3 sialic acid với mật độ rất thấp và ở
gia cầm cũng có các thụ thể alpha 2-6 sialic acid với mật độ rất thấp [28]. Người ta
cũng nhận thấy nếu đột biến xảy ra ở 2 vị trí trên gen HA tương ứng với axit amin
182 và 192 thì virus có thể gắn với cả thụ thể của người và gia cầm [10, 27].
- Phân đoạn 6 (gen NA): Có kích thước khoảng từ 1350-1410 bases, mang gen
mã hóa cho neuraminidase, một kháng nguyên bề mặt của virus, có vai trò là một
enzyme cắt đứt liên kết giữa gốc sialic acid của màng tế bào nhiễm với phân tử
carbonhydrate của protein HA, giải phóng các hạt virus con ra khỏi tế bào vật chủ.
Ngoài ra, NA còn phân cắt các liên kết glycoside, giải phóng neuraminic acid làm tan

7


loãng màng nhầy bề mặt biểu mô đường hô hấp, tạo điều kiện cho virus nhanh chóng
tiếp cận tế bào biểu mô và thoát khỏi các chất ức chế không đặc hiệu. Giống kháng
nguyên HA, NA cũng là đích chủ yếu của cơ chế bảo vệ miễn dịch của cơ thể chủ,
sinh ra kháng thể đặc hiệu với kháng nguyên NA của các chủng virus đang nhễm.
Như vậy, hai kháng nguyên bề mặt HA và NA của virus là cơ sở điều chế các vaccine
phòng cúm hiện này cho người và gia cầm và hạn chế lây truyền sang người [2].
Các phân đoạn mã hóa cho các protein thành phần của enzyme polymerase
của virus, có độ dài ổn định và có tính bảo tồn cao, gồm:
- Phân đoạn 1 (gen PB2) có kích thước khoảng 2431 bases, mang gen mã hóa
tổng hợp protein PB2, là tiểu đơn vị thành phần trong phức hợp enzyme polymerase
của virus, chịu trách nhiệm khởi đầu phiên mã RNA virus [2]. Nghiên cứu thấy
rằng, trên PB2 tất cả các virus cúm gia cầm đều có axit amin ở vị trí 627 là
glutamine, còn PB2 ở các chủng A/H5N1 phân lập từ người mang đột biến chứa

axit amin lysine ở vị trí 627. Sự có mặt của lysine ở vị trí 627 của PB2 sẽ tạo thuận
lợi cho virus phát triển ở cả đường hô hấp trên và đường hô hấp dưới của động vật
có vú, là nguyên nhân làm cho A/H5N1 có độc lực cao [29].
- Phân đoạn 2 (gen PB1) có kích thước khoảng 2431 bases, mang gen mã hóa
tổng hợp protein PB1 và PB1-F2. PB1 là tiểu đơn vị xúc tác của phức hợp enyzme
polymerase, chịu trách nhiệm gắn mũ RNA [5]. PB1-F2 liên quan đến độc lực của
virus và có thể có vai trò quan trọng trong việc xác định mức độ nguy hiểm của dịch
cúm [43]. Khi so sánh các chủng virus trong vụ dịch ở Hong Kong năm 1997, người
ta nhận thấy sự biến đổi axit amin asparagine ở vị trí 66 thành serine (N66S) trên
PB1-F2 liên quan đến độc lực của virus. Sự thay đổi axit amin N66S cũng được
phát hiện trên PB1-F2 của virus cúm gây ra đại dịch cúm năm 1918 [17].
- Phân đoạn 3 (gen PA) có kích thước khoảng 2233 bases, là phân đoạn gen
bảo tồn cao, mã hóa tổng hợp protein PA, là một tiểu đơn vị của enzyme polymerase
chịu trách nhiệm kéo dài RNA trong quá trình tổng hợp RNA của virus [40].
Các phân đoạn mã hóa các protein chức năng khác của virus, chúng có kích
thước tương đối ổn định giữa các chủng virus cúm A, gồm:

8


- Phân đoạn 5 (gen NP) có kích thước khoảng 1556 bases, mã hóa tổng hợp
nucleoprotein (NP), chịu trách nhiệm vận chuyển RNA giữa nhân và bào tương tế
bào chủ. NP có đặc tính kháng nguyên biểu hiện theo nhóm virus, tồn tại trong các
hạt virus ở dạng kết hợp với mỗi phân đoạn RNA.
- Phân đoạn 7 (gen M): có kích thước khoảng 1027 bases, mang gen mã hóa
tổng hợp protein nền M1 và M2 của virus. Các protein này kết hợp với 2 kháng
nguyên bề mặt tạo nên lớp vỏ capsid của virus. Hai protein này được tạo ra từ cùng
một phân đoạn RNA với các khung đọc mở khác nhau. Protein M1 gắn với RNA
của virus và M2 có tác dụng phá vỡ vỏ bọc của virus để giải phóng các phân đoạn
RNA vào tế bào chất của tế bào chủ. M2 là protein xuyên màng có bản chất là một

kênh ion, cần thiết cho quá trình xâm nhiễm của virus [36]. Sự thay thế axit amin ở
vị trí 31 serin thành asparagine trên protein M2 của một số chủng H5N1 liên quan
đến tình trạng kháng amantadin của virus [25].
- Phân đoạn 8 (gen NS) có kích thước khoảng 890 bases, chứa gen mã hóa cho
2 protein không cấu trúc của virus là NS1 và NEP (nuclear export protein) (thường
được gọi là protein NS2). Độc lực của virus liên quan đến protein NS [39]. NS1 là
protein có vai trò trong việc ghép nối, dịch mã và vận chuyển RNA qua màng tế
bào. NEP có vai trò trung gian trong quá trình vận chuyển các ribonucleoprotein của
virus (vRNPs) vào nhân tế bào chủ.
1.1.4. Chu trình tái bản của virus cúm A/H5N1
Chu trình tái bản của virus cúm xảy ra chủ yếu ở các tế bào biểu mô đường hô hấp,
đường tiêu hóa của cơ thể nhiễm (hình 1.3).

