enzyme pro

Trường Đại học Nha Trang
Viện công nghệ sinh học và môi trường
: Thu nhận enzyme Protease từ nấm
mốc Aspergillus oryzae và ứng dụng
trong chế biến nước tương
Semina
GVHD: TS. Vũ Ngọc Bội
SVTH: 1. Lê Thị Vân
2. Nguyễn Thị Thanh Trà
3. Nguyễn Thị Ngọc Bích
4. Vũ Thị Xuân
5. Nguyễn Thị Thu Huyền
6. Lại Nhật Linh
7. Nguyễn Quyết Thắng
NỘI DUNG

B. Ứng
dụng trong
sản xuất
nước tương

A. Thu nhận
enzyme
Protease từ
nấm mốc
Aspergillus
oryzae .
A. Thu nhận enzyme Protease
I. Tổng quan về enzyme Protease
II. Quy trình thu nhận enzyme Protease từ
nấm mốc Aspe r gil l u s or yz ae

.
I. Tổng quan enzyme Protease
1.Giới
thiệu
chung
2.Phân
loại
protease
Ngoài ra, nhiều protease cũng có khả năng thuỷ phân liên
kết este (bromelin) và vận chuyển amino acid
- Nhóm enzyme protease xúc tác quá trình thuỷ phân liên
kết peptit (-CO-NH-)n trong phân tử protein, polypeptide đến
sản phẩm cuối cùng là các amino acid
1. Giới thiệu chung
Mô hình enzyme Protease thủy phân phân tử
Protein:
H2N-CH-CO--NH-CH-CO--…--NH-CH-COOH
R1 R2 RX
H2O
H2N-CH-COOH + H2N-CH-CO--…--NH-CH-COOH
Protease
R1 R2 RX
Sản phẩm thủy phân là có thể là peptide, peptone, amino acid … tùy theo
mức độ thủy phân.
2. Phân loại
Potease(peptidase)(E.C.3.4)
Exopeptidase(E.C.3.4.11-17) Endopeptidase(E.C.3.4.21-99)
Aminopeptidase Serine proteinase
Cystein proteinase
Cacboxypeptidas

Aspartic proteinase
Metallo proteinase
Cấu trúc không gian của protease

Protease có bản chất là protein,
chỉ có các protein có cấu trúc
bậc 4 mới thể hiện hoạt tính
sinh học.

Cấu trúc không gian của
protease được hình thành do
các tiểu phần dưới đơn vị có
cấu trúc bậc 3 liên hợp lại bằng
các liên kết hydro, tương tác
tĩnh điện, tương tác kị nước …
Trung tâm hoạt động của protease

Trung tâm hoạt động của
protease thường bao gồm một
tổ chức các nhóm định chức
của amino aicd không tham gia
tạo thành trục chính của sợi
polypeptide.
Vd : nhóm – SH của Cys, -OH của
Ser, Tys, ε- NH2 của Lys,
-COOH của Asp,Glu, …

Trung tâm hoạt động của
protease hai cấu tử bao gồm
các nhóm ngoại ( vitamin, ion,

kim loại)
II. Quy trình thu nhận enzyme Protease
từ nấm mốc
1. Sơ lược về nấm mốc A.oryzae.
2. Quy trình thu nhận enzyme.
a. Phân lập nấm A.oryzae.
b. Lên men tạo enzyme Protease.
c. Thu nhận sản phẩm.
d. Sản xuất enzyme Protease tinh khiết.
1.Sơ lược về nấm mốc A.oryzae
Phân loại: A.oryzae thuộc.
chi Aspergillus
họ Trichocomaceae
bộ Eurotiales
lớp Eurotiomycetes
ngành Ascomycota
và thuộc giới nấm
(theo Kitamoto, 2002).
2. Đặc điểm

Nấm vi thể, nấm mọc và phát triển thành lớp mốc màu đen,
vàng.

Cơ thể sinh trưởng là hệ sợi, phân nhánh có vách ngang chia
sợi thành nhiều tế bào, sợi mảnh chiều ngang sợi khoảng 5 –
7µm.

Sinh sản bằng bào tử.