9


Hình 1.3. Chu trình tái bản của virus cúm A
Khởi đầu chu trình là sự gắn kết của virus với các thụ thể có chứa nhóm
sialic acid trên bề mặt tế bào nhiễm nhờ kháng nguyên HA. Khi virus bám gắn được
với tế bào, màng tế bào lõm lại hình thành túi thực bào (endosome). Túi thực bào
giảm dần pH để giúp cho quá trình hoà nhập màng virus với màng túi thực bào và
giải phóng các phức hợp RNP của virus vào tế bào chất của tế bào chủ. Sau đó, các
phức hợp RNP được vận chuyển vào nhân tế bào để tổng hợp sợi dương RNA. Sợi
dương RNA được làm khuôn để sao mã tạo mRNA và tái bản sợi âm RNA của
virus. mRNA được đưa ra tế bào chất để tổng hợp protein của virus. Quá trình tổng
hợp protein và tái bản hệ gen của virus là quá trình phức tạp được điều hoà bởi
nhiều yếu tố của virus cũng như của tế bào. Các protein PB1, PB2, PA và NP của
virus sau khi được tổng hợp sẽ được đưa vào nhân tế bào và kết hợp với RNA virus
hình thành các phức hợp RNP và phức hợp được đưa ra tế bào chất. Các protein
khác (HA, NA và M2) được glycosyl hoá nhờ mạng lười nội sinh chất và phức hệ

golgi của tế bào. Sau khi hoàn thiện, các protein này được đưa đến màng tế bào gắn
vào lớp lipid kép và khi mật độ đủ lớn thì các phức hợp RNP và protein M1 cũng
tập hợp lại trên màng để hình thành hạt virus thế hệ con gắn trên bề mặt tế bào nhờ
liên kết giữa HA với nhóm sialic acid của glycoprotein màng tế bào. Các hạt virus
sau đó giải phóng khỏi màng nhờ tác dụng cắt nhóm sialic acid của enzyme
neuraminidase.

10


Thời gian từ khi virus xâm nhiễm tế bào đến khi hình thành thế hệ virus con trung
bình khoảng 6 giờ. Sự giải phóng các hạt virus mới không phá tan tế bào nhiễm,
nhưng các tế bào này bị rối loạn hệ thống tổng hợp các đại phân tử và rơi vào quá
trình chết theo chương trình (apoptosis) làm tổn thương mô của cơ thể vật chủ [48].
1.1.5. Hiện tượng biến đổi kháng nguyên của virus cúm A
Virus cúm A là loại virus đặc biệt nhất trong các virus đường hô hấp do có hệ
gen phân thành 8 đoạn và khả năng biến đổi kháng nguyên nhanh chóng. Khả năng
biến đổi kháng nguyên của virus cúm A là hệ quả của các quá trình biến đổi di
truyền của virus. Các cơ chế biến đổi di truyền của virus bao gồm:
- Hiện tượng trao đổi kháng nguyên (antigenic shift): Antigenic shift là các
biến đổi di truyền lớn của virus cúm, tạo ra chủng virus mới từ các chủng virus ban
đầu bằng cách sắp xếp lại hệ gen. Quá trình này xảy ra khi virus cúm của các loài
khác nhau đồng nhiễm trên cùng một vật chủ (ví dụ như hai chủng virus cúm người
và virus cúm gia cầm đồng nhiễm trên lợn) trao đổi hệ gen cho nhau, tạo ra các thế
hệ virus mới có các phân đoạn gen kết hợp từ các chủng ban đầu. Sự trao đổi kháng
nguyên có thể tạo ra các chủng virus cúm mới có khả năng lây nhiễm các loài vật
chủ mới hoặc gia tăng động lực gây bệnh [2].
- Hiện tượng lệch kháng nguyên (antigenic drift): Antigenic drift là quá trình
tích lũy các đột biến gen trên gen mã hóa cho các kháng nguyên quan trọng của
virus (kháng nguyên HA và NA). Do enzyme polymerase của virus không có cơ chế

đọc sửa nên trong quá trình tái bản tần số đột biến ở virus rất cao, trung bình mỗi
lần tái bản hệ gen của virus sẽ có 1 nucleotid bị biến đổi [21]. Qua nhiều thế hệ
virus, các đột biến này dần dần được tích lũy lại và đến một lúc nào đó sẽ làm thay
đổi đặc tính kháng nguyên của virus [21]. Chủng virus cúm với các đặc tính kháng
nguyên mới có thể thoát khỏi hệ thống miễn dịch của cơ thể và dễ dàng lan truyền
trong quần thể.
- Hiện tượng glycosyl hóa: Glycosyl hóa (glycosylation) là sự gắn kết của
một chuỗi oligosaccharide với amino acid asparagine ở một số vị trí nhất định trong
chuỗi polypeptide HA hay NA, hay một số polypeptide khác của virus cúm. Thông

11


thường chuỗi oligosaccharide được gắn tại vị trí N-X-S/T (N = asparagine; X =
amino acid bất kì, trừ proline; S/T = serine hoặc threonine) [7]. Đây là những vị trí
được cho là gắn kết với các kháng thể được cơ thể sinh ra do kích thích của kháng
nguyên, nhằm bảo vệ cơ thể nhiễm. Hiện tượng lệch kháng nguyên sinh ra đột biến
điểm hình thành bộ mã của asparagine, tạo tiền đồ cho hiện tượng glycosyl hóa xảy
ra khi tổng hợp chuỗi polypeptide HA hay NA, làm thay đổi đặc tính kháng nguyên
của HA và NA, giúp cho virus thoát khỏi tác động miễn dịch bảo vệ của cơ thể chủ
và điều hoà sự nhân lên của virus [7].
Hiện tượng lệch kháng nguyên và glycosyl hóa tạo ra những biến đổi di truyền
nhỏ nhưng diễn ra liên tục trong quá trình lưu hành của virus trong tự nhiên. Ngược
lại, hiện tượng trao đổi kháng nguyên có thể xảy ra với tất cả các chủng của virus
cúm A khi có hiện tượng đồng nhiễm, tạo ra các biến đổi di truyền lớn và hình thành
chủng virus mới. Đây cũng chính là vấn đề đáng lo ngại của virus cúm A/H5N1
hiện nay, mặc dù virus này chưa có sự thích nghi lây nhiễm dễ dàng ở người, nhưng
nó có khả năng gây bệnh cho người với tỉ lệ tử vong rất cao. Nếu như chủng virus
A/H5N1 trao đổi gen HA hay NA, hoặc cả hai gen với một chủng virus cúm A đã
thích nghi ở người (ví dụ như H1N1 hoặc H3N2) có thể tạo ra chủng virus mới

thích ứng lây nhiễm dễ dàng ở người, là nguy cơ của một đại dịch cúm mới [25].
1.1.6. Khả năng thích ứng vật chủ của virus cúm A
Vật chủ tự nhiên của tất cả các chủng virus cúm A là các loài thủy cầm
hoang dã (chủ yếu là vịt trời), đây là nguyên nhân lan truyền virus trong tự nhiên
rất khó kiểm soát. Virus cúm A có khả năng gia tăng biên độ vật chủ của chúng
trong quá trình lây truyền ở tự nhiên (hình 1.4).

12


Hình 1.4. Các vật chủ tự nhiên và khả năng lây nhiễm giữa các loài vật chủ của
virus cúm A.
/>Nhờ đặc tính luôn thay đổi kháng nguyên trong tự nhiên, virus cúm A có
khả năng xâm nhiễm nhiều loài vật chủ trung gian khác nhau như gia cầm, một
số loài động vật có vú (hải cẩu, cá voi, ngựa, lợn…) và cả con người, tạo nên
tính thích ứng lan truyền “nội loài” như gà - gà, hay “ngoại loài” như gà - lợn;
gà - lợn - người. Đặc điểm thích ứng vật chủ này là điều kiện thuận lợi cho virus
cúm A trao đổi, tái tổ hợp các phân đoạn gen, đặc biệt là các phân đoạn gen
kháng nguyên (HA và NA) giữa các chủng, tạo ra một chủng virus cúm mới có
khả năng thích ứng xâm nhiễm ở loài vật chủ mới của chúng đặc biệt khi chúng
vượt qua được “rào cản loài” dễ dàng thích ứng lây nhiễm gây bệnh từ gia cầm
sang người và giữa người với người [15].
Các nghiên cứu về virus H5N1 trong thời gian gần đây cho thấy virus đã có
những biến đổi để thích nghi lây nhiễm trên người. Hai chủng virus H5N1 phân lập
trên người năm 2003 (Hong Kong) cho thấy có hiện tượng giảm ái lực với thụ thể
của gia cầm và có ái lực (mặc dù chỉ ở mức thấp) với thụ thể của người và sự thay
đổi axit amin ở vị trí 227 (Ser thành Asn) là nguyên nhân làm thay đổi tính đặc hiệu
với thụ thể của virus [23]. Đột biến ở vị trí 182 hoặc 192 (Asn182Lys hoặc

13

Gln192Arg) làm cho H5N1 thay đổi đặc tính gắn thụ thể, từ dạng có ái lực với thụ
thể của gia cầm chuyển thành dạng có ái lực với thụ thể của người [52].
Trong thế kỷ 20, chỉ có các chủng virus H1N1, H2N2, H3N2 và H1N2 lưu
hành trên người. Tuy nhiên trong những năm gần đây có nhiều subtype virus cúm
gia cầm như H5N1, H7N3, H7N7, H9N2 và H10N7 đã lây nhiễm cho người.
Virus cúm A/H5N1 có khả năng lây nhiễm và gây bệnh cho nhiều loài động
vật có vú khác như chó, mèo, hổ, báo…
1.1.7. Độc lực và khả năng gây bệnh của virus cúm A/H5N1
Khả năng gây bệnh của virus cúm A phụ thuộc vào độc lực và tính thích ứng
vật chủ của từng chủng virus. Thông thường chúng không gây bệnh hoặc chỉ gây
bệnh nhẹ giới hạn ở đường hô hấp của chim hoang dã và gia cầm, nhưng một số
chủng thuộc subtype H5, H7, H1, H2 và H3 có thể gây bệnh nặng ở nhiều cơ quan
trong cơ thể, gây nên dịch cúm ở gia cầm và người [52]. Dựa vào khả năng gây
bệnh của virus trên gia cầm, virus cúm A được chia thành 2 nhóm là nhóm có độc
lực cao (Highly Pathogenic Avian Influenza - HPAI) và nhóm có độc lực thấp (Low
Pathogenic Avian Influenza - LPAI). Nhóm LPAI thường chỉ gây ra các bệnh nhẹ ở
đường hô hấp, giảm sức đẻ và/hoặc giảm trọng lượng, mặc dù đôi khi có thể gây
bệnh với tỉ lệ cao nhưng tỉ lệ chết thường thấp. Trái lại, virus HPAI thường gây chết
gia cầm với tỷ lệ cao, ít nhất 75% gia cầm nhiễm đều bị chết [45]. Cho đến nay, tất
cả các chủng HPAI đã biết đều thuộc subtype H5 hoặc H7, tuy nhiên không phải tất
cả mà chỉ có một số ít các chủng virus thuộc subtype H5 và H7 là HPAI. Protein HA
của LPAI có đặc điểm là chỉ có một axit amin kiềm là arginine tại vị trí phân cắt và
một axit amin kiềm khác ở trước vị trí phân cắt 3 hoặc 4 axit amin (tùy thuộc vào
từng subtype). Do đó, protein HA của LPAI chỉ bị phân cắt bởi các protease ngoại
bào (extracellular proteases) do các tế bào hoặc vi khuẩn tại vị trí xâm nhiễm (ví dụ
như khí quản và ruột) tiết ra. Trái lại, protein HA của HPAI lại có nhiều axit amin
kiềm tại vị trí phân cắt, do đó có thể chịu tác dụng của các protease nội bào
(intracellular protease) phổ biến như furin [44]. Chính vì vậy mà HPAI có thể gây