Giàu enzyme thủy phân nội bào và ngoại bào: amylase,

protease. Có khả năng thủy phân liên kết β-glucoside, endo-β-
1,4-glucanase
Nấm mốc A.oryzae
2. Quy trình thu nhận Protease
Phân lập nấm mốc
Lên men tạo Protease
Tinh sạch enzyme Thu nhận enzyme
2.1 Phân lập chủng nấm A.oryzae
đất

Nguồn phân lập thức ăn

trung tâm cung cấp nấm giống
phân lập trong điều kiện tự nhiên
Phương pháp phân lập trong điều kiện sản xuất

phân lập từ mẫu giống đã hỏng
Quy trình tạo mốc giống :
-
Mẫu được say nhuyễn , thêm nước cất, pha loãng ở các nồng độ
thích hợp và nhân giống chọn lọc trên môi trường tổng hợp: MT
Czapek bằng kĩ thuật cấy trang.
Saccharose : 30g
NaNO3 : 3g
K2SO4 : 1g
MgSO4 : 0,5g
KCl : 0,5g
FeSO4 : 0,1g
Nước cất: 1000ml (pH= 5-5,5)
-

Giống sau khi phân lập sẽ được cấy truyền sang bình tam giác
Môi trường nuôi nấm :
.Cám, ngô đã xay nhỏ, có thêt bố sung thêm trấu cho xốp.
. Độ dày khoảng 1- 2cm
. Đem hấp chín, để nguội 30 - 35 C̊
. Cấy truyền giống từ ống nghiệm sang bình tam giác và
nuôi 36 – 48 giờ nhiệt 30 - 35 C̊
Giống nhân
thành công có
thể sử dụng
ngay hoặc
đem đi bảo
quản và dự
trữ.
2.2 Lên men tạo Protease ( sử dụng phương pháp nuôi
cấy trên môi trường bán rắn)

Môi trường nuôi cấy
- Môi trường có ảnh hưởng trực tiếp đến sự sinh trưởng và tổng
hợp enzyme của vi sinh vật, thành phần môi trường phải đảm bảo
đủ chất dinh dưỡng cho sự phát triển bình thường của vi sinh vật
và sự sinh tổng hợp enzyme.
- Thành phần chính của môi trường : C, N, H,O; ngoài ra còn các
chất vô cơ : Mn, Ca, P, S, Fe…và các chất vi lượng khác.
- Để tăng sự tổng hợp enzyme người ta thường bổ sung các chất
cảm ứng, các chất này thường là cơ chất tương ứng của enzyme
cần tổng hợp

a. Nguồn cacbon


Thường là các hợp chất hữu cơ trong đó chủ yếu pà glucid, có
nhiều hợp chất là nguồn cacbon cho A. oryzae sinh enzyme
protease có hoạt lực cao.
Vd: đối với A. oryzae sinh tổng hợp proteinase tác dụng của nguồn cơ
chất có thể theo thứ tự:
fructose→saccharose→maltose→ glucose → arabinose → glactose
b. Nguồn nito

Nguồn nito sử dụng bao gồm hai nhóm: nito vô cơ và nito hữu cơ

Đối với A. oryzae trên môi trường có chứa nguồn nito hữu cơ thì
khả năng sinh tổng hợp protease acid cao.

Môi trường bổ sung cả hai nguồn nito trên thì hoạt lực sinh enzyme
tăng cao
Vd : môi trường có cám mì , bột đậu tương đã tách chất béo, có cả hai
nguồn nito khả năng sinh protease của A. oryzae tăng 22-74%
b. Nguồn nito

Các amino acid có ảnh hưởng rõ rệt tới sự sinh tổng hợp enzyme của vi
sinh vật, có thể cảm ứng hoặc ức chế
Vd: Gly, Ala, Met có tác dụng làm tăng hoạt lực protease của chủng A. oryzae
đột biến 251-90 đến 6 – 9 % và nguyên chủng A. oryzae 132-63 tới 7-24%
c. Nguồn nguyên tố khoáng và các chất khác.