14


bệnh ở nhiều mô, cơ quan khác nhau trên cơ thể vật chủ và gây nên các triệu chứng
nặng nề và tỉ lệ tử vong cao.
Độc lực và khả năng gây bệnh của virus A/H5N1 được quyết định chủ yếu bởi
các protein của virus là HA, PB2, NS1 và PB1-F2: Protein HA là kháng nguyên bề
mặt quan trọng của virus cúm, giúp cho virus có thể gắn với các thụ thể sialic acid
đặc hiệu trên bề mặt tế bào, hòa màng và xâm nhiễm tế bào chủ. Vị trí phân cắt
protein HA của A/H5N1 mang nhiều axit amin kiềm nên dễ dàng bị phân cắt bởi
các protease, giúp virus có thể lây nhiễm và tái bản ở nhiều mô cơ quan khác nhau
trong cơ thể vật chủ và gây nên các triệu chứng nặng nề. Protein PB2 là một thành
phần quan trọng của phức hợp RNP của virus, tham gia vào quá trình sao mã và tái
bản của virus. Protein NS1 có thể tham gia điều hòa đáp ứng miễn dịch ở vật chủ,
do đó cũng là một yếu tố quyết định độc lực của virus đối với con người. PB1-F2 có
vai trò gây ra hiện tượng apoptosis làm tổn thương mô, cơ quan của cơ thể nhiễm.
1.1.8. Sức đề kháng của virus cúm A
Virus cúm A tương đối nhạy cảm với các tác nhân vật lí hay hóa học. Các hạt virus
tồn tại thích hợp trong khoảng pH từ 6.5 đến 7.9. Ở pH quá acid hay quá kiềm, khả năng
lây nhiễm của virus bị giảm mạnh. Lớp vỏ ngoài của virus bản chất là lớp lipid kép, có
nguồn gốc từ màng tế bào nhiễm, dễ bị phá hủy bởi các dung môi hòa tan lipid, chất tẩy
rửa và các chất sát trùng: formaldehyde, phenol, β-propiolacton, sodium hypochloride,
acid loãng và hydroxylamine. Virus bị bất hoạt dưới ánh sáng trực tiếp sau 40 giờ, tồn tại
được 15 ngày ánh sáng thường, tia tử ngoại bất hoạt được virus nhưng không phá hủy
được kháng nguyên của virus. Tuy nhiên, virus cúm A dễ dàng bị tiêu diệt hoàn toàn ở
100oC và ở 60oC/30 phút, tồn tại ít nhất 3 tháng ở nhiệt độ thấp (trong phân gia cầm), và
tới hàng năm ở nhiệt độ bảo quản (-70oC). Trong phủ tạng gia cầm (40oC), virus tồn tại 2530 ngày nhưng chỉ tồn tại 7 - 8 ngày ở nhiệt độ cơ thể người (37 oC); trong nước, virus có
thể sống tới 4 ngày ở nhiệt độ 30oC.

15


1.2. CHẨN ĐOÁN, ĐIỀU TRỊ VÀ DỰ PHÒNG BỆNH CÚM GIA CẦM A/H5N1
1.2.1. Triệu chứng nhiễm cúm A/H5N1
Ở gia cầm, thời gian ủ bệnh từ vài giờ đến trên hai mươi ngày, biểu hiện các
triệu chứng sốt cao, chảy nước mắt, đứng tụm một chỗ, lông xù, phù đầu và mắt, da
tím tái, chân xuất huyết, chảy nước dãi ở mỏ. Con vật khi sốt cao có biểu hiện
không bình thường ở hệ thống tiêu hóa, hô hấp, sinh sản và thần kinh. Triệu chứng
chung là giảm hoạt động, giảm tiêu thụ thức ăn, gầy yếu. Trường hợp nặng có biểu
hiện ho, khó thở, rối loạn thần kinh, ỉa chảy, một số con có biểu hiện co giật hoặc ở
tư thế không bình thường. Những triệu trứng trên có thể xảy ra cùng một lúc hoặc
riêng rẽ [3, 4].
Ở người, thời gian ủ bệnh bệnh của virus cúm A/H5N1 có thể kéo dài hơn so
với cúm mùa, trung bình hầu hết các trường hợp nhiễm A/H5N1 là từ 2-4 ngày,
nhưng một số trường hợp có thể kéo dài hơn, 8-17 ngày [16]. Các triệu chứng lâm
sàng nhiễm cúm A/H5N1 có thể không biểu hiện hoặc biểu hiện các triệu chứng ở
các mức độ khác nhau, từ nhẹ như bệnh cúm thông thường (khó thở, ho, sốt) cho
đến biểu hiện viêm phổi nặng, hội chứng suy hô hấp cấp (ARDS- Acute Respiratory
Distress Syndrome) hay hội chứng suy đa tạng (MODS- Multiorgan Disfunction
Syndrome). Các nghiên cứu cho thấy một số bệnh nhân không biểu hiện triệu chứng
(phát hiện qua xét nghiệm) và cũng có trường hợp biểu hiện các triệu chứng không
điển hình (viêm não hoặc viêm đường tiêu hóa) [6]. Không giống như cúm mùa,
bệnh nhân nhiễm A/H5N1 thường không có biểu hiện nhiễm trùng đường hô hấp
trên mà thường biểu hiện tình trạng viêm phổi và nhiễm trùng đường hô hấp dưới.
Đặc điểm lâm sàng này có thể là do các thụ thể đặc hiệu với HA của virus cúm
A/H5N1 có nhiều ở đường hô hấp dưới. Triệu chứng cận lâm sàng thường gặp là:
giảm số lượng bạch cầu, đặc biệt là bạch cầu lympho, giảm số lượng tiểu cầu, giảm
albumin huyết; tăng hàm lượng một số protein huyết thanh như aminotransaminase,
lactate dehydrogenase và creatine phosphokinase; đường huyết tăng rõ, có thể liên

quan đến việc sử dụng corticosteroid và có thể tăng creatinine máu [31]. Ở những
bệnh nhân có tải lượng virus cao trong dịch mũi và dịch nội khí quản, những bệnh

16


nhân ở giai đoạn cuối của bệnh thì hàm lượng cytokin và chemokin trong máu
thường tăng cao, đặc biệt là các yếu tố như interleukin-6, yếu tố hoại tử u và các
interferon, chứng tỏ hiện tượng virus đang phát tán trong cơ thể [19]. Ở những bệnh
nhân tử vong, người ta đã phát hiện các kháng nguyên và/hoặc RNA của virus ở hầu
hết các mô trong cơ thể, bao gồm: phổi, khí quản, gan, niêm mạc ruột non, ruột già,
tủy xương và não.
Tỉ lệ tử vong đối với bệnh nhân nhiễm cúm A/H5N1 nhập viện tương đối cao,
xấp xỉ 60% [13, 16], mặc dù tỷ lệ tử vong chung có lẽ thấp hơn nhiều. Trái ngược
với năm 1997, khi phần lớn các ca tử vong xảy ra ở bệnh nhân trên 13 tuổi, cúm
A/H5N1 hiện nay gây tỷ lệ tử vong cao ở trẻ nhỏ. Ở trẻ dưới 15 tuổi, tỷ lệ tử vong
là 89% [16]. Thời gian trung bình từ khi có triệu chứng đầu tiên đến khi tử vong là
9-10 ngày (thay đổi từ 6-30 ngày) và hầu hết bệnh nhân tử vong do suy hô hấp tiển
triển [5, 16].
1.2.2. Các phương pháp xét nghiệm và chẩn đoán nhiễm cúm A/H5N1
Chẩn đoán lâm sàng nhiễm cúm A/H5N1 là rất khó vì triệu chứng của bệnh rất
đa dạng và tương tự như một số bệnh khác. Để chẩn đoán xác định người ta thường
phải dựa vào các kết quả xét nghiệm xác định sự có mặt của virus, kháng nguyên,
kháng thể hoặc RNA của virus trong mẫu bệnh phẩm.
1.2.2.1. Các phương pháp xét nghiệm phát hiện cúm A/H5N1
Với đặc điểm cấu tạo và khả năng gây bệnh của virus cúm A/H5N1, kỹ thuật
xét nghiệm không chỉ đòi hỏi có độ tin cậy và độ nhạy cao mà thời gian xét nghiệm
phải nhanh [34]. Các kỹ thuật xét nghiệm có thể áp dụng trong chẩn đoán virus cúm
A/H5N1 bao gồm: phân lập virus; phát hiện kháng nguyên; phát hiện RNA của
virus bằng kỹ thuật RT-PCR, realtime RT-PCR...và phát hiện sự tăng hiệu giá kháng

thể trong huyết thanh bệnh nhân. Trong giai đoạn dịch cúm A/H5N1 đang bùng phát
thì việc áp dụng các kỹ thuật chẩn đoán nhanh, có thể thực hiện với nhiều mẫu bệnh
phẩm cùng một lúc có vai trò hết sức quan trọng.

17


Phương pháp phân lập virus
Hiện nay, phân lập virus là tiêu chuẩn vàng trong chẩn đoán cúm A/H5N1 vì
các chủng virus sau khi phân lập có thể được dùng trong các nghiên cứu về sau như:
giải trình tự, xác định subtype, xác định clade, phân tích các đột biến và hiện tượng
tái tổ hợp để tìm hiểu về khả năng tái bản, khả năng lây nhiễm của virus và hiện
tượng kháng thuốc của virus. Virus A/H5N1 có thể phân lập bằng cách nuôi cấy trên
phôi gà SPF (specific pathogenic free) hoặc nuôi cấy trên tế bào thận chó (MardinDarby canine kidney - MDCK) hoặc các dòng tế bào cảm nhiễm với virus cúm
khác.
Phân lập từ trứng: hầu hết các virus cúm phát triển ổn định trong khoang túi
niệu hoặc túi ối của phôi gà 10-12 ngày tuổi. Sau khi gây nhiễm trứng 48-72 giờ,
thu dịch khoang niệu mô, xác định sự có mặt và xác định subtype virus bằng các
phản ứng miễn dịch (HA, HI) hoặc RT-PCR. Với chủng virus có độc lực cao, phôi
có thể bị chết trong vòng 24 giờ sau khi gây nhiễm.
Phân lập từ tế bào: Khi nuôi cấy các virus cúm mùa LPAI trên tế bào MDCK,
người ta phải bổ sung trypsin để virus có thể tái bản. Tuy nhiên, đối với các virus
cúm A/H5N1, vì là HPAI nên virus có thể tái bản mà không cần bổ sung trypsin.
Là tiêu chuẩn vàng, nhưng phân lập virus đòi hỏi phải có phòng an toàn sinh
học cấp 3 (BioSafety Level 3 - BSL3) và thời gian nuôi cấy tương đối lâu, từ 2-6
ngày. Ngoài ra, sau khi phân lập được virus vẫn phải thực hiện các xét nghiệm khác
để chẩn đoán xác định subtype virus.
Phương pháp phát hiện kháng nguyên
Là phương pháp dùng kháng thể đặc hiệu để phát hiện kháng nguyên virus.
Người ta có thể phát hiện kháng nguyên của virus trực tiếp từ mẫu bệnh phẩm bằng

một số kỹ thuật khác nhau, tuy nhiên kỹ thuật được sử dụng phổ biến hơn do thời
gian xét nghiệm nhanh là:
Kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang trực tiếp (direct immunofluorescence assay):
Tế bào niêm mạc đường hô hấp được cố định trên lam kính, kháng nguyên của virus

18


được phát hiện bằng kháng thể đặc hiệu có gắn huỳnh quang và quan sát dưới kính
hiển vi huỳnh quang.
Kỹ thuật miễn dịch gắn men (EIA: Enzyme-linhked Immunosorbent Assay):
Kỹ thuật sử dụng kháng thể đặc hiệu gắn enzyme để phát hiện kháng nguyên virus.
Mẫu bệnh phẩm được gắn lên thành giếng, sau khi được ủ với kháng thể có gắn
enzyme thì bổ sung cơ chất phù hợp. Nếu có kháng nguyên virus trong mẫu bệnh
phẩm thì enzyme sẽ tác dụng với cơ chất làm đổi màu.
Kỹ thuật phát hiện kháng nguyên virus nhanh, đơn giản nhưng chỉ phát hiện
được các kháng nguyên bảo thủ của virus cúm như NP và M. Do đó, kết qu ả xét
nghiệm dương tính cũng chỉ có thể kết luận là nhiễm virus cúm A, không xác định
được có phải là A/H5N1 hay không. Độ nhạy của các kỹ thuật có thể chấp nhận
được khi áp dụng trong chẩn đoán cúm mùa ở người, tuy nhiên để chẩn đoán cúm
A/H5N1 thì chưa đạt yêu cầu [9, 34]. Hiện nay một số bộ sinh phẩm phát hiện
kháng nguyên đặc hiệu của H5N1 đã được đưa ra thị trường và đang được thử
nghiệm trong chẩn đoán cho gia cầm.
Phương pháp phát hiện kháng thể (chẩn đoán huyết thanh học)
Là phương pháp dùng kháng nguyên chuẩn virus (virus) để phát hiện kháng
thể đặc hiệu kháng virus trong huyết thanh hoặc trong các dịch cơ thể. Một số kỹ
thuật chẩn đoán huyết thanh có thể áp dụng trong chẩn đoán cúm A/H5N1:
Phản ứng ức chế ngưng kết hồng cầu (HI- Hemagglutinin Inhibitory): Thành
phần phản ứng bao gồm kháng nguyên virus chuẩn, kháng huyết thanh cần kiểm tra
(đã loại bỏ các yếu tố ức chế và các yếu tố gây ngưng kết hồng cầu) và hồng cầu

pha loãng 0.4-0.5% (hồng cầu gà, hồng cầu lợn guinea, hoặc hồng cầu người nhóm
máu O). Kháng nguyên virus chuẩn được ủ với kháng huyết thanh ở các nồng độ
khác nhau, sau đó bổ sung hồng cầu. Mẫu dương tính là mẫu có chứa kháng thể đặc
hiệu với HA, là các giếng có hồng cầu không bị ngưng kết mà lắng xuống đáy
giếng. Hiệu giá HI chính là tỉ lệ pha loãng huyết thanh thấp nhất có thể ức chế
ngưng kết hồng cầu [33].