Muối khoáng rất cần thiết cho sự phát triển bình thường của vi sinh vật và
sự sinh tổng hợp enzyme
Vd: ion Mg(2+) có tác dụng trong quá trình sinh tổng hợp và ổn định các
enzyme có hoạt tính ở nhiệt độ cao
Quy trình:

1. Chuẩn bị môi trường làm mốc trên khay:
- Nguyên liệu chính được sử dụng là cám và ngô đã được xay
và bổ sung thêm trấu hoặc mạt cưa để tăng độ xốp giúp cho hệ sợi
nấm phát triển tốt, tận dụng tối đa nguồn cơ chất.
- Trộn với nước theo tỉ lệ 80 – 90 trọng lượng so với nguyên
liệu, sau khi trộn để khoảng 3-4 giờ cho ngô thấm đều nước, đem
hấp khử trùng ( P=1-1,5 atm ở nhiệt độ 121°C trong 45-60 phút )
- Nguyên liệu sau khi hấp phải chín đều, độ ẩm còn lại 45-50%
là vừa.
2. Trộn giống vi sinh vật :
- Nguyên liệu được rỡ ra và làm nguội nhanh đến khoảng 26 -
28°C thì tiến hành cấy giống hoặc rắc bào tử vào môi trường ủ
thành đống vài giờ
- Tỉ lệ giống đưa vào nuôi cấy thường vào khoảng 0,5 – 2% so
với khối lượng của môi trường hoặc cao hơn.
3. Kĩ thuật nuôi cấy:
- Sau thời gian ủ bào tử đã nảy mầm nhưng chưa thành sợi
cần rải môi trường thành từng lớp mỏng 2- 3cm, và giữ cho nhiệt
độ không quá 36 độ C.
- Đưa các khay vào phòng nuôi cấy đặt trên các giá đỡ được
thiết kế sao cho không khí được lưu thông thường xuyên
- Nhiệt độ nuôi cấy thích hợp cho sợi nấm phát triển là 28
-32°C
- Thời gian nuôi cấy khoảng 60 giờ, nếu bào tử hình thành
chậm thì có thể 70 – 72 giờ


Các giai đoạn phát triển của nấm mốc:
- Gđ 1:
. Sợi nấm bắt đầu hình thành có màu trắng hoặc sữa

. Khối môi trường còn rời rạc
. Enzyme mới bắt đầu hình thành
- Gđ 2:
. Kéo dài 14-18 giờ, toàn bộ bào tử đã phát triển thành hệ sợi
. Môi trường kết chặt lại, độ ẩm giảm dần, nhiệt độ môi trường tăng nhanh,
quá trình đồng hóa diễn ra mạnh, lượng cơ chất giảm nhiều
. Enzyme protease được tổng hợp mạnh
- Gđ 3:
. Kéo dài 10 – 20 giờ
. Quá trình trao đổi chất yếu dần
. Bào tử được hình thành nhiều lượng enzyme tao ra ít.
-
Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men

Độ ẩm của môi trường:
- Độ ẩm ảnh hưởng trực tiếp đến quá trình trao đổi chất của nấm
mốc, thiếu nước thì các quá trình thủy phân cơ chất của môi trường
và sự sinh tổng hợp các hợp chất cần thiết không thể thực hiên.
- Độ ẩm tốt nhất cho sự hình thành enzyme của A. oryzae là 55– 60%
độ ẩm thích hợp cho sự hình thành bào tử là 45%

Ảnh hưởng của không khí:
- A. oryzae là vi sinh vật hoàn toàn hiếu khí, chỉ phát triển bình
thường khi có đầy đủ oxy. Vì vậy môi trường phải xốp và thoáng
khí.
- Theo thực nghiệm trong quá trình nuôi cấy A. oryzae cứ cách 1 giờ
môi trường cần 1,7 m3 không khí, nồng độ CO2 là 8%

Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy:
- Hầu hết các chủng A. oryzae có cực đại sinh enzyme protease ở

giờ thứ 36 – 42 của quá trình nuôi cấy.Thời gian nuôi cấy để thu
được lượng protease cực đại thường được xác định bằng thục
nghiệm.
- Thời gian nuôi cấy phải phù hợp tránh hiện tượng nấm sinh bào tử
vì nó thường làm giảm hoạt lực của enzyme, với A. oryzae hoạt lực
sinh enzyme thường kết thúc khi nấm bắt đầu sinh bào tử.

Ảnh của pH và nhiệt độ:
- pH thích hợp cho nấm mốc phát triển là môi trường acid yếu
khoảng 5,5 -6
- Nhiệt độ cũng là một yếu tố hết sức quan trọng, ảnh hưởng tới sự
sinh trưởng của nấm mốc và sinh enzyme
Trong quá trình nuôi cấy cần giữ cho nhiệt độ môi trường trong
khoảng 27 - 36 độ C