19


Phản ứng HI thường được sử dụng để phát hiện kháng thể đặc hiệu của virus
cúm mùa trong huyết thanh bệnh nhân nhưng ít được sử dụng để phát hiện kháng
thể kháng virus H5N1 trong huyết thanh người và động vật có vú do có độ nhạy
thấp [8].
Western Blot (WB): là kĩ thuật có độ nhạy cao, được sử dụng để phát hiện
kháng thể kháng virus cúm trong các mẫu huyết thanh. Kháng nguyên toàn phần
của virus hoặc protein HA tinh chế được chạy điện di trên gel, sau đó chuyển sang
màng nitrocellulose hoặc nylon. Màng chứa kháng nguyên được cắt thành các băng
nhỏ, ủ với mẫu huyết thanh pha loãng, kháng thể đặc hiệu trong huyết thanh sẽ liên
kết với kháng nguyên gắn trên màng. Tiến hành ủ các băng nêu trên với kháng
kháng thể đặc hiệu có gắn enzyme, chất chỉ thị màu (phosphatase kiềm hoặc
peroxidase cải củ cay) hoặc biotin và được nhận biết bằng streptavidin-HRP. Vị trí
gắn kháng thể kháng virus sẽ được xác định khi ủ các băng này với cơ chất của
enzyme hoặc chất tạo màu. WB có độ nhạy cao, thường được sử dụng kết hợp với
kĩ thuật HI hoặc EIA để làm tăng độ nhạy và độ đặc hiệu [42].
Kĩ thuật trung hoà virus: Mẫu virus được ủ với huyết thanh bệnh nhân sau đó
hỗn hợp được sử dụng để gây nhiễm trong hệ thống phù hợp (tế bào nuôi cấy, phôi
trứng) để xác định sự xâm nhiễm của virus. Nếu không có sự xâm nhiễm của virus,
tức là kết quả dương tính, khi đó huyết thanh có kháng thể đặc hiệu với virus.
Người ta đã áp dụng kỹ thuật này trong vụ dịch ở Hong Kong năm 1997 để phát

hiện kháng thể kháng H5N1 trong huyết thanh bệnh nhân và có thể phát hiện được
14 ngày sau khi bệnh nhân biểu hiện triệu chứng [35]. Kỹ thuật này có độ nhạy và
độ đặc hiệu cao, có thể sử dụng để phát hiện kháng thể kháng H5N1 ở người nhưng
do sử dụng mẫu virus cúm gia cầm nên cũng phải thực hiện trong phòng an toàn
sinh học cấp độ 3.
Kỹ thuật trung hòa vi lượng (Microneutralization - MN): là kĩ thuật trung hoà
virus được thực hiện trên tấm 96 giếng, kết quả được đọc bằng phản ứng EIA sau
18-22 giờ kể từ khi gây nhiễm. Kĩ thuật MN dựa trên phản ứng trung hòa virus với
kháng thể đặc hiệu. Huyết thanh bệnh nhân được pha loãng ở các nồng độ khác

20


nhau và được ủ cùng một lượng virus nhất định trước khi tiến hành gây nhiễm tế
bào. Nếu trong huyết thanh bệnh nhân có kháng thể đặc hiệu kháng H5N1 thì kháng
thể sẽ trung hòa virus và virus không thể gây nhiễm tế bào. Sau khi ủ, các tế bào
được gắn cố định và tiến hành xác định sự có mặt của protein NP của virus trong
các tế bào nhiễm virus bằng phản ứng EIA. Hiện nay, kỹ thuật MN là kỹ thuật phát
hiện kháng thể kháng H5N1 tốt nhất. Nhược điểm là kỹ thuật áp dụng với mẫu virus
sống nên phải thực hiện trong phòng an toàn sinh học cấp độ 3. So với kĩ thuật
trung hoà virus thông thường, kỹ thuật MN cho kết quả nhanh, chính xác hơn và có
thể thực hiện đồng thời nhiều mẫu trên một tấm 96 giếng.
Chẩn đoán huyết thanh học có vai trò quan trọng trong các nghiên cứu dịch tễ
học. Các kỹ thuật này đòi hỏi phải có hai mẫu huyết thanh giai đoạn cấp và giai
đoạn phục hồi, do đó ít có giá trị trong chẩn đoán nhiễm H5N1 cấp mà thường chỉ
được sử dụng để khẳng định chẩn đoán trên bệnh nhân đang điều trị.
Kỹ thuật RT-PCR
Kỹ thuật RT-PCR là kỹ thuật khuếch đại một đoạn khuôn mẫu RNA theo
nguyên lý của PCR, bao gồm 2 giai đoạn:
Giai đoạn 1: Phiên mã ngược (RT-Reverse transcription) khuôn mẫu RNA

thành sợi DNA thứ nhất, sau đó dùng sợi này làm khuôn để tổng hợp sợi DNA thứ
hai tạo cDNA nhờ enzyme phiên mã ngược.
Giai đoạn 2: Dùng sợi đôi cDNA làm khuôn mẫu để thực hiện phản ứng PCR
khuếch đại đoạn gen mong muốn.
Có 2 phương pháp thực hiện RT-PCR. Đó là phương pháp RT-PCR một bước
và phương pháp RT-PCR hai bước. Trong phương pháp RT-PCR hai bước, phản ứng
phiên mã ngược tạo cDNA thực hiện trong một tube phản ứng, sau đó lấy sản phẩm
cDNA cho vào tube PCR chứa PCR mix với mồi đặc hiệu để chạy PCR khuếch đại
trình tự DNA đích muốn tìm. Phương pháp này sẽ có nguy cơ ngoại nhiễm sản
phẩm khuếch đại do phải mở nắp tube PCR để cho sản phẩm cDNA của giai đoạn
RT vào. Tuy nhiên, nguy cơ ngoại nhiễm có thể loại bỏ hoàn toàn bằng việc cho

21


dUTP và UNG (uracil-N-glycosylase) vào PCR mix của giai đoạn PCR. Với
phương pháp RT-PCR một bước, cả hai giai đoạn RT và PCR được thực hiện trong
một tube phản ứng, tất cả các thành phần của 2 giai đoạn được cho vào cùng một
lần. Ở đây, toàn bộ sản phẩm cDNA đều tham gia vào PCR và không nhất thiết phải
có mồi riêng cho RT vì chính mồi của PCR sẽ được sử dụng làm mồi cho RT. RTPCR một bước thuận tiện hơn và tránh được nguy cơ ngoại nhiễm sản phẩm khuếch
đại.
Kỹ thuật RT-PCR phát hiện các trình tự gen đặc trưng cho virus cúm A (gen
M) hoặc cho subtype HA và NA của virus dựa trên các cặp mồi được thiết kế đặc
hiệu với từng gen, do đó có thể xác định được các subtuye virus cúm A với độ nhạy
và độ đặc hiệu cao. Để chẩn đoán các trường hợp nghi nhiễm cúm A/H5N1, người
ta thường phải thực hiện vài phản ứng RT-PCR, bao gồm phản ứng xác định nhiễm
cúm A và các phản ứng xác định subtype HA và NA. Thời gian để thực hiện xét
nghiệm bằng kỹ thuật này mất khoảng từ 12-24 giờ hoặc hơn, tùy thuộc vào từng
phòng thí nghiệm. Kỹ thuật realtime RT-PCR chẩn đoán A/H5N1 giúp rút ngắn thời
gian xét nghiệm xuống còn 4-6 giờ, tăng độ nhạy và độ đặc hiệu đồng thời có thể

xác định được mật độ virus trong mẫu bệnh phẩm [18, 41]. Do không phải điện di
phân tích kết quả nên kỹ thuật realtime RT-PCR hạn chế được hiện tượng dương
tính giả do nhiễm sản phẩm PCR. Kỹ thuật này cho kết quả nhanh và chính xác
nhưng chi phí cao, tốn kém.
Kỹ thuật multiplex RT-PCR: Sử dụng cả 3 cặp mồi đặc hiệu phát hiện cả 3 gen
M, HA và NA của virus cúm A/H5N1 trong cùng một phản ứng. Kỹ thuật này khắc
phục được nhược điểm của hai kỹ thuật trên nhưng để xây dựng được phản ứng
multiplex RT-PCR thì quan trọng nhất là phải thiết kế được các mồi có nhiệt độ gắn
mồi (Ta- Annaeling temperature) vào DNA đích tương đương nhau và quan trọng
nữa là độ nhạy phát hiện từng tác nhân đích không bị giảm so với độ nhạy của RTPCR đơn mồi.
Kỹ thuật RT-PCR chẩn đoán cúm A/H5N1 với độ nhạy và độ đặc hiệu cao.
Tuy nhiên, do virus cúm A/H5N1 có tần suất đột biến cao và trong thời gian gần

22


đây đã hình thành nhiều subclade khác nhau [14] nên việc chẩn đoán A/H5N1 bằng
kỹ thuật RT-PCR đòi hỏi phải thường xuyên chuẩn hóa, thay đổi các cặp mồi cho
phù hợp với sự biến đổi của virus cúm A/H5N1.
1.2.2.2. Chẩn đoán
Ngày 19/08/2008, Bộ trưởng Bộ Y tế đã ra quyết định số: 30/2008/QĐ-BYT
về việc ban hành “Hướng dẫn chẩn đoán, xử trí và phòng lây nhiễm cúm A/H5N ở
người”. Theo đó, việc chẩn đoán nhiễm cúm A/H5N1 ở người dựa vào yếu tố dịch
tễ, các triệu chứng lâm sàng và cận lâm sàng, trong đó tiêu chuẩn quan trọng nhất
để chẩn đoán xác định một trường hợp nhiễm cúm A/H5N1 là kết quả xét nghiệm
dương tính với cúm A/H5N1 bằng kỹ thuật RT-PCR.
1.2.3. Điều trị nhiễm cúm A/H5N1 ở người
Hai dòng thuốc kháng virus được sử dụng để điều trị các trường hợp nhiễm
virus cúm gia cầm là các thuốc ức chế neuraminidase (oseltamivir và zanamivir) và
các thuốc ức chế kênh ion M2 (amantadine và rimantadine). Các thuốc ức chế NA

được sử dụng phổ biến hơn do thuốc có ít tác dụng phụ và ít bị kháng thuốc hơn so
với các thuốc dòng adamantane. Do còn thiếu các nghiên cứu thử nghiệm nên liều
lượng và thời gian điều trị của các thuốc kháng virus còn chưa được chuẩn hóa. Tuy
nhiên WHO khuyến cáo rằng các trường hợp có biểu hiện các triệu chứng về tiêu
hóa, các trường hợp nặng hoặc điều trị ở giai đoạn muộn cần phải sử dụng thuốc với
liều cao và thời gian điều trị dài hơn các trường hợp thông thường [5].
Những nguyên tắc khi điều trị bằng các thuốc kháng virus bao gồm: Bệnh
nhân nghi ngờ nhiễm cúm A/H5N1 cần được điều trị ngay bằng thuốc kháng virus
mà không chờ kết quả xét nghiệm [49]. Oseltamivir là lựa chọn hàng đầu, đối với
những trường hợp nhiễm A/H5N1 thể nặng có thể dùng oseltamivir với liều gấp đôi
(150 mg x 2 lần/ngày) và tăng thời gian dùng thuốc [49]. Oseltamivir vẫn có tác
dụng tốt đối với các trường hợp điều trị muộn nếu có dấu hiệu virus vẫn đang nhân
lên [49, 20]. Điều trị phối hợp các thuốc kháng virus với nhau hoặc phối hợp thuốc

23


kháng virus với thuốc kháng viêm hoặc thuốc điều trị miễn dịch cũng được áp dụng,
tuy nhiên hiệu quả của các phương pháp điều trị phối hợp đều chưa được đánh giá
đầy đủ. Corticosteroid là thuốc được sử dụng phổ biến nhưng hiệu quả điều trị chưa
rõ ràng. Thậm chí một nghiên cứu còn cho thấy trong số 7 bệnh nhân được điều trị
bằng corticosteroid có tới 6 bệnh nhân tử vong [47]. Rõ ràng là cần phải có những
nghiên cứu tiếp theo để đánh giá về hiệu quả điều trị khi phối hợp thuốc kháng virus
với các thuốc khác. Ở giai đoạn toàn phát của bệnh, đặc biệt là khi bệnh nhân đã
biểu hiện ARDS và/hoặc MODS, thì bệnh nhân cần phải được chăm sóc đặc biệt
với sự hỗ trợ thở máy, dùng thuốc vận mạch và liệu pháp thận thay thế [16]. Đối với
những trường hợp viêm phổi tiến triển thành ARDS thì không nên áp dụng thở máy
thông thường mà cần đặt nội khí quản ngay khi bệnh nhân có biểu hiện suy hô hấp.
1.2.4. Kiểm soát lây nhiễm và dự phòng
Mỗi đợt dịch cúm HPAI H5N1 ở người thường khởi đầu bằng các vụ dịch cúm

trên gia cầm. Do vậy, để phòng chống sự lây lan từ gia cầm sang con người chúng
ta cần tăng cường các biện pháp nhằm ngăn chặn và diệt trừ nguồn bệnh trên gia
cầm. Các biện pháp này bao gồm công tác tiêm chủng, tăng cường các biện pháp an
toàn sinh học và tiêu hủy gia cầm khi xảy ra dịch. Ở các quốc gia chưa xảy ra dịch,
công tác giám sát, các biện pháp an toàn sinh học và kế hoạch phòng chống dịch có
vai trò quan trọng để ngăn chăn sự xuất hiện của virus và thiết lập tình trạng sẵn
sàng trong phòng chống dịch cúm gia cầm. Các biện pháp phòng ngừa ở mức độ
quốc gia có thể làm giảm nguy cơ lây lan dịch cúm gia cầm qua đường biên giới;
tuy nhiên, các biện pháp phòng ngừa ở mức độ xử lý dịch có vai trò quan trọng để
ngăn chặn sự lây lan dịch bệnh ở người. Các biện pháp phòng ngừa này do WHO và
CDC (Centers for Disease Control and Prevention) đưa ra nhằm làm giảm tỉ lệ mắc
cúm gia cầm ở người bằng cách thực hiện các biện pháp bảo vệ cá nhân phù hợp tại
các cơ sở y tế. Hiện tại, CDC và WHO khuyến cáo sử dụng khẩu trang N-95 khi
chăm sóc bệnh nhân cúm gia cầm. Trong quá trình thực hiện các thủ thuật có nguy
cơ cao như soi phế quản, thông khí không xâm lấn, đặt nội khí quản, cho bệnh nhân
thở ôxy hoặc khí dung thuốc... thì nhân viên y tế cần phải được trang bị các phương

24


tiện chuyên dụng hơn như mặt nạ kín hoàn toàn hoặc mặt nạ lọc khí kết hợp với các
dụng cụ bảo hộ khác như áo choàng không thấm nước, găng tay và kính bảo vệ mặt
[12]. Rửa tay trước và sau khi tiếp xúc với bệnh nhân bằng các dung dịch khử trùng
tại bồn rửa ngay trong phòng bệnh nhân. Ngay khi bệnh nhân nhập viện, cần phải
tiến hành cách ly bệnh nhân trong phòng áp lực âm. Các nhân viên y tế cần được
tiêm phòng vaccine cúm mùa hàng năm để ngăn chặn hiện tượng đồng nhiễm virus
cúm. Các nhân viên y tế tiếp xúc với bệnh nhân cần được điều trị dự phòng bằng
thuốc kháng virus ngay lập tức, nếu ai có biểu hiện nhiễm bệnh phải nghỉ và giám
sát chặt chẽ. Với các biện pháp phòng ngừa như vậy thì nguy cơ lây lan virus cúm
gia cầm sẽ giảm tới mức thấp nhất, ngăn chặn nguy cơ lây nhiễm sang các bệnh

nhân khác, sang người nhà và nhân viên y tế.
1.3. MỘT SỐ NGHIÊN CỨU VIRUS CÚM A/H5N1 Ở VIỆT NAM VÀ TRÊN
THẾ GIỚI
Trước tình hình lây lan của dịch cúm gia cầm, thế giới và Việt Nam đã có
nhiều công trình nghiên cứu về phương pháp chẩn đoán, điều trị và dự phòng bệnh
cúm. Ngay khi dịch cúm A/H5N1 xảy ra trên gia cầm vào cuối năm 2003, các
phòng thí nghiệm trọng điểm của nước ta đã nhanh chóng hoàn thiện kỹ thuật phát
hiện virus cúm A/H5N1 trên mẫu bệnh phẩm bằng kỹ thuật RT-PCR đồng thời triển
khai kỹ thuật giải trình các gen của cúm A/H5N1 nhằm tìm hiểu sâu hơn về chủng
virus đang lưu hành tại Việt Nam. Những chuỗi gen giúp xác định subtype H5,
subtype N1 và các gen cấu trúc đã được Viện Công nghệ Sinh học, Viện Pasteur TP
Hồ Chí Minh, Viện Vệ sinh dịch tễ trung ương, Viện Thú y giải mã và công bố trên
Ngân hàng gen [30, 38]. Trên cơ sở phân tích trình tự gen kháng nguyên H5 và N1,
các tác giả khẳng định nguồn gốc của virus cúm A gây bệnh trên gia cầm và người
tại Việt Nam cùng nhóm với virus H5N1 phân lập tại Trung Quốc [30]. Các biến
chủng H5N1 của Hồng Kông, Trung Quốc phân lập những năm 1997 - 2001 và Hàn
Quốc, Đài Loan (phân lập năm 2003) đều có nguồn gốc từ chim cút và ngỗng
(A/Goose/Guandong/1/96) vùng Quảng Đông (Trung Quốc), đó là các biến chủng
thuộc dòng Quảng Đông [30]. Như vậy, virus cúm gia cầm gây bệnh ở gia cầm và

